Warsaw March 2009 1

Dr. K. Luden

Cryptosporidia i Giardia

Analityka i wyzwania

Dr Katrin Luden

Dr. K. Luden

Cryptosporidium C. parvum pasożyty wewnątrzkomórkowe wywołujące

biegunkę Zakażenie wywoływane przez oocysty (5 µm)

zawierające sporozoity (dawka wywołująca zakażenie 1-10 oocysts)

Przenoszone drogą fekalną lub przez zanieczyszczoną wodę

Rezerwuar: kręgowce, np. bydło, konie, kozy, owce, psy, koty, ptaki…

Czas inkubacji 7-10 (1-12) dni Możliwe wydalanie z odchodami przez okres kilku tygodni Do tej pory brak specyficznej terapii Środki profilaktyczne: podgrzewanie do 60°C przez 30

min. lub gotowanie

Warsaw March 2009 2

Dr. K. Luden

Giardia

G. lamblia pasożyt jelita cienkiego wywołujący biegunkę Zakażenie wywołują cysty (7x 12 µm) zawierające

trofozoity Przenoszone drogą fekalną lub przez zanieczyszczoną

wodę Rezerwuar: ludzie, kręgowce? Czas inkubacji 3 - 25 (1-14) dni Istnieje terapia lekowa Może trwać w stadium bezobjawowym przez lata

Warsaw March 2009 3

Dyrektywa w sprawie wody do spożycia 98/83/EC

Dr. K. Luden

Załącznik I Część C: Parametry wskaźnikowe

Clostridium perfringens

Uwaga 2: Tego parametru nie trzeba mierzyć, chyba że woda pochodzi z wód powierzchniowych lub znajduje się pod ich wpływem. W przypadku niezgodności z wartością parametryczną, dane Państwo Członkowskie musi zbadać dostawę w celu zapewnienia, że nie ma potencjalnego zagrożenia dla zdrowia ludzkiego wynikającego z obecności mikroorganizmów chorobotwórczych np.: cryptosporidium. Państwa Członkowskie muszą włączyć wyniki tych badań do sprawozdań, które przedkładają na mocy art. 13 ust. 2.

Warsaw March 2009 4

Dr. K. Luden

Załącznik I Część C: Parametry wskaźnikoweClostridium perfringensTego parametru nie trzeba mierzyć, chyba że woda pochodzi z wód powierzchniowych lub znajduje się pod ich wpływem. W przypadku niezgodności z wartością graniczną, dane Państwo Członkowskie musi zbadać system zaopatrzenia w celu zapewnienia, że nie ma potencjalnego zagrożenia dla zdrowia ludzkiego wynikającego z obecności mikroorganizmów chorobotwórczych np.: cryptosporidium.Właściwe władze informują Federalne Ministerstwo Zdrowia przez najwyższe władze kraju związkowego.

Niemiecka ustawa o wodzie do spożycia

Warsaw March 2009 5

Dr. K. Luden

Wartości graniczne i metody

Cryptosporidium Giardia

Ujęty w dyrektywie i ustawieNie ujęty w dyrektywie, ani w ustawie

Brak wartości parametrycznych

Brak wartości parametrycznych

Brak metody Brak metody

Ocena ryzyka ???

Warsaw March 2009 6

Metody stosowane rutynowo w USA i ZK: US EPA 16223 oraz ZK (DWI), podobne do ISO 15553

Dr. K. Luden

Jakość wody – wyodrębnianie z wody i identyfikacja oocyst Cryptosporidium oraz cyst Giardia

Zakres: brak identyfikacji gatunku, brak oznaczania żywotności, brak oznaczania zjadliwości

Zasada: Stężanie z wody przez filtrację i elucję, po której

następuje powolne wirowanie Oczyszczanie metodą separacji immunomagnetycznej

(immunomagnetic separation - IMS) Wykrywanie metodą epifluorescencji oraz mikroskopii w

systemie kontrastu interferencyjno – różniczkowego (differential interference contrast - DIC)

ISO 15553

Warsaw March 2009 7

Dr. K. Luden

Próbobranie: 10 do 1.000 l wody – do pojemników transportowych lub filtrowanie na miejscuprzepływ oraz ciśnienie mogą być ograniczone przez dobór filtra

Około 95-100 % pasożytów zatrzymywane jest na filtrze

Stopień odzysku całej metody podlega znaczącym wahaniom (10-80 %), w zależności od matrycy

Mętność jest istotna (przyleganie oocyst/cyst do cząsteczek?)

ISO 15553

Warsaw March 2009 8

Stężanie

Dr. K. Luden

Warsaw March 2009 9

Miejsce pobrania (woda surowa, uzdatniona, kranowa)

Kapsuła filtraEnvirocheck, Filta Max

Przepływomierz(określenie ilości oocyst / objętość)

Odpływ

Pompy

perystaltyczne zwykłe

Stężanie

Dr. K. Luden

Kapsuła filtra jest płukana, a bufor elucyjny zbierany w probówkach do wirowania

Wirowanie

Zlanie supernatantu

Oczyszczanie / IMS

Warsaw March 2009 10

Stężanie

Dr. K. Luden

Kapsuła filtra jest płukana, a bufor elucyjny zbierany w probówkach do wirowania

Wirowanie

Zlanie supernatantu

Oczyszczanie / IMS

Warsaw March 2009 11

Oczyszczanie metodą IMS

Dr. K. Luden

Separacja immunomagnetyczna

Warsaw March 2009 12

YElement paramagnetyczny

Przeciwciała cryptosporidium

Oocysta

Y

Kompleks oddzielany od cząstek stałych przy pomocy magnesów i przemywania

IMS

Dr. K. Luden

Warsaw March 2009 13

Oczyszczanie metodą IMS / Wykrywanie

Dr. K. Luden

Separacja immunomagnetyczna

Warsaw March 2009 14

Rozbicie kompleksu przez zastosowanie kwasu (wysokiej temperatury)Y Y

Barwienie przeciwciałami połączonymi z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)

Wykrywanie przy pomocy mikroskopu

Mikroskopia epifluorescencyjna i DIC (Differential interference contrast – kontrast interferencyjno - różniczkowy)

Dr. K. Luden

Warsaw March 2009 15

Cryptosporidium oocysta

4-6 µm

Giardiacysta

8-12 µm

x 7-10 µm

Wykrywanie

Zalecane jest barwienie DAPI w celu wykrycia jąder sporozoitów trofozoitów

Przy pomocy DIC można wykryć wewnętrzne cechy morfologiczne

Dr. K. Luden

Wyzwania

Etap analizy Wyzwanie

FiltracjaRetencja ~ 100 %, ale odzysk jedynie 10-80 %

ElucjaStrata oocyst / cyst przez niecałkowity transfer

WirowanieStrata oocyst / cyst przez naruszenie granulatu

Oczyszczanie metodą IMSStraty na etapie przemywania

Przeciwciała specyficzne jedynie dla niektórych gatunków

Wykrywanie metodą epifluorescencji

Fluorescencja tła cząstek stałych

Niełatwe do identyfikacji ze względu na pospolity kształt

Warsaw March 2009 16

Dr. K. Luden

Charakterystyka wyników

Warsaw March 2009 17

Odzysk, granica wykrywalności, efekt matrycy

Metoda niezbyt dobrze odróżnia komórki żywe od martwych i zakaźne od niezakaźnych

Zawsze konieczna analiza kilku próbek:

próba porażona (kontrola pozytywna, oznaczenie odzysku)

próba naturalna

wiarygodna kontrola negatywna (wykluczenie zanieczyszczenia krzyżowego sprzętu, ocena fluorescencji tła…)

Koszt ~ 400 €(kapsuła filtra, barwienie, sprzęt, czas)

Dr. K. Luden

Sytuacja w Niemczech

Warsaw March 2009 18

Kontrole jakości: badanie biegłości?

W Niemczech niewiele laboratoriów stosuje tę metodę (np. Federalna Agencja Środowiska)

Brak badań biegłości (jak przesyłać próby wody o pojemności 10 l?)

Większość wody do spożycia pochodzi ze starych wód podziemnych: źródło bardzo bezpieczne

Nie ma konieczności przeprowadzania tej analizy, ale również bark możliwości szybkiego wdrożenia metody na poziomie laboratorium

Dr. K. Luden

Kryptosporydioza w Dolnej Saksonii

Warsaw March 2009 19

Lic

zba

zg

łosz

onyc

h p

rzyp

ad

ków

0

5

10

15

20

25

30

35

Jan Feb Mar April May June July Aug Sept Oct Nov Dec

2005

2006

2007

2008

Dr. K. Luden

Warsaw March 2009 20

Rok przypadki2005 1532006 1452007 1442008 161

Dolna Saksonia – 7,9 miliona mieszkańców

1 zgłoszony incydent na 50 000 mieszkańców na rok

90% wody do spożycia z chronionych wód podziemnych („stara” woda podziemna)

Wody powierzchniowe mają wpływ na 10% wody do spożycia

Kryptosporydioza w Dolnej Saksonii

Dr. K. Luden

Zagadnienia dla służb ochrony zdrowia

Warsaw March 2009 21

W przypadku kryptosporydiozy

? rodzaj dostaw wody (publiczne, prywatna studnia, wody podziemne, woda uzdatniona…)

? rodzaj obszaru (wiejski, gospodarstwo rolne…) / kontakt z obornikiem...

? kontakt z osobą cierpiącą na biegunkę

? wizyta w gospodarstwie hodowlanym

? kontakt z cielętami, zwierzętami domowymi, mlekiem niepasteryzowanym

? plac zabaw

? pływalnia publiczna

Dr. K. Luden

Potencjalne zanieczyszenie pochodzenia fekalnego

Warsaw March 2009 22

Wystąpienie pasożytów możliwe, ale brak możliwości przeprowadzenia analizy laboratoryjnej

Ważne informacje o rodzaju dostaw wody jako podstawa oceny ryzyka

Technika pobierania prób / punkt pobrania

System dystrybucji (rury, etc.)

Typ dystrybuowanej wody / ujęcia

Uzdatnianie (firma wodociągowa, poszczególne etapy)

Zlewnia

Plan bezpieczeństwa wodnego / system wielobarierowy

Dr. K. Luden

Dziękuję Państwu za uwagę!

Warsaw March 2009 23