PRÁCTICA # 9

CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS

INTRODUCCION

A menudo es necesario identificar y cuantificar los aminoácidos individuales de una mezcla, tanto en estudios metabólicos como en las investigaciones de la estructura de las proteínas.El uso de la cromatografía en capa fina o de la electroforesis son adecuados para averiguar el número y la cantidad relativa de los diferentes aminoácidos presentes en una muestra (análisis cualitativo), aunque para los análisis cuantitativos es necesaria la cromatografía de gases o un analizador de aminoácidos.

Cromatografía en capa fina:Una importante aplicación de la cromatografía en capa fina es la de servir como guía para el desarrollo de las condiciones óptimas para realizar separaciones por cromatografía de líquidos de alta resolución. Proporciona una idea rápida de los aminoácidos mayoritarios existentes en la muestra. Las ventajas de este procedimiento son la rapidez y el bajo coste de los ensayos experimentales. De hecho, se recomiendan que los ensayos en capa fina deberán preceder siempre al uso de la columna.En la cromatografía de papel se pueden aplicar grandes volúmenes de muestra, lo que permite la elución posterior de un aminoácido en particular para su posterior purificación y análisis, factor que tiene gran importancia en la identificación de un constituyente desconocido de la muestra.Antes de la realizar la cromatografía, es necesario eliminar las sustancias que interfieren, tales como proteínas, carbohidratos y sales, lo que puede hacerse con una resina de intercambio iónico. Los aminoácidos retenidos pueden eluirse a continuación añadiendo a la columna un pequeño volumen de amoniaco y lavando después con agua destilada. La separación de los aminoácidos se basa en que éstos se reparten de modo diferencial entre la fase móvil y la fase estacionaria. Generalmente se realizan por el procedimiento ascendente: introduciendo el borde inferior de la placa cromatográfica en el eluyente que será succionado por acción de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie del la placa.La identificación de un aminoácido se realiza comparando los valores de Rf (factor de retraso: cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desde el origen y la distancia recorrida por el solvente desde el origen), con otros tomados como referencia, debiéndose utilizar al menos tres sistemas de disolventes distintos para establecer su identidad con un cierto grado de seguridad.La naturaleza de los aminoácidos es un factor importante a la hora de elegir un disolvente, ya que los diferentes solventes pueden permitir una mejor resolución de los componentes ácidos, básicos o neutros. En general, aumentando la

proporción de agua en el disolvente se incrementan todos los valores de R f e introduciendo pequeñas cantidades de amoniaco aumentan los valores del factor de retraso de los aminoácidos básicos. Algunos disolventes contienen compuestos nocivos, por ejemplo el fenol, lo que restringe su uso rutinario. La composición química del disolvente puede también limitar el rango de reactivos de localización que pueden aplicarse satisfactoriamente. Por ejemplo, el ácido sulfanílico no puede utilizarse con disolventes fenólicos.El poder de resolución de la cromatografía de capa fina puede aumentarse empleando técnicas bidimensionales, o sea, utilizando dos disolventes distintos. Se aplica una cantidad de muestra mayor que la utilizada generalmente para la separación cromatográfica de una dimensión (aproximadamente el triple) en una esquina del papel o placa y se hace correr en una dimensión. Entonces el cromatograma se seca completamente al aire, se gira un ángulo de 90º y se desarrolla con el segundo solvente. Tras un nuevo secado, se sumerge en el reactivo de localización elegido. En la cromatografía de dos dimensiones, la composición de los dos disolventes es la que determina el orden en que debe utilizarse.Las separaciones bidimensionales permiten la resolución de un gran número de aminoácidos presentes en una muestra, ya que los que tienen una movilidad similar en la primera dimensión se separan en la segunda. Esto es muy útil en la detección de los componentes que están en muy baja concentración y pueden quedar enmascarados por otros compuestos que tengan una concentración alta cuando se utiliza la cromatografía en una dimensión.

Cromatografía de gases:Se han hecho muchos ensayos para aprovechar la velocidad y sensibilidad que ofrece la cromatografía de gases, pero aunque se han realizado considerables progresos en el desarrollo de tales métodos, aún no se utiliza de forma rutinaria para el análisis de aminoácidos en muestras biológicas. La razón de esto radica en el hecho de que los aminoácidos, aunque similares, son compuestos químicamente heterogéneos y además no son suficientemente volátiles a menos que se conviertan en algún derivado apropiado. Aparecen dificultades no sólo a la hora de elegir el método de obtención de tales derivados, sino también en la selección de una fase estacionaria que sea capaz de resolver los derivados de todos los elementos de un grupo tan diverso de compuestos. A lo hora de elegir el detector aparecen también problemas similares.

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC):Existen dos técnicas para la determinación de aminoácidos a través de cromatografía líquida: cromatografía de reparto en fase reversa y cromatografía de intercambio iónico.La cromatografía de líquidos de alta resolución es la técnica de separación más ampliamente utilizada. Las razones más importantes son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos

campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos y otros.

Cromatografía en fase reversa:La cromatografía en fase reversa consiste en un disolvente fundamentalmente polar como fase móvil y una cadena hidrocarbonada ligada como fase estacionaria. Algunas de las ventajas más sustanciales de esta alternativa son su gran reproducibilidad, tiempos de retención cortos, velocidad de muestreo alta, sistema cromatográfico simple y amplio campo de aplicación. Por todo ello, las aplicaciones son cada vez más numerosas. La selectividad se basa en las interacciones específicas entre el soluto y la fase móvil, ya sea de tipo polar, de formación de puentes de hidrógeno o mediante equilibrios secundarios provocados al variar la composición de la fase móvil (ácido-base, formación de complejos o pares iónicos, adición de complejos metal-ligando o reactivos quirales para separar los isómeros ópticos, etc.).

Cromatografía de intercambio iónico:La cromatografía iónica está relacionada con los métodos modernos y eficaces para la determinación de iones que se basan en el uso de resinas de intercambio iónico.Existen métodos automatizados para la separación y detección de aminoácidos y otras especies iónicas en mezclas complejas. El desarrollo de la HPLC moderna empezó a finales de los años sesenta, pero su aplicación a la separación por intercambio iónico se retraso debido a la inexistencia de un método general y sensible para la detección de especies como los cationes alcalinos y alcalinotérreos, y aniones como los haluros, acetato y nitrato. Esta situación se remedió en 1975 al desarrollarse por técnicos de Dow Chemical Company la técnica de supresión del efluente, la cual hace posible la detección conductimétrica de los iones eluídos. El analizador de aminoácidos, con el que se lleva a cabo la cuantización de los aminoácidos se basa en esta técnica.

OBJETIVOS

1. Identificar a los aminoácidos por cromatografía en capa fina.2. Revelar los aminoácidos por medio de la reacción de ninhidrina.

MATERIALES Y REACTIVOS

Material:Cámara de cromatografía Estufa Pipeta automática Placa silica-gel de cromatografía

Reactivos:Silica-geln-butanolÁcido acéticoNinhidrina al 0.5 % en acetonaAminoácidos: glicina, glutamina, serina, valina, L-alanina, metionina.

METODOLOGIA

1. Depositar en la cámara de cromatografía una mezcla de n-butanol, ácido acético y agua (12:3:15) de tal forma que el solvente quede a una altura de 1 cm.

2. A dos cm del borde inferior de la placa, señalar los puntos de aplicación, colocar un punto de cada aminoácido en cada punto de la placa.

3. Cuando la muestra este seca, colocarla en la cámara y permitir el corrimiento mas allá de la mitad de la placa (1 hora aproximadamente).

4. Una vez terminado el corrimiento sacar las placas y permitir que se sequen.5. Rociar con ninhidrina y revelar en la estufa.

OBSERVACIONES:

RESULTADOS:

CONCLUCIONES:

CUESTIONARIO:

BIBLIOGRAFIA