CromoproteineCromoproteinele sunt heteroproteine care au ca grupă prostetică un compus ce absoarbe

în vizibil determinând o culoare specifică.În funcţie de natura grupei prostetice, cromoproteinele se pot clasifica în :

cromoproteine porfirinice (hemoglobina, mioglobina - transportori de oxigen, citocromii – transportori de electroni în diverse lanţuri oxidative, catalaza, peroxidazele – enzime ce funcţionează ca antioxidanţi, etc.) – hemoproteine (grupa colorata hem) cromoproteine neporfirinice (siderofilina, feritina – proteine implicate în transportul, respectiv depozitarea fierului în organism, ceruloplasmina – proteină ce conţine cupru, etc.).

Unele cromoproteine sunt şi metaloproteine, deoarece conţin şi ioni metalici.Cromoproteinele porfirinice au ca grupă prostetică hemul, o porfirină substituită,

deosebindu-se între ele prin modul de legare a hemului la componenta proteică (apoproteină), prin natura apoproteinei şi, uneori, prin mici diferenţe în structura hemului.

Pentru a-şi asigura necesarul de oxigen, gaz puţin solubil în soluţii apoase, neputând fi furnizat celulelor în cantităţi suficiente, organismele au evoluat spre formarea unor proteine transportoare de oxigen. Pentru că aminoacizii constituenţi ai proteinelor nu pot lega oxigenul, au fost exploatate proprietăţile unor metale, precum Fe, Cu, capabile să-l fixeze. Acestea au fost incluse în structura unor proteine, în scopul evitării reacţiilor cu formare de specii reactive ale oxigenului pe care metalele bivalente le potenţează.

Mioglobina şi hemoglobina au reprezentat modele importante pentru studiul structurii şi proprietăţilor proteinelor şi al interrelaţiilor structură – funcţii biologice.

Mioglobina (Mb) este o proteină globulară compactă, având masa moleculară de 17,2 kD, alcătuită din hem legat de un singur lanţ polipeptidic cu 153 aminoacizi, globina, care prezintă structură primară, secundară şi terţiară. Este cromoproteina din muşchi care are rolul de a depozita oxigenul în ţesutul muscular. La mamiferele care se scufundă, muşchii conţin mai multă mioglobină, la celelalte conţin cantităţi variabile, însă mai mari în muşchii scheletici şi miocard, conferindu-le acestora culoarea roşie.

Hemoglobinele (Hb) sunt şi ele proteine globulare compacte, dar tetramerice, cu masa aproximativ 64,5 kD, conţinute în eritrocitele din sângele vertebratelor, alcătuite ca şi Mb din hem şi globină. Legăturile între hem şi globină sunt de aceeaşi natură în Mb şi Hb.

Hb îndeplinesc roluri biologice importante: transportă O2 de la plămâni la ţesuturi şi CO2 de la ţesuturi la plămâni; contribuie la menţinerea constantă a echilibrului acido-bazic în sânge printr-o mare

capacitate de tamponare conferită de histidină, componenta proteică conţinând în proporţie de aproximativ 10% acest aminoacid.

Structura mioglobinei şi hemoglobinei. Hemul, grupa prostetică a mioglobinei şi hemoglobinei, este alcătuit din protoporfirină IX şi Fe2+ (vezi figura).

Protoporfirina IX este un derivat al unui nucleu format din 4 heterocicluri pirolice unite prin punţi metinice (-CH=). Conţine legături duble conjugate ce explică şi capacitatea acestor sisteme de a absorbi în vizibil (hemoglobina absoarbe la 405 nm - banda lui Sorét).

În funcţie de intensitatea luminii absorbite, se poate face dozarea hemoglobinei. Lipsa conjugării la unii intermediari de sinteză (uroporfirinogen, coproporfirinogen) se

traduce prin absenţa culorii. În lumină UV, hemoglobina prezintă fluorescenţă.Prin includerea ionului Fe2+ în nucleul protoporfirinei IX rezultă hemul. Dintre cele şase

valenţe ale ionului Fe2+, patru sunt satisfăcute de protoporfirina IX, la valenţele a 5-a şi a 6-a, perpendiculare pe planul protoporfirinei, putându-se lega diferiţi liganzi (O2, CO, NO).

1

Structura hemului hidratat

În hemul liber, reacţia cu oxigenul la una din cele două valenţe libere poate determina oxidarea ireversibilă a Fe2+ la Fe3+, hemina rezultată neputând lega oxigenul.

Reacţia de oxidare este împiedicată prin sechestrarea hemului într-o structură proteică în care accesul la valenţele libere ale Fe2+ este restricţionat. În această formă, valenţa a 5-a este satisfăcută de un rest de histidină din globină, iar a şasea reprezintă situsul de legare pentru oxigen, legându-se apoi de un rest de histidină din globină.

Globina este o proteină globulară conţinută în toate proteinele transportoare de oxigen, existând mici diferenţe structurale între acestea. Globina din mioglobină şi hemoglobină conţine un număr mare de resturi de histidină (aproximativ 10% în Hb) şi se poate asocia cu o moleculă de hem prin diferite interacţiuni necovalente.

Globina are următoarele roluri: formează un „buzunar” pentru hem; protejează ionul Fe2+ de oxidare pentru a interacţiona cu molecula de oxigen; formează „buzunarul” în care poate fi inclusă molecula de oxigen.

Partea proteică a Hb adulte rezultă prin asocierea a patru catene polipeptidice, identice două câte două: 2 catene α, conţinând fiecare 141 aminoacizi şi 2 catene β, fiecare alcătuită din 146 aminoacizi. Există similaritate între secvenţa de aminoacizi din lanţurile globinei din Hb şi cel al Mb, 27 dintre aceştia fiind identici. Lanţurile α şi β se unesc două câte două formând un dimer αβ, iar ulterior se formează tetramerul α2β2 .

Fiecare catenă include o moleculă de hem, astfel că tetramerul Hb conţine 4 resturi hem. Structura tetramerică a hemoglobinei este esenţială pentru funcţiile ei biologice. Hemoglobinele pot cristaliza formând cristale specifice ca formă fiecărei specii.

Specificitatea de specie este conferită de globină, care are un conţinut în aminoacizi diferit de la o specie la alta.

Legarea O2 la Mb şi Hb. În oximioglobină (MbO2) şi oxihemoglobină (HbO2) (forme cu oxigen), la a 6-a valenţă a fierului se leagă molecula de oxigen (vezi figura).

Studiile de cristalografie cu raze X, au evidenţiat modificări semnificative ale dispoziţiei fierului faţă de planul hemului atunci când se leagă molecula de oxigen.

Pentru Mb astfel de deplasări sunt puţin importante, însă ele afectează sever structura hemoglobinei şi ele sunt răspunzătoare de proprietăţile allosterice ale acesteia.

În oxihemoglobină (HbO2), legarea primei molecule O2 la lanţul α1 determină deplasarea Fe2+ spre planul porfirinei. Această deplasare determină modificări conformaţionale ce sunt transmise lanţurilor adiacente crescându-le afinitatea pentru oxigen.

Efectul se numeşte efect cooperativ pozitiv şi din acest motiv aspectul curbei de saturare cu oxigen este diferit la hemoglobină şi mioglobină (vezi figura).

2

Reprezentarea schematică a legării hemului de globină

Mb, fiind proteină de rezervă de oxigen, leagă O2 după o curbă cu aspect hiperbolic, având afinitate mai mare pentru oxigen decât Hb la orice presiune.

O proteină care leagă O2 după o curbă hiperbolică nu poate funcţiona ca proteină transportoare de O2, deoarece dacă are afinitate mare, îl poate fixa în plămâni, la o presiune crescută, dar nu-l poate ceda ţesuturilor. Dacă îl fixează cu afinitate mai mică pentru a-l putea ceda ţesuturilor, nu s-ar încărca la plămâni cu o cantitate suficientă de O2.

Hb poate funcţiona ca proteină de transport de O2. Aceasta are o curbă de saturare cu aspect sigmoid. Se saturează cu oxigen în plămâni, unde pO2 este de aproximativ 100 torri şi cedează oxigenul în ţesuturi unde presiunea din capilare este 40 torri.

Curba de saturare cu oxigen ale Mb şi Hb

Modulatori ce influenţează legarea O2 la hemoglobină. Legarea oxigenului la hemoglobină este influenţată de concentraţia H+, CO2, şi de acidul 2,3-difosfogliceric (DPG).

Deoxihemoglobina are o afinitate mai mare pentru H+ decât oxihemoglobina. Dacă pH-ul scade, se accentuează disocierea HbO2.

Deci H+ este un antagonist al legării oxigenului la hemoglobină.

3

Importanţa biologică a acestei modulări rezidă în faptul că, în ţesuturile în care mediul se acidifiază ca rezultat al unor procese metabolice, se eliberează mai uşor oxigenul necesar.

Dioxidul de carbon (CO2) influenţează oxigenarea hemoglobinei similar cu ionii H+, deoarece la dizolvarea lui în sânge se formează H+. Anhidraza carbonică din hematii catalizează hidratarea CO2, iar protonii rezultaţi la ionizarea acidului sunt preluaţi de Hb şi disociază O2.

Ionii bicarbonat (HCO3-) sunt transportaţi la plămâni. Când hemoglobina se oxigenează

din nou în plămâni, H+ sunt eliberaţi, reacţionează cu ionul HCO3- pentru a forma acidul

carbonic din care rezultă CO2 ce se elimină prin respiraţie. O parte din CO2 se leagă de hemoglobină, sub formă de carbamat la resturile amino, rezultând carbhemoglobină.

Un alt factor care influenţează acceptarea O2 de către hemoglobină este acidul 2,3-difosfogliceric (DPG). Legarea DPG la hemoglobină duce la eliberarea O2 Eritrocitele conţin o concentraţie de DPG echivalentă celei a hemoglobinei, de aproximativ 4,5 mM.

Legarea DPG stabilizează hemoglobina în forma neoxigenată, forma oxigenată având o cavitate centrală mult prea redusă pentru legarea acestuia.

Importanţa fiziologică a interacţiunii DPG – Hb. Interacţiunea permite adaptarea multor mamifere (primate, om) în condiţiile unor presiuni reduse ale O2 (de exemplu, la altitudine, în hipoxie). Când organismul se găseşte în condiţii în care pO2 este mai mică, cantitatea de DPG creşte determinând scăderea afinităţii hemoglobinei pentru O2, acesta fiind mai uşor eliberat în ţesuturi. La alte mamifere (cal, oaie, capră), hemoglobina are o afinitate mai mică pentru O2 şi DPG nu este important pentru acestea.

Hemoglobine fiziologice. În eritrocitele umane, în diferite perioade de viaţă, s-au identificat următoarele tipuri de hemoglobină care diferă între ele prin natura lanţurilor, toate conţinând lanţurile α: HbA (α2β2), HbA2 (α2δ2), HbF (α2γ2), HbE2(α2ε2), HbE1(ε4).

HbE (hemoglobina embrionară) se sintetizează în primele luni după concepţie, mai întâi ca HbE1 (Gower) şi apoi HbE2. Ulterior, ea este înlocuită de HbF (hemoglobina fetală), majoritară între lunile 3 şi 8 de viaţă intrauterină.

Din luna a 3-a, începe să se sintetizeze şi HbA (hemoglobina adultă), dar aceasta predomină abia după naştere. În viaţa extrauterină, sângele mai conţine şi o altă hemoglobină adultă, HbA2.

Lanturile Hb predominante în perioada intra şi extrauterină

4

Fiecare din cele patru tipuri de hemoglobină se caracterizează prin: mobilitate electroforetică caracteristică; punct izoelectric caracteristic; formarea de cristale sub formă de bipiramide simetrice; denaturare în mediu acid sau bazic.

HbF se deosebeşte de HbA prin afinitatea pentru O2. Deoarece HbF nu are lanţuri β, ci două lanţuri γ, aceasta interacţionează cu DPG mai puţin. De aceea, HbF are afinitate mai mare pentru O2 putându-l lega la presiuni la care este disociat de pe HbA, ceea ce face posibilă oxigenarea fătului de la mamă prin schimbul de oxigen între HbF şi HbA.

Hemoglobine anormale şi patologice. În anumite situaţii, cantitatea de hemoglobină sau calitatea acesteia sunt diferite de cele normale, fiind însoţite de anemie. Aceste afecţiuni de numesc hemoglobinopatii. Hemoglobinopatiile pot fi: calitative, se formează o hemoglobină cu secvenţă de aminoacizi diferită de cea normală, de exemplu HbS, HbC, Hb Malta, Sasketon, Boston; cantitative, se formează cantitate mai mică de Hb normală sau anormală datorită cantităţii deficitare a unuia din lanţuri (talasemii).

Hemoglobina glicozilată (HbA1c) este o fracţiune din HbA, glicozilată prin legarea ireversibilă a glucozei la valina terminală din catena β. În condiţii normale, pentru o glicemie de 60 – 110 mg/dl, reprezintă ~ 7,5%. Aceasta creşte proporţional cu concentraţia glucozei în sânge, fiind un indice util pentru monitorizarea diabetului zaharat, concentraţii mai mari de 10% indicând un control metabolic defectuos. Aceasta formă se poate separa prin cromatografie sau electroforeză.

Carboxihemoglobina (HbCO) se formează prin legarea coordinativă a monoxidului de carbon (CO) la ionul Fe2+ din hem. Reacţia este reversibilă, afinitatea hemoglobinei pentru CO fiind de aproximativ 200 ori mai mare decât pentru oxigen, astfel că semisaturarea are loc la o presiune foarte mică (0,012 torri), astfel Hb devenind nefuncţională.

Până la o concentraţie de 10 % HbCO nu apar simptome caracteristice. Între 10–30% apare cefalee, la 30–50% accentuarea cefaleei, confuzii mintale, greaţă, vomă, accelerarea pulsului, comă, la 50–60% apar convulsii, iar după 60–70% şoc anafilactic, insuficienţă respiratorie, moarte. La concentraţii de 80–90%, moartea survine în câteva secunde.

Methemoglobina (MetHb). Sub acţiunea oxidanţilor, Fe2+ din hem se oxidează la Fe3+

cu formarea heminei, grupa prostetică a methemoglobinei, ce nu poate transporta oxigenul. MetHb se formează fiziologic în mod continuu în eritrocite, dar este redusă rapid la Hb de un sistem în care intervin methemoglobin reductazele I şi II, vitamina C şi glutationul redus (GSH). Afectarea genetică a sintezei celor două enzime determină acumularea MetHb şi duce la lezarea membranei eritrocitare. Nou născuţii prezintă o tendinţă mai mare spre methemoglobinemie, datorită unei insuficienţe a sistemelor enzimatice, sensibilităţii mai mari a HbF la oxidare, hipovitaminozei C. La aceştia apare şi icter hemolitic.

Cantităţile mari de nitriţi şi nitraţi pot favoriza, de asemenea, formarea MetHb. Unele medicamente determină producerea unei cantităţi mai mari de MetHb ce depăşeşte capacitatea reductazelor existente de a o transforma în forma redusă:

a) antipiretice şi analgezice: paracetamol, acetanilidă, fenazol;b) agenţi antibacterieni: sulfamide, cloramfenicol;c) agenţi antimalarici: chinină;d) compuşi conţinuţi de unele preparate dermice: unguente cu benzocaină, pirogalol.

CitocromiiAceste heteroproteine au fost descrise, la început, ca pigmenţi similari celor sanguini de

către Mac Munn (1886) şi redenumiţi citocromi pe baza calităţilor spectrale (Keilin, 1925).În această clasă de cromoproteine sunt incluse toate hemoproteinele intracelulare legate

de particulele subcelulare ce au una din următoarele funcţii biologice: catalizatori în reacţii de oxidoreducere; intervin în conservarea energiei, fotosinteză şi în metabolismul unor bacterii anaerobe;

5

intervin în reacţii de metabolizare a unor compuşi endogeni şi exogeni (xenobiotice).Funcţia transportoare de electroni se manifestă prin schimbarea valenţei fierului din

grupa prostetică sau prin schimbul de protoni:

Clasificarea citocromilor se face în funcţie de mai multe criterii: structura grupei prostetice şi modul de legare cu apoproteina, spectrele de absorbţie, potenţialul redox.

Sunt denumiţi, în general, cu literele mici ale alfabetului latin, urmate de anumiţi indici numerici: a, a3, b, b5, c. Există însă şi denumiri particulare, de exemplu citocromii P450.

Citocromul c este o hemoproteină cu masă moleculară mică (M = 12,4 kD) alcătuită din 104 aminoacizi. Este conţinut în mitocondrii şi se izolează uşor din miocard. Este o proteină globulară, cu formă aproape sferică.

Citocromul c este o componentă a lanţului redox din membrana mitocondrială. Citocromul c este şi un mediator al procesului de moarte celulară programată (apoptoză), eliberarea sa în citoplasmă ca efect al unor semnale intramitocondriale fiind importantă în continuarea evenimentelor citoplasmatice implicate în acest proces.

Structura hemului a, b, c

Citocromul b este tot o hemoproteină mitocondrială care are rol în desfăşurarea transferului de electroni şi H+ prin membrana mitocondrială. Conţine acelaşi hem ca şi Hb.

Citocromul a este o hemoproteină mitocondrială componentă a lanţului respirator care se caracterizează prin prezenţa unei catene izoprenoidice cu 15 atomi de carbon la grupa vinil din poziţia 2 a hemului şi prin transformarea grupei metil din poziţia 8 în grupă formil (-CHO). Intervine în transferul de electroni şi H+ prin membrana mitocondrială în respiraţia celulară.

Citocromul b5 este o hemoproteină conţinută în microzomi fiind component al lanţului oxidativ de la nivelul reticulului endoplasmatic neted implicat în procese biochimice particulare, cum ar fi desaturarea acizilor graşi.

Citocromii P450 sunt reprezentaţi de câteva sute de hemoproteine prezente în aproape toate celulele mature, cu excepţia eritrocitelor şi muşchilor scheletici, denumite astfel datorită maximului de absorbţie pe care complexele cu CO ale formelor reduse îl prezintă la 450 nm. Sunt grupaţi în mai multe familii, în fiecare familie (numerotată cu cifre arabe) existând mai multe subfamilii denumite cu literele alfabetului latin (Cyp 2A, Cyp 3C etc).

Sunt proteine oligomere alcătuite din 16 monomeri ce conţin 8 molecule de hem.

6

Se găsesc în veziculele reticulului endoplasmatic neted şi fac parte dintr-un sistem transportor de e- nefosforilant a cărui energie este utilizată pentru monooxigenarea substratului (oxidaze cu functie mixtă)

Sistemul oxidazelor cu funcţie mixtă microzomale (OFMM) intervine în metabolizarea unor compuşi endogeni şi exogeni (hemoglobină, colesterol, medicamente, alcool, etc.), având specificitate de substrat diferită. Multe procese metabolice ce se desfăşoară cu participarea sistemului citocromilor P450: reacţiile de aromatizare şi hidroxilare din biosinteza hormonilor steroizi; oxidarea eicosanoidelor; hidroxilarea vitaminei D3 etc.

Inducerea enzimelor din acest sistem are importanţă medicală deoarece reprezintă mecanismul biochimic al interacţiunilor dintre medicamente.

7