Biotehnologii AlimentareBiotehnologii Alimentare

BACTERIILE LACTICEBACTERIILE LACTICE

CURS - 3CURS - 3

GeneralitaGeneralitaţiţi

Bacteriile lactice (LAB) sunt bacterii Gram pozitive, Bacteriile lactice (LAB) sunt bacterii Gram pozitive, sunt acid tolerante, nesporogene, cu proprietăţi sunt acid tolerante, nesporogene, cu proprietăţi metabolice şi fiziologice asemănătoare. metabolice şi fiziologice asemănătoare.

Aceste bacterii Aceste bacterii se izolează frecvent din plantele în se izolează frecvent din plantele în descompunere şi din produsele lactatedescompunere şi din produsele lactate, , produc acid produc acid lactic prin fermentarea glucidelorlactic prin fermentarea glucidelor. Datorită acţiunii . Datorită acţiunii acidifiante asupra mediului în care se dezvoltă şi acidifiante asupra mediului în care se dezvoltă şi inhibante faţă de microorganismele de alterare sau inhibante faţă de microorganismele de alterare sau patogene (unele bacterii lactice sintetizează patogene (unele bacterii lactice sintetizează bacteriocine), bacteriocine), bacteriile lacticebacteriile lactice au fost utilizate din au fost utilizate din cele mai vechi timpuri în procesele fermentative cele mai vechi timpuri în procesele fermentative alimentare.alimentare.

GeneralitaGeneralitaţiţi Acidul lacticAcidul lactic, ca şi alţi produşi de metabolism , ca şi alţi produşi de metabolism

contribuie la calităţile organoleptice şi textura alimentelor. contribuie la calităţile organoleptice şi textura alimentelor. Bacteriile lactice utilizate în biotehnologii alimentare au Bacteriile lactice utilizate în biotehnologii alimentare au statutul GRAS (generally recognized as safe).statutul GRAS (generally recognized as safe).

Speciile bacteriene care sunt încadrate în categoria Speciile bacteriene care sunt încadrate în categoria bacteriilor lactice aparţin următoarelor genuri:bacteriilor lactice aparţin următoarelor genuri: LactobacillusLactobacillus LeuconostocLeuconostoc Pediococcus Lactococcus Streptococcus

GeneralitaGeneralitaţiţi

alte genuri incluse în ordinul Lactobacillales: Aerococcus Carnobacterium Enterococcus Oenococcus Tetragenococcus Vagococcus Weissella

FAMILIA STREPTOCOCCACEAEFamilia cuprinde următoarele genuri:Genul Streptococcus

S. pyogenes - specia tip a genului (grupa A) - agentul etiologic al scarlatinei;

S. agalactiae (grupa B) - produce mamite; S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae (grupa C); S. equi subsp. equi (grupa C); S. pneumoniae (unii autori consideră gen aparte Genul Diplococcus); S. salivarius ssp. Thermophilus - se utilizează împreună cu

Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus la obţinerea iaurtului. Prin fermentarea unor glucide din lapte (lactoza) rezultă acid lactic, care creiază un mediu favorabil dezvoltării lactobacililor.

S. bovis (grupa D);S. uberis (grupa E);S. suis (grupa S);

FAMILIA STREPTOCOCCACEAE Genul Lactococcus (streptococii din produsele lactate):

Lactococcus lactis subsp. Lactis Lactococcus lactis ssp. lactis var. diacetilactis Lactococcus lactis ssp. Cremoris Lactococcus lactis ssp. hordniae

Genul Vagococcus: Vagococcus fluvialis Vagococcus salmoniarum - se izolează din ape şi peşti;

Genul Enterococcus (streptococii enterici): Enterococcus faecalis; E. faecium Enterococcus seriolicida

Genul Melissococcus M. plutonius (agentul etiologic al locii europene a albinelor).

FAMILIA STREPTOCOCCACEAE Genul Leuconostoc

Leuconostoc mesenteroides cu 3 subspecii: ssp. Mesenteroides ssp. carnosum ssp. dextranicum. Leuconostoc carnosum - germen anaerob care se

dezvoltă la temperaturi scăzute (1-5°C) în pachetele de carne refrigerată sau în carnea sub vacuum şi determină degradarea acestor produse;

Genul Pediococcus — coci care se găsesc în diferite produse fermentate (bere), mai rar lapte şi produse lactate;

Genul Aerococcus Genul Gemella

FAMILIA STREPTOCOCCACEAEClasificarea streptococilor dupăClasificarea streptococilor după habitat şi semnificaţia patogenetică:Streptococii lactici care participă la formarea „florei de protecţie a laptelui,, eliminând bacteriile Gram negative. Se utilizează în industria laptelui ca „germeni de iniţiere,, a fermentaţiei lactice. Genul Lactococcus include streptococii lactici (fosta specie Streptococcus lactis a fost inclusă în genul Lactococcus, sub denumirea de Lactococcus lactis, cu cele trei subspecii lactis, cremoris şi hordiniae.Streptococii fecali - cu habitat la nivelul intestinului subţire la om şi animale.Streptococii orali - participă la formarea florei obişnuite a mucoasei bucale şi plăcii dentare.Streptococii piogeni - cuprind speciile obişnuit patogene pentru om şi animale.

FAMILIA STREPTOCOCCACEAE

Morfologie: streptococii sunt germeni de formă sferică sau ovală cu diametrul de 0,6µ- 1µ, simetrici sau asimetrici, Gram pozitivi, nesporogeni, necilogeni, unele tulpini sunt capsulogene (capsula este alcătuită din acid hialuronic).

In frotiuri se întâlnesc grupaţi sub formă de lanţuri (gruparea strepto), cu lungimi variabile, în funcţie de specie, tulpină şi mediul de cultură.

La S. pneumoniae caracteristică este gruparea diplo, în forma cifrei 8, în care cei doi coci asimetrici sunt uniţi prin zonele efilate şi prezintă o capsulă comună.

Streptococcus spp. HemoculturăColoraţie Gram, 100x

Streptococcus ssp.Microscopie electronică

FAMILIA STREPTOCOCCACEAE Ecologie. Habitatul obişnuit îl constituie laptele şi produsele

lactate. Lactococcus lactis subspecia lactis se izolează din lapte, iar subspecia cremoris, din produse lactate acide.

Condiţii de cultivare. Exigenţele nutritive ale streptococilor sunt corelate cu grupul serologic din care fac parte. Streptococii din grupele A şi C se dezvoltă optim pe medii cu sânge şi triptoză. Cei din grupul B pe agar cu sânge de oaie, iar cei din grupul D pe agar cu bilă, esculină şi azidă de sodiu. Majoritatea streptococilor sunt serofili. Tipul respirator este în funcţie de specie: aerob, anaerob, aerotolerant.

Caractere culturale. In medii lichide (bulion cu ser) dezvoltarea este aglutinantă, cu formarea unui depozit floconos sau granular (în funcţie de lungimea lanţurilor), mediul fiind limpede. Tulpinile care formează lanţuri scurte, pot produce grade diferite de turbiditate.

FAMILIA STREPTOCOCCACEAECaractere culturale.Pe medii solide (agar cu ser) se dezvoltă sub formă de colonii izolate, mici (Ø 0,5mm), uniforme, cu margini regulate, lucioase, nepigmentate, semitransparente. Proprietăţi biochimice.Activitatea glucidolitică: Streptococii lactici sunt homofermentativi, fermentează lactoza, zaharoza, maltoza la acid lactic (85-95%), rezultând şi cantităţi foarte mici de CO2 şi acid acetic. Lactoza este metabolizată la glucoza şigalactoză, apoi ambele monozaharide sunt descompuse la acid lactic. Prin acţiunea fermentativă asupra glucidelor, streptococii lactici acidifică substratul în care se dezvoltă, prin acumulare de acid lactic şi astfel, creează un mediuprielnic multiplicării lactobacililor.Activitatea proteolitică a streptococilor este în general mai slabă decât cea a lactobacililor, concluzie rezultată în urma determinării azotului neproteic în laptele degresat inoculat cu Lactococcus lactis. Unele tulpini nu degradează sau degradează foarte puţin cazeina, deşi unii streptococi lactici (subspecia cremoris), produc peptidaze intra şi extracelulare.

FAMILIA STREPTOCOCCACEAE Producerea de substanţă capsulară. Unii streptococi

lactici sunt capsulogeni, sintetizează o capsulă de natură polizaharidică. Această proprietate se reflectă în aspectul filant, cu cuagul dens al produsului în care se dezvoltă.

In cele ce urmează se caracterizează diferite genuri de bacterii cu importanţă pentru industria alimentară.

1. Genul STREPTOCOCCUSReprezentantul principal al genului este Streptococcus thermophilus care a fost reclasificat ca Streptococcus salivarius ssp. Thermophilus, pe baza studiilor genetice de analiză a omologiei ADN-ADN şi a conţinutului de acizi graşi din compoziţia structurilor membranare.

Genul STREPTOCOCCUSMorfologie:bacterie de formă sferică sau ovală, Gram pozitivă, nesporogenă, imobilă, în frotiuri se întâlnesc grupări „strepto,,Condiţii de cultivare şi caractere culturale:germen facultativ anaerob; se dezvoltă în limite largi de temperatură, se multiplică la 45°C, fiind o specie termofilă; - se dezvoltă pe medii ce conţin peptonă, glucide (glucoza, sucroză).- incubarea se realizează la 37°C, timp de 24 ore. Caractere culturale: - pe mediile solide formează colonii mici (cu diametrul de 0,5-1 mm), lucioase, nepigmentate, semiopace, care aparţin tipului cultural S.

Genul STREPTOCOCCUS

Proprietăţi biochimice:Sistemul proteolitic al acestei specii bacteriene este similar celui întâlnit şi la alte bacterii LAB (bacterii lactice) şi este alcătuit, în principal, din:- Proteaza extracelulară capabilă să hidrolizeze cazeina (se consideră că activitatea proteolitică este totuşi redusă);Bacteria nu produce catalază, nici oxidază, fermentează glucoza, galactoza, lactoza cu formare de acid lactic (fermentaţie homolactică). Nu fermentează manitolul, maltoza, D-sorbitolul, xiloza şi nici trehaloza.

Aplicaţii: S. thermophilus este utilizat la obţinerea unor produse lactate şi este considerat a doua cultură starter ca importanţă în industria laptelui, după Lactococcus lactis. Această specie bacteriană face parte din grupul bacteriilor lactice termofile şi este utilizată împreună cu Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus sau Lactobacillus helveticus la obţinerea iaurtului sau a unor sortimente de brânzeturi (Emmental, Gruyere, grana), procesate la temperaturi relativ ridicate (45°C).

GENUL LACTOCOCCUS

Genul Lactococcus cuprinde 5 specii: Lactococcus lactis subsp. lactis

biovar diacetilactis;

subsp. cremoris;

subsp. hordniae; Lactococcus piscium; Lactococcus plantarum; Lactococcus raffinolactis; Lactococcus gariviae.

Specia Lactococcus lactis este implicată în industria alimentară şi mai ales în industria laptelui.

Membrii genului Lactococcus sunt bacterii Gram pozitive, sub formă de coci sferici sau ovoidali, cu diam. de 0,5 - l,5u., imobili, nesporogeni. In frotiuri se întâlnesc sub formă de grupări diplo şi lanţuri scurte (în general, nu formează lanţuri lungi).

GENUL LACTOCOCCUS

Lactobacillus sp.Bacteriile lactice apar pe suprafata agarului sub forma unor colonii mici, de obicei foarte galbene, lucioase si transparente. In jurul lor mediul de cultura isi schimba culoarea datorita acidului lactic care se formeaza. Testul catalazic este negativ (nu se observa bule de gaz) , testul gram este pozitiv (culoare albastru-mov)

GENUL LACTOCOCCUS Aceşti germeni se caracterizează printr-un metabolism

fermentativ, din care rezultă cantităţi mari de L-acid lactic. Se dezvoltă între 10 şi 45°C, temperatura optimă fiind de 30°C, manifestă exigenţe nutritive sporite, necesitând aminoacizi, vitamine şi nu se dezvoltă în prezenţa NaCl 5% (excepţie fac Lc. Lactis subsp. Lactis şi Lc. plantarum). Lactococii se diferenţiază de celelalte bacterii lactice, prin sensibilitatea la valori extreme de pH (≤5 şi 9,2), inhibarea dezvoltării culturii la temperatura de 40°C şi sensibilitatea faţă de concentraţii ridicate de NaCl (5%). Subspecia lactis de Lactococcus lactis se diferenţiază de

subspecia cremoris pe baza capacităţii primei subspecii de a se dezvolta la temperatura de 40°C, în prezenţa unor concentraţii crescute de NaCl (5%) şi la pH 9,2.

GENUL LACTOCOCCUS Specia Lactococcus lactis se caracterizează prin 3 funcţii

metabolice majore: fermentarea lactozei cu producere de acid lactic, hidroliza cazeinei şi fermentarea acidului citric.

Dintre cele trei subspeci de Lc. lactis, doar subspeciile lactis şi cremoris se folosesc în industria laptelui, în special pentru producerea de acid lactic. Ele utilizează sub 0,5% lactoza din lapte şi nu sunt atât de rezistente la pH acid ca alte bacterii lactice (ex. Lactobacillus). Lactobacilii produc numai acid lactic L, pe când alte bacterii lactice produc acid lactic D sau o combinaţie de acid lactic L şi D.

Principalele caracteristici importante pentru industria alimentară, ale bacteriilor din specia Lactococcus lactis, sunt codificate de plasmide şi anume: metabolizarea lactozei, sinteza de proteinaze, producerea de bacteriocine şi rezistenţa la bacteriofagi.

GENUL LACTOCOCCUS AplicatiiAplicatii: : Lactococii se utilizează frecvent împreună cu

alte bacterii lactice (Lactobacillus şi Streptococcus) la prepararea unor culturi starter, utilizate în industria laptelui. Aceste culturi, în urma fermentării glucidelor, produc acid lactic, care serveşte Ia acidifierea şi conservarea produsului şi totodată contribuie la formarea aromei. Conservarea preparatului, este asigurată de acidul lactic produs, dar şi de bacteriocinele elaborate de lactococi (nizina).

3. 3. GENUL ENTEROCOCCUSGENUL ENTEROCOCCUS  Acest gen, a fost recent înfiinţat şi cuprinde

următoarele specii de interes pentru industria alimentară: Enterococcus faecalis (Streptococcus faecalis) Enterococcus faecium (Streptococcus faecium)

Enterococcus durans (Streptococcus durans). 

GENUL ENTEROCOCCUSGENUL ENTEROCOCCUS Aceste specii se dezvoltă la 100C, dar şi la 450C,

în prezenţa unor concentraţii mari de NaCl (6,5%) şi săruri biliare, cât şi la pH=9,6.

Toate speciile, manifestă un grad ridicat de termorezistenţă - rezistă la t° de 63°C, timp de 30 minute şi la doze relativ mari de penicilină.

Speciile Enterococcus faecium şi Enterococcus durans, se află în brânzeturile obţinute din lapte crud (E. faecium manifestă o bună activitate acidifiantă). Aceste specii se utilizează la prepararea brânzei Cheddar în SUA, pentru accelerarea procesului de maturare.

Enterococii stimulează dezvoltarea germenilor din genul Leuconostoc, prin proteoliza cazeinei.

GENUL ENTEROCOCCUSGENUL ENTEROCOCCUS Enterococii prezenţi în alimente, pot fi utilizaţi ca indicator

igienico-sanitar (prezenţa lor demonstrând posibilitatea contaminării alimentului cu germeni enterici patogeni, ca şi o tratare termică necorespunzătoare pe parcursul procesului de obţinere a alimentului respectiv). E. faecium este utilizat ca probiotic la animale, iar E. faecalis ca

probiotic la oameni.

4. 4. GENUL LEUCONOSTOCGENUL LEUCONOSTOC

In acest gen sunt incluse bacterii de formă sferică, lenticulară, grupate diplo sau strepto, neciliate, nesporogene, Gram pozitive, facultativ anaerobe, catalazo negative (spre deosebire de stafîlococi), heterofermentative.

Speciile acestui gen au fost divizate în două grupe: - în prima grupă sunt încadrate specii care încep să se

multiplice în medii cu pH peste 5,5 şi care se găsesc în soluţiile mucilaginoase de zahăr, în produse lactate, legume în fermentaţie.

GENUL LEUCONOSTOC Leuconostoc mesenteroides

ssp. mesenteroides ssp. cremoris (citovorum) ssp. dextranicum

Leuconostoc lactis Leuconostoc argentinum Leuconostoc citreum (amelibiosum) Leuconostoc gellidium Leuconostoc paramesenteroides/ pseumesenteroides Leuconostoc carnosum - a doua grupă cuprindea specia Leuconostoc oenos

(actual încadrată în genul Oenococcus - Oenococcus oenî), întâlnită în unele vinuri şi care se dezvoltă la valori mici de pH (4,2- 4,8 sau chiar mai mici).

GENUL LEUCONOSTOC

Germenii din genul Leuconostoc se dezvoltă bine la temperaturi cuprinse între 20 şi 30°C (niciodată la 45 °C), necesitând pentru dezvoltare vitamine (acid nicotinic, acid pantotenic, tiamină, biotină) şi glucide, dar şi microelemente. Pe mediile solide formează colonii mici (Ø <l mm), circulare, netede, alb-gri.

Formează polimeri glucidici (dextran). Nu manifestă activitate proteolitică, nu reduc azotaţii (nitraţii în nitriţi).

Majoritatea speciilor se dezvoltă greu în lapte fară adaos de substanţe stimulatoare.

Activitatea glucidolitică diferă de la o specie la alta, este de tip heterofermentativ, în urma fermentării glucozei rezultă acid lactic, etanol şi CO2.

GENUL LEUCONOSTOC Leuconostoc carnosum este un germen anaerob

care se dezvoltă la t° scăzute (1-5°C) în pachetele de carne refrigerată sau în carnea sub vacuum şi determină degradarea acestor produse. Este o bacterie nepatogenă şi la pH scăzut produce peroxid de hidrogen, acizi organici, iar unele tulpini sintetizează bacteriocine cu efect antimicrobian.

Leuconostoc mezenteroides se prezintă sub formă de coci Gram pozitivi, imobili, dispuşi izolaţi, în perechi sau lanţuri scurte. Se dezvoltă pe medii solide cu glucoza. Iniţiază

procesele fermentative la varza murată şi se utilizează în industria laptelui şi în panificaţie.

GENUL LEUCONOSTOC AplicatiiAplicatii: : Leuconostocii se utilizează la fermentarea unor

produse vegetale (varză, castraveţi, măsline), participând la acţiunea florei spontane sau sub formă de culturi starter, la fermentarea malo-lactica a vinurilor (L. oenos), pentru producere de dextran etc. In industria laptelui, leuconostocii se folosesc la obţinerea unor produse lactate fermentate (lapte acru, smântână fermentată pentru consum sau pentru fabricarea untului, brânzeturilor etc). In acest scop se utilizează culturi lactice alcătuite din: Bacterii acidifiante: Lactococcus lactis subspeciile lactis şi

cremoris; Bacterii aromatizante: Leuconostoc citrovorum .

Bacteriile producătoare de aromă au două calităţi importante: elaborează compuşi aromatizanţi (diacetil, acetoină, acetat etc.) şi produc CO2 care determină formarea unor ochiuri mici în diferite sortimente de brânză (Tilsit, Gouda). Dacă se utilizează o cultură mixtă de Leuconostoc citrovorum şi Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetilactis, creşte sinteza de acetoină şi diacetil, cu menţinerea constantă a cantităţii de acid lactic.

GENUL PEDIOCOCCUSGermenii acestui gen se prezintă sub formă de coci, grupaţi în

perechi sau în tetrade (câte 4), imobili, nesporogeni. Fermentează glucoza, fructoza, manoza la acid lactic racemic (DL), nu fermentează sorbitolul şi amidonul. Genul face parte din familia Lactobacillaceae.

Genul cuprinde următoarele specii de interes pentru industria alimentară:

Pediococcus acidilacti Pediococcus cerevisiae Pediococcus pentosaceus Pediococcus halophilus- Tetragenococcus halophilus Pediococcus urinae-equi Pediococii produc acid lactic, bacteriocine, care manifestă o

acţiune inhibantă asupra microorganismelor patogene şi faţă de cele de alterare.

GENUL PEDIOCOCCUS Pediococcus acidilacti se utilizează la prepararea unor

produse de came la temperaturi mai ridicate (bacteria are temperatura optimă de dezvoltare de 40-50°C) şi datorită producerii de acid lactic, produsul va avea un gust acrişor. Producerea de acid lactic are loc mai rapid la temperaturi mai ridicate şi mai lent la (15-27°C).

Pediococcus pentosaceus are temperatura optimă de dezvoltare mai joasă (15-27°C), dar se poate dezvolta şi la 40°C, însă nu la 50°C.

Tulpinile de P. pentosaceus pot conţine între 3 şi 5 plasmide care codifică sinteza de bacteriocine şi enzime capabile să fermenteze rafinoza, melibioza şi zaharoza. Plasmidele pot fi transferate prin conjugare de la celule bacteriene de Pediococcus la bacterii din genurile Enterococcus, Streptococcus sau Lactococcus.

GENUL PEDIOCOCCUS P. pentosaceus se utilizează ca şi cultură starter pentru

fermentarea cârnaţilor şi a unor produse vegetale: castraveţi, fasole verde, varză etc. (Simpson and lagucni, 995). De asemenea, bacteria face parte din microflora care intervine în procesul de maturare a brânzeturilor (Beresford ît al., 2001) şi se utilizează sub formă de cultură starter Ia )bţinerea produselor lactate fermentate.

Pediococcus halophilus (Tetragenococcus halo-philus) intervine în obţinerea laptelui de soia. Prin invechire, acest produs de fermentaţie devine brun închis. Explicaţia constă în preferinţa bacteriei pentru hexoze ^glucoza şi fructoză), în detrimentul pentozelor. Mai întâi sunt consumate hexozele şi în final pentozele. De regulă pentozele rămân neutilizate în produsul fermentat. Acest mecanism este cunoscut sub denumirea de „efectul glucozei,, şi reprezintă cauza culorii brune a laptelui de soia învechit.

Va multumesc!Va multumesc!

Pentru data viitoare: ALTE BACTERII UTILIZATE IN

INDUSTRIA ALIMENTARA FAMILIA LACTOBACILLACEAE