COURS CHM 2971 Hiver 2005 Chimie bio-analytiqueesilbac1.esi.umontreal.ca/~thibaupi/CHM2971/DOC/CHM 2971 H06_GC… · - permanganate 3.2 La chromatographie sur couche mince (CCM ou

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COURS2

17 janvier 2006

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2.4 Définitions quantitatives

• Donc DM estplus importanteen GC (analytegazeux) qu’enLC (analyteliquide)

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• Cu : Résistance au transfert de masse (TM)– Facteur le plus important, autant en chromatographie liquide

qu’en chromatographie gazeuse. Englobe 3 processus:– TM dans la phase mobile– TM dans la phase mobile stagnante dans les pores– TM dans la phase stationnaire

– Caractérise le processus d’adsorption désorption– Il faut maintenir K = [A]S/[A]M constante


CM

CS

phase stationnaire

support

pore

Phase mobile

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xM

pxM D

dkfwC µµ

2)( ′⋅=

« CM »

xS

fxS Dk

dkqC µµ

)1(

2

′+

⋅′⋅=

« CS »w : constante deproportionnalitéf(k’): fonction décrivantl’affinité du soluté pour laphase mobiledp : la taille des particulesDM : coefficient de diffusion(dans la phase mobile)

q : un facteur géométrique qui dépend dela nature des micro- particules; q ~ 1/30 k’ : le facteur de capacité df : l’épaisseur de la phase stationnaire DS : est le coefficient de diffusion du solutédans la phase stationnaire

* H diminue si les particules du support solide sont petites (dp), si lefilm greffé (la phase stationnaire) est mince (df), si DM et DS grand.

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xSMx

u)CC(uBAH +++=

pd2H ⋅⋅= λx

MDµ

γ 12 ⋅⋅+ xM

2p

Dd)k(fw

µ′⋅

+ xS

f

Dkdkq

µ)1(

2

′+

⋅′⋅+


Équation de van Deemter

Chemins multiples

Diffusion longitudinal

Transfert de masse

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• Équation générale de la chromatographie :

Équation qui lie la R, N, k’ et α :

– On voit que :• N = f (R2)• R ↑ si α ↑• R ↑ si k’ ↑

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −

= '

'

11

4 B

B

kkNR

αα

Efficacité Sélectivité Facteur de capacité


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• Conditions limites :

– Manque d’efficacité : N → 0, on a que R → 0• Situation caractérisée par des pics larges• Solutions : limiter les volumes morts, optimiser la vitesse

linéaire moyenne,– Manque de sélectivité : α → 1, on a que R → 0

• Situation caractérisée par des pics minces, des temps derétention raisonnables mais, une mauvaise séparation.

• Solutions : changer la température ou la phase stationnaire– Manque d’affinité : k’B → 0, on a que R → 0

• Situation caractérisée par des temps de rétention trop courts• Solutions : diminuer la température ou changer la phase

stationnaire

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −

= '

'

11

4 B

B

kkNR

αα


xu

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3.0 Techniques dechromatographie

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Classification des techniques

3.1 Aperçu des différentestechniques utilises

ChromatographieDéfinition : séparation des constituants d’un mélange en fonctiondes vitesses auxquelles ils sont entraînés, par une phase mobileliquide ou gazeuse, à travers une phase stationnaire

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Analyse de peptides

3.1 Aperçu des différentestechniques utilises

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3.2 La chromatographie surcouche mince (CCM ou TLC)

PrincipeTechnique utilisant une plaque surlesquelle se trouve une couche dephase stationnaire:• Une goutte du mélange à séparerest déposée au bas de la plaque• Le bas de la plaque est trempédans un solvant (ou mélange) qui sedéplace vers le haut par capillarité• Les analytes migrent à différentesvitesses et se séparent

A B A+B

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s

cf d

dR ==solvant de front le par parcourue distance

composé un par parcourue distance

• La distance parcourue par uncomposé dépend de la force desinteractions avec la phasestationnaire par rapport à sadissolution dans la phase mobile

• On peut relier k’ et Rf parl’équation :

f

f

RR

k−

=1'

A B A+B

dA dB ds

S

Xf d

dR =


Rf

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• Support solide :– Verre– Aluminium– Plastique

• Phase stationnaire (df ≈ 150 µm) :– Alumine, Al2O3 ? polaire– Silice, SiO2 ? polaire– Phase inverse (C18, …) ? non-polaire

* Quand la phase stationnaire est polaire, la distance de migration estreliée à la polarité des composés. Les molécule peu polaires migrent plusloin avec le solvant, tandis que les molécules polaires sont plus retenuspar la phase stationnaire et migrent moins.

• Phase mobile :– Tout solvant ou mélange de solvants dans lequel les analytes sont

solubles et où il n’y a pas de réaction chimique (Ex. : chloroforme,méthanol, hexane, acétate d’éthyle)


Matériel

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• Visuelle- produit coloré

• Optique- lampe UV

• Formation de dérivés- Révélation avec réactifs :

- iode- acide sulfurique - ninhydrine- permanganate


Détection

incolore excitation UV

émission visible

coloré

Limite de détection ≈ 0,1 mM

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3.3 Chromatographie gazeuseSchéma de l’appareil

Tamis moléculaire

Restricteurde flux

Contrôleurde flux

ÉlectromètreDétecteur

Enregistreur:-Imprimante-Intégrateur-Ordinateur

Régulateur Injecteur

Colonne

Gaz

por

teu

r

Hyd

rogè

ne

Air

Injecteur

Four

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2.4 Chromatographie gazeusePhotographie de l’appareil

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• Injecteur : injection directe

3.3 Chromatographie gazeusePrincipaux constituants

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• Injecteur : Diviseur d’effluent (Split/splitless)

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• Échantillons :– État physique : liquide (0,1-10 µL) ou gaz (0,5-5 mL)– Stable thermiquement (350 °C)– Volatil– Polarité moyenne– Masse moléculaire < 600 g/mol

• Four– Température constante(mode isotherme)– Température variable avec le temps(mode programmation de température)


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• Gaz vecteur (phase mobile) :– Son rôle consiste à entraîner les solutés– Gaz chimiquement inerte (He, N2 ou H2)

• He le plus utilisé car compatible avec la plupart desdétecteurs en GC

– Choix dépend du détecteur– Caractéristiques : peu coûteux, peu dangereux et pur

• Impuretés qui doivent être enlevées• H2O : Tamis moléculaire• O2 : Systèmes commerciaux d’élimination catalytique• Hydrocarbures : Charbon activé


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• Effet de la nature des gaz sur la vitesse optimale de séparation

3.3 Chromatographie gazeusePhase mobile

Rouessac & Rouessac

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– He, N2 et H2 donnent environ le même HEPT optimal, mais à des débits(µ) différents

– Vitesse optimale augmente de N2 < He < H2

– Séparations les plus rapides avec H2 sans perte de résolution (HEPT↓)Or, Il est inconvénient car :

• réagit de manière catalytique avec les composés insaturés• incompatible avec la MS car détruit l’huile des pompes• gaz explosif lorsque présent à >4% vol.

– À plus haut débit, H2 et He donnent une meilleures R (HEPT ↓) que N2

• soluté se diffuse plus rapidement donc Cµ↓ ⇒ HEPT ↓ ⇒ R ↑– Si gaz plus lourd, il y a moins de diffusion, donc B/µ↓ ⇒ HEPT ↓ ⇒ R ↑– Viscosité : H2 < N2 < He

• résistance lors de la circulation dans un capillaire

3.3 Chromatographie gazeusePhase mobile

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10-600,5-15Flux (ml/min)

2-40,1-0,7Diamètre interne (mm)

10 µg/pic100 ng/picCapacité

1-100,1-8Épaisseur du film (µm)

4000250 000N (total moyen)

10-403-40Pression de tête (psig)

0,5-55-100Longueur (m)

support granulé inerteimprégné de phase stat.liquide (CGL) ouadsorbant actif (CGS)

tapisse la paroi interneWCOT (wall-coated),SCOT (support-coated)PLOT (porous-layer)

Phase stationnaire

verre, cuivre ou acierinoxydableSiO2 + polyimideColonne

Colonne garnieColonne capillaire

3.3 Chromatographie gazeuseType de colonne

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30 m x 0.53 mm x 0.88 µm DB-1 Type de phase stationnaire(L x d.i. x dp)


Porus Layer Open Tube

Wall Coated Open Tube

Support Coated Open Tube

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• Avantages des colonnes capillaires p/r colonnes remplies :– N augmente car A (chemins multiples) ? 0, HEPT ↓ ⇒ R ↑– Débit (µ) plus élevé = temps d’analyse plus courts

• Pas de particules paquetées dans la colonne (∆P ↓)– Plus grande sensibilité pour des petites quantités d’analyte– Pas pratique pour l’analyse de gaz inerte, inorganique, faible MM


Garnie CapillaireN ~ 642

N ~ 6400

Harris Fig. 24-3 et 24-4

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• Support (pour phase stationnaire) :– Grains de solide inactifs, fins et uniformes– Grande surface spécifique (> 1m2/g) et stabilité thermique– Retient le liquide non volatil (phase stat.)– 3 types :

• Supports poreux naturels : diatomée (CHROMOSORB)• Supports poreux artificiels : billes de silice poreuse (SPHÉROSIL)• Supports peu ou non poreux : billes de verre ou poudre de

Téflon


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• Caractéristiques élémentaires :– Solide (CGS) ou liquide (CGL) chimiquement inerte– Non volatil et non soluble dans la phase mobile– Uniformément distribué et stabilité thermique– Son rôle est de permettre un équilibre de distribution (KD, k’, α)

• Phases stat. solides : ADSORPTION (PLOT)– Alumine (Al2O3) : Séparation des hydrocarbures– Zéolite (Na12(Al12Si12O48) • 27 H2O (« molecular sieves ») :

Séparation des gaz comme H2, O2, N2, CO2 et CH4

• Phases stat. liquides : PARTAGE (WCOT et SCOT)– Non volatil à la T de l’analyse– Choix relié aux composés à séparer (« Qui se ressemble

s’assemble ») et à sa température limite d’utilisation (volatilité)

3.3 Chromatographie gazeusePhase stationnaire

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Structure (colonnes garnies etcapillaires):

- Squalane : référence nonpolaire (hydrocarbure MM↑)

- Huiles de silicone :- Faciles à synthétiser- Polarités variables- Stabilité thermique- Peu volatiles et greffables- Structure connue

- Carbowax (polyéthylèneglycol)- Carboran (T ~400oC)- Polymère silarylène

(T ~ 400oC)

3.3 GCPhase stationnaire

Harris Table 24-1

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3.3 Chromatographie gazeusePhase stationnaire

• Phase stat. greffée– Lié chimiquement à la surface du support

• Phase stat. réticulée– Réaction in situ sur la phase stat.

(polymérisation) créant de nouveaux liensplus robustes

Bénéfices– Minimise le bleeding (détachement

progressif de la phase stationnaire)– Augmente la résistance au solvant– Augmente la stabilité thermique– Augmente la durée de vie

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3.3 Chromatographie gazeuseEffet de la température

• En GC, la température (T) est un paramètredéterminant pour la rétention

• La chromatographie est un processus enpseudo équilibre :

mA

sA

ccK

=1- On sait que :

m

s

VVkK ×= ,

( )( ) s

m

m

s

VV

AmolnAmolnK ×=

2- Donc :

3- Thermodynamique :

4- En substituant K on isole ln k’ pour obtenir :

KRTG ln−=∆

s

m

VV

RTGk lnln , −

∆−=

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3.3 Chromatographie gazeuseEffet de la température

Si on considère un mélange de composés avec des Téb très différentes, lessolutés à faible Téb seront bien séparés au début de la programmation, et larétention des solutés à Téb plus élevés est amenée à un temps raisonnableà plus haute température. T↑ ? pression de vapeur↑ ? k’ ↓ ? tanalyse↓

Isotherme:150oC

Programmation de température:50oC à 250oC 8oC/min

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• Ordre d’élution en GC :– Le moteur général de l’élution est la température.– Pour des solutés très semblables (Téb similaires), les différentes

interactions avec la phase stationnaire permettront la séparation

• Indice de rétention :– Droite de Kovats : l’injection d’un mélange de n-alcanes dans

une colonne chromatographique dont le débit du gaz vecteur etla température sont stabilisés permet d’obtenir unchromatogramme dont les temps de rétention répondent àl’équation suivante :

3.3 Chromatographie gazeuseIndices de rétention

bantR +=,log (n)

n : nbre d’atomes de C(≥ 5 ou 6)a et b : coefficients numériques

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