CRISPR ゲノム編集ワークフロー

CRISPR ゲノム編集ワークフロー

Application Insights

多彩で効率的なワークフロー

遺伝子を編集する技術には、その機能、そして細胞の生態を変える力があります。治療的研究の発見および前臨床段階のための新規細胞株や改良動物モデルの作成から、CAR-T細胞療法のような実用的治療法創出まで、CRISPRゲノム編集は、科学を急速に前進させることを可能にしています。ゲノム編集の下流のアプリケーションは多数存在し、研究開発の実施方法や病気の治療と治療の方法も変わっています。ここではPC3癌細胞株を用いたゲノム編集における4つの主要なステップをガイドするワークフローを紹介します。今回、細胞接着および細胞シグナリングにおいての役割が知られている遺伝子 ICAM-1を破壊するために、GFPおよびピューロマイシン耐性遺伝子もノックインさせる、遺伝子ノックアウト戦略を設計しました。GFPおよびピューロマイシン耐性は、遺伝子破壊の成功を追跡することを容易にするためのマーカーです。今回の例ではノックイン戦略を選択しましたが、このワークフローは他のほとんどのゲノム編集実験にも適用できます。ICAM-1ノックアウト細胞株の生成とその後の解析を実施する際に、バイオ・ラッド製品が各段階でどのようにゲノム編集をサポートし、実験を加速するかをご参照ください。

| 2 ゲノム編集ワークフロー

多彩で効率的なワークフロー

TransFectin™Lipid Reagents

Gene Pulser Xcell™エレクトロポレーションシステム

ZOE™ 蛍光セルイメージャーS3e™ セルソーター

CFXリアルタイム PCR解析システムQX200™ Droplet Digital™ PCRシステム

Bio-Plex® 200システムCFX AutomationシステムⅡ

下流の分析

ゲノム編集結果の確認

トランスフェクション

濃縮とシングルセル分離

3

4

1

2

BIO-RADʼS CRISPR GENE EDITING WORKFLOW:GENERATING AND ANALYZING ICAM-1 KNOCKOUT CELL LINES

Bio-Rad Laboratories | 3

定量ウェスタンV3ワークフロー

ゲノム編集戦略を計画した後、CRISPRゲノム編集ワークフローの最初のステップは、”動物/ヒト”細胞や”腫瘍由来/野生型”細胞など、目的の細胞に合わせてCRISPR-Cas9システムを導入する最良の方法を選定することです。転写効率およびその後の細胞生存率は、どの方法を用いるかを検討する際に非常に重要な目安です。バイオ・ラッドでは、いくつかの遺伝子導入の選択肢をご提供しています。業界をリードするGene Pulser Xcell™エレクトロポレーションシステムは、700を超える論文で使用されており、20年以上にわたり幅広い研究をサポートしています。リポフェクションが最も効率的であることが考えられる場合には、TransFectin™Lipid Reagentにより初代細胞株でも穏やかで高効率なリポフェクションという選択肢があります。ZOE™蛍光セルイメージャーを使用すると、トランスフェクションの効率と細胞の状態・形態をモニタリングすることができます。TC20全自動セルカウンターは、トランスフェクションの複数の段階で細胞数計測を自動化し、実験のすべてのステップで細胞数計測の精度を向上させます。GFPおよびピューロマイシン耐性遺伝子を含むドナーテンプレートのノックインを用いてICAM-1を破壊するノックアウト戦略を設計しました。 TransFectin™ Lipid ReagentまたはGene Pulser Xcellシステムのいずれかを用いてPC3細胞をトランスフェクションしました。トランスフェクション成功の最初の指標としてGFP蛍光を利用しました。

トランスフェクション

エレクトロポレーションシステム

Chen S et al. (2016). Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem 291, 14,457‒14,467.

信頼できるトランスフェクションツール

Gene Pulser Xcell™

ZOE™ 蛍光セルイメージャー

TransFectin™Lipid Reagents

TC20™ セルカウンター

成功事例：CRISPR RNPの受精卵へのエレクトロポレーション(CRISPR-EZ)

Gene Pulser Xcellシステムを使用して、ハイスループットなin vivoゲノム編集を高効率で行って

います（Chen S et al. 2016)。CRISPR-EZはin vivoゲノム編集においてマイクロインジェクションを

置き換える可能性があるシンプルで経済的、ハイスループットかつ高効率な方法です。

| 4 ゲノム編集ワークフロー

トランスフェクション

Bio-Rad Laboratories | 5

トランスフェクション効率の最適化

A

B

10％ HyClone FBS（GE Hea l thca re）、1％ペニシリン - ストレプトマイ

シン（GIBCO）を含むHam ’s F-12 Nu t r i en t M i x（GIBCO）中でPC3細

胞（ATCC）を培養し、37℃および5％ CO 2で7日間維持した。トランスフェ

クションの前に、細胞をTC 2 0全自動セルカウンターを用いて計数した。

ICAM-1（Or iGene）を標的とする2つの異なるCRISPR-Cas9プラスミド

の1つおよび左右の同種アームならびにG F P - P u r o機能カセット（O r i -

Gene）を含むドナーベクターを、Gene Pu lser Xce l lシステムによるエレク

トロポレーションまたはTransFect in™ L ip id Reagentによるリポフェク

ションにて導入した。エレクトロポレーション処理およびリポフェクション

処理された細胞の培地を、処理して24時間後に新鮮な増殖培地と交換した。

ZOE™蛍光セルイメージャーを用いて、トランスフェクションされた培養物

中のG F P発現を評価し、プラスミドが細胞に目的通りに導入されたことを

示した。（A）Gene Pu lse r Xce l l システムを用いて、トランスフェクション

から24時間後のP C 3細胞をZO E ™蛍光セルイメージャーで画像化した

重ね合わせ画像および（B）GFPチャネル。TransFect inでも、Gene Pu lse r

Xce l l システムと同等のレベルのトランスフェクション効率を示した（データ

は示していない）。

細胞分取と30日間の短縮化

成功事例：解釈が難しい異種細胞集団を解析している場合でも、均質な細胞株の拡大と作製のためにゲノム編集細胞

を単離しようとしている場合でも、信頼性の高いシングルセルソーティングは強力かつ重要な第一歩です。

バイオ・ラッドのBulletin 6853では、TC20™ セルカウンターと ZOE™ セルイメージャーを使用して、S3e™

セルソーターのシングルセルソーティングの信頼性を検証するシンプルな4ステップワークフローを示しています。

詳細については bio-rad.com/CRISPR1 にアクセスしてください。

濃縮とシングルセル分離

細胞をトランスフェクションしたら、目的の細胞を濃縮する必要があります。このステップにより、ワークフローが高速化され、試薬や消耗品の不要な消費が削減されます。濃縮はまた、細胞の培養継代の数を減少させ、その後の分析のために健康な細胞を確保することができます。S3e™ セルソーターとZOE™ 蛍光セルイメージャーを使用することで、共通機器を利用せずに各研究室の実験ベンチ上で簡便に細胞濃縮を行うことができ、ワークフローを30日短縮することができます。

S3e™セルソーターを用いてGFP陽性PC3細胞を選別することにより、目的通りトランスフェクトされた細胞を濃縮しました。濃縮およびその後のピューロマイシン選択の後、S3e™セルソーターを用いて、その後のためにGFP陽性ピューロマイシン耐性細胞をシングルセルで単離をしました。ZOE™蛍光セルイメージャーで、ピューロマイシン処理前後の濃縮を迅速に確認しました。

S3e™ セルソーター

ZOE™ セルイメージャー

| 6 ゲノム編集ワークフロー

濃縮とシングルセル分離

Bio-Rad Laboratories | 7

バイオ・ラッドのワークフロー 従来のワークフロー

14DAYS POSTPUROMYCINADDITION

14DAYS POSTPUROMYCINADDITION

56

84

14

14

14

77

TRANSFECT

ENRICHIsolate only GFP-positive cells

PUROMYCIN SELECTION

POST PUROMYCIN SELECTION

POST PUROMYCIN SELECTION

SINGLE-CELL SORTING

TRANSFECT

PUROMYCIN SELECTION

MANUAL SINGLE-CELLISOLATION OR DILUTION

DAYS

DAYS

DAYS

DAYS

DAYS

DAYS

DAYS

DAYS

DAYS

7

28

35

14

+

DAYS

TOTAL

TOTAL

DAYS

+

加速された標的細胞濃縮エレクトロポレーションまたはTransFectin Lipid Reagentのいずれかによってトランスフェクトされた細胞を14日間培養した。生存GFP陽性細胞を、S3e™ セルソーターを用いて混合細胞から選別した。14日後に濃縮した細胞をピューロマイシン選択し、ゲノム編集細胞をさらに選択した。 処理後のGFP陽性細胞をS3e™セルソーターを用いてシングルセルソーティングした。シングルセル単離およびGFP蛍光は、ZOE™蛍光セルイメージャーを用いて確認した。その後、細胞を、さらなる分析のために80％コンフルエントになるまで2週間継代した。 この加速されたワークフローは、従来（84日間以上）よりも短い56日間でICAM-1ノックアウト細胞株クローンのコンフルエントな培養形成を可能にした。

信頼できる方法でゲノム編集を確認

成功事例：

ゲノム編集結果の確認

WTNHEJ

ZOE™セルイメージャー

QX200™ Droplet

Digital™PCRシステム

解析システム

目的の細胞を濃縮したら、標的細胞を正常にゲノム編集できたことを確認して、下流のアッセイに移ります。ゲノム上で編集部位を直接検出する方法か、細胞またはプロテオームでの間接的な検出方法によって確認することができます。PCRベースの手法は、高精度かつ高感度な検出および定量の結果を提供します。ハイ・フィデリティPCR、ドロップレットデジタルPCR（ddPCR™）、リアルタイムPCR（qPCR）、および高分解能融解分析（High Resolution Melt Analysis, HRMA）により、NHEJおよびHDR編集の解析が可能です。 CFXリアルタイムPCR解析システムは、定量PCRおよびHRMA用の汎用プラットフォームです。標準PCRおよびシークエンシング検証のための、iProof™ High-Fidelity DNAポリメラーゼは取り込みエラーを最小限に抑えることができます。編集効率が低い場合、ddPCR技術は比類のない精度で対立遺伝子の変化を、0.5％以下の頻度でも検出が可能です。ZOE™蛍光セルイメージャーは実験ベンチ上で、ノックインされたことや新たに編集した細胞のタンパク質発現がノックアウトされたことを確認できます。定量ウェスタンV3ワークフローは他のウェスタンブロット手法よりも迅速かつ正確に、発現されたタンパク質を定量的に検出します。検証済みPrecisionAb™ ウェスタンブロッティング抗体を組み込むことで、実験から不確実性を取り除くこともできます。ゲノム編集を確認するために、ZOE™ 蛍光セルイメージャーおよび定量ウェスタンV3ワークフローを使用しました。ddPCRやqPCRを使用したHRMA（データは示されていません）のような直接的方法と同時に、このような間接的方法でゲノム編集を確認することで、解析を先に進めることに確信を持つことができます。

バイオ・ラッドのBulletin6712には、ゲノム編集された対立遺伝子の検出とCRISPRおよびTALENでのゲノム編集プロトコール最適化のための迅速で費用対効果が高い、ハイスループットのドロップレットデジタルPCRについて記載されています。この方法はゲノム編集の成功率が低い初代細胞および多能性幹細胞を使用する場合に特に有用です。詳細については bio-rad.com/CRISPR2 にアクセスしてください。

CFXリアルタイムPCR

定量ウェスタンV3ワークフロー

| 8 ゲノム編集ワークフロー

ゲノム編集結果の確認

Bio-Rad Laboratories | 9

免疫細胞化学(ICC)によるゲノム編集の確認 ウェスタンブロットによるゲノム編集の確認

A

B

コントロールおよび編集細胞を、抗 ICAM-1抗体（赤色）およびDAPI（青色）含有マウント媒体で染色する48時間前に顕微鏡スライド上に播種した。スライドは、ZOE蛍光セルイメージャーを使用して画像化された。編集細胞はGFPの発現を示すが、ICAM-1発現は示さない。 (A)コントロールPC3細胞の免疫染色は、豊富なICAM-1発現を示す。 (B)CRISPR編集PC3細胞は ICAM-1発現を失い、安定したGFP発現を獲得した。

コントロールおよび編集細胞をプロテアーゼ阻害剤カクテル（V WR）を含有するRIPAバッファー（V WR）に氷上で溶解し、超音波処理し、スピンダウンして微粒子を除去した。溶解物を再び遠心分離し、上清をβ-メルカプトエタノール（カタログ番号1610710）を含む4×Laemmliサンプルバッファー（カタログ番号1610747）で希釈し、12％アクリルアミドプレキャストSta in-Freeゲルで流した。トランスブロットTu rbo™トランスファーシステム（カタログ番号1704150JA）を用いてタンパク質を100 Vで7分間ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンを1％カゼインを含むTBSでブロックし、次いでPBSTで洗浄した。ICAM-1を認識する抗CD54抗体（カタログ番号VPA00014）/ヤギ抗ウサギ I gG Sta rBr ight™ Blue 700（カタログ番号12004161）（赤色）、抗GAPDH hFAB™ ローダミン標識一次抗体（カタログ番号12004167）（青色）、および抗turboGFP一次抗体（OrigGene）（緑色）を用いて検出した。ChemiDoc™ Touch MPイメージングシステムで画像化した。

Bio-Plex®200システム

定量ウェスタンV3ワークフロー

ZE5™ Cell Analyzer

QX200™ Droplet Digital™PCRシステム

CFX AutomationシステムⅡ

成功事例：

下流の分析 分析と導き出される発見

本稿では、CRISPR Gene Editingワークフローにフローサイトメトリーを組み込むことで、結果が出るまでの時間が短縮されることを示しました。バイオ・ラッドのbulletin 6961は、実験のさらなる詳細と、ICAM-1ノックアウト研究の追加結果を示しています。詳細については bio-rad.com/CRISPR3 にアクセスしてください。

細胞が正しく編集されたことを確認したら、その表現型を調べ始めることができます。ターゲットまたはリード化合物の発見と検証のために、細胞ベースのアッセイの一部として薬物を使用して発現システムへの影響を調べる場合もあります。バイオ・ラッドは、ゲノム、細胞、プロテオームレベルで新しく生成された細胞株を研究するためのツールを提供しています。ハイスループットの遺伝子発現解析のためには、プレデザインかつ検証済みで、さらにカスタマイズ可能なツールとして、CFX Automationシステム、PrimePCR™ Gene Ex-pressionアッセイとパネル、そしてリアルタイムPCR解析システム用CFX Maestro™ソフトウェアを提供しています。より高感度な絶対定量を行うには、プレデザインもしくはカスタムのddPCR™ Genome Editing DetectionアッセイとドロップレットデジタルPCRシステムをご使用ください。ZE5™ Cell Analyzerを使用すると、細胞レベルでの編集の効果を調べることができます。この柔軟なセルアナライザーは、初心者も専門家も同じように操作できます。最大30パラメーターの実験に対応しています。この高レベルのマルチプレックス化により、編集細胞そのものや様々なアッセイ条件に対する細胞の応答を詳細に特徴付けることができます。定量ウェスタンV3ワークフローとバリデーションされたBio-Plex マルチプレックスアッセイを使用したマルチプレックスプロテオーム解析により、新しい細胞株のプロテオームプロファイルの全体像を把握することができます。検証済みPrecisionAb™ウェスタンブロッティング抗体や、疾患特異的またはカスタマイズ可能なマルチプレックスBio-Plexアッセイにより、高感度で信頼性の高い結果が保証されます。ICAM-1ノックアウト細胞を特徴付けるために、PrimePCR遺伝子発現パネルおよびCFX Maestroソフトウェアを使用して、遺伝子発現の変化を評価しました。

| 10 ゲノム編集ワークフロー

下流の分析

Bio-Rad Laboratories | 11

TNF-α処理に応答したコントロールおよび編集細胞における遺伝子発現解析

B

GENE1 SPP12 SELL3 VCAN4 LAMB35 MMP106 MMP17 SGCE8 MMP139 ITGB110 LAMB111 ADAMTS112 SPARC13 ECM14 ITGB4

C

543210

Rela

tive

norm

alize

d ex

pres

sion

A

27

25

23

21

2‒1

2‒3

2‒5

2‒7

2‒9

2‒11

2‒13

2‒15

2‒15 2‒13 2‒10 2‒7 2‒4 2‒1 22 25

ITGA7ITGB1

COL7A1CD44

COL5A1KAL1

ITGA1MMP15

COL12A1THBS3ITGB5SPG7

MMP16LAMB1

ADAMTS1ITGB4TIMP2ITGA6

CTNND2CDH1VCANITGAV

MMP14LAMB3

COL6A2ECM1ITGA2

COL6A1MMP10ICAM1MMP1

MMP13TIMP1

PC3 + TNF-α

PC3

Edited PC3 + TNF-α

Edited PC3

コントロールおよび編集細胞をT NF-αで処理して I CA M-1発現を刺激した。細胞を、細胞培養から直接gDNAを含まないRNAの調製を可能にするS ing l eShot™ Ce l l Lys i s K i t（カタログ番号1725080）を用いて溶解した。細胞溶解液を、3つの異なるP r i m e P C R P re d e s i g n e d 3 8 4-we l l パスウェイプレート（Ma le U rogen i t a l D i seases T i e r1、E x t race l l u l a r Ma t r i x、およびNeop lasm Metas ta-s i s）に添加した。リアルタイムPCRにより962個の標的をスクリーニングし、CF X384 Touch™リアルタイムP C R解析システム（カタログ番号18 5 5 4 8 4 J1）を用いて遺伝子発現の変化を検出し、結果をCF X Maest ro ソフトウェア（カタログ番号12004110）を用いて分析した。(A )相対正規化発現プロットは、TNF-α処理に応答する野生型PC3と比較して、ゲノム編集細胞におけるI C A M -1発現の変化はほとんどまたは全く示さない。これらの結果は、ゲノム編集細胞が低レベルのICAM-1発現を保持していることも示している。（B）散布図によって発現変化を異なる視点から確認できる。コントロール細胞（非刺激野生型PC3細胞）と比較して赤色の線は4倍の増加を示し、緑色の線は4倍の減少を示す。（C）興味深いことに、他の細胞接着マーカーは、TNF-αによる刺激の前後に野生型PC3細胞とゲノム編集PC3細胞との間で発現が変化しており、ゲノム編集細胞ではこれらの遺伝子産物が ICAM-1の欠如を補っていることが示唆される。 PC3（　 ）; PC3 + TNF-α（　 ）;編集PC3（　 ）;編集PC3 + TNF-α（　 ）

Edite

d PC

3 +

TNF-

α, n

orm

alize

d ex

pres

sion

PC3 normalized expression

COL1A1 CTGF ECM1 FN1 i tga1 i tga3 i tgB2 mmp11 mmp15 sparc thbs3 t imp2

Target

121213

14

3

4

5 67

8

9

10

11

なぜバイオ・ラッドなのか？

詳細はbio-rad.com/CRISPRinfoにアクセスしてください。

バイオ・ラッドは、ライフサイエンスの研究と臨床診断をサポートする60年以上の経験を持っています。デジタルPCR、トランスフェクション、遺伝子およびタンパク質発現解析技術のリーダーです。 当社の革新的な製品は、独立したソリューションとしても提供されますが、ダウンタイムを最小限に抑え、いついかなるときでも正しい答えを提供すべく、最適化されたワークフローに組み込むことができます。CRISPRゲノム編集ワークフローは、新規治療薬の発見と開発の時間を短縮するために設計された多くのバイオ・ラッド ワークフローのうちの1つです。

導入 濃縮 確認 分析細胞S3eセルソーター ● ● ● ●

ZOE蛍光セルイメージャー ● ● ● ●

Gene Pulser Xcellエレクトロポレーションシステム ●

TransFectin Lipid Reagent ●

Helios Gene Gunシステム ●

TC20全自動セルカウンター ● ● ● ●

組織免疫化学、フローサイトメトリー用抗体 ● ● ● ●

遺伝子QX200 Droplet Digital PCRシステム ● ●

PrimePCRアッセイ（リアルタイムPCR用/デジタルPCR用） ● ●

CFXリアルタイムPCR解析システム ● ●

CFX Maestroソフトウェア ● ●

Hard-Shell PCRプレート ● ●

C1000 Touchサーマルサイクラー ● ●

SsoAdvanced Universal Supermix ● ●

iProof High-Fidel i t y PCR Reagents ● ●

Precision Melt Analysisソフトウェア ● ●

タンパク質Bio-Plexマルチプレックスシステム ●

Bio-Plexマルチプレックスアッセイ ●

Stain-Freeゲル ● ●

トランスブロット Turboシステム ● ●

ChemiDoc Touch MPイメージングシステム ● ●

PrecisionAb 検証済みウェスタンブロッティング用抗体 ● ●

組織免疫化学、フローサイトメトリー用抗体 ● ●

タンパク質調製用ビーズとキット ● ●

HyClone and GE Healthcare are trademarks of GE Healthcare Group companies. GIBCO is a trademark of Thermo Fisher Scientific. turboGFP and OriGene are trademarks of OrigGene Technologies, Inc. VWR is a trademark of VWR International, LLC. Tween is a trademark of ICI Americas Inc.

The Bio-Plex Suspension Array System includes fluorescently labeled microspheres and instrumentation licensed to Bio-Rad Laboratories, Inc. by the Luminex Corporation.

Bio-Rad ’s thermal cyclers and real-time thermal cyclers are covered by one or more of the following U.S. patents or their foreign counterparts owned by Eppendorf AG: U.S. Patent Numbers 6,767,512 and 7,074,367.

The QX200 Droplet Digital PCR System is covered by claims of U.S. patents, and/or pending U.S. and non-U.S. patent applications owned by or under license to Bio-Rad Laboratories, Inc. Purchase of the product includes a limited, non-transferable right under such intellectual property for use of the product for internal research purposes only. No rights are granted for diagnostic uses. No rights are granted for use of the product for commercial applications of any kind, including but not limited to manufacturing, quality control, or commercial services, such as contract services or fee for services. Information concerning a license for such uses can be obtained from Bio-Rad Laboratories. It is the responsibility of the purchaser/end user to acquire any additional intellectual property rights that may be required.

Purchase of iProof High-Fidelity PCR Reagents includes an immunity from suit under patents specified in the product inserts to use only the amount purchased for the purchaser ’s own internal research. No other patent rights are conveyed expressly, by implication, or by estoppel. Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA

Hard-Shell Plates are covered by one or more of the following U.S. patents or their foreign counterparts owned by Eppendorf AG: U.S. Patent Numbers 7,347,977; 6,340,589; and 6,528,302.

Use of SsoAdvanced Supermixes is covered by one or more of the following U.S. patents and corresponding patent claims outside the U.S.: 5,804,375; 5,994,056; and 6,171,785. The purchase of these products includes a limited, non-transferable immunity from suit under the foregoing patent claims for using only this amount of product for the purchaser ’s own internal research. No right under any other patent claim and no right to perform commercial services of any kind, including without limitation reporting the results of purchaser's activities for a fee or other commercial consideration, is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. These products are for research use only. Diagnostic uses under Roche patents require a separate license from Roche. Further information on purchasing licenses may be obtained from the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA.

www.bio-rad.com本　　　社　〒140-0002 東京都品川区東品川2-2-24 TEL 03-6361-7000 FAX 03-5463-8480大阪営業所　〒532-0025 大阪市淀川区新北野1-14-11 TEL 06-6308-6568 FAX 06-6308-3064福岡営業所　〒812-0013 福岡市博多区博多駅東2-5-28 TEL 092-475-4856 FAX 092-475-4858

＊学術的なお問合せは TEL 03-6404-0331 FAX 03-6404-0334

バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社ライフサイエンス

取扱店

※価格（税抜き）、仕様などは予告無く変更することがありますので、ご了承ください。※価格は2018年4月現在のもので、メーカー希望小売価格（税別）です。※本カタログに記載されている会社名、商品名は各社の商標または登録商標です。 C11557L 1802a