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Dr. Juan Carlos Hormazábal O.
Jefe Subdepto. Enfermedades Infecciosas
Instituto de Salud Publica
Coqueluche: Hacia el cambio en
el diagnóstico microbiológico
Agenda:
1 Generalidades
2 Cultivo
3 Inmunofluorescencia Directa IFD
4 Estudios Serológicos
5 Pruebas Moleculares
6 Conclusiones
Coqueluche, Generalidades
Coqueluche es una enfermedad infecciosa bacteriana aguda que
afecta el tracto respiratorio.
Es causada por un bacilo gram negativo, Bordetella pertussis,
transmitida desde un individuo infectado a uno susceptible.
Esta es una infección inmunoprevenible, que continúa siendo
endémica
Periodo Incubación: 7-10 dias
Enfermedad Clásica: Niños no inmunizados
Periodo Catarral 1 -2 semanas
Periodo Paroxístico 2-8 semanas
Periodo Convalecencia 1-2 semanas
Enfermedad Moderada Vacunados/Adultos que han hecho la enfermedad
Asintomáticos Vacunados o Adultos que han hecho la enfermedad
Dg
Lab Vigil
Epi
Sospecha Clínica
COQUELUCHE
Diagnóstico
Control
Prevención
COQUELUCHE
DIAGNÓSTICO, CONTROL Y PREVENCIÓN
Cultivo
Estudios Serológicos
Diagnóstico Rápido
Molecular
IFD
Parámetros Clínicos
Aspectos Epidemiológicos
Estrategias
Inmunización
EL LABORATORIO LA ENFERMEDAD
Cultivo Bordetella spp.
Es considerado el gold standard
El cultivo de B. pertussis es exigente, requiere de la
neutralización de productos tóxicos de su metabolismo
Su crecimiento es lento, más que el de la flora
microbiana acompañante
Mattoo et Al Clin Microbiol Rev 2005;18 326-382
Cultivo: Toma de muestra
A partir de una muestra obtenida por aspirado
nasofaríngeo o tórula nasofaríngea
También puede utilizarse aspirado traqueal / lavado
broquio alveolar.
No se recomienda el uso de tórulas de algodón
Cultivo: Transporte y siembra
Inmediata
Medio de Transporte: Amies charcoal, Regan-Lowe
Medios de Cultivo Recomendados
Medio Regan-Lowe-Charcoal suplementado con sangre
de caballo y cefalexina es de elección
Se han reportado inusuales casos de inhibición de
crecimiento por cefalexina
Bordet Gengou: menos utilizado, rápida expiración (8
semanas)
Mattoo et Al Clin Microbiol Rev 2005;18 326-382
Factor Crítico
Cultivo Bordetella
Incubación: 7 a 10 días
Atmósfera aerobia y en humedad
Colonias en R-L:
– Pueden aparecer a partir del 3er día
– Grises, lisas y brillantes de aspecto similar a gotas de
rocío o gotitas de mercurio
– Catalasa: Positiva
– Oxidasa: Positiva
– Urea Negativa
Cultivo Bordetella Identificación:
Pruebas bioquímicas, características de crecimiento
Mediante Inmunofluorescencia Directa de colonias
sospechosas
PCR para B. pertussis
Antisueros
Espectrometría de masa
Sensibilidad: 37%
Especificidad: 100%
VPP: 100%
VPN: 76%
Halperin et Al. J Clin Microbiol 1989;27:752-757
Mattoo et Al Clin Microbiol Rev 2005;18 326-382
Cultivo Bordetella Su rendimiento es máximo en el periodo catarral y
durante la primera semana del periodo paroxístico.
Al cuarto día de emplear macrólidos puede detectar B.
pertussis en 56% de los pacientes infectados
En adultos el cultivo es infrecuentemente positivo, puede
ser de un 10 hasta un 30%
Estudio de Brote Coqueluche, Isla Saint Croix, Comunicación CDC Atlanta 2007
Cultivo Bordetella :
Ventajas
Alta especificidad
Considerado Gold Standard
Desventajas
Lento, crecimiento demora 7-10 días
Baja sensibilidad, afectada por
- Edad del paciente
- Estado de inmunización previa
- Tratamiento antimicrobiano
- Duración de los síntomas previo a la toma de muestra
- Condiciones de transporte de muestra
Técnica ampliamente utilizada en
investigaciones biológicas
Inicialmente desarrollada por Coons y Kaplan en 1941
Utilizada de rutina en el laboratorio clínico (métodos
estandarizados)
Permite el estudio de diversas estructuras celulares en células en
suspensión, cultivos celulares, tejidos, microesferas y
microarreglos
Detectan moléculas específicas en muestras frescas o fijadas
Utiliza anticuerpos químicamente conjugados con marcadores
como Fluoresceína Tiocianato o Tetrametil Rhodamina Isocianato
Inmunofluorescencia
Principios de Fluorescencia
Es un tipo de luminiscencia
Cuando las moléculas con propiedades
de luminiscencia absorben luz de excitación,
emiten luz pero a diferente longitud de onda
Este fenómeno de emisión ocurre rápidamente
luego de la absorción de luz de excitación
Se produce debido a su estructura atómica, los electrones se encuentran
organizados en in nivel de energía muy discreta rodeando al núcleo
atómico.
Cuando un electrón absorbe energía de un fotón de luz, se excita y «salta» a
un nivel de energía mayor e inestable. El electrón excitado, comienza a perder
energía a través de la emisión de un fotón
La luz emitida (fluorescencia), es de menor energía que la recibida, por lo que
su longitud de onda es mayor en comparación con la luz recibida
Principios Inmunofluorescencia Directa/Indirecta
Excitación y Emisión
Salto de Stokes
G. Kumar, IHC Staining Methods, 5ed 2009
Principios Inmunofluorescencia Directa/Indirecta
Los anticuerpos marcados se unen
directa o indirectamente a un antígeno
específico
Por medio de técnicas de fluorescencia
el antígeno específico es reconocido
La emisión de fluorescencia puede ser
cuantificada por citometría de flujo,
scanner de microarreglos, capturador
de imágenes automatizado o
manualmente por microscopía de
fluorescencia o microscopía confocal
Inmunofluorescencia Directa B. pertussis
Antígeno Blanco es el Lipoóligosacárido (LOS)
Componente esencial de la membrana externa
El sitio antigénico se localiza en tres amino azúcares de la fracción de carbohidrato del LOS
Antigénicamente muy estable en Bordetella pertussis independiente de su estado fisiológico
Existen raras variantes LOS que no poseen el sitio antigénico
Presenta reacciones cruzadas con sitios de B. bronchiseptica
Inmunofluorescencia Directa:
Toma de muestra
Aspirado Nasofaríngeo (ANF)
Torulado Nasofaríngeo
Preparación de frotis de aspirado nasofaríngeo
Fijación del frotis
Procedimiento de tinción
Lavado
Lectura de láminas
Inmunofluorescencia Directa B. pertussis
Reactivos IFD
Anticuerpo policlonal
Anticuerpo monoclonal
B.pertussis fluoresceina
B.parpertussis rodamina
Inmunofluorescencia directa
Lectura por microscopía de fluorescencia
Importante capacitación del operador de la técnica
Lectura manual, susceptible de automatizar en citometría de
flujo (gran costo)
Inmunofluorescencia Directa
Ventajas
• Permite un diagnóstico presuntivo rápido
• Bajo costo
Desventajas
• Sensibilidad muy variable, alrededor de 29-71%
• Su especificidad puede ser alta pero es operador dependiente como toda inmunofluorescencia.
• Gran reactividad cruzada con la flora de la cavidad oral, falsos positivos con H. influenzae no capsulados, difteroides, B. bronchiseptica
• Variable desempeño de los kits comerciales según la especificidad de los anticuerpos utilizados
McNicol et Al. J Clin Microbiol 1995; 33:2869-2871
Martin et Al Can J Infect Dis 1995;6:16-18
Mattoo et Al Clin Microbiol Rev 2005;18 326-382
Originalmente este tipo de estudio
se reservó para la evaluación de respuesta
inmune frente a vacunas.
Se utiliza rutinariamente para el diagnóstico de tos ferina
principalmente en Europa y Australia,
Desde el punto de vista de Salud Pública es útil para
confirmar el diagnóstico durante los brotes, en particular
en los casos en que no se realizaron cultivos.
Dado que la respuesta inmune a los antígenos de B.
pertussis toman un mayor tiempo, las pruebas de
serología se reservan principalmente para situaciones de
diagnóstico tardío, cuando el cultivo y la PCR pueden ya
no ser positivas.
Estudios Serológicos
Lab. Referencia Bordetella, CDC Atlanta.
Inmunoensayos
Anticuerpos Anti-pertussis
Existen disponibles técnicas de ELISA
para detectar IgM, IgG e IgA específicas
Determinación de anticuerpos contra Toxina pertusis
(TP), Hemaglutinina filamentosa (HF), Pertactina (PRN)
Análisis muestras pareadas, no siempre disponibilidad
de puntos de corte
La medición de IgA sérica específica anti TP, es exclusiva de la infección, no se eleva con la vacunación
IgA es poco sensible en lactantes, siendo una buena herramienta diagnóstica en individuos mayores vacunados, en particular adolescentes y adultos.
Comparación de respuesta frente a diversos antígenos para el diagnóstico
serológico de Coqueluche por medio de ELISA
Toxina Pertussis (PT) presentó mayor sensibilidad (92%)
Estudios Serológicos, Antígenos
Watanabe et Al. Clin Vacc Inmun 2006;13, 341-348
Estudios Serológicos
La serología suele ser reactiva a partir de la segunda semana de
iniciado los síntomas, hasta las 12 semanas
Protocolo CDC Atlanta IgG-TP
Mayor a 94 IU/mL: Infección Reciente
Mayor a 49 IU/mL: Respuesta indeterminada o zona gris, indicando
una posible infección reciente.
Menzies et Al. Clin Vacc Inm 2006;13:341-348
Ventajas
Permite el diagnóstico de Coqueluche reciente, en períodos clínicos que
fallan en su desempeño los otros métodos diagnósticos
Útil en el estudio de brotes, en especial para el diagnóstico retrospectivo
Técnica estandarizada y de fácil realización
Desventajas
Gran variedad de protocolos, que estudian diversos antígenos, los cuales
presentan diferente desempeño
Carencia de punto de corte para nuestra población (PT)
Necesidad de muestras pareadas en especial si no existe punto de corte
para la población específica
Interferencia de vacunación reciente (menor a tres meses) en algunos
protocolos
Reporte de cepa de B. pertussis europea con ausencia de PT
Menzies et Al. Clin Vacc Inm 2006;13:341-348
Bouchez et Al. Vaccine. 2009: 9;27(43):6034-41
Estudio Serológico Coqueluche
Diagnóstico de Coqueluche por Pruebas
Moleculares
• Detección del ADN de sitios específicos de B. pertussis
• No requiere que la bacteria este viable
• Altamente sensible y especifica
• Indicado en pacientes sintomáticos
Hibridación de genes blancos con sondas complementarias
Amplificación de genes específicos por Reacción de Polimerasa en
Cadena (PCR) Punto Final – Tiempo Real
Secuenciación del ADN y análisis a nivel de pares de bases
Cortes con enzimas de restricción y estudio del polimorfismo de los
fragmentos
–Fragmentos pequeños: RFLP
–Macro fragmentos: Electroforesis de campo pulsado (PFGE)
Técnicas de análisis de ácidos nucleicos
Diagnóstico Molecular Coqueluche
Diagnóstico Molecular Coqueluche
El diagnóstico de Coqueluche es complejo debido
a variaciones en la especificidad y sensibilidad de
los distintos métodos disponibles
Es fundamental la estandarización y la
implementación de un sistema de calidad que
permitan la obtención de resultados confiables y
datos comparables
Existen diversas guías internacionales que
establecen protocolos de diagnóstico y regulan
aspectos técnicos para la implementación de
técnicas de diagnostico molecular, en especial
para PCR en Tiempo Real
Es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta
el producto de la amplificación.
La formación del producto de
PCR se monitorea mientras se
lleva a cabo la amplificación.
Analiza ciclo a ciclo los cambios
de la señal fluorescente generada
durante las etapas del PCR.
¿Qué es PCR en tiempo real?
Coqueluche y PCR en Tiempo Real
Diagnóstico Molecular Coqueluche
Presencia de Signos y Síntomas de la Infección
Solo pacientes con clínica compatible deben ser estudiados.
El estudio de pacientes asintomáticos sólo eleva la ocurrencia de falsos
positivos. Los contactos asintomáticos de casos confirmados tampoco
deben ser estudiados
Tiempo Óptimo para la Prueba
Primeras tres semanas de iniciados los síntomas (alta concentración de
DNA en nasofaringe).
El tratamiento antimicrobiano puede generar un falso negativo, en
especial luego de 5 días de tratamiento
Toma de la Muestra Apropiada
Aspirado o hisopado del nasofaringe posterior
Hisopados de cavidad nasal o faringe tienen baja carga de DNA. Se
debe utilizar tórulas de Polyester (Dacron), rayón o nylon. El algodón y
alginato de calcio puede inhibir la reacción de PCR
Prevención Contaminación de las Muestras con DNA pertussis
Algunas vacunas poseen DNA detectable por PCR y puede contaminar
areas de toma de muestra si no se toman precauciones en la
preparación y administración de vacunas pertussis
Extremar cuidados con medios de transporte, de preferencia no líquidos
o semi sólidos. Utilizar sistemas cerrados para la aspiración
Adecuada Interpretación de Resultados
En general no existe una estricta estandarización el los laboratorios de
microbiología clínica. Los métodos, los genes blanco y los criterios de
interpretación pueden variar (cutoffs)
Niveles altos de ciclo umbral (Cycle threshold Ct) indican niveles bajos
de DNA blanco. Interpretación de estos casos deben ser realizados
cuidadosamente en el contexto clínico y epidemiológico
La secuencia Blanco más comúnmente utilizada es IS481
- Presente en múltiples copias en B. pertussis
- Discreta presencia en B. holmessii y B. bronchiseptica
- Es susceptible de presentar falsos positivos
La utilización de múltiples secuencias blanco aumentan
especificidad
Siempre se debe informar las secuencias blanco estudiadas
Guidance and Protocol for the Use of Real Time PCR in Laboratory Diagnosis of Human Infection with B. pertussis or B. parapertussis,
ECDC, 2012
PCR múltiple IS1001/IS481 positivo puede ser complementado por
un PCR para ptxA-pr:
IS1001 positivo: B. pertussis o B. bronchiseptica
IS481 positivo, ptxA-Pr negativo: Bordetella spp.
IS481 positivo, ptxA-Pr positivo: B. pertussis
IS481 positivo e IS1001 positivo: Posible co-infección con diferentes
especies de Bordetella
Diagnóstico Molecular Coqueluche
Guidance and Protocol for the Use of Real Time PCR in Laboratory Diagnosis of
Human Infection with B. pertussis or B. parapertussis, ECDC, 2012
Algoritmo de PCR
Laboratorio de Referencia Bordetella, CDC Atlanta
Conclusiones
CULTIVO
Gold Standard
Baja Sensibilidad
Siembra precoz es
crítica
Crecimiento lento
Utilidad Clínica
Limitada
IFD
Desempeño muy
variable
Baja Sensibilidad
Operador
Dependiente
Disponibilidad de Kits
con desempeño
Variable
Diagnóstico
Molecular (PCR)
Mejor Sensibilidad y
Especificidad
Técnica
Recomendada por
Centros
Internacionales
Importante
estandarización
Costo Elevado y
Brechas Técnicas en
el Sistema Público
Gracias
