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Confinement moléculaire et Confinement moléculaire et organisation de la membrane des organisation de la membrane des
cellules vivantes: analyse de la diffusion cellules vivantes: analyse de la diffusion par spectroscopie de corrélation de par spectroscopie de corrélation de
fluorescencefluorescence
Laure WAWREZINIECKLaure WAWREZINIECKÉcole doctorale Sciences de la Vie et de la Santé, Université Aix-Marseille II Spécialité: Biologie des eucaryotes, option Immunologie
Sous la direction de:Didier MARGUET, Centre d’Immunologie de Marseille-LuminyUniversité Aix-Marseille II – CNRS – INSERMPierre-François LENNE, Institut FresnelUniversité Aix-Marseille III – CNRS
Journée des doctorants – 17 déc Journée des doctorants – 17 déc 0404
Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy bourse MENRT
la membrane cellulaire: une structure très complexe! organisation dynamique: étude de la diffusion
différentes méthodes sont possibles: Suivi de particules uniques (SPT)Recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP)Spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)
Engelman, Nature, 2005
Spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)
I. Modèles d’organisation compartimentée de la membrane cellulaire
II. Un outil pour étudier la diffusion moléculaire: la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)
III. FCS à rayon variable et lois de diffusion FCSWawrezinieck et al,
SPIE, 2004Wawrezinieck et al.,
Biophys J, 2005
IV. Lois de diffusion FCS mesurées dans les cellules vivantes COS-7 et nature du confinement membranaire
Lenne et al, EMBO J,
2006
V. Étude préliminaire de la réorganisation membranaire au cours de l’activation cellulaire
tiré de Singer & Nicolson, 1972
Confinement moléculaire dans la membrane cellulaire Modèles d’organisation
Confinement moléculaire dans la membrane cellulaire Modèles d’organisation
animation réalisée par l’équipe d’A. Kusumi
Confinement moléculaire dans la membrane cellulaire Modèles d’organisation
tiré de Jacobson et al., 1995
mise en contact rapide des différents acteurs d’une réaction organisation non aléatoire et non uniforme de la membrane
animation réalisée par l’équipe d’A. Kusumi
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Structure du réseau de microfilaments d’actine
50 µ m 0,2 µm
Image obtenue par microscopie confocale de fluorescence de cellules CEF après marquage par rhodamine-phalloïdineWakatsuki et al., 2001
Image obtenue par microscopie électronique dans un lamellipode de fibroblaste REF-52Svitkina et al., 1987
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Le réseau des microfilaments d’actine: un obstacle à la diffusion des protéines transmembranaires
équipe de Kusumi
Expériences de suivi de particules uniques par l’équipe de Kusumi (cellules NRK):confinement transitoire des protéines TfR dans les mailles du réseau d’actine:
taille des mailles: 260 nmtemps moyen de confinement: 55 ms
récepteur à la transferrine (TfR)
Fujiwara et al., 2002
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Les protéines ancrées au cytosquelette: un obstacle à la diffusion des phospholipides
équipe de Kusumi
Expériences de suivi de particules uniques par l’équipe de Kusumi (cellules NRK):confinement transitoire des phospholipides DOPE :
taille des mailles: 230 nmtemps moyen de confinement: 11 ms Fujiwara et al.,
2002
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts”
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts”
pas d’observation directe (structures trop petites et trop nombreuses)
« membrane rafts are small (10-200 nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes » (Pike, 2006)
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts”
Une définition biochimique:
• fractions de membranes résistantes à l’extraction par des détergents non-ioniques tels que le Triton X-100 à 4°C (ou le Brij 98 à 37°C)
• microdomaines enrichis en sphingolipides, cholestérol et certaines protéines
dans rafts hors rafts
GFP-GPI
« membrane rafts are small (10-200 nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes » (Pike, 2006)
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts”
Vers une définition physique ?
• utilisation des propriétés de diffusion différentes en présence et en l’absence de microdomaines
• mesure de la diffusion par des méthodes optiques
« membrane rafts are small (10-200 nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes » (Pike, 2006)
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
La FCS: montage de microscopie de fluorescence
laser miroir dichroïque
objectif de microscope
trou confocal
filtre
échantillon
photodiode à avalanches
I(t)
autocorrélation
volume confocal
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Principe de la FCS: cas d’une molécule unique
Fonction d’autocorrélation:
2
2
tI
τtItIτg
Inte
nsi
té d
e fl
uo
resc
ence
I(
t)
temps t
fluctuation de fluorescence
=1+
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Principe de la FCS: cas d’une molécule unique
Fonction d’autocorrélation:
2
2
tI
τtItIτg
= 1 + aire relative de recouvrement
Inte
nsi
té d
e fl
uo
resc
ence
I(
t)
temps t
fluctuation de fluorescence
I(t) copies I(t+)
recouvrement
délai
temps t
Inte
nsi
té d
e fl
uo
resc
ence
I(
t)
=1+
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Principe de la FCS: cas d’une molécule unique
Fonction d’autocorrélation:
2
2
tI
τtItIτg
= 1 + aire relative de recouvrement
Inte
nsi
té d
e fl
uo
resc
ence
I(
t)
temps t
fluctuation de fluorescence
I(t) copies I(t+)
recouvrement
aire
rel
ativ
e d
e re
cou
vrem
ent
délai
délai
temps t
Inte
nsi
té d
e fl
uo
resc
ence
I(
t)
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Principe de la FCS: cas de plusieurs molécules
0 10 20 30 40 50 60
300
350
Intensité de fluorescence
(kHz)
temps t (s)
105
délai τ (ms)
1
1.1
1.2
1.3
1.4
101 102 103 104
fon
ctio
n d
’au
toco
rré
latio
n
g(2
) (τ)
N
11
temps de diffusion dans le volume confocal
Utilisation de la FCS pour l’étude de la diffusion
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
La FCS traditionnelle:
temps de diffusion
Comment obtenir de nouvelles informations sur l’organisation membranaire?
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
tem
ps d
e di
ffus
ion
τ d
aire du spot w2
La FCS à rayon variable:
Comment obtenir de nouvelles informations sur l’organisation membranaire?
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
tem
ps d
e di
ffus
ion
τ d
aire du spot w2
La FCS à rayon variable:
Comment obtenir de nouvelles informations sur l’organisation membranaire?
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
tem
ps d
e di
ffus
ion
τ d
aire du spot w2
La FCS à rayon variable:
Comment obtenir de nouvelles informations sur l’organisation membranaire?
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
tem
ps d
e di
ffus
ion
τ d
aire du spot w2
La FCS à rayon variable:
‘Loi de diffusion FCS’
Comment obtenir de nouvelles informations sur l’organisation membranaire?
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
tem
ps d
e di
ffus
ion
τ d
aire du spot w2
La FCS à rayon variable:
‘Loi de diffusion FCS’
tem
ps d
e di
ffus
ion
τ d
aire du spot w2
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
La FCS à différentes échelles spatiales
Le diamètre du spot peut être réglé entre 0,4 et 1,0 µm
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Mesures de FCS réalisées sur les cellules COS-7
selon axe z20
15
10
5
0100x10380604020
intensité détectée (cps)
cellule COS-7
30
μm
x
y
z
lamelle
noyau
volume confocal
posi
tion (
µm
)
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Analogues lipidiques fluorescents et protéines de fusion utilisées dans les cellules COS-7
(1) glycérophospholipides: FL-PC et FL-PE(2) sphingolipides: FL-SM et FL-GM1
(3) protéines ancrées GPI: GPI-GFP et Thy1-GFP(4) protéines transmembranaires: GFP-TfR et GFP-DPPIV
1.08
1.06
1.04
1.02
1.00
fonct
ion d
’auto
corr
éla
tion
0.001 0.1 10 1000délai (ms)
1.20
1.15
1.10
1.05
1.00
fonct
ion d
’auto
corr
éla
tion
0.001 0.1 10 1000délai (ms)
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Mesures de FCS réalisées sur les cellules COS-7: étude de l’autocorrélogramme
GFP-TfRFL-GM1
diffusion libre 2D
τdiff
L’étude à une seule taille de volume confocal ne permet pas de conclure quant au type de diffusion
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Lois de diffusion FCS mesurées sur les cellules COS-7
100
80
60
40
20
0
-20
tem
ps
de d
iffusi
on (
ms)
160140120100806040200
waist2 (x10
3 nm
2)
FL-GM1
GFP-TfR
Quels types d’organisation de la membrane permettent d’expliquer de telles lois de diffusion?
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Simulations: modèles de diffusion
diffusion libre
aire du spot - w2tem
ps d
e di
ffusi
on
D
wd 4
2
obstacles imperméables
domaines isolés
partage dynamique
réseau
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Simulations: paramètres
w
Modèle de réseau
P
Dmicro
2r
Dout
DinPin
Pout
r
Modèle des domaines isolés
w
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Simulations: paramètres
Force de confinement (Sconf ):
P
P
rAS
diff
confconf
11
Temps de confinement (τconf ):temps moyen mis par une molécule placée au centre du domaine pour en sortir
r
P
avec : P : probabilité de sortie d’un domaine r : rayon du domaine : longueur moyenne du pas élémentaire diff : temps de diffusion à travers le domaine A : constante
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Simulations du réseau: résultats
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Simulations du réseau: résultats
diffconf
effd
t
D
wt
2
4
0
2
0
si Xc2>2:
Grandes tailles de spots confocaux
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Simulations des domaines isolés: résultats
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Simulations des domaines isolés: résultats
diffconf
effd
t
wD
t
2
4
1
0
20
: coefficient de partaget0: indice de confinement
Grandes tailles de spots confocaux
si Xc2>10:
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Simulations: résumé des résultats
Aires accessibles domaines isolés t0 > 0
diffusion libre t0 = 0
réseau t0 < 0
0
réseau
domaines isolés
diffusion libre
Aire du spot confocal
tem
ps d
e
diff
usio
n
obstacles imperméables
obstacles imperméables
t0 = 0
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Glycérophospholipides/Protéines ancrées GPI/Sphingolipides
FL-PC: glycérophospholipideGFP-GPI: protéine ancrée GPIFL-GM1: sphingolipide
Modification enzymatique de la membrane
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
cholestéroloxydase
sphingomyélinase
sphingomyéline
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Analogues lipidiques fluorescents: traitements enzymatiques
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
FL-GM1 FL-SM FL-PCordo
nnée
à l'
orig
ine
(ms)
no treatment
+ COase 1 U/mL
+ SMase 0.1 U/mL
GFP-GPI
50
40
30
20
10
0
tem
ps
de d
iffusi
on (
ms)
120x103
80400
waist2 (nm
2)
FL-GM1
+ COase 1U/mL
+ SMase 0.1 U/mL
sans traitement
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques mais pas dans les mailles du cytosquelette
modif actine
modif radeaux lipidiques
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques
Les glycérophospholipides, sphingolipides et protéines ancrées GFP ne sont pas sensibles au confinement par le réseau d’actine
Cyto D
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR
control
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR
control
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR
control
+ cytochalasine D (2 μM)
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR
control
+ cytochalasine D (2 μM)
+ cytochalasine D (10 μM)
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques et/ou les mailles du cytosquelette
modif actine
modif radeaux lipidiques
modif actine +modif radeaux lipidiques
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Confinement transitoire des protéines transmembranaires dans les radeaux lipidiques et dans les mailles du réseau d’actine
Cyto DCyto D
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques et/ou dans les mailles du réseau d’actine
caractéristiques des mailles du réseau d’actine:
caractéristiques des domaines isolés:
• taille des mailles: 2r = 240 ± 60 nm
• conf de l’ordre de plusieurs dizaines ou centaines de ms
• structure dépendante de la température
• taille des domaines: r < 60 nm
• conf de l’ordre de plusieurs dizaines de ms
• structures indépendantes de la température
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Application à l’étude de l’activation des lymphocytes T
Principe:
mesures sur cellules Jurkat, dont on maîtrise l’activation par ajout dans le milieu de culture d’un anticorps anti-CD3 humain
Complexe TCR/CD3
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Lois de diffusion FCS dans les cellules Jurkat en l’absence d’activation
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Lois de diffusion FCS dans les cellules Jurkat en l’absence d’activation
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Lois de diffusion FCS dans les cellules Jurkat en l’absence d’activation
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Temps de diffusion et lois de diffusion FCS au cours de l’activation
Ajout del’anticorps
0 1 2 3 4 6 7 8 1095
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic d’activation
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic d’activation
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic d’activation
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Comment expliquer la loi de diffusion FCS mesurée au pic d’activation ?
loi de diffusion obtenue pour un confinement total dans un domaine de taille finie
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Proposition de modèle…
activation
Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation
Conclusion et perspectives…
• étude qualitative: distinction entre deux types de confinement
• étude quantitative: mesure du temps de confinement et estimation de la taille
• 1ère mise en évidence de l’existence des radeaux lipidiques dans les membranes de cellules vivantes au repos
Federico Belloni PhD PACA/Zeiss
Fabien Conchonaud PhD
Laure Wawrezinieck PhD
Annie BonedAnnemarie LellouchArnauld Sergé
Didier Marguet
Nadia Djaker PhD
David Gachet PhD
Patrick FerrandPierre-François LenneSerge Monneret Jérôme Wenger
Hervé Rigneault
Un grand merci à:
H. Qasmi et N. Bertaux pour les simulationsN. Sandeau pour les calculs de volumes confocauxF. Conchonaud pour toutes les préparations de cellules et les mesures de FRAPO. Würtz et A. Boned pour la biochimieO. Hawchar et Y. Hamon et H-T He pour les mesures sur Jurkat
et P-F Lenne, H. Rigneault et D. Marguet pour leur soutien sans faille