Curs 6 Biol Mol Nou

8/15/2019 Curs 6 Biol Mol Nou

1/100


2/100


3/100


4/100

Enzime de restrictie de tipul I cu activitate anucleazei si metilazei intr-o singura enzima.

Ele se unesc 4-6pb ale ADN-ului gazda-

specific, fiind separate de 6-8pb si continandadenine metilate.

Zona de secţionare a ADN poate fi realizata la

o distanta de 1000 bp (perechi de baze) delocatia alipirii enzimei.Un exemplu este enzima EcoK intalnit la E.coli

K12. Aceasta recunoaste locatia:• 5’- A C N N N N N N G T G C• T G N N N N N N C A C G – 5’ • unde N reprezinta nucleotidele nonspecifice

iar rezidurile de adenina (A) sunt metilate.


5/100

Tipul III• Tipul III de enzime de restrictie se aseamana cu cele

de Tip I in capacitatea lor de a metilan si de arestrictiona (de a taia) ADN-ul.

• Asemenea tipului I, acestea sunt enzime complexecu doua subunitati.

• Locatiile de recunoastere ale acestor enzime suntasimetrice iar clivajul substratului de ADN apare de laperechile de baze 24 – 26 spre capatul 3’.

• Un exemplu al tipului III de enzime este HINF III alH. influenzae. Recunoaste locatiile:

• 5’ - C G A A T• G C T T A –5’

• unde metilarea adeninei apare doar pe o catena.


6/100


7/100


8/100

• Taierea ADN-ului la secvente specifice sta la baza multor

proceduri in tehnologia moleculara, inclusiv cartografierea,clonarea, ingineria genetica si analiza mutatiilor .

• Enzimele de restricite sunt folosite frecvent in laboratorul clinic,spre exemplu in analiza rearanjarii/redispunerii genelor si indetectarea mutatiilor.

• Desi toate enzimele de restrictie tip II functioneaza prinsimetria bilaterala, modelul lor bicatenar se desface diferit.

• Unele enzime desfac structura duplex printr-o separareesalonata la nivelul punctelor de recunoastere, lasand 2-4baze suspendate la capetele lanturilor ADN.


9/100


10/100

Enzime tip II


11/100


12/100


13/100


14/100

These cuts produce

“blunt ends”

5’ TGACGGGTTCGAGG CCAG 3’ 3’ ACTGCCCAAGGT CC GG TC 5’


15/100

The names for restriction enzymes comefrom:

• the type of bacteria in which the enzyme is found

• the order in which the restriction enzyme was

identified and isolated.EcoRI for example

R strain of E.coli bacteria

I as it is was the first E . coli restriction enzyme tobe discovered.


16/100


17/100


18/100

More examples of restriction sites ofrestriction enzymes with their cut sites

Hind III : 5’ AAGCTT 3’ 3’ TTCGAA 5’

Bam HI : 5’ GGATCC 3’

3’ CCTAGG 5’

Alu I : 5’ AGCT 3’

3’ TCGA 5’


19/100

• Unele enzime de restricţie prefera ADNmonocatenar altele preferandu-l pe cel

bicatenar.• Endonucleazele repararatoare functioneaza

in

• zonele de denaturare ale ADN-ului, cum ar fiportiunile fara baze (apurinice si apirimidinice),

• zone cu dimeri de timina sau cu baze

nepotrivite.


20/100


21/100


22/100


23/100

• Eliminarea bazelor eronate este urmatăde încorporarea bazei corecte cu

ajutorul ADN polimerazei. Aceastăactivitate se exercită pe ADN simplu saudublu catenar.

• - activitatea exonucleazei 5'-3', enzimeleelimină nucleotidele de la 5' a ADN dublucatenar.

• Această activitate este utilizată în tehnicade marcaj prin translaţia secţiunii.

ADN li I


24/100

• ADN polimeraza I

• Această enzimă a fost purificată la început din culturibacteriene ale E. coli, exercită o activitate de ADN

polimerază, astfel că are două activităţi deexonucleaze.

• Activitatea exonucleazică 5'-3' a ADN pol I poate fiexercitată pe un hibrid ARN/ADN , ea esterezultatul deci a unei activităţi de RNază Hintrinsecă care constă în eliminarea unui lanţ de ARN

prin activitatea exonucleazei 5'-3'.


25/100

• Această proprietate a fost exploatată în

reacţia de revertranscripţie pentrueliberarea primului lanţ de ADNsintetizat şi va permite sinteza unuiasecundar.

• El va avea rol de amorsă necesară şi la

sinteza celui de-al doilea lanţcomplementar.

L t lă t i lt i tili t


26/100

• La ora actuală sunt şi alte enzime utilizatepentru efectuarea de reacţii dereverstranscripţie.

• În activitatea exonucleazei 5'-3' a ADN pol Iare loc eliminarea unui grup fosfat în 5', careduce la imposibilitatea reacţiei de elongaţie.

• În consecinţă domeniul de aplicaţie al acesteienzime este de a limita marcajul sondei printranslaţia secţiunii, aplicaţie în care ea este

utilizată în strânsă legătură cu DNaza I.


27/100

• Fragmentul Klenow se realizează printr -oproteoliză limitată a ADNpol I de la E.coli,enzimă monomerică care generează douăfragmente, foarte mari.

• Ele au pierdut activitatea exonucleazică 5'-3'dar conservă activitatea exonucleazică 3'-5' şicea de ADNpolimerază.


28/100

• Aplicaţiile fragmentului Klenow:

• secvenţierea după metoda Sanger

• sinteza unui lanţ de ADN complementar

• marcare izotopică (32PdNTP) aextremităţii 3' a ADN prin reacţia deschimbare a nucleotidelor reci contranucleotidelor marcate, catalizată prinactivitate exonucleazică.


29/100

• ADN polimeraza bacteriofagului T4 şi T7catalizează transferul fosforului radioactivγ32P pe ATP.

• Astfel ATP este marcat cu 32P pe a treia

grupare a fosfatului de pe extremitatea 5 afragmentului de ADN.

• Tehnica este aplicată pentru obţinerea

oligonucleotidelor marcate care vor fi utilizateca sonde pentru criblajul băncilor.


30/100

• T4 ADN polimeraza

• Această enzimă a fost izolată la începutdin bacterioagul T4.

• ADN pol T4 şi are o activitate

exonucleazică 3'-5' foarte eficace pe ADN monocatenar şi este de 200 de orimai activă decât fragmentului Klenow de

la E.coli



31/100


• Această enzimă a fost obţinută prin izolarea ei de labacteriofagul T7, după infecţia bacteriei E.coli cu

fagul.• Este caracterizată prin eficacitate de sinteză,

replicarea rapidă a fagului în cursul ciclului de infecţie.

• Ea posedă în acelaşi timp o activitate exonucleazică3'-5' puternic exprimată, de aproximativ de 1000 deori mai mare decât a fragmentului Klenow. Aceastăactivitate importantă exonucleazică explică fidelitatea

mare a T7 ADN pol.• Aplicaţii principale:

• marcarea ADN în 3'

• mutageneza dirijată


32/100

• T7 ADN pol modificată: secvenoza

• Tratamentul chimic al T7 ADNpol modifică

enzima diminuând considerabil activitateaexonucleazică.

• Enzimele obţinute – secvenoza 1.0 şi 2.0 suntutilizate în reacţiile de secvenţiere de bunăcalitate.

• Taq ADNpol a fost izolată din Thermus


33/100

• Taq ADNpol a fost izolată din Thermusaquaticus. Prezintă particularitatea de a sedezvolta în izvoare calde la 80˚C. Este supusă

la temperaturi extreme.• Este o pol dependentă ADN. Posedă de

asemenea activitate exonucleazică 5'-3' dar

este lipsită de funcţii corectoare.• Temperatura optimă de funcţionare de 70-75˚C.

• Originea sa îi conferă o stabilitate remarcabilă

la temperaturi înalte. Timpul de înjumătăţireeste mai mare de două ore la 92˚C şi de 40minute la 95˚C.


34/100

Heat-stable DNA polymerase

• Taq DNA polymerasewas isolated from thebacterium Thermusaquaticus.

• Taq polymerase is

stable at the hightemperatures (~95oC)used for denaturingDNA.

Hot springs at YellowstoneNational Park, Wyoming.


35/100

PCR

• Această termorezistenţă stă la baza utilizării


36/100

• Această termorezistenţă stă la baza utilizăriisale în metode de amplificare genică precumPCR în timpul cărora se efectuează numeroase

cicluri termice care presupun temperaturi de 90-95˚C.• Alt avantaj hibridarea amorselor cu matricea

se face la o temperatură mai mare ceea cedetermină hibridarea specifică.

• Sensibilitate tehnicii este mare. Aceastăenzimă a fost clonată.

• Un anumit număr de ADN pol termostabile aufost extrase din alte bacterii Archebacterii şiEubacterii. Fiecare are o particularitate şi outilizare specifică.


37/100


38/100

• începând de la amorse aleatorii numitehexanucelotide .

• RT este o ADN polimerază ARNdependentă.

• Această enzimă transformă ARN în ADN-ul său complementar şi poate sintetiza lanţ

compelmentar ADN nou sintetizat (seobţine un ADN dublu catenar).


39/100

Morfologie şi structură virusului HIV

Virion de formă sferică, diametru de 100nm, acoperit deo anvelopă prevăzută cu spiculi. Genomul este ARN monocatenar, compus din 3 gene

“gag“, “pol“,“env“.

“gag”-codifica proteinele capsidale“pol”- codifica enzimele virale“env”- codifica proteinele anvelopeiReverstranscriptaza este o enzimă caracteristică

retrovirusurilor


40/100

• ARN polimeraza


41/100

ARN polimeraza• T7 ARNpol este produsă de bacteriofagul T7, are o

specificitate crescută pentru situsul promotor al faguluiT7 de iniţiere a transcripţiei.

• Este foarte utilizată pentru sinteza 5'-3' in vitro a ARNobţinând sonde ARN şi

• poate fi utilizată pentru secvenţierea ADN clonat într -

un vector care conţine secvenţa promotoare T7. • Aplicaţii: sinteza ARN pornind de la ADN pentruobţinerea de sonde.

• SP6 ARNpolimeraza

• Spre deosebire de cealaltă enzimă aceasta esteprodusă de SP6 , cu afinitate foarte mare pentrusecvenţa situsului promotor SP6. Este utilizată pentrusinteza sondelor ARN.


42/100

• T3 ARNpolimeraza


43/100

T3 ARNpolimeraza • Este ADN dependentă având o mare afinitate pentru

secvenţa promotorului bacteriofag T3, transcrie ADN în ARN de la 5' la 3'. Aplicaţii identice cu T7

ARNpolimeraza. • QB replicaza este ARN dependentă in vitro avândfuncţia de replicare a ADN genomic al fagului QB. Eaidentifică ADN de replicat pe baza structurii secundare.

• Enzime de modificare • Fosfataza alcalină catalizează hidroliza grupării 5'PO4 a ADN şi ARN eliberând un rest fosfat şi creândo extremitate 5'OH.

• Aplicaţii: prevenirea legării vectorilor de clonaj peei însăşi eliminând posibilitatea de formare alegăturilor fosfodiester; eliminarea grupării 5'PO4

înainte de marcajul acizilor nucleici prin T4polinucleotid kinaza.

• Această enzimă este foarte des utilizată ca


44/100

• Această enzimă este foarte des utilizată cagenerator de semnal de unde naturadependentă de substratul utilizat în sisteme de

detecţie a acizilor nucleici. • Polinucleotidkinaza catalizează transferul uneigrupe gama fosfat de la un ATP la extremitatea5'OH a unui ADN sau a ARN.

• ADN nativ fosfatat în 5' este adesea necesar săfie tratat în prealabil cu fosfatază.

• Aplicaţii: marcarea unei sonde ADN sau ARN în

5' terminal;• marcarea unei amorse utilizate pentru secvenţa

markerilor radioactivi utilizând gamma 32P,

gamma 33P şi gamma 35S.


45/100

• ADN ligaza asigură formarea legăturilor

fosfodiester între deoxiriboză 3'OH şi 5'PO4 a

două nucleotide adiacente.• Permite legarea sau lipirea a două ADN dublucatenare.

• Are într-un fel activitate inversă enzimelor de

restricţie. • Aplicaţii: subclonarea produşilor de amplificare în vectori.

• Există T4 ADN ligază care leagă extremitatea5'PO4 a unui ADN sau ARN monocatenar cuextremitatea 3'OH.


46/100

• Nucleazele sunt enzime care ataca aciziinucleici fie de la extremitatea 5' sau 3'

numite şi exonucleaze, fie din interiorsau endonucleaze.• ARNaza sau RNaze sunt endonucleaze

care hidrolizează puntea fosfodiesterică

de ARN: A, T1 şi H. • - RNaza A extrasă din pancreasul debovine distruge ARN monocatenar

îndeosebi după resturile C şi U.

• Hibrizii ADN- ARN şi ARN dublu catenarsunt rezistenţi.

Inhibitorii de RNază


47/100

• Inhibitorii de RNază • Inhibă activitatea RNazelor şi împiedică

distrugerea ARN de către acestea.• Aplicaţii: protejează ARNm în cursul RT; creşte

randamentul sintezei sondelor de ARN cuajutorul ARN polimerazelor; toate aplicaţiile în

care există riscul de degradare a ARN de cătreRNază • Proteinaza K, enzimă utilizată de extracţia

acizilor nucleici. Digeră celule întregi, nucleulchiar ţesuturi făcând astfel accesibil ADN şi ARN. Este stabilă la 40-60˚Cşi eficace înprezenţa detergenţilor, dintre care cel mai bun

este SDS anionic. • Alţi detergenţi neionici pot fi utilizaţi Non I P40


48/100

Alţi detergenţi neionici pot fi utilizaţi Non I, P40şi TWIN20.

• Ea şi pierde activitatea proteazică latemperatua de 90˚C.

• Aplicaţii: extracţia acizilor nucleici.

• Agaraza permite eliberarea acizilor nucleicidintr-un gel de agaroză. Digeră agaroza, dar nudistruge acizii nucleici. Este un mijloc deextragere a ADN din agaroză.

• Extracţie şi purificarea ADN


49/100

Extracţie şi purificarea ADN • Extracţia ADN • Comportă:recoltarea şi păstrarea probelor şi extracţia

propriu-zisă • Probele ADN trebuie potejate de: inhibitori aienzimelor utilizate (inhibitori ai Taq polimerază),nucleaze care pot degrada acizii nucleici (ARN este în

special sensibil).• Frecvent sunt probe totale de sânge ele pot fiseparate în plasma , ser şi leucocite. Alte medii curentfolosite sunt din:culturi (fagi, bacterii), urină, lichid

cefalorahidian, expectoraţii, probe rezultate prinpuncţionare şi biopsie. • Condiţii de prelevare• Probele trebuiesc recoltate steril.

• O probă de sânge poate fi colectată în tub uscat dacă


50/100

O probă de sânge poate fi colectată în tub uscat dacăcercetările obţinute se realizează din ser sau pe EDTAdacă se lucrează pe plasmă.

• Este recomandată lizarea globulelor roşii înainte deextracţia ADN ( de exemplu liza cu clorură deamoniu) apoi purificarea globulelor albe.

• Dacă se utilizează un anticoagulant trebuie să ţinem

cont de natura sa. Heparina este un inhibitor pentruTaq polimerază mai mult sau mai puţin dificil deeliminat după procesul de extracţie utilizat.

• Ţesuturile sunt bogate în nucleaze (proteaze, DNazeşi RNaze).

• În cazul LCR este recomandat păstrarea la frigider,imediat după recoltare. Este cunoscut faptul că LCR şi

urina sunt medii bogate în inhibitori.

• ARN este o moleculă fragilă foarte sensibilă


51/100

• ARN este o moleculă fragilă, foarte sensibilăla RN azele care sunt frecvente în mediupână şi pe degete.

• În cazul studiilor de ARN probele saufracţiunile lor trebuiesc congelate la -80°C înprimele 3 ore după recoltare.

• Probele pot fi expediate în gheaţă carbonică. În timpul manipulării este indispensabil săevităm contaminarea probei şi ARN să fieconservat (este fragil).

• Se recomandă: purtarea mănuşilor,autoclavarea materialelor, utilizarea de pipetespecial rezervate acestui scop la capete cu

filtre sterile. • În funcţie de tipul ADN-ului se cunosc 2


52/100

În funcţie de tipul ADN ului se cunosc 2tehnici de extracţie pentru tipul genomic şipentru cel plasmidic.

• Extracţia ADN cromozomial sau genomic • Metoda fenol cloroform • Extracţia ADN din sânge total este cea mai

utilizată. Parcurge 3 etape: • -liza celulelor şi denaturarea complexelornucleoproteice pentru eliberarea ADN dinmediul intracelular

• -extracţia propriu-zisă pentru eliminareaproteinelor

• -precipitarea pentru purificarea ADN


53/100

• Obţinerea fracţiunii de extras

• În practică ADN situat în celulele nucleate serecuperează centrifugând leucocitele pebaza gradientului de densitate.

• Se poate centrifuga tubul la viteză joasă şise recoltează de la interfaţă dintre plasmăşi coagulul de globule roşii.

• După spălare cu soluţie tampon proba estegata de extracţie.


54/100


55/100


56/100

• Liza celulelor şi denaturarea complexelor


57/100

ş pnucleoproteice pentru eliberarea ADN din mediulintracelular

• Un sistem utilizat curent adaptat la toate tipurile deprobe este amestecul detergent/proteinază caredisociază ţesuturile, celulele, capsida virusurilor şieliberaază acizii nucleici.

• Proteinaza K, enzimă utilizată pentru extracţia acizilornucleici.

• Digeră celule întregi, nucleul chiar ţesuturi făcând

astfel accesibil ADN şi ARN. • Este stabilă la 40-60˚Cşi eficace în prezenţadetergenţilor, dintre care cel mai bun este SDS(dodecylsulfat de sodiu) anionic. Ea îşi pierde

activitatea proteazică la temperatua de 90˚C.


58/100


59/100

• Fierberea in 8% sucroza, 8% detergent TritonX-100, tampon Tris si EDTA dupa tratarea cu

lizozim, determină eliberarea ADN ce poate fiimediat precipitat in alcool.

• ADN-ul extras cu NaOH sau prin procedurile

de fierbere, este denaturat (monocatenar) sieste posibil sa nu fie potrivit pentru metode carefolosesc enzimele de restrictie ce necesita ADNbicatenar.

• Avantajul acestor tipuri de extractie este vitezasi simplicitatea. Metodele de amplificare vorfunctiona folosind acest tip de izolare a ADN-

E t ţi i i ă


60/100

Extracţia propriu-zisă • Dupa eliberarea ADN-ului din celula, purificarile

ulterioare necesita eliminarea proteinelor,lipidelor, carbohidratilor si resturilorcelulare.

• Acest lucru este realizat folosind o combinatie

de salinitate mare, pH scazut si o mixturaorganica de fenol si cloroform. • Combinatia dizolva usor contaminantii

hidrofobici ca lipidele si lipoproteinele,

colecteaza resturile celulare si elimina cele maimulte proteine ADN-asociate.•


61/100

• Cand sunt adaugate fenol si cloroform din lizatull l hid fili f l i bif i


62/100

celular hidrofilic, se formeaza o emulsie bifazica.• Centrifugarea va favoriza aşezarea stratului hidrofobic

(lipidele si alte componente hidrofobice) la baza sistratul hidrofilic deasupra.

• ADN-ul se va dizolva in etapele apoase superioare. • Componentele amfifilice ce au atat proprietati

hidrofobice si hidrofilice ca si resturile celulare, se voraduna formand un precipitat alb la interfata dintre celedoua straturi.

• Etapa superioara, contine ADN colectat ce apoi

este precipitat folosind etanol sau isopropanol intr-o concentratie mare de sare (amoniu, potasiu sauacetat de sodiu, litiu sau clorura de sodiu).


63/100


64/100


65/100


66/100


67/100

• ARN-ul viral poate fi izolat direct din ser

sau alte fluide prin intermediul sferelor sau coloanelor special formate.

• Ca majoritatea metodelor de izolare a ADN-ului, nu se poate face diferenta intre ARNul microorganismelor si cel al celuleigazda, prin urmare folosirea unui preparat

fara celule fiind cea mai potrivita.


68/100


69/100


70/100


71/100

• ADNaze pot fi adaugate direct in ARN ul


72/100

• ADNaze pot fi adaugate direct in ARN-ulabsorbit din coloana pentru a indeparta

ADNul contaminant.• Solutiile de spalare si eluantul pot fi atraseprin coloana, de catre gravitate, vid sau

forta centrifuga.• Coloane mici de material silica-based ce sepotrivesc inauntrul microtuburilor suntfolosite pe scara larga pentru izolarea derutina a acidului nucleic din toate tipurile despecimene.


73/100

Extractia organica a ARN-ului total


74/100

g

Izolarea ARN-ului pe matrice


75/100

Izolarea ARN ului pe matricesolida


76/100

• Dupa spalarea ARN-ului rezidual, ARN-ul polyA


77/100

Dupa spalarea ARN ului rezidual, ARN ul polyAeste developat prin spalarea coloanei cu solutietampon calduta, slab salina ce contine detergent.

• Prin aceasta abordare, se poate obtine aproximativ30-40 ng de mARN din 1 microgram de ARN total.

• Exista limitari ale izolarii ARN-ului polyA folosind

oligo dT sau dU.• Eficienta legaturii polyA sau polyU este variabila.

• Structura secundara (puntile de hidrogenintracatenare sau intercatenare) din proba tintapoate concura cu legarea la oligomerul de prindere.

• Unele ţesuturi ca pancreasul, lichidulcefalorahidian (LCR) sunt foarte bogate în


78/100

cefalorahidian (LCR) sunt foarte bogate înRNaze.

• Deşi nu este posibil să le eliminăm, ele suntcapabile să se renatureze după supunereala şoc termic.

• Totuşi după încăzire adaosul deβmercaptoetanol agent reducător, ajută lapăstrarea RNazelor în stare denaturată

împiedicând reformarea punţilor disulfidice.

• Este indispensabilă neutralizarea acţiunii lor înlizatul celular tratând proba cu detergenţi şiagenţi haotropici ca βmercaptoetanol şitiocianat de guanidină.

• În laborator sunt două surse de contaminare cuRNaze: mâinile operatorului şi germenii în suspensie


79/100

RNaze: mâinile operatorului şi germenii în suspensiedin aer care se depun pe sticlărie şi consumabile.

• Deci este esenţial să se lucreze permanent cu

mănuşi, să se utilizeze materiale de unică folosinţă,sticlăria să fie tratată cu dietilpirocarbonat (DEPC0,1%) inhibitor puternic de RNază - apoi autoclavată (DEPC intră în reacţie cu bazele purinice), fie să fiesupusă la temperaturi foarte mari (200°C) la autoclavfără tratament cu DEPC.

• Materialul plastic este decontaminat cu sodă caustică0,1 N şi EDTA 1 mM apoi spălat cu DEPC. Reactivii şitampoanele trebuie tratate cu DEPC apoi autoclavate.

• Pentru tamponul TRIS nu se face autoclavare dar seutilizează apă tratată cu DEPC pentru preparareatamponului. Apa deionizată este în principiu lipsită de

ARNază.

• In concluzie sunt necesare trei etape succesive pentruobţinerea ARN purificat


80/100

obţinerea ARN purificat. • 1. Liza celulară. Se folosesc două grupe de

detergenţi puternici care inhibă RNazele. În primagrupă agentul disociant utilizat este t ioc ianatul deguanidină (GTC) iar în a doua se asociază cu

βmercaptoetanol . Ambii sunt inhibitori de RNază.• Utilizarea combinată permite disocierea proteinelor

liza celulelor, inactivarea RNazelor şi denaturareaARN.

• Dacă se doreşte eliminarea riscului de contaminare ARN cu ADN este necesară tratarea cu DNază.

• Tehnica uneşte metode care necesită utilizareafenolului şi a detergentului. Adesea se adaugă uninhibitor de RNaze /RNasin) izolat din pancreas debovine. RNazele sunt de asemenea inactivate cuSDS roteinaza K.

• 2. Extracţia propriu –zisă a ARN • ARN este extras cu fenol/cloroform Separarea se


81/100

• ARN este extras cu fenol/cloroform. Separarea seface pe baza precipitării diferite a ARN şi ADN înfuncţie de pH. În condiţii de pHacid ARN rămâne în

soluţie apoasă. ADN şi proteinele fiind în interfază.• În mediu alcalin ADN rămâne în soluţie apoasă. • 3.Precipitarea ARN. Se efectuează similar cu ADN cu

izopropanol sau etanol de asemenea se face spălarecu etanol 70%.

• ARN se mai poate obţine cu bile magnetice.• Există numeroase kituri de extracţie rapidă.

• Dozarea ARN. Poate fi necesară în Northern blot,RNazin Protein Assey.• Spectrofotometria. Este cea mai utilizată şi măsoară

densitatea optimă la 260-280 nm a unei diluţii de ARN.

• Sinteza unui ADNc in vi t ro M i l i t di ARN t dif ită di


82/100

• Manipularea şi studiu ARN este diferită dincauza marii sensibilităţi la ribonucleaze care-l

distrug. Este necesară recopierea secvenţei de ARN pentru a crea o structură stabilă şi care vafi amplificată în funcţie de necesităţi .

• ARNm purificat, utilizâd cromatografia prinafinitatea pe o coloană de oligodezoxitimidina,este legat în prima etapă cu oligonucleotide

poliT care se ataşează la coada polyA.

• Pornind de la extremitatea 3 a acestei amorse poly T, transcriptaza inversă, care este o ADN

polimerază, sintetizează un lanţ de ADNcomplementar al mesagerului de po rnire

• Odată ce s-a realizat această sinteză se degradeazăARN i t b ă t ib l ă


83/100

ARN printr-o bază tare sau o ribonucleazăspecifică.

• Lanţurile de ADN constituite formează spontan obuclă la extremitatea 3, sub forma de agrafă de păr,care se hibridează pe ea însăşi.

• Extrem itatea 3 a acestei bucle va servi ca situs de

demaraj pent ru ADN po l imeraza, care va sintet izaun lanţ de ADN complementar primei . Oribonuclează specifică ADN-ului monocatenar vasuprima bucla la extremitate.

• ADNc dublu catenar este sintetizat. Se poate astfelconstitui atât ADNc câţi ARNm există într -o celulă;• ansamblul acestor ADNc formează o bancă deADNc.


84/100

• Electroforeza • Electroforeza este o metoda de separare a


85/100

Electroforeza este o metoda de separare aparticulelor incărcate electric prin migrarediferenţială sub actiunea unui câmp electric. Ne

permite cuantificarea de manieră precisă a ADN şi ARN, iar în anumite cazuri, aprecierea cantităţii deacizi nucleici prezenţi (prin raportarea la un markerde talie cunoscută).

• Se poate utiliza hârtie, acetat de celuloza, gel depoliacrilamidă, gel de agaroză, gel de amidon, gel desiliciu. Există două tipuri de gel utilizate mai frecventagaroză şi poliacrilamidă care permit o separaremai bună.

• Agaroza, polizaharid extras dintr-o varietate de algăroşie, este un polimer al unei unităţi dizaharidice; la încălzire în soluţii apoase formează hidrosoli, care larăcire se transformă în hidrogel.


86/100

• n trecerea prin mediul de agaroză sau acrilamidă,moleculele se separă în funcţie de dimensiune.


87/100

• Cele mai mari sunt reţinute, iar cele mai micimigrează.

• Acrilamida are putere mai mare separatoare decâtagaroza însă este mai toxică.• Tehnica electroforezei• După formarea, turnarea gelului, trasarea godeurilor şi

solidificarea acestuia se vor introduce probele de ADN.• În primul godeu se introduce un marker cunoscut, care

permite estimarea mărimii fragmentelor de ADN. Seutilizează frecvent ADN de fag restrictat cu oanumită enzimă. Fragmentele rezultate au o mărimecunoscută, ceea ce permite folosirea lor ca etalon.

• În godeurile rămase se introduc pe rând probele careurmează să fie analizate.

• Se adaugă doi coloranţi: unul bine vizibil pe gelcare va migra foarte rapid, albastru de bromfenol,


88/100

g p , ,pus înaintea fragmentelor de ADN pentru a delimitadistanţa parcursă până la anod.

• Al doilea, brom ura de et id iu, care se seintercalează între bazele de acizi nucleici şiimprimă o culoare oranj când acestea sunt expusela lumina UV. Astfel, moleculele de ADN

complexate cu bromură de etidiu devin vizibile. • Aparatul de electroforeză se cuplează la o sursă de

curent . Polul pozitiv este opus godeurilor.Cândfrontul de migrare ajunge în apropierea capătului

opus al gelului, se întrerupe sursa de curent. Sescoate tăviţa cu gel şi se vizualizează în UV la 254nm, se vor fotografia fragmentele de ADN digerate

în gel.

• Distanţa de migraţie este proporţională masamoleculară: există o proporţionalitate inversă între


89/100

moleculară: există o proporţionalitate inversă întremobilitatea şi logaritmul masei, dar relaţia estevalabilă pentru moleculele liniare având sub 20 kb.

Se determină astfel mărimea fragmentelor derestricţie obţnute şi se compară cu a celor demărime cunoscută.

• migrarea moleculelor mari de 20kb este aproapeindependentă de mărime şi nu mai apare o relaţie delinearitate;

• conformaţia cerc deschis CD/OC - open circle, cerccovalent închis CCI/CCC – covalenty closed cirle. Laaceeaşi masă moleculară, CCI au cea mai mare

mobilitate pe când conformaţia CD este mai lentă.Moleculele liniare au o mobilitate intermediară. • tamponul de electroforeză folosit este Tris Acetat

(TAE).

• După migrare probele se citesc la UV.


90/100

• În unele cazuri moleculele care trebuiesc

separate sunt marcate prin încorporarea unuiizotop radioacitv care permite detectareaprin autoradiografie.

• Particulele energetice emise de radioizotopimprimă un film fotografic pe gel. Sedevelopează pentru a se vedea benzile negrecare corespund moleculelor marcate radioactiv.


91/100


92/100


93/100

• La separarea unui amestec de proteineeste puţin probabilă alegerea acelui set decondiţii să poată garanta cel mai bun grad

de separare a fiecărei componente decelelalte.• Dacă într -un gel se obţine o singură bandă

această nu conţine în sine dovada

prezenţei unei singure componenteomogene.

• Gelurile plate verticale G i l il 0 5 1 5 C ât t


94/100

• Grosimea gelurilor 0,5-1,5 mm. Cu cât suntmai subţiri cu atât sunt mai rapide şi

eficiente pentru colorare, decolorare, iarrăcirea din timpul electroforezei este mairapidă şi mai uniformă. Aceasta permite

aplicarea unei tensiuni mai mari şi a unor timpide acţiune mai reduşi.

• Gelurile sunt obţinute în forme separate care

ulterior sunt inserate în aparat cu ajutorul unorgarnituri de cauciuc şi introduse în tamponul cereprezintă mediul de răcire (răcire realizată prinmijlocirea tuburilor de apă).


95/100

• Un colorant trasor este albastru debromfenol. Acesta migrează cu o vitezămai mare decât oricare dintrecomponententele macromoleculare aleprobei şi indică momentul stopăriielectroforezei.

• Gelurile se introduc în baie de colorant cu

bromură de etidiu 3 minute, apoi seexaminează la o lampă cu ultraviolete.

• Lipoproteinele, au caracter parţial proteic pot ficolorate înaintea electroforezei pentru a le deosebi deproteine Se foloseşte Sudan Black B


96/100

proteine. Se foloseşte Sudan Black B.• Există densiometre laser care scanează gelurile la

nivele de rezoluţie extrem de ridicată. Răspunsulscanner-ului poate fi computerizat ceea ce permite înregistrarea, redarea, evaluarea şi stocarea datelorpe disc sau imprimarea lor, precum şi compunerea adouă geluri diferite.

• Semnalul densitometric este preluat, înregistrat şi estecuantificat prin măsurarea suprafeţelor de sub peak-urile individuale.

• Se poate recurge la integrarea electronucă sau prin

achiziţionarea de date pentru calcul computerizat alsuprafeţelor de sub peak, metodă folosită pentruscanarea unui număr mai mare de geluri. Înălţimeapeak-ului depinde de distanţa materialuluiparcursă prin gel.

• Electroforeza proteinelor • Proteinele se pot separa prin electroforeză ca şi


97/100

• Proteinele se pot separa prin electroforeză ca şiacizii nucleici. Suportul poate fi acetat de celuloză,

pentru proteinele din serul uman, sau hârtie, într-untampon de pH de 8,6.

• Benzile corespunzătoare proteinelor separate,sunt vizualizate prin colorare cu un colorant

specific şi printr -o scanare densiometrică se obţinindicaţii despre cantitatea relativă a proteinelor dinfiecare bandă separată.

• Deşi mobilitatea proteinelor depinde în special desarcina electrică relativă a acestora, dimensiuneaproteinelor joacă de asemenea un rol important şiaceasta contribuie desigur la poziţia benzii

corespunzătoare moleculei de γglobulină • Electroforeza proteinelor în gel de poliacrilamidă • Gelul de poliacrilamidă se poate folosi în locul


98/100

Gelul de poliacrilamidă se poate folosi în loculacetatului de celuloză sau al hârtiei pentru separarea

proteinelor native.• Un astfel de gel este folosit în mod obişnuit înprezenţa dodecil sulfatului de sodiu (SDS).

• În acest caz proteinele oligomerice (alcătuite din

câteva unităţi polipeptidice) se pot separa însubunităţile lor individuale.

• Proteinele se separă într -o soluţie SDS 1%.

• Acest detergent desface majoritatea legăturilor dintreproteine şi dintre acestea şi lipide.

• Pentru a desface şi punţile disulfurice, se adaugăfoarte des şi 2-mercaptoetanol.


99/100

• Mobilitatea electroforetică a majorităţii proteinelor (darnu şi a glicoproteinelor), depinde de dimensiunea lor,


100/100

ş g p ), p ,deoarece sarcina negativă adusă de moleculele SDSlegată de proteină este mult mai mare decât sarcinanetă a proteinei însăşi.

• O distribuţie specifică (pattern) de benzi se obţine lacolorarea gelului cu Albastru Comassie.

• Gelul de agaroză poate fi folosit în locul celui depoliacrilamidă în cazul proteinelor mai mari sau pentrua obţine o separare diferită în absenţa SDS.

• Se poate aplica metoda PAGE bidimensională,folosind condiţii de lucru diferite de cele două direcţiide migrare: de exemplu un gradient constant de pH( H 4 7%) di ţi i H 11 14% li il idă

Documents

Curs 6 Biol Mol Nou