Cours MB 3

III. Atteintes toxiques au niveau du génome : Génotoxicité

1. Génotoxicologie :

1. Définition2. Applications3. Etapes historiques4. De l’exposition à un agent à l’effet génétique :Facteurs qui influencent l’évaluation du risque génotoxique d’un produit donné :

1. Caractéristiques du mode de traitement2. Caractéristiques biologiques3. Méthodes

5. Effets des agents génotoxiques sur la molécule d’ADN proprement dite :a. Nature des dommages ou lésions suceptibles de se produire sur l’ADN après

exposition à un agent génotoxiqueb. Sources des dommages à l’ADN

1. Sources exogènes2. Sources endogènes

c. Les mécanismes de réparation de l’ADN :Les mécanismes conservatifs :. Glycosylases et méthyltransférases. Photoréactivation. Excision-resynthèse. Réparation post-réplicative (recombinaison)Les mécanismes fautifs. Le système SOS

6. Relation mutagénèse / cancérogénèse :Utilité de l’étude des maladies génétiques associées à une hypersensibilité à des agents génotoxiques :. Xeroderma pigmentosum (XP). Anémie de Fanconi (AF)

7. Conclusion

Génotoxicologie

Etapes historiques

. 1909 : Johannsen stabilité des gènes variabilité : « mutations spontanées »

. 1927 : Müller et Stadler induction de mutations par des rayons X.

. 1935 : Delbruck, Timoféeff-Ressousky relations dose-effet en terme de « théorie de la cible ».

. 1935-36 : Lea induction d’aberrations chromosomiques par les radiations ionisantes.

. 1937 : Demerec gènes mutateurs chez la Drosophile.

. 1942-1947 : Auerbach et Robson induction de mutations par les « gaz asphyxiants » d’usage militaire (moutardes azotées ou soufrées).

. 1944 : Hollaender effet mutagène du rayonnement UV (254 nm).

. 1950 à 1970 : Progrès génotoxicologie / biochimie des acides nucléiques, des protéines, de la génétique microbienne et des cellules eucaryotes.

. 1970-1980 : Tests de détection des agents mutagènes :Bactéries Salmonella typhimurium : test de Ames (1973) E. coliLevures : Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombeNeurosporaDrosophileCellules de hamster en cultureCellules humaines en cultureLymphocytes humains

. 1977 : création d’une commission internationale de protection de l’environnement contre les agents mutagènes et carcinogènes (ICPEMC).

. Novembre 1977 : 4 039 907 substances chimiques différentes.

. 1990 : Plus de 5 000 000 de substances chimiques recensées, dont ~ 1 % (60 000) sont d’usage courant.

. 2000 : 18 000 000 (100 000 commercialisées).

Mise en place de la Directive REACH :Registration, Evaluation and Authorization of CHemical compounds

1. Enregistrement Des substances fabriquées / importées au-delà d’1 t/an (15 à 20000 substances non

concernées) « Pas de données – pas de marché » Renforcement de la communication dans la chaine d’approvisionnement

2. Evaluation Des dossiers par l’agence ECHA De certaines substances « prioritaires » par les Etats Membres

3. Autorisation Interdiction et substitution à terme des substances « extrêmement préoccupantes » :

CMR (Cancérogènes, Mutagènes, Reprotoxiques : 1500 à 2000 substances), sans seuil de tonnage sauf pour certaines utilisations autorisées

4. RestrictionMaintien des restrictions existantes (ex directive 76/769 CE phtalates dans les jouets,

colorants azoïques dans les textiles, …)

De l’exposition à un agent à l’effet génétique

Etapes et processus Désignation Dimension

Exposition à l’agent Niveau d’esposition ppm, mg, mM

prémutagène ou dose administrée Pénétration

« uptake »

Absorption du Dose pharmacologique Conc° par

prémutagène unité de poids Transport

Activation

Détoxification

Présence du mutagène Dose tissus mM, mM/Hr

dans les tissus Transport

Diffusion

Mutagène au voisinage Dose dans la cible mM, mM/Hr

de l’ADN Production de

Lésions :

Alkylation

Intercalation

Etc…

Adduits dans l’ADN Dose moléculaire adduits/nucléotides Réparation

Fixation des

dommages :

Temps

d’expression

Mutation (au sens large) Réponses Fréquence des

biologiques mutations/survivants

mutations/gamètes

De l’exposition à un agent à l’effet génétique

Facteurs qui influencent l’évaluation du risque génotoxique d’un produit donné

1. Caractéristiques du mode de traitement / d’exposition :

. Dose

. Débit de la dose

. Fractionnement de la dose

. Nature du produit et le mode d’administration

. Présence ou absence d’O2

. Combinaison avec d’autres agents

2. Caractéristiques biologiques :

. Age

. Sexe

. Facteurs génétiques

. Type de tissu

. Type d’organe

. Espèce.


1. Génotoxicologie :

1. Définition2. Applications3. Etapes historiques4. De l’exposition à un agent à l’effet génétique :Facteurs qui influencent l’évaluation du risque génotoxique d’un produit donné :

1. Caractéristiques du mode de traitement2. Caractéristiques biologiques3. Méthodes

5. Effets des agents génotoxiques sur la molécule d’ADN proprement dite :a. Nature des dommages ou lésions suceptibles de se produire sur l’ADN après

exposition à un agent génotoxiqueb. Sources des dommages à l’ADN

1. Sources exogènes2. Sources endogènes

Principales lésions génotoxiques de l’ADN


Exemples de mutations et de leurs conséquences (par analogie avec des erreurs dans la copie d'un texte).

Gène normal On ne fait pas d'omelette sans casser des

oeufs. Conséquences

Substitution On ne sait pas d'omelette sans casser des

oeufs. Sans gravité

Substitution On ne fait pas d'omelette sans vasser des

oeufs. Perte de sens

Délétion 1 / On ne fas d'omelette sans casser des

oeufs. Perte de sens

2/ On ne fait pas d'omelete sans casser des

oeufs. Sans conséquence

Addition 1 / On ne fait pas d'omelette sans casser

des boeufs. Perte de sens

2/ On ne fait pas d'ommelette sans casser

des oeufs. Sans conséquence

Addition d'un "STOP"

On ne fait pas. d'omelette sans casser des oeufs.

Perte de sens

Fin de lecture

anticipée

Duplication On ne fait pait pas d'omelette sans casser

des oeufs. Perte de sens

Déplacement On ne fait pas d'oeufs. omelette sans

casser des Perte de sens

Échange On ne fait pas d'oeufs sans casser des

omelette. Perte de sens

Inversion On ne fait pas d'ressac snas ettelemo des

oeufs Perte de sens


Sources des dommages à l’ADN

1. Sources exogènes : Source Type de lésion Nombre d’adduits

induits par cellule . Bain de soleil Dimères de T (1) 60 à 80 000

(1 heure d’exposition)

. Tabagisme Adduits sur l’ADN (2) 100 à 2000 selon la

(20 cigarettes par jour) capacité d’activation

métabolique des HAP

(2) est moins bien réparé que (1)

. Travailleurs dans BaPdiol-époxyde 400 à 70 000

fours à charbon

. Travailleurs dans BaPdiol-époxyde 300 à 6500

fonderies

. Bruit de fond des Rupture simple brin 2/an

radiations naturelles

(0.2 rem/an : dose naturelle à Paris, > en montagne)

1. Sources endogènes : Source Type de lésions Lésions/cellule/jour

. T°C corporelle - Ruptures simples 20 000 à 40 000

(37°C) - Sites apuriniques (A, G) 10 000

- Sites apyrimidiques (T, C) 500

- Déamination (de A ouC) 100 à 300

. Radicaux libres - Dommages de bases 10 000

- Thymine glycol 270

- Thymidine glycol 70

- 5-hydroxyméthyluracile 620

- 8-hydroxydéoxyguanosine 168

- Ruptures simples, doubles,

pontages, … ?

. Métabolismes - Adduits glucose 3

divers - N7CH3G 4 000

- N3CH3A 600

- O6CH3G 10 à 30

- Pontages ADN/ADN et

ADN/protéines ?

2.

Par comparaison :

►Nombre total de gènes chez l’homme de 20-25 000 à 40 000

► Seulement 5% de l’ADN génomique est transcrit

► Environ 40% du génome humain est constitué de séquences répétées

Génotoxicité

c. Les mécanismes de réparation de l’ADN :Les mécanismes conservatifs :. Glycosylases et méthyltransférases. Photoréactivation. Excision-resynthèse. Réparation post-réplicative (recombinaison)Les mécanismes fautifs. Le système SOS


7. Conclusion

ADN polymérase

Endonucléases

Exonucléases

Polynucléotide ligase

Enzymes de restriction

c. Les mécanismes de réparation de l’ADN :Les mécanismes conservatifs :. Insérases, glycosylases et méthyltransférases. Photoréactivation. Excision-resynthèse. Réparation post-réplicative (recombinaison)Les mécanismes fautifs. Le système SOS


7. Conclusion

Reconnaissance du défaut par l’enzyme et coupure du dimère

sous l’action de la lumière visible (320-500 nm)

Le brin d’ADN est corrigé et l’enzyme est libérée

(254 nm)

Réparation par excision-resynthèse(ex chez E. coli)

Réparation post-réplicative par recombinaison



7. Conclusion

Schéma de fonctionnement de la réponse SOS

Mécanisme moléculaire de la mutagenèse SOS



7. Conclusion

Xeroderma pigmentosum : mélanose lenticulaire progressive

100%

% de survie

Dose UV

Phénotype sauvage

Mutant XP

Fréquence de mutation après irradiation in vitro aux rayons UVC d'un ADN plasmidique puis réplication dans des cellules normales et des cellules XP

déficientes en réparation. d'après A. Sarasin

Anémie de Fanconi

Principales caractéristiques cliniques de la forme classique :

Anomalies de la pigmentation de la peau : dans la forme commune du XP, les premiers signes apparaissent dès 1 à 2 ans. C'est d'abord une hypersensibilité aux rayons UV du soleil (érythèmes intenses), puis des altérations de la peau exposée (sécheresse cutanée, taches hyperpigmentées, kératoses).

Apparition de tumeurs : elles sont cutanées ou ophtalmologiques et apparaissent dès l'âge de 8 ans. La fréquence des cancers cutanés est multipliée par 4800 chez les sujets de moins de 20 ans par rapport à un groupe témoin.

Anomalies ophtalmologiques : ce sont des inflammations de la conjonctive et de la cornée qui se manifestent dès l'âge de 4 ans avec quelquefois des mélanomes sur les paupières.

Anomalies neurologiques : 20% des malades XP ont une perte progressive de neurones du cortex cérébral entrainant des troubles neurologiques sévères. Ceci s'expliquerait par un déficit de l'activité de la catalase (enzyme de détoxification cellulaire) des cellules nerveuses.

Evolution : l'espérance de vie des patients XP est réduite de 30 ans en moyenne par rapport à une population témoin.


« Les enfants de la lune »


Forme Variant :

Hypersensibilité à la lumière, mais pas de syndromes neurologiques ;

Développement d’épithéliomas de la peau mais avec développement de cancer plus tardifs, vers 15 à 20 ans, avec survie jusqu’à environ 45 ans.

Classique : défectif dans la reconnaissance de la lésion

Variant : réparation post-réplicative défectueuse

13 gènes contrôlent cette maladie(hybridation somatique ou complémentation)

Anémie de Fanconi

Hypersensibilité à des agents réalisant des pontages interbrins dans l’ADN ;

Petite taille des individus ;

Anémie aplasique (arrêt ou insuffisance de développement) et anomalie de la moëlle osseuse congénitales ;

Retardation mentale et pigmentations anormales de la peau ;

Forte disposition aux cancers, en particulier aux leucémies.

La rupture chromosomique spontanée et la prédisposition à la leucémie sont des traits caractéristiques de cette maladie. Il y a au moins 7 groupes de complémentation dans l'anémie Fanconi : FANCA, FANCB, FANCC, FANCD, FANCE, FANCF, FANCG.

Anomalies dans la production de facteurs de croissance spécifiques (ex : interleukine-6), mais aussi en facteur nécrosant des tumeurs (TNF)


2. Cancérogénèse :

1. Les différentes étapes de la cancérogénèse :a. Phase d’initiationb. Phase de promotionc. Phase de progressiond. Phase d’invasion

2. Mécanismes épigénétiques de la cancérogénèse :

Modulation du fonctionnement cellulaire :1. Inhibition de la communication intercellulaire en cancérogénèse épigénétique2. Altérations du cytosquelette en cancérogénèse épigénétique3. Modulation de l’expression de gènes dans la cancérogénèse épigénétique

Définition :

Une cellule cancéreuse est une cellule qui a définitivement échappé aux mécanismes de contrôle de la

division cellulaire et qui, par expansion clonale (clone = colonie de cellules issues par multiplication d’une seule

cellule), va se multiplier de façon anarchique, ne répondant plus à l’état d’homéostasie qui règne

normalement au niveau tant cellulaire et tissulaire qu’au niveau de l’individu.

4 grandes familles de cancer :

-Les carcinomes : les plus fréquents (plus de 85%). Ils concernent les tissus

épithéliaux, c’est-à-dire des tissus minces formés d’une ou plusieurs couches de cellules jointives.

-Les Sarcomes concernent les tissus conjonctifs

de soutien de la structure de l’organisme, qu’ils soient communs ou spécialisés (par exemple osseux, cartilagineux, musculaires, adipeux, vasculaires…). Très rares (moins de 1%).

-Les lymphomes concernent le tissu hématopoïétique: moelle rouge des os

où les cellules du sang se forment et tissu lymphoïde ; se développent à partir des cellules du système immunitaire, le plussouvent dans les ganglions lymphatiques.

- Les Leucémies concernent les tissus de la moelle osseuse responsable de la

production des globules blancs.

Schéma de la cancérisation de la peau de souris en deux étapes selon Berenblum et Shubik (1947)

DMBA : (7,12)-Di-Méthyl-Benz(a)Anthracène

TPA : 12-o-TétradécanoylPhorbol-13-Acétate(ester de phorbol)

LES ONCOGNES

Le mot oncogène désigne une multitude de gènes régulateurs de la croissance pouvant contribuer au développement du cancer après des activations très variées.

OncogèneEspèce

d'origineTumeuranimale

Tumeurhumaine

Facteurs de croissancesisint-2ks3hst

singesourishommehomme

sarcomesarcome

--

Gliome, fibrosarcomeCancer du seinSarcome de KaposiCancer de l'estomac

Récepteurs membranaires à activité protéine kinasefmserbbkitrosneumettrk

chatpouletchat

poulethommehommehomme

sarcomeerythroblastose

sarcomesarcome

---

SarcomeErythroblastoseSarcomeSarcomeNeuroblastomeOstéosarcomeColon

Les oncogènes sont nommés en général avec trois lettres minuscules, suivant un préfixe rappelant leur origine cellulaire ou virale : exemple c-myc, c-jun, v-src, v-abl etc.

OncogèneEspèce

d'origineTumeuranimale

Tumeurhumaine

Tyrosines kinases cytoplasmiquessrcyesfgrfpsfesabl

pouletpouletchat

pouletchat

souris

sarcome de Rouss. Yamaguchis. Rasheeds. Fujinamis. Snyder

leucémie Abelson

SarcomeSarcomeSarcomeSarcomeSarcomeLeucémie

Sérine Thréonine Kinasemosraf

sourissouris

sarcomeleucémie

sarcomesarcome

Famille Ras H-rasK-rasN-ras

ratrat

homme

s. de Harveys de Kirsten

-

multiplesmultiplesneuroblastome

Facteurs nucléaires de transcriptionc-mycN-mycL-mycmybfosskijunrel etserba

poulethommehommepouletsourispouletpoulet

oie pouletpoulet

myélomatose--

myéloblastosesarcome fbj

s Sloan Ketteringleucémielymphome leucémie

erythroblastose

multiplesneuroblastomecancer du poumonleucémies,nombreuxcancers épithéliauxnombreuxleucémie leucémieérythroblastose

(GTP : Guanosine Tri Phosphate)

LES GENES SUPPRESSEURS DE TUMEURS

On peut distinguer deux types de fonctions aux gènes suppresseurs :

-La première est celle de gardien de l’intégrité du matériel génétique ou caretakers. L’implication de ces gènes est assez faible, car elle doit être suivie de

trois autres événements pour aboutir à un cancer : mutation de l’autre allèle, complétant le déficit du système de réparation (ou encore absence de cet allèle),

puis mutations du gène d’arrêt ou gatekeeper.

- La seconde est celle des gènes d’arrêt du développement : p53, pRb, APC, NF1, qui empêchent la progression dans le cycle cellulaire s’ils n’ont pas l’information

correcte des gènes caretakers.

FONCTIONS DES GENES SUPPRESSEURS DE TUMEUR :

Ce sont des gènes dont l’inactivation est impliquée dans le processus de transformation maligne.

•CONTROLE DU CYCLE CELLULAIRE ex: p16/INK4, p21, Rb

•MAINTIEN DE LA STABILITE DU GENOME ex: p53, ATM

•REPARATION DE L’ADN ex: BRCA1, BRCA2

•GENES PRO-APOPTOTIQUES ex: p53

Le gène p53La protéine p53 présente un rôle charnière entre le développement de tumeur, l'arrêt du

cycle cellulaire, la différenciation et l'apoptose.

Les principaux virus à ADN, responsables de tumeurs, semblent le faire par l'intermédiaire d'un complexe spécifique avec la protéine p53.

Le gène p53 est probablement impliqué, soit directement, soit indirectement (localisation cytoplasmique de la protéine) dans plus de la moitié des tumeurs humaines.

Gène suppresseur LocusFonction (suspectée)

Rb 13 q 14Protéine p105

Facteur de transcription

P 53 17 p 11.1 Protéine nucléaire

APCDCCWT1

BRCA1

5 q18 q 21.311 p 13

17 q 21-22

Protéine cytosqueletteProtéine membranaire – CAM

Facteur de transcriptionFacteur de transcription

MTS1 1p et 9p Inhibiteurs des cdk

MSH2MLH1PMS1PMS2

2p3p2q7q

Intégrité du génomeRéparation des mésappariements

?


Ce qui fait le poison, c’est la dose!!!


L’instabilité génétique est la caractéristique fondamentale de la cellule cancéreuse, capable à tout moment d’évolueret de générer denouveaux clones avec des avantagessélectifs dans toutes les conditions.

1. Altération des systèmes de réparation de l'ADN qui favorise la survenuede lésions génétiques

2. Altération des gènes impliqués dans la surveillance du génome et larégulation de l'apoptose qui autorisent la survie de cellules anormales

3. Avantage de prolifération et de survie qui augmente le nombre de divisionscellulaires et la probabilité de mutations

4. Instabilité caryotypique résultant de l'altération des mécanismes derecombinaison et de ségrégation des chromosomes lors de la mitose

Quels sont les facteurs qui peuvent moduler

la phase d’invasion ?

Perte des propriétés d’adhésivité des cellules

Importance des facteurs angiogéniques

Mise en évidence d’une métalloptotéase à Zn

(stromélysine 3) capable de couper les

structures servant de barrière aux cellules

cancéreuses

Certains facteurs sont capables de retarder,

voire d’empêcher le déroulement de l’apoptose

Importance de la membrane basale

La membrane basale constitue le premier rempart contre l’invasion tumorale. Il s’agit d’une spécialisation de la matrice extracellulaire, se présentant comme une

mince couche de 50 à 200 nm d’épaisseur, limitant entièrement les structures épithéliales et vasculaires. Elle forme une frontière avec le tissu conjonctif.

Les membranes basales sont constituées essentiellement de laminine, de collagène de type IV, de fibronectine, d’héparane sulfate protéoglycane. La laminine, molécule volumineuse de poids

moléculaire de 850 000, en forme de croix, intervient dans l’ancrage à la membrane basale des cellules épithéliales et endothéliales, grâce à des récepteurs spécifiques.

Représentation schématique de la structure de la membrane basale Les croix représentent les molécules de laminine, les échelles les molécules de protéoglycanes, les éléments en étoile la fibronectine, et la triple chaîne du collagène.

Atteintes toxiques au niveau du génome : Génotoxicité

2. Cancérogénèse :

1. Les différentes étapes de la cancérogénèse :a. Phase d’initiationb. Phase de promotionc. Phase de progressiond. Phase d’invasion

2. Mécanismes épigénétiques de la cancérogénèse :

Modulation du fonctionnement cellulaire :1. Inhibition de la communication intercellulaire en cancérogénèse épigénétique2. Altérations du cytosquelette en cancérogénèse épigénétique3. Modulation de l’expression de gènes dans la cancérogénèse épigénétique

Altérations de l’actine provoquées par un promoteur tumoral, le phénobarbital dans des hépatocytes de rat

Hépatocytes témoins Hépatocytes + phénobarbital 1mM pendant 1h

Altérations de l’actine provoquées par un promoteur tumoral, le phénobarbital dans des hépatocytes de rat

Hépatocytes + phénobarbital 1 mM pendant 24h

Hépatocytes + phénobarbital 1 mM pendant 24h + période de récupération de 24h

Modulation de l’expression des gènes

1. Proto-oncogènes :

DMBA + TPA activation du gène Ha-ras (précoce, puis surexpression) Cellules Balbc/3T3 + TPA activation du gène c-fos, puis

c-myc PB, Biliverdine surexpression du gène Ki-ras, myc et fos

2. Gène de l’ornithine-décarboxylase :

DMBA + TPA induction de l’activité ODC

3. Isozymes du Cytochrome P-450 :

PB, Polychlorobiphényles, Dioxine, DDT, Dieldrine,

proliférateurs de péroxysomes expression d’isozymes

spécifiques du P-450 + expression des enzymes de phase I

et II liaison des métabolites à des récepteurs de la superfamille des récepteurs

stéroïdiens facteurs de transcription impliqués dans croissance, différenciation

et prolifération cellulaire cancérogenèse

Documents

Cours MB 3