CTD 第2 部 - 医薬品医療機器総合機構...CV Coefficient of Variation · X ECL Electrochemiluminescence7Á ¼ ì Û$Î ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent assay4Ý(ò) $? ¾%T

CTD 第 2 部

2.6 非臨床試験の概要文及び概要表

2.6.4 薬物動態試験の概要文

MSD 株式会社

ベズロトクスマブ（遺伝子組換え）注射剤 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.4 薬物動態試験の概要文

2.6.4 薬物動態試験の概要文 - 1 -

目次

頁

表一覧 ............................................................................................................................................................. 2

図一覧 ............................................................................................................................................................. 3

略号及び用語の定義 ..................................................................................................................................... 4

2.6.4 薬物動態試験の概要文 ................................................................................................................. 5

2.6.4.1 概要 ......................................................................................................................................... 5

2.6.4.2 分析法 ..................................................................................................................................... 6

2.6.4.2.1 ハムスターを用いた薬物動態試験 ............................................................................. 8

2.6.4.3 分布 ......................................................................................................................................... 9

2.6.4.3.1 ハムスターを用いた in vivo 組織分布試験 ................................................................ 9

2.6.4.3.2 Caco-2細胞を用いた in vitro 組織分布試験 .............................................................. 10

2.6.4.3.3 静脈内投与した抗体が腸管内腔の C. difficile トキシンを中和するメカニズ

ム ................................................................................................................................... 14

2.6.4.4 代謝 ....................................................................................................................................... 15

2.6.4.5 排泄 ....................................................................................................................................... 15

2.6.4.6 薬物動態学的薬物相互作用 ............................................................................................... 15

2.6.4.7 その他の薬物動態試験 ....................................................................................................... 15

2.6.4.8 考察及び結論 ....................................................................................................................... 16

2.6.4.9 参考文献 ............................................................................................................................... 17



表一覧

頁

表 2.6.4-1 MK-3415及び MK-6072の分析法 ................................................................................... 7

表 2.6.4-2 正常ハムスターに MK-3415A（MK-3415 50 mg/kg/day 及び MK-6072

50 mg/kg/day）を投与した際の最終投与後48時間の MK-3415及び MK-6072

の血清中濃度の要約統計量（PK001及び PD006） .................................................... 9



図一覧

頁

図 2.6.4-1 CDI ハムスターに MK-3415A（MK-3415 50 mg/kg 及び MK-6072 50 mg/kg）

を皮下投与した際の腸組織への分布（正常ハムスターに対する比較、PK002）

......................................................................................................................................... 10

図 2.6.4-2 Caco-2細胞単層膜におけるトキシン A 濃度及びトキシン B 濃度と経上皮電

気抵抗の関係並びに MK-3415及び MK-6072のトキシン中和作用（PK002） ..... 12

図 2.6.4-3 Caco-2細胞単層膜におけるMK-3415及びMK-6072の基底膜側コンパートメ

ントから管腔側コンパートメントへの移行（PK002） .......................................... 13

図 2.6.4-4 静脈内投与した抗体が腸管内腔のC. difficile トキシンを中和するメカニズム

......................................................................................................................................... 14



略号及び用語の定義

略語定義

ADA Anti-Drug Antibody 抗薬物抗体

C. difficile Clostridium difficile クロストリジウム・ディフィシル

CDI Clostridium difficile Infection クロストリジウム・ディフィシル感染症

CV Coefficient of Variation 変動係数

ECL Electrochemiluminescence 電気化学発光

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent assay 酵素結合免疫吸着法 F(ab’)2 Fragment of an antibody with two

antigen-binding F(ab) portions linked together by disulfide bonds

ジスルフィド結合で連結した2つの

抗原結合性フラグメント

GLP Good Laboratory Practice 医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準

ICH International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use

日米 EU 医薬品規制調和国際会議

IgG Immunoglobulin G 免疫グロブリン G SD Standard Deviation 標準偏差 TER Transepithelial Electrical Resistance 経上皮電気抵抗



2.6.4 薬物動態試験の概要文

2.6.4.1 概要

Clostridium difficile（C. difficile）は、嫌気性有芽胞グラム陽性桿菌であり、腸管毒性を示すトキ

シン A 及び細胞毒性を示すトキシン B を産生することにより症状を引き起こす[資料4.3: 37]。

C. difficile トキシン A に対するヒトモノクローナル抗体（MK-3415）及び C. difficile トキシン B

に対するヒトモノクローナル抗体（MK-6072）は、それぞれトキシン A 及びトキシン B に結合し

中和する完全ヒトモノクローナル抗体である。

MK-3415及び MK-6072の開発では、C. difficile 感染症（CDI）の標準的抗菌薬治療を受けている

初回又は再発の CDI 患者を対象として、各モノクローナル抗体を単剤（MK-3415又は MK-6072）

若しくは併用（MK-3415＋MK-6072、MK-3415A）で投与した際の CDI 再発抑制効果を評価した。

その結果、得られた臨床成績に基づき、MK-6072のみを製造販売承認申請することとした[2.7.3

項]。

非臨床においては、げっ歯類の C. difficile 感染モデルで CDI の完全な抑制のためにはトキシン

A 及びトキシン B いずれも中和されていることが必要であったため、MK-6072単剤では十分な有

効性が得られない可能性が考えられた。そのため、非臨床試験では MK-3415又は MK-6072の単剤

に加え、MK-3415A（併用）についても検討した。

以下に、本項[2.6.4 項]で記載した内容の要約を示す。

ハムスターの C. difficile 感染モデル（CDI ハムスター）を用いた薬理試験において有効性が確

認された際の MK-3415及び MK-6072の血清中濃度を検討するため、正常なハムスターを用いてス

パースサンプリングによる薬物動態試験を行った。その結果、CDI ハムスターにおいて CDI 抑制

効果を評価した時点である、MK-3415A（MK-3415 50 mg/kg 及び MK-6072 50 mg/kg）最終投与後

48時間の MK-3415及び MK-6072の血清中濃度の中央値は、それぞれ350及び320 μg/mL[資料

4.2.2.2.2: PK001]であり、別の薬物動態試験ではそれぞれ588及び493 μg/mL であった[資料4.2.2.2.1:

PD006]、[2.6.4.2.1 項]。

また、免疫グロブリン G（IgG）抗体である MK-3415及び MK-6072が静脈内投与後に循環血中

から腸上皮を通過し、腸管内腔に存在する C. difficile トキシンを中和するメカニズムを検討する

ため、in vivo 及び in vitro の組織分布試験を実施した[2.6.4.3 項]。正常ハムスター及び CDI ハム

スターを用いた in vivo 組織分布試験の結果、循環血中の MK-3415及び MK-6072は腸管内腔の感

染部位に到達し、その濃度は正常ハムスターに比べて CDI ハムスターで有意に高かった[2.6.4.3.1

項]。また、2次元培養した Caco-2細胞（ヒト結腸癌由来細胞株）の単層膜を用いた in vitro 組織試

験の結果、トキシンを管腔側コンパートメント（ヒトの腸管内腔を想定）に添加することにより、

MK-3415及び MK-6072の基底膜側コンパートメント（ヒトの循環血中を想定）から管腔側コンパ

ートメントへの透過率は大幅に増加した[2.6.4.3.2 項]。これは、トキシンにより腸上皮のバリア

機能が傷害され、細胞間隙から管腔側への抗体の非特異的な漏出が増加したためと考えられる。

したがって、in vivo 及び in vitro の組織分布試験の結果から、静脈内投与した MK-3415及び

MK-6072は腸組織の上皮下に分布するが、トキシンにより損傷した腸上皮細胞層を介して腸管内

腔へ漏出することで、腸管内腔のトキシンに直接作用すると考えられた。また、同じ損傷部位を



介してトキシンが腸管内腔から循環血中へ漏出した場合においても、そのトキシンに対して循環

血中の MK-3415及び MK-6072が直接作用することが示唆された。

2.6.4.2 分析法

薬物動態試験、毒性試験及びトキシコキネティクス試験では、MK-3415及び MK-6072の血清中

濃度の測定に免疫測定法を用いた。以下に、各試験で用いた測定法を示す。

ハムスターを用いた GLP 非準拠薬物動態試験（PD006）[2.6.5.3.1 項]

酵素結合免疫吸着法（ELISA）（捕捉試薬：トキシン A 又はトキシン B のフラグメント 4）

ハムスターを用いた in vivo 組織分布試験（PK002）[2.6.5.4.1 項]

ELISA（検出試薬：抗ヒト IgG、Bethyl Laboratories 社）

Caco-2細胞（2次元培養）の単層膜を用いた in vitro 組織分布試験（PK002）[2.6.5.4.3 項]

ELISA（検出試薬：抗ヒト IgG、Fisher 社）

マウスを用いた初期の GLP 準拠反復投与毒性試験（TT# -7811、MK-3415のみ）[2.6.7.1 項]

ELISA（捕捉試薬：トキシン A、検出試薬：抗ヒト IgG）[資料 4.2.2.1.5: 0483L7]

マウスを用いた GLP 準拠反復投与毒性試験（TT# -7803）[2.6.7.1 項]

ELISA（捕捉試薬：トキシン A フラグメント 4 又はトキシン B フラグメント 4、検出試薬：抗

ヒト IgG）[資料 4.2.2.1.6: 0483L8]

マウスを用いた GLP 非準拠探索的単回投与トキシコキネティクス試験（TT# -1108）[2.6.7.1 項]

電気化学発光（ECL）法（捕捉試薬及び検出試薬：抗イディオタイプ抗体）

マウスを用いた GLP 準拠反復投与毒性試験（TT# -1015）、（TT# -1079）[2.6.7.1 項]

バリデート済みの ECL 法（捕捉試薬及び検出試薬：抗イディオタイプ抗体）[資料 4.2.2.1.2:

048JTV]、[資料 4.2.2.1.1: 048G70]

これら 2 つの毒性試験（TT# -1015、TT# -1079）では、バリデート済みの ECL 法（ブリッジ

ングアッセイ）を用い、抗薬物抗体（ADA）を測定した（捕捉試薬：ビオチン化 MK-3415 又は

ビオチン化 MK-6072、検出試薬：ルテニウム化 MK-3415 又はルテニウム化 MK-6072、陽性対照：

アフィニティー精製したウサギ抗 MK-3415 ポリクローナル抗体又はウサギ抗 MK-6072 ポリクロ

ーナル抗体）[資料 4.2.2.1.3: 048LLP]、[資料 4.2.2.1.4: 048LYD]。バリデート済みの ECL 法では、

Meso Scale Discovery 社製のプラットフォームを使用した[表 2.6.4-1]。



以上の試験の概要は[2.6.5.1 項]に示した。なお、マウスを用いた GLP 非準拠単回投与トキシコ

キネティクス試験（1 試験）及び GLP 準拠反復投与毒性試験（4 試験）の結果については[2.6.7.1 項]

に示した。

表 2.6.4-1 MK-3415 及び MK-6072 の分析法

Method Description

Study Number

Study Title Species/Strain

Validated Assay/ GLP

Assay purpose

Drug assays for GLP toxicity studies

TT -1015 TT -1079 (BT00114 & BT00116)

Validation Report title: Validation of an Electrochemiluminescence Immunoassay for the Determination of MK-3415 Concentrations in CD-1 Mouse Serum Using Meso Scale Discovery’s Sector Imager 6000 Analyzer. Validation of an Electrochemiluminescence Immunoassay for the Determination of MK-6072 Concentrations in CD-1 Mouse Serum using Meso Scale Discovery’s Sector Imager 6000 Analyzer.

Mouse/ CD-1

Yes/Yes Assay purpose: Determination of drug level in mouse serum Type: ECL

ADA assays for GLP toxicity studies

TT -1015 TT 1079 (BT00115 & BT00117)

Validation Report title: Validation of an Electrochemiluminescence Immunoassay for the Detection of Anti-MK-3415 Antibodies in CD-1 Mouse Serum Using Meso Scale Discovery’s Sector Imager 6000 Analyzer. Validation of an Electrochemiluminescence Immunoassay for the Detection of Anti-MK-6072 Antibodies in CD-1 Mouse Serum Using Meso Scale Discovery’s Sector Imager 6000 Analyzer.

Mouse/ CD-1

Yes/Yes Assay purpose: Determination of ADA in mouse serum Type: ECL



2.6.4.2.1 ハムスターを用いた薬物動態試験

CDI ハムスターを用いた薬理試験（PD005及び PD023）において有効性が確認された際の

MK-3415及び MK-6072の血清中濃度を検討するため、正常ハムスターを用いて2つの薬物動態試

験（PK001及び PD006）を実施した[2.6.5.3.1 項]。本項では、これら薬理試験（PD005及び PD023）

及び薬物動態試験（PK001及び PD006）の結果を要約した。

CDI ハムスターを用いた薬理試験（PD005及び PD023）

薬理試験[資料4.2.1.1.5: PD005]において、ハムスターに MK-3415A（MK-3415 50 mg/kg/day 及び

MK-6072 5.6～50 mg/kg/day）を4日間腹腔内投与後、C. difficile の芽胞を接種した（CDI ハムスタ

ー：直接接種による初回感染モデル）。その結果、MK-3415A 最終投与後48時間の生存数は、

MK-3415A 非投与群で55例中3例であったのに対し、MK-3415A 投与群では65例中61例と有意に増

加した（P<0.0001）。また、試験期間後半（Day5～11）の生存数も、MK-3415A 非投与群で55例中

0例であったのに対し、MK-3415A 投与群では65例中36例と有意に増加した（P<0.0001）。また、

別途実施した CDI ハムスターを用いた薬理試験[資料4.2.1.1.21: PD023]の成績から、有効性がみら

れる最大用量は MK-3415 50 mg/kg/day 及び MK-6072 50 mg/kg/day の4日間併用投与であることが

示された[2.6.3.1 項]。

これら CDI ハムスターを用いた薬理試験（PD005及び PD023）では血清中薬物濃度を測定しな

かったが、ヒトにおける CDI 再発抑制のための初回投与量の選択に際して有効性に関連する

MK-3415及び MK-6072の血清中濃度を検討するため、薬物動態試験（PK001及び PD006）を実施

した。なお、ハムスターを用いた組織分布試験（PK002）の結果、CDI ハムスターと正常ハムス

ターで腸組織中の MK-3415及び MK-6072の薬物濃度が類似していたこと[2.6.5.4.1 項]、すなわち

作用部位付近の曝露量は正常ハムスターとCDIハムスターで同程度であると考えられたことから、

これら薬物動態試験（PK001及び PD006）では正常ハムスターを用いた。

正常ハムスターを用いた薬物動態試験（PK001及び PD006）

薬物動態試験[資料4.2.2.2.2: PK001]において、正常ハムスターに MK-3415A（MK-3415 50 mg/kg

及び MK-6072 10又は50 mg/kg）を1日1回、4つの異なる投与期間（1、2、3又は4日間）で投与し

た。投与経路は、薬理試験（PD005及び PD023）と同様に腹腔内投与とした[2.6.5.3.1 項]。その結

果、投与回数と曝露量との間に関連性が認められなかったため、4つの投与期間の異なる群のデー

タを統合し、要約統計量を算出した[表 2.6.4-2]。CDI ハムスターにおいて CDI 抑制効果を評価し

た時点である、MK-3415A 最終投与後48時間の MK-3415及び MK-6072の血清中濃度の中央値（変

動係数）はそれぞれ350 μg/mL（54.9%）及び320 μg/mL（63.1%）であった。

続いて実施した薬物動態試験[資料4.2.2.2.1: PD006]では、より例数を増やし、正常ハムスターに

MK-3415A（MK-3415 50 mg/kg/day 及び MK-6072 50 mg/kg/day）を4日間連日投与した。MK-3415A

最終投与後48時間の MK-3415及び MK-6072の血清中濃度の中央値はそれぞれ588 μg/mL 及び

493 μg/mL であり、先に実施した試験（PK001）の結果に比べるとやや高かったものの、著しい差

はみられなかった[表 2.6.4-2]。



表 2.6.4-2 正常ハムスターに MK-3415A（MK-3415 50 mg/kg/day 及び MK-6072 50 mg/kg/day）

を投与した際の最終投与後 48時間の MK-3415 及び MK-6072 の血清中濃度の要約統計量（PK001

及び PD006） PK001 PD006 Actoxumab Bezlotoxumab Actoxumab BezlotoxumabN 9 8 22 22 Mean (g/mL) 481 376 605 531 SD (g/mL) 264 237 246 247 Min (g/mL) 208 128 279 221 Median (g/mL) 350 320 588 493 Max (g/mL) 1010 805 1171 1213CV% 54.9 63.1 40.7 46.5

[2.6.5.3.1 項]

2.6.4.3 分布

放射性標識体を用いた MK-3415及び MK-6072の標準的な組織分布試験は、日米 EU 医薬品規制

調和国際会議（ICH）S6（R1）のガイダンス「バイオテクノロジー応用医薬品の非臨床における

安全性評価ガイダンス」に基づき、実施していない。ただし、MK-3415及び MK-6072が腸上皮を

通過し腸管内腔に存在する C. difficile トキシンを中和するメカニズムを検討するため、in vivo 及

び in vitro の組織分布試験を実施した。MK-3415については、正常ハムスターを用いた免疫組織化

学的手法による予備的な組織分布試験（PD007）において腸組織への分布が認められていたが、

より包括的に評価するため、MK-3415及び MK-6072の両化合物について、in vivo 及び in vitro の

組織分布試験（PK002）を実施した[2.6.5.1 項]。

2.6.4.3.1 ハムスターを用いた in vivo 組織分布試験

ヒトにおいて静脈内投与後全身循環したMK-3415Aが腸管内腔の感染部位に到達するかを検討

するため、ハムスターを用いて腸組織への分布を評価した[資料4.2.2.3.2: PK002]。まず、C. difficile

の毒素産生菌（B1株）の接種（初回）の有無により、ハムスターを2群（接種あり：CDI ハムス

ター、接種なし：正常ハムスター）に分け、続いて、両群に MK-3415A（MK-3415 50 mg/kg 及び

MK-6072 50 mg/kg）を単回皮下投与した。C. difficile の毒素産生菌を接種後、腸組織を様々な時点

で CDI ハムスター及び正常ハムスターから採取し、切除した腸組織のホモジネート中及び腸内容

物中のヒト IgG（MK-3415及び MK-6072）濃度を ELISA で測定した。毒素産生菌接種後2日目の

結果を[図 2.6.4-1]に示す。腸組織のホモジネート中のヒト IgG（MK-3415及び MK-6072）濃度は、

CDI ハムスター及び正常ハムスターの間で有意な差はみられなかった（[図 2.6.4-1]、A）。一方

で、腸内容物中、すなわち感染部位に該当する腸管内腔のヒト IgG（MK-3415及び MK-6072）濃

度は、正常ハムスターに比べ CDI ハムスターで高く、その差は空腸及び盲腸で有意であった。特

に盲腸では、正常ハムスターではヒト IgG（MK-3415及び MK-6072）がほぼ検出されなかったの

に対し、CDI ハムスターでは顕著に高かった（[図 2.6.4-1]、B）。



図 2.6.4-1 CDI ハムスターに MK-3415A（MK-3415 50 mg/kg 及び MK-6072 50 mg/kg）を皮

下投与した際の腸組織への分布（正常ハムスターに対する比較、PK002） CDI ハムスター（黒色、n=4）及び正常ハムスター（白色、n=3）から毒素産生菌接種後2日目に摘出した（A）腸組織のホモジネート中、（B）腸内容物中のヒト IgG（MK-3415及び MK-6072）濃度平均値±標準偏差 Duod：十二指腸、Jej：空腸、Ile：回腸、Col：上行結腸、Cec：盲腸 *P<0.01：正常ハムスターとの比較

2回の独立した試験のうち1試験のデータを示した

[2.6.5.4.1 項]

また、CDI ハムスターでは正常ハムスターに比べて腸管壁を通過する MK-3415及び MK-6072

が増加することを、毒素産生菌接種後2日目に採取した組織の免疫組織化学的検査により、細胞レ

ベルでも確認した[資料4.2.2.3.2: PK002]、[2.6.5.4.1 項]。正常ハムスターでは、MK-3415及び

MK-6072は主に上皮下粘膜（粘膜固有層を含む）に存在し、腸管内腔への漏出を防ぐバリア機能

を持つ上皮細胞層は染色されなかった。一方、CDI ハムスターでは、上皮細胞層を含む粘膜全体

に MK-3415及び MK-6072のシグナルが検出され、上皮細胞層にかなりの損傷及び脱落がみられた。

したがって、上皮細胞の損傷により MK-3415及び MK-6072の腸管内腔への移行が可能になったと

考えられた。

以上の結果から、C. difficile トキシンにより腸上皮が傷害されたことにより、皮下投与後全身循

環した MK-3415及び MK-6072の腸管内腔への移行が促進されたと考えられた。

2.6.4.3.2 Caco-2細胞を用いた in vitro 組織分布試験

ヒトにおいて静脈内投与した MK-3415及び MK-6072が腸管内腔に存在する C. difficile トキシン

を中和するメカニズムを検討するため、2次元培養した Caco-2細胞の単層膜を用いた in vitro 組織

分布試験を実施した[資料4.2.2.3.2: PK002]。本試験では、ヒト結腸癌由来細胞株であり培養により

腸管上皮様に分化する Caco-2細胞の単層膜を、管腔側コンパートメント（ヒトの腸管内腔を想定）

と基底膜側コンパートメント（ヒトの循環血中を想定）に分けることにより正常な腸粘膜上皮細

胞の細胞極性を模した条件下で、経上皮電気抵抗により細胞膜透過性を評価した（経上皮電気抵



抗の減少は上皮層が損傷を受けたことを示唆）[資料4.3: 27]。循環血中の MK-3415及び MK-6072

が、腸管内腔のトキシンをどのように中和するかを検討するため、トキシン A 及びトキシン B を

管腔側コンパートメントに添加したときの経上皮電気抵抗を測定した[2.6.5.4.2 項]。その結果、

経上皮電気抵抗はトキシンの濃度に依存して減少した（[図 2.6.4-2]、●）。しかし、トキシンを

添加した管腔側コンパートメントに MK-3415又は MK-6072を添加すると、トキシン添加24時間後

の経上皮電気抵抗の減少は緩やかになり、トキシンに対して強い中和作用を示した（[図 2.6.4-2]、

■）。

また、トキシンを添加した側とは異なる基底膜側コンパートメントに MK-3415又は MK-6072

を添加した場合についても経上皮電気抵抗を評価した結果（[図 2.6.4-2]、▲）、管腔側コンパー

トメントに薬物を添加した場合（■）に比べるとその差は小さいものの、薬物非添加群（●）と

の間に有意な差がみられた。この結果から、トキシンにより腸上皮が損傷することで腸組織中の

MK-3415及び MK-6072の腸管内腔への移行が増加し、トキシンを中和することが示唆された。

さらに、Fc 領域を介した輸送により中和作用を示す可能性を検討するため、MK-3415又は

MK-6072のジスルフィド結合で連結した2つの抗原結合性フラグメント［F(ab’)2、トキシンとの結

合部位を2ヵ所とも持っているが Fc 領域を持たない］を基底膜側コンパートメントに添加し、経

上皮電気抵抗を評価した（[図 2.6.4-2]、▼）。その結果、完全な抗体（▲）と同様にトキシンを

中和する作用がみられたことから、基底膜側コンパートメント（ヒトの循環血中）に添加した抗

体が、管腔側コンパートメント（ヒトの腸管内腔）のトキシンに対して中和作用を示すために、

Fc 領域は必要ないことが示された。



図 2.6.4-2 Caco-2 細胞単層膜におけるトキシン A 濃度及びトキシン B 濃度と経上皮電気抵抗

の関係並びに MK-3415 及び MK-6072 のトキシン中和作用（PK002）管腔側コンパートメントに（A）トキシン A／（B）トキシン B を添加後24時間に測定した、トキシン濃度に対する経上皮電気抵抗

TER：経上皮電気抵抗、[TcdA]：トキシン A 濃度、[TcdB]：トキシン B 濃度 ●：MK-3415又は MK-6072を添加せず ■：（A）MK-3415／（B）MK-6072 100 μg/mL を管腔側コンパートメントに添加 ▲：（A）MK-3415／（B）MK-6072 100 μg/mL を基底膜側コンパートメントに添加 ▼：（A）MK-3415／（B）MK-6072の F(ab’)2 100 μg/mL を基底膜側コンパートメントに添加

MK-3415又は MK-6072若しくはこれらの F(ab’)2はトキシン添加の18時間前に添加した *P<0.05及び**P<0.001：MK-3415又は MK-6072非添加時との比較平均値±標準偏差（少なくとも4回の独立した試験データ） [2.6.5.4.2 項]

以上の結果から、基底膜側コンパートメントに添加した MK-3415及び MK-6072が管腔側コンパ

ートメントへ移行し、トキシンを中和したと考えられた。そこで、管腔側コンパートメントにト

キシン存在下と非存在下で、基底膜側から管腔側コンパートメントに移行した MK-3415及び

MK-6072の濃度を比較した。その結果、トキシン存在下では、MK-3415及び MK-6072の基底膜側

から管腔側コンパートメントへの移行は経時的に増加し、トキシン濃度への依存性がみられた。

基底膜側コンパートメントに対する管腔側コンパートメントの MK-3415及び MK-6072の濃度（ト

キシン添加後48時間）の割合は、トキシン非存在下ではともに0.2%未満と小さかった一方で、ト

キシン A（64 ng/mL）又はトキシン B（256 ng/mL）存在下ではそれぞれ40%以上及び20%以上で

あった（[図 2.6.4-3]、A 及び B）、[2.6.5.4.3 項]。また、MK-3415及び MK-6072の F(ab’)2について

も同様に割合を評価したところ、トキシン存在下及び非存在下のいずれにおいても MK-3415及び

MK-6072と同程度又はそれ以上であった（[図 2.6.4-3]、C 及び D）。したがって、MK-3415及び

MK-6072が管腔側コンパートメントへ移行する際に、Fc 領域を介した輸送経路は関与しないこと

が示された[2.6.5.4.4 項]。



図 2.6.4-3 Caco-2 細胞単層膜における MK-3415 及び MK-6072 の

基底膜側コンパートメントから管腔側コンパートメントへの移行（PK002）

MK-3415又は MK-6072若しくはこれらの F(ab’)2 100 μg/mL を基底膜側に添加した18時間後にトキシン又は緩衝液を管腔側に添加後の、管腔側の MK-3415濃度（[actoxumab]apical）及び MK-6072濃度（[bezlotoxumab]apical）

上：（A）トキシン A を各濃度（ng/mL）で添加後の管腔側コンパートメントの MK-3415の濃度推移（B）トキシン B を各濃度（ng/mL）で添加後の管腔側コンパートメントの MK-6072の濃度推移 *P<0.05及び**P<0.001：同じ測定時点内での比較、#P<0.05及び##P<0.001：同じトキシン濃度内での比較

下： ●：緩衝液を管腔側に添加後の管腔側の（C）MK-3415／（D）MK-6072濃度推移 ■：緩衝液を管腔側に添加後の（C）MK-3415／（D）MK-6072の F(ab’)2濃度推移 ▲：（C）トキシン A 64 ng/mL／（D）トキシン B 256 ng/mL を管腔側に添加後の（C）MK-3415／（D）MK-6072濃度推移 ▼：（C）トキシン A 64 ng/mL／（D）トキシン B 256 ng/mL を管腔側に添加後の（C）MK-3415／（D）MK-6072の F(ab’)2濃度推移 *P<0.01及び**P<0.0001：トキシン非存在下との比較、##P<0.0001：トキシン存在下での F(ab’)2との比較

平均値±標準偏差（少なくとも2回の独立した試験データ） [2.6.5.4.3 項]、[2.6.5.4.4 項]



2.6.4.3.3 静脈内投与した抗体が腸管内腔の C. difficile トキシンを中和するメカニズム

[2.6.4.3.1 項]及び[2.6.4.3.2 項]の結果から、静脈内投与した MK-3415及び MK-6072は以下に示

したメカニズムにより、腸管内腔の C. difficile トキシンを中和すると考えられた[図 2.6.4-4]。

1) MK-3415及び／又は MK-6072（抗体）を静脈内投与すると全身循環し、まず、腸上皮の基

底膜側（basolateral、循環血中）に抗体が高濃度で存在し、限定的ではあるが細胞間隙経路

を介した管腔側（apical、腸管内腔）への漏出もみられる。

2) C. difficile の毒素産生菌が腸管内に定着すると、管腔側にトキシンの蓄積が始まるが、基底

膜側から移行した抗体により、一定量のトキシンが中和される。

3) トキシンにより上皮が損傷すると、

• 管腔側への抗体の移行が増加することにより、管腔側のトキシンが中和される

• 基底膜側にトキシンが移行した場合でも、基底膜側に存在する抗体により中和され

る

十分な量の抗体が管腔側に移行すると、抗体がトキシンによる新たな傷害を防御し、上皮

が回復・治癒する。抗体－トキシン複合体が腸管内腔から消失すると、腸管壁は元の状態

（I）に回復し、基底膜側の抗体が再び高濃度となる。

図 2.6.4-4 静脈内投与した抗体が腸管内腔の C. difficile トキシンを中和するメカニズム (I) 健康な個体では、抗体は腸上皮の basolateral 側に存在し、細胞間隙から apical 側へわずかに移行する (II) 感染時には、トキシンは腸上皮の apical 側に蓄積し、わずかに移行した抗体により中和される (III) トキシンが上皮細胞を標的として腸管壁のバリア機能を破壊することで、抗体の腸管内腔への移行が可

能となる。結果として、トキシンの中和→上皮の傷害の防御→上皮の回復及び腸の完全なバリア機能の再建をもたらす

[資料4.2.2.3.2: PK002]、[2.6.5.1 項]



以上より、抗体を静脈内投与すると全身循環後、まずは腸組織の上皮下に分布するが、C. difficile

に感染するとその大部分はトキシンによる損傷部位を介して腸管内腔に漏出し、腸管内腔のトキ

シンに直接作用すると考えられた。また、同じ損傷部位を介してトキシンが腸管壁の基底膜側（循

環血中）に漏出した場合でも、そのトキシンに対して循環血中の抗体が直接作用することが示唆

された。腸管壁が顕著な損傷を受ける前に上皮が回復すると、CDI の症状を示さない可能性があ

る（無症候性の定着）。CDI 再発抑制を対象とした患者集団では、既に腸管に病変部が存在し、[図

2.6.4-4]の III の状態からサイクルが開始すると考えられるが、標準治療である抗菌薬療法に加え

MK-3415及び／又はMK-6072によりトキシンを中和することで[図 2.6.4-4]の Iの状態になり、CDI

の再発が抑制できると考えられる。

2.6.4.4 代謝

ICH S6（R1）のガイダンス「バイオテクノロジー応用医薬品の非臨床における安全性評価」に

基づき、MK-3415及び MK-6072について従来の代謝試験は実施していない。

2.6.4.5 排泄

ICH S6（R1）のガイダンス「バイオテクノロジー応用医薬品の非臨床における安全性評価」に

基づき、MK-3415及び MK-6072について従来の排泄試験は実施していない。

2.6.4.6 薬物動態学的薬物相互作用

IgG 抗体である MK-3415及び MK-6072は、蛋白の異化作用により消失することから、CYP 及び

他の代謝酵素に作用する薬物による影響を受ける可能性は低い。また、MK-3415及び MK-6072は

外因性蛋白を標的とした IgG 抗体であるため、CYP、その他の代謝酵素又はトランスポーターの

発現に直接的に作用することにより低分子化合物の消失に影響を及ぼす可能性は低い。さらに、

in vitro 試験及び動物を用いた試験は、ヒトにおける蛋白製剤の薬物相互作用の可能性を予測する

ために有用ではないと考えられた[資料4.3: 17]。したがって、MK-3415及び MK-6072が薬物相互

作用を受ける又は引き起こす可能性について、非臨床薬物動態試験による検討は実施しなかった。

2.6.4.7 その他の薬物動態試験

その他の薬物動態試験は実施していない。



2.6.4.8 考察及び結論

ヒトにおける CDI 再発抑制のための初回投与量の選択に際して、正常ハムスターを用いた薬物

動態試験（MK-3415 50 mg/kg 及び MK-6072 50 mg/kg を投与）により、有効性に関連する MK-3415

及び MK-6072の血清中濃度を確認した。その結果、生存率による CDI 抑制効果の評価時点である

MK-3415A 最終投与後48時間の MK-3415及び MK-6072の血清中濃度の中央値は、それぞれ350及

び320 μg/mL であった。

また、ヒトにおいて静脈内投与した MK-3415及び MK-6072が腸管内腔に存在する C. difficile ト

キシンを中和するメカニズムを検討するため、in vivo 及び in vitro の組織分布試験を実施した。

ハムスターを用いた in vivo 組織分布試験の結果、循環血中の MK-3415及び MK-6072は腸管内

腔の感染部位に到達し、その濃度は正常ハムスターに比べて CDI ハムスターで有意に高かった。

Caco-2細胞を用いた in vitro 組織分布試験［単層で管腔側（ヒトの腸管内腔を想定）と基底膜側

（ヒトの循環血中を想定）の2つのコンパートメントに分割］の結果、基底膜側コンパートメント

に添加した MK-3415及び MK-6072の管腔側コンパートメントへの移行は、管腔側にトキシンを添

加することにより大幅に増加した。これは、トキシンにより腸上皮のバリア機能が傷害され、細

胞間隙から管腔側への MK-3415及び MK-6072の非特異的な漏出が増加したためと考えられる。

以上の in vivo 及び in vitro の組織分布試験から、静脈内投与した MK-3415及び MK-6072は循環

血中から腸組織の上皮下に分布するが、トキシンにより損傷した腸上皮細胞層を介して腸管内腔

へ漏出することで、腸管内腔のトキシンに直接作用すると考えられた。また、同じ損傷部位を介

してトキシンが腸管内腔から腸管上皮下に漏出した場合においても、そのトキシンに対して

MK-3415及び MK-6072が直接作用することが示唆された。循環血中の抗体薬の半減期が長いこと

が、腸上皮の基底膜側（循環血中）における一定かつ持続的な中和作用を可能にしていると考え

られた。



2.6.4.9 参考文献

[資料4.3: 17] Evers R, Dallas S, Dickmann LJ, Fahmi OA, Kenny JR, Kraynov E, et al. Critical

review of preclinical approaches to investigate cytochrome P450-mediated

therapeutic protein drug-drug interactions and recommendations for best

practices: a white paper. Drug Metab Dispos 2013:1-46.

[資料4.3: 37] Voth DE, Ballard JD. Clostridium difficile toxins: mechanism of action and role

in disease. Clin Microbiol Rev 2005;18(2):247-63.

[資料4.3: 27] Sambuy Y, De Angelis I, Ranaldi G, Scarino ML, Stammati A, Zucco F. The

Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and

culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol.

2005 Jan;21(1):1-26.

CTD 第 2 部

2.6 非臨床試験の概要文及び概要表

2.6.5 薬物動態試験概要表

MSD 株式会社

ベズロトクスマブ（遺伝子組換え）注射剤 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.5 薬物動態試験概要表

2.6.5 薬物動態試験概要表 - 1 -

目次

頁

2.6.5 薬物動態試験概要表 ..................................................................................................................... 2

2.6.5.1 薬物動態試験：一覧表 ......................................................................................................... 2

2.6.5.2 分析法及びバリデーション試験 ......................................................................................... 3

2.6.5.3 薬物動態試験：吸収 ............................................................................................................. 4

2.6.5.3.1 反復投与後の吸収 ......................................................................................................... 4

2.6.5.4 薬物動態試験：分布 ............................................................................................................. 6

2.6.5.4.1 ハムスターを用いた in vivo 組織分布試験 ................................................................ 6

2.6.5.4.2 Caco-2細胞の単層膜を用いた in vitro 組織分布試験［管腔側（apical）に添

加したトキシン A 及びトキシン B の作用（経上皮電気抵抗への影響）並び

に MK-3415及び MK-6072のトキシン中和作用の評価］ ....................................... 7

2.6.5.4.3 Caco-2細胞の単層膜を用いた in vitro 組織分布試験［MK-3415及び

MK-6072の基底膜側（basolateral）から管腔側（apical）への輸送の評価（ト

キシンの濃度を漸増）］ ............................................................................................... 9

2.6.5.4.4 Caco-2細胞の単層膜を用いた in vitro 組織分布試験［MK-3415及び

MK-6072の基底膜側（basolateral）から管腔側（apical）への輸送の評価（ト

キシンの濃度は一定）］ ............................................................................................. 10



2.6.5 薬物動態試験概要表

2.6.5.1 薬物動態試験：一覧表被験物質：MK-3415（Actoxumab）及び MK-6072（Bezlotoxumab）

試験の種類試験系投与経路実施施設試験番号／記載箇所吸収

Preliminary Study of the Pharmacokinetics of Actoxumab and Bezlotoxumab in Healthy Hamsters

Hamsters Intraperitoneal Massachusetts Biologics Laboratories Boston, MA

PK001 [資料4.2.2.2.2: PK001]

Pharmacokinetics of Actoxumab and Bezlotoxumab in Hamsters Hamsters Intraperitoneal Massachusetts Biologics Laboratories Boston, MA

PD006 [資料4.2.2.2.1: PD006]

分布

CDA1 Localization to Hamster Gut Mucosa as Determined by Immunohistochemistry

Hamsters Intraperitoneal Massachusetts Biologics Laboratories Boston, MA

PD007 [資料4.2.2.3.1: PD007]

Transport of Systemic Actoxumab and Bezlotoxumab to the Gut Lumen

Hamsters Subcutaneous Merck Research Laboratories Kenilworth, NJ

PK002 [資料4.2.2.3.2: PK002]

Effects of Apical Toxin on TER and Neutralization by Actoxumab and Bezlotoxumab in a Two-dimensional Caco-2 Cell Monolayer Culture System

Caco-2 Cell line

In vitro Merck Research Laboratories Kenilworth, NJ

PK002 [資料4.2.2.3.2: PK002]

Transport of Actoxumab and Bezlotoxumab from the Basolateral to the Apical Side of Caco-2 Cell Monolayers as a Function of Toxin Concentration

Caco-2 Cell line


PK002 [資料4.2.2.3.2: PK002]

Transport of Actoxumab, Bezlotoxumab, and Respective F(ab’)2 from the Basolateral to the Apical Side of Caco-2 Monolayers at a Fixed Concentration of Toxin

Caco-2 Cell line


PK002 [資料4.2.2.3.2: PK002]



2.6.5.2 分析法及びバリデーション試験

[2.6.4.2 項]参照



2.6.5.3 薬物動態試験：吸収

2.6.5.3.1 反復投与後の吸収被験物質：MK-3415（Actoxumab）及び MK-6072（Bezlotoxumab）

Species/Strain Hamster Study Number PK001[資料4.2.2.2.2: PK001] Number of animals 11 in 50 mg/kg Actoxumab + 50 mg/kg Bezlotoxumab;

12 in 50 mg/kg Actoxumab + 10 mg/kg Bezlotoxumab Method of administration / Duration of dosing

Intraperitoneal / 1-4 daily doses

Dose (mg/kg) 50 mg/kg Actoxumab + 50 mg/kg Bezlotoxumab 50 mg/kg Actoxumab+10 mg/kg Bezlotoxumab Analytes Actoxumab and Bezlotoxumab PK parameters: Concentration at 48 hr after last dose

4, 3, 2, 1 daily doses combined a Actoxumab Bezlotoxumab Actoxumab Bezlotoxumab N b 9 8 10 9 Mean (g/mL) 481 376 373 76.2 Standard Deviation (g/mL) 264 237 138 55.8 Min (g/mL) 208 128 225 21.2 Median (g/mL) 350 320 337 54.3 Max (g/mL) 1010 805 622 187 CV% 54.9 63.1 37.0 73.3

a： Dose groups from 4, 3, 2, and 1 daily doses were combined due to high variability in observed concentrations between groups and small numbers per group. b： Low drug concentrations occurred in ~20% of the hamsters. Actoxumab data from 4 hamsters (2 in 50 mg/kg each mAb and 2 in 50 mg/kg actoxumab + 10 mg/kg

bezlotoxumab groups) were excluded from the summary analysis due to concentrations ≤1% of median for each time point prior to exclusion. Bezlotoxumab data from 6 hamsters (3 in 50 mg/kg each mAb and 3 in 50 mg/kg actoxumab + 10 mg/kg bezlotoxumab groups) were excluded from the summary analysis due to concentrations ≤1% of median for each time point prior to exclusion. Data from Tables 2, 3, 4, and 5 of PK001[資料4.2.2.2.2: PK001].



2.6.5.3.1 反復投与後の吸収（続き）被験物質：MK-3415（Actoxumab）及び MK-6072（Bezlotoxumab）

Species/Strain Hamster Study Number PD006[資料4.2.2.2.1: PD006] Number of animals 30 Vehicle/Formulation Actoxumab (lot GS-CDA1-05-01, 25 mg/mL), PBSa and Bezlotoxumab (lot M47A-05-02FC, 25 mg/mL), PBS a Method of administration/Duration of dosing Intraperitoneal/ 4 daily doses Dose (mg/kg) 50 mg/kg Actoxumab and Bezlotoxumab Sample serum Analytes Actoxumab and Bezlotoxumab Assay Toxin fragment 4 binding ELISA PK parameters: Concentration at 48 hr after last dose

Dosed daily for 4 days Actoxumab Bezlotoxumab N b 22 22 Mean (g/mL) 605 531 Standard Deviation (g/mL) 246 247 Min (g/mL) 279 221 Median (g/mL) 588 493 Max (g/mL) 1171 1213 CV% 40.7 46.5

a： PBS= phosphate buffered saline. b： Six animals were excluded due to atypically low actoxumab and bezlotoxumab serum concentrations and two other animals did not have blood drawn at 48 hr because they

did not survive the retro-orbital bleed at 24 hr. Data from Table 3 of PD006[資料4.2.2.2.1: PD006].



2.6.5.4 薬物動態試験：分布

2.6.5.4.1 ハムスターを用いた in vivo 組織分布試験

被験物質：MK-3415（Actoxumab）及び MK-6072（Bezlotoxumab）

Transport of Systemic Actoxumab and Bezlotoxumab to the Gut Lumen Study No.: PK002[資料4.2.2.3.2: PK002] Species: Golden Syrian Hamsters Number of animals (M): n=4 CDI, n=3 healthy Feeding condition: Unknown

Vehicle/Formulation: Actoxumab: Lot WL00040965 Bezlotoxumab: Lot WL00040967

Method of administration: subcutaneous Dose (mg/kg): 50 mg/kg (each)

Analytes: Actoxumab and Bezlotoxumab Assay: Human IgG ELISA

Sample/Sampling Time: Homogenized Tissue (g/g) / 2 days Gut Lumenal Contents (g/mL) / 2 days

Tissue Healthy Hamsters

(Mean ± SD) CDI Hamsters (Mean ± SD)

Healthy Hamsters (Mean ± SD)

CDI Hamsters (Mean ± SD)

duodenum 168 26.7 215 58.4 0.419 0.419 2.05 3.02 jejunum 233 16.2 319 57.6 0.165 0.0271 4.85* 2.08

ileum 224 52.9 245 27.7 3.73 2.24 6.76 1.33 colon 44.3 3.47 115 31.0 2.25 1.39 7.91 4.30 cecum 320 62.4 240 38.7 0.204 0.181 67.3* 28.3

Additional Information: Hamsters were first challenged with or without a toxigenic strain of C. difficile (strain B1) and then administered a single SC dose of 50 mg/kg of each antibody. Human IgG concentrations representing the combined concentrations of actoxumab and bezlotoxumab were determined in homogenized whole intestinal tissues and lumenal contents from healthy and C. difficile-infected (CDI) hamsters, harvested 2 days after challenge. No significant differences in the levels of actoxumab and bezlotoxumab in the homogenized tissues were found when comparing healthy to C. difficile infected hamsters across all tissues. Concentrations in gut lumen were higher in hamsters with CDI compared with healthy hamsters. * is p<0.01 compared to corresponding lumenal contents in healthy hamsters. The values listed are from Table 4 of PK002 [資料4.2.2.3.2: PK002].



2.6.5.4.2 Caco-2細胞の単層膜を用いた in vitro 組織分布試験［管腔側（apical）に添加したトキシン A 及びトキシン B の作用（経上皮電気抵抗への影響）並びに MK-3415及び MK-6072のトキシン中和作用の評価］


Type of Study: Effects of Apical Toxin on TER and Neutralization by Actoxumab and Bezlotoxumab in a Two-Dimensional Caco-2 Cell Monolayer Culture System

Study No.: PK002[資料4.2.2.3.2: PK002]

Method: Two-dimensional Caco-2 cell monolayer culture system was treated with C. difficile toxin A (TcdA) or toxin B (TcdB) in the apical chamber in the presence or absence of actoxumab or bezlotoxumab or their respective F(ab’)2. The integrity of the epithelial layer was monitored by measuring the transepithelial electrical resistance (TER) at 24 hr after addition of toxin to the apical chamber. Antibodies were added 18 hr prior to addition of toxins. TER measurements were normalized to values obtained in the absence of toxin at each time point to account for minor time-dependent variability.

Results: When increasing concentrations of toxin were applied to the apical chamber, normalized TER values decreased, indicating that the integrity of the epithelial monolayer had been compromised. When antibody was also added to the apical chamber, the antibodies showed a strong neutralizing effect on the toxins as shown by the shift toward higher TER values (approaching 1). A significant but smaller shift was also observed when antibodies were added to the basolateral/systemic side of the cell monolayer, approximating the protection afforded by systemically-circulating neutralizing antibodies in the context of CDI. Experiments with F(ab’)2 applied to the basolateral chamber showed similar neutralizing effects to that of intact antibodies, demonstrating that Fc regions of IgG molecules on the basolateral side of the cell monolayer are not necessary for transepithelial toxin neutralization. The values listed are from Table 5 and 6 of PK002.




Normalized TER Values from Two-dimensional Caco-2 Cell Monolayer Culture System (Mean SD)

[TcdA] ng/mL to apical chamber [TcdB] ng/mL in apical chamber 0.1 0.3 1 3 10 1 3 10 30 100

No Actoxumab added to either chamber No Bezlotoxumab added to either chamber 0.818 ± 0.0729

0.413 ± 0.203

0.113 ± 0.0807

0.0307 ± 0.0136

0.0103 ± 0.00383

0.907 ± 0.0788

0.726 ± 0.175

0.390 ± 0.175

0.149 ± 0.164

0.0478 ± 0.0334

Actoxumab F(ab’)2 added to basolateral chamber 100 g/mL Bezlotoxumab F(ab’)2 added to basolateral chamber 100 g/mL 0.919 ± 0.0523

0.749** ± 0.0917

0.376**± 0.226

0.0884 ± 0.0466

0.0300 ± 0.0152

0.980 0.0303

0.898*± 0.0709

0.681**± 0.177

0.398** ± 0.243

0.174 ± 0.204

Actoxumab added to basolateral chamber 100 g/mL Bezlotoxumab added to basolateral chamber 100 g/mL 0.882 0.0125

0.649** ± 0.164

0.274* ± 0.198

0.0660 ± 0.0314

0.0258 ± 0.0142

0.948 ± 0.0366

0.865 ± 0.111

0.709** ± 0.224

0.421** ± 0.317

0.180 ± 0.224

Actoxumab added to apical chamber 100 g/mL Bezlotoxumab added to apical chamber 100 g/mL 0.979* ± 0.0140

0.961** ± 0.0152

0.945** ± 0.0186

0.949** ± 0.0323

0.931** ± 0.0526

0.961 0.0284

0.932* ± 0.0638

0.937** ± 0.0447

0.882** ± 0.0924

0.792** ± 0.152

* is p<0.05 and ** is p<0.001 vs no Actoxumab added. * is p<0.05 and ** is p<0.001 vs no Bezlotoxumab added.



2.6.5.4.3 Caco-2細胞の単層膜を用いた in vitro 組織分布試験［MK-3415及び MK-6072の基底膜側（basolateral）から管腔側（apical）への輸送の評価（トキシンの濃度を漸増）］


Type of study: Transport of Actoxumab and Bezlotoxumab from the Basolateral to the Apical Side of Caco-2 Cell Monolayers as a Function of Toxin Concentration

Study No.: PK002[資料4.2.2.3.2: PK002]

Method: Antibodies (100 g/mL) were added to the basolateral chamber 18 hr prior to addition of toxin or buffer. Concentrations of actoxumab or bezlotoxumab were measured in the apical chamber of a two-dimensional Caco-2 cell monolayer culture system at various times after addition of increasing concentrations of toxin. A human IgG ELISA was used to measure antibody concentrations in separate experiments for actoxumab or bezlotoxumab. Results: Transport to the apical chamber was minimal 18 hr after addition of antibodies to the basolateral chamber prior to addition of toxin (at t=0 with respect to toxin addition). Transport of antibodies into the apical chamber increased with time in the presence of toxin and the effect was dependent on the concentration of toxin added to the apical chamber. At 48 hr, the percentage of actoxumab in the apical chamber relative to the amount originally added to the basal chamber (100 g/mL) was 0.113% in the absence of TcdA and 41.2% in the presence of 64 ng/mL of TcdA. At 48 hr, the percentage of bezlotoxumab in the apical chamber relative to the amount originally added to the basal chamber (100 g/mL) was 0.125% in the absence of TcdB and 23.3 % in the presence of 256 ng/mL of TcdB. * is p<0.05; ** is p<0.001 compared to all other toxin concentrations at the same time point. # is p<0.05; ## is p<0.001 compared to all other time points at the same toxin concentration. Values listed are from Tables 7 and 8 of PK002.

Time Dependent Antibody Concentration in Apical Chamber (mean SD) Apical toxin

(ng/mL) 0 (hr) 6 (hr) 24 (hr) 48 (hr)

Apical toxin (ng/mL)

0 (hr) 6 (hr) 24 (hr) 48 (hr)

TcdA Actoxumab in apical chamber (ng/mL) TcdB Bezlotoxumab in apical chamber (ng/mL) 0 7.69 3.26 22.2 8.73 40.8 2.68 113 71.7 0 8.25 5.30 34.7 23.0 45.6 28.1 125 20.4

0.25 9.83 0.255 14.8 8.78 51.0 2.45 195 19.0 1 12.8 8.41 26.3 12.1 41.6 12.9 98.5 15.5 1 13.8 4.30 14.9 3.77 150 42.1 804 251 4 16.2 12.3 29.3 13.9 61.8 22.1 145 27.3 4 20.2 0.470 18.5 3.39 1070 276 3588 481 16 16.5 11.4 25.5 16.3 156 43.5 616 173

16 22.5 5.46 36.0 22.1 4604*,# 1963 14776**,## 4671 64 21.7 10.6 32.9 16.0 1026 562 7072**,## 2457 64 11.4 4.30 139.5 30.7 10821**,## 3685 41216**,## 3049 256 19.5 15.8 48.9 26.8 5633**,## 2003 23348**,## 4054



2.6.5.4.4 Caco-2細胞の単層膜を用いた in vitro 組織分布試験［MK-3415及び MK-6072の基底膜側（basolateral）から管腔側（apical）への輸送の評価（トキシンの濃度は一定）］


Type of Study: Transport of Actoxumab and Bezlotoxumab, and Respective F(ab’)2 from the Basolateral to the Apical Side of Caco-2 Monolayers at a Fixed Concentration of Toxin

Study No.: PK002[資料4.2.2.3.2: PK002]

Method: Antibodies or F(ab’)2 (100 g/mL) were added to the basolateral chamber 18 hr prior to addition of toxin or buffer. Concentrations of actoxumab or bezlotoxumab were measured in the apical chamber of a two-dimensional Caco-2 cell monolayer culture system at various times after addition of toxin to the apical chamber. A human IgG ELISA was used to measure antibody or F(ab’)2 concentrations in separate experiments for actoxumab or bezlotoxumab. Results: Transport of antibodies or F(ab’)2 into the apical chamber increased with time in the presence of toxin added to the apical chamber. Transport of F(ab’)2 was similar or higher than that of the antibodies. ## is p<0.0001 compared to F(ab’)2 in the presence of toxin and * is p<0.01; ** is p<0.0001 compared to the absence of toxin. Values listed are from Table 9 of PK002. Time Dependent Antibody Concentration in Apical Chamber (mean ± SD)

Apical toxin (ng/mL)

0 (hr) 6 (hr) 24 (hr) 48 (hr) Apical toxin

(ng/mL) 0 (hr) 6 (hr) 24 (hr) 48 (hr)

TcdA Actoxumab in apical chamber (nM) TcdB Bezlotoxumab in apical chamber (nM)

0 0.0527 0.0224

0.152 0.0599 0.280 0.0184 0.778 0.491 0 0.0567 0.0364

0.239 0.158 0.313 0.193 0.862 0.140

Actoxumab F(ab’)2 in apical chamber (nM) Bezlotoxumab F(ab’)2 in apical chamber (nM) 0 0.585 0.263 0.412 0.191 1.558 0.256 1.97 0.368 0 0.666 0.321 0.439 0.285 1.36 0.379 2.17 0.250 Actoxumab in apical chamber (nM) Bezlotoxumab in apical chamber (nM)

64 0.0781 0.0295

0.956 0.210 74.2## 25.3 283**,##

20.9 256 0.134 0.109 0.336 0.184 38.7 13.8

160**,## 27.8

Actoxumab F(ab’)2 in apical chamber (nM) Bezlotoxumab F(ab’)2 in apical chamber (nM) 64 0.361 0.225 4.25 0.169 216** 48.5 914** 114 256 0.592 0.127 1.42 0.642 94.2* 45.8 367** 121

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