CURSO MONOGRÁFICO DE HPLC (enero de 2001)

I. INTRODUCCIÓN

Cuando utilizamos un método cromatográfico de HPLC para llevar a cabo un análisis, seguimos generalmente una receta que hemos encontrado en la bibliografía. Allí se nos dice que debemos llevar a cabo una serie de operaciones para conseguir nuestro objetivo, como el tipo de columna que debemos emplear, la fase móvil, si la elución conlleva un gradiente, longitud de onda de la detección (en caso de una detección espectrofotométrica), cómo debemos preparar y conservar los patrones, que flujo debemos emplear, etc. Poca veces el analista se pregunta el porqué de estas condiciones concretas, es decir, en qué criterios se basó el que desarrollo el método cromatográfico que vamos a utilizar para proponerlo.

Si nos limitamos a aplicar fielmente la receta sin indagar en su base analítica nos expondremos, con bastante probabilidad, a que cualquier incidencia o variación en las condiciones experimentales o en el tipo de muestra, dé al traste con la consecución de nuestros objetivos. Por ello es muy recomendable, y en gran parte es el objetivo de este curso, indagar en las etapas implicadas en el desarrollo de un método de HPLC, fundamentalmente en lo referente a:

- Selección de fase estacionaria y fase móvil.- Selección de las condiciones de detección.- Tratamiento de la muestra.- cuantificación y validación del método.

Cada día muchos cromatografistas necesitan desarrollar un método de separación de HPLC. Aunque hay una gran diversidad de casos prácticos, el desarrollo de un método sigue una serie de etapas que podemos reunir en los siguientes nueve puntos. Fig 1.

1.-Recoger Información sobre la muestra

Sólo en un caso ideal se va a poder disponer de una información completa sobre la muestra. Entre la información interesante que conviene disponer de la misma está la recogida en la Fig 2. No obstante para nuestra exposición de los próximos días no es necesario disponer de una completa información de la muestra.

2.- Definir los objetivos de la separación

En la Fig 3 se recogen los posibles objetivos de la separación cromatográfica.

3.- Tratamiento de muestra

La muestra puede llegar al analista de muy diferentes formas como se recoge en la Fig 4.

Como norma general es deseable que la disolución final que se vaya a inyectar en el cromatógrafo tenga una composición lo más parecida posible a la fase móvil, por lo que, en general, será preciso someterla a un tratamiento para eliminar posibles interferencias o sustancias dañinas para la columna (lo dará BRIGUI).

4.- Elección del detector y de las condiciones de detección

La elección del detector va a depender de los objetivos de la separación. Si se trata de determinar un solo analito nos interesa que el detector sea lo mas selectivo posible respecto a ese analito. Si por el contrario nos interesa determinar varios o muchos componentes de la muestra deberemos elegir un detector universal. Nosotros nos vamos a situar en este último caso y basaremos nuestro análisis en la utilización del detector más popular , el detector espectrofotométrico. Los razonamientos que haremos son perfectamente extrapolables otros tipos de detectores.

Si los compuestos de interés dan poca señal en el detector UV-Vis, se recurre a otros tipos de detectores como:

Indice de refracciónFluorescenciaElectroquímica

Mientras que la derivatización de los analitos se deja como último recurso, pues supone trabajo adicional y disminución de la precisión.

5.- Elección de la modalidad de Cromatografía líquida

Salvo que las muestras pertenezcan a algunos de los siguientes grupos:

Muestras con analitos de elevado PMMezclas de isómeros

Muestras de sales inorgánicas o hidratos de carbono

en la mayoría de los casos la modalidad cromatográfica elegida pertenecerá a alguna de las siguientes modalidades:

Fase normal Fase reversaPares iónicos

y por tanto, vamos a basar nuestra exposición en estas tres modalidades.

6.- Realización de una prueba preliminar

En este punto se inyecta una muestra para obtener un cromatograma inicial en unas condiciones estandar, el cual nos va a servir da base para ir introduciendo las oportunas modificaciones.

7.-Optimización de la separación

Con la finalidad de conseguir los objetivos recogidos en la Fig 5:

Resolución

Conviene que sea los mas elevada posible considerando que con el tiempo la columna va perdiendo efectividad.

Tiempo de análisis

Aunque un tiempo de 10 a 15 min para una separación cromatográfica es aceptable, hay que considerar que este periodo sólo represente una parte mínima del empleado en el procedimiento analítico completo, el cual incluye la preparación de la muestra, patrones, fase móvil, puesta en marcha del cromatógrafo, etc.

Precisión

Dependerá de la calidad exigida a los resultados del análisis.

Presión

Conviene trabajar con presiones máximas de trabajo sensiblemente inferiores a las recomendadas por el fabricante de la bomba, ya que con el uso la columna se va taponando con pequeñas partículas y la presión irá subiendo. A menor presión, el sistema sufre menos (juntas, válvulas, etc).

Altura de pico y consumo de disolventes

Comentado en la tabla.

8.- Aparecen problemas

A lo largo de la utilización del método cromatográfico surgirán problemas como:

Ensanchamiento de bandas, lo que conduce a una disminución en N.

Tailing, con pérdida de resolución.

Problemas instrumentales (elevación de la presión, fugas de fase móvil...)

Que nos obligaran a estar preparados para su rápida solución.

9.- Validación del método

El método cromatográfico debe ser suficiente robusto y fiable en caso de que se vaya a emplear en análisis de rutina en diferentes laboratorios. Para ello conviene conocer o estudiar, si es que no se conocen, los siguientes aspectos:

- Influencia en los resultados de pequeñas variaciones en los factores Tª, composición de la fase móvil, flujo, tratamiento de la muestra, y en general en cualquier variable que pueda afectar al método.

- ¿Cuál es el comportamiento del método al analizar diferentes tipos de muestras con diferente matriz y diferentes rangos de concentración?.

- ¿cómo varían los resultados día a día?.

- Comportamiento del método frente a muestras certificadas y en estudios interlaboratorios.

II.- OBJETIVO:RESOLUCIÓN

La cromatografía líquida de alta resolución(HPLC) es fundamentalmente una técnica separativa, es decir, su gran potencial se basa en su capacidad para separar los componentes de la muestra analizada. Cuanto mayor sea su poder de separación – su poder de resolución en lenguaje cromatográfico – tanto mejor habrá conseguido su objetivo. Por tanto, necesitamos saber:

1) Cómo se cuantifica dicho poder de separación.2) Qué factores le afectan.3) Cómo se puede mejorar.

1.- ¿Cómo se cuantifica la Resolución?

La forma más habitual es mediante la fórmula

donde w1 y w2 son las anchuras de las bandas sobre la línea base.

Cuando las bandas están muy solapadas es dificil medir w1 y w2, y entonces se suelen medir las anchuras de las bandas a la mitad de la altura, empleando la siguiente fórmula para la resolución:

Objetivo

Conseguir que las sustancias que componen la muestra den lugar a picos bien separados en el cromatograma.

Es evidente que si solamente interesan 1 ó 2 picos del cromatograma, aunque éste tenga muchos más, el esfuerzo para lograrlo será mucho menor que si es preciso resolver todos los componentes de la muestra.

¿Cómo de grande debe ser la resolución?

Para análisis cuantitativo es conveniente que la Rs sea superior a 1.5 e incluso mayor, ya que con el uso la columna se va degradando y perdiendo eficacia, lo que dará lugar al ensanchamiento gradual de las bandas y a una disminución en la resolución.

2.- Factores que determinan el valor de Rs

Para saber cómo controlar la resolución es preciso conocer la ecuación básica de la misma

donde,

es el factor de separación entre las dos bandas, =k´2/k´1 , siendo los k´ los factores de retención de las bandas.

N, número de platos teóricos promedio de las dos bandas.

k’ , el factor de retención medio de las dos bandas. Se puede determinar a partir de la fórmula tR = t0 ( 1+ k’ ).

N puede medirse a partir de tR y la w1/2 de cualquiera de las dos bandas mediante la fórmula

Por tanto la resolución depende de tres factores, , N y k’, que aunque están interrelacionados, pueden optimizarse independientemente.

3.- Estrategia para aumentar Rs

Lo más aconsejable es optimizar primero k’ y después centrarse en las condiciones que efectan a y N.

¿Cómo se modifica k’?

Cómo la resolución aumenta con el cociente k’/(1+k’), cuanto mayor sea k’ mayor será la resolución pero, k’ elevados implican tiempos de análisis grandes y bandas anchas que son difíciles de cuantificar. Por tanto, son preferibles valores de k’ intermedios, en el rango 1<k’<20, para todas las bandas del cromatograma.

Los k’ de las bandas aumentan o disminuyen con cámbios en la fuerza de la fase móvil. Los k’ disminuyen con el aumento de la fuerza de la fase móvil, como se ilustra en la Fig 6.

¿Cómo se modifica ?

se puede modificar actuando sobre los siguientes factores Fig 7:

Tipo de disolventes de la fase móvil. pH de la fase móvil Fuerza de la fase móvil. Aditivos de la fase móvil (formadores de pares iónicos, tampones,

modificadores, sales...) Tipo de columna. Tª.

La composición de la fase móvil es el factor que más influye sobre el espaciado de las bandas. Dicha composición varia dependiendo de la modalidad cromatográfica de que se trate:

En fase reversa, la fase estacionaria es apolar y la separación se controla empleando como fase móvil una mezcla de agua tamponada con un disolvente orgánico miscible con el agua, como metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano.

En fase normal, las fases estacionarias más utilizadas son sílice o fases ligadas polares como ciano, diol y amino. En este tipo de cromatografía los disolventes se clasifican en cuatro grupos (Fig 8).

Lo normal en esta modalidad cromatográfica es que la fase móvil esté constituida por la mezcla de un disolvente débil como hexano o FC-113 y alguno de los pertenecientes a los tres primeros grupos de la Tabla anterior, como cloruro de metileno, metil-t-butileter o acetonitrilo.

En cromatografía de pares iónicos, los analitos son compuestos iónicos o ionizables por lo que la retención y la selectividad de la separación se van a ver afectadas fundamentalmente por los siguientes factores:

. pH

. Agente formador de pares iónicos.

. Concentración de dicho agente.

. Fuerza iónica.

Hay otros aditivos que se le pueden añadir a la fase móvil para mejorar su selectividad, como agentes complejantes que formen complejos reversibles con varios analitos de la fase móvil; éste es el caso de la adición de éteres crown en análisis de aminas (Fig.9)

El valor de también va a venir determinado por el tipo de columna (fase estacionaria). En este sentido podemos hablar de dos efectos de selectividad:

Uno intencionado, que resulta de la elección de un tipo concreto de fase estacionaria, como ciano, diol, .. Ejemplo Fig. 10.

Otro accidental, debido a los grupos silanol residuales questán siempre presentes en una fase estacionaria ligada. Ejemplo Fig 11.

Finalmente, la Temperatura se puede utilizar de forma ocasional para mejorar la selectividad de la separación, fundamentalmente con compuestos que tengan diferente tamaño y forma, o que estén parcialmente ionizados, ya que el grado de ionización depende de la temperatura.

¿Cómo se modifica N?

Una vez optimizados k’ y se procede a ajustar N, seleccionando los siguientes parámetros:

L (longitud de la columna)Tamaño de partícula de fase estacionaria, yFlujo

Hay que tener en cuenta que cuanto mayor es el valor de la longitud de la columna mejor será la resolución, pero también será mas grande el tiempo de análisis, por lo que si tiene un valor apropiado, una columna de 8 a 10 cm puede ser suficiente.

También, cuanto menor es el tamaño de partícula de fase estacionaria, mejor resolución, pero mas posibilidades de que se obstruya la columna. Es aconsejable que la presión no sobrepase los 150-200 bares.

Finalmente, deberemos seleccionar aquel flujo que nos proporcione las mejores condiciones de trabajo, en cuanto a N, tiempo de análisis y sensibilidad.

Las Figs. 12 y 13 ilustran estas consideraciones.

III.- EL PAPEL DE LA COLUMNA

En este capítulo veremos, por una parte, las características más importantes de las columnas, geométricas, químicas y cromatográficas. Por otra parte veremos también los problemas que se pueden presentar en el uso de las columnas y las posibles soluciones. Finalmente veremos el mantenimiento de una columna.

1.- Características geométricas y químicas de una columna

Características Geométricas

Las características geométricas más importantes de una columna son:

Longitud: Suele estar entre 5 y 25 cm. A mayor longitud mayor N, aunque también mayor gasto de disolventes y mayor tiempo de análisis.(Fig 14).

Tamaño de partícula: Oscila entre 3 y 10 m. Cuanto menor es el tamaño, mayor N, aunque más cara, mas resistencia al flujo y mas posibilidad de que se obture.

Tamaño de los poros de las partículas: En general el tamaño de los poros debe ser superior a tres veces el diámetro de las moléculas a separar.

Geometría de las partículas: Éstas pueden ser irregulares o esféricas. Cuanto más uniformes sean las partículas mayor eficacia. (Fig.15).

Características Químicas

La naturaleza química de la fase estacionaria puede ser muy diversa. Se trata de un adsorbente como la sílice o de una sustancia mas o menor polar unida por enlace covalente a un soporte sólido. El soporte puede ser

- Sílice (generalmente)- Un polímero orgánico.

Cuando se emplea sílice como soporte, la unión de la fase estacionaria al mismo puede lograrse de diferentes maneras, como se refleja en la Fig 16.

Las fases estacionarias mas utilizadas llevan la denominación

C18, C8, Diol, Ciano, Fenil,.....

En general las fases enlazadas de cadena larga son más estables que las de cadena corta, y las apolares más que las polares.

Cuando se emplea la Sílice como soporte, no todo el soporte va a quedar recubierto de fase estacionaria; en muchos casos van a quedar grupos silanol sin enlazar que van a repercutir seriamente en la bondad de la separación, pues dan lugar a lo que se conoce como Interacciones Secundarias, cuyos efectos son generalmente indeseables:

Tipos de interacciones secundarias

Las que tienen lugar con compuestos básicos son generalmente de dos tipos

. Por puentes de Hidrógeno

R3N: + HO-Si R3N: ..........H.......O-Si

. Por cambio iónico

R3NH+ + (X+)-O-Si R3NH+ -O-Si + X+

Formas de combatir las interacciones secundarias

. Mediante la adición de modificadores de la fase móvil que bloqueen los grupos silanol. Se suelen emplear como modificadores aminas terciarias como la trietilamina (TEA).

. Mediante reacciones de end-capping, con trimetilclorosilano (TMS).

La Fig 17 ilustra el fenómeno de las interacciones secundarias.

Las fases ligadas cuyo soporte es un polímero como el poliestireno son estables en un intervalo de pH de 1 a 13, mientras que las basadas en sílice no deben emplearse por encima de pH 8. No obstante, estas últimas presentan otra serie de ventajas, como el hecho de ser bastante más baratas, más eficientes y más resistentes mecánicamente.

2.- Características cromatográficas

Desde el punto de vista cromatográfico las características más interesantes de una columna son:

N (Nº de Platos Teóricos)

Es la característica más importante pues de ella depende la eficacia de la columna. En la Fig 18 se dan algunos valores típicos. El fabricante suele darlo con un cromatograma de prueba y el analista debe comprobarla cada cierto tiempo.

Asimetria de los picos

La forma de los picos también es importante. Son preferibles picos simétricos ya que los picos asimétricos conducen a cuantificaciones imprecisas, pobre resolución, y falta de reproducibilidad en la retención.

Forma de medir el factor de asimetria: Fig 19.

Reproducibilidad en k’ o tR

Caida de presión

Debe estar en 30-50% de la predicha mediante la ecuación:

3.- Problemas con la columna y remedios

Si se observa una falta de reproducibilidad en los tiempos de retención y/o la resolución, o se observa que los picos cromatográficos presentan colas, ello puede indicar que hay algun problema que afecta a la columna:

A) Causas de falta de reproducibilidad y sus posibles remedios

Efectos secundarios:

Como ya se ha comentado son debidos a los grupos silanol residuales y se corrigen con modificadores de la fase móvil como TEA o acetato.

Saturación de la fase estacionaria, debido a la inyección de una cantidad excesiva de muestra. Es recomendable determinar la máxima cantidad de muestra que no afecta a los tR ni a N, para trabajar siempre por debajo de ese límite.

Cambios en la temperatura

Es una causa frecuente de variaciones en los tiempos de retención, especialmente con compuestos iónicos o ionizables. Se corrige termostatando la columna a una temperatura 0.2 ºC.

Relacionado con la fase móvil:

Pobre tamponamiento:

En tal caso se aumenta la concentración de tampón.

Cambios en la composición de la fase móvil:

Las mezclas de los disolventes que constituyen la fase móvil se deben hacer con gran exactitud, preferiblemente con un sistema on-line.También puede ocurrir que el sistema de desgasificado provoque la evaporación selectiva de alguno de los disolventes que integran la fase móvil.

B) Tailing (picos con colas)

Las posibles causas y remedios de los cromatogramas con colas en los picos son:

Columna de mala calidad:

Probablemente debido a que esté mal empaquetada. En tal caso se devuelve al fabricante.

Taponamiento parcial de la cabeza de la columna (inlet frit) o un vacio al principio: Fig 20.

Cambiar el inlet-frit y/o rellenar con una papilla espesa de fase estacionaria el hueco que se halla formado.

Lavar la columna.

Utilizar una guardacolumna

Inyectar muestras límpias

Inyección de una cantidad excesiva de muestra.

Inyectar no mas de 2-50 g de cada compuesto para una columna de 15 x 0.46 cm.

Inyección de la muestra en un disolvente más fuerte que la fase móvil.Fig 21.

La muestra debe estar en un medio lo mas parecido posible a la fase móvil.

Efectos extra-columna, como:

. loop con volumen excesivamente grande. Es preferible un loop con volumen inferior a 25 l.

. Conexiones ( V.Inyección-columna, columna-detector ) de diámetro excesivo. Usar tubos de conexión con diámetro interno inferior a 0.010 cm y hacer correctamente las conexiones con los fittings adecuados.

. Célula de flujo con excesivo volumen. Usar una célula de flujo limpia con volumen inferior a 10 l.

Efectos químicos

Efectos secundarios debidos a los grupos silanol. Emplear TEA y/o acetato.

Contaminación por metales (Fe, Ni, ...) presentes en el empaquetamiento o producidos por el deterioro de las conexiones por fases móviles agresivas.

4.- Mantenimiento de columna. Vida de la misma

Recomendaciones para alargar la vida de la columna ( Fig 22):

Evitar cambios bruscos de presión y presiones excesivamente elevadas.

Evitar la inyección de muestras sucias:

Para lo cual deberemos:

- Usar guardacolumna- Lavar con frecuencia la columna con un disolvente

fuerte como 1/1 Isopropanol/cloroformo para fase reversa, y metanol para fase normal.

- Hacer un tratamiento previo de la muestra para eliminar componentes que puedan quedar muy retenidos.

- Poner un filtro de 0.5 m entre la válvula de inyección y la columna.

- Filtrar la muestra y los disolventes.

En el caso de fases enlazadas:

- Mantener el pH de la fase móvil entre 2.5 y 7.0. (Fig 23).- Evitar Tª> 60º.- Para evitar la proliferación de microorganismos en fases

móviles, añadir a las mismas 100-200 ppm de azida sódica.

- Guardarlas en acetonitrilo, bien tapadas.

IV DESARROLLO DE UN MÉTODO CROMATOGRÁFICO

1.- Etapas del desarrollo de un método cromatográfico

En la Fig 24 se recogen las 4 etapas básicas del desarrollo de un método cromatográfico.

La etapa primera o previa viene determinada por el tipo de muestra y comprende:

1. La elección del sistema de detección: Hoy día se dispone de una gran variedad de detectores. Naturalmente esta elección vendrá condicionada por la instrumentación de la que disponga el laboratorio. Nosotros nos vamos a referir exclusivamente al detector espectrofotométrico, ya que es el más utilizado y es aplicable a la mayor parte de los análisis. En la utilización de este detector deberemos tener en cuenta una serie de recomendaciones:

- Entre 185 y 210 nm se pueden detectar la mayoria de los compuestos.

- Si se utiliza una longitud de onda de detección muy baja, la fase móvil deberá ser suficientemente transparente, empleando disolventes como hexano, heptano, acetonitrilo, tampones con fosfatos inorgánicos y huyendo de los gradientes.

- Una columna muy sucia o degradada producirá ruido de fondo. Como ya se dijo conviene lavarla a diario con metanol o acetonitrilo.

2. La elección de la modalidad cromatográfica: La eleción de la modalidad cromatográfica y el tipo de columna se hace en función del peso molecular de los analitos y de su solubilidad en los disolventes orgánicos y en agua, tal como se indica en la Fig 25. Es decir, se tiene en cuenta el carácter mas o menos iónico de los analitos.

Las etapas 2ª, 3ª y 4ª de la Fig 24 se comentarán mas adelante.

2.- Optimización de la selectividad en fase reversa

Disolventes empleados : Metanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano + agua tamponada.

Forma de actuar : Dependerá del tipo de muestra, según se trate de una muestra fácil, media o dificil. Fig 26.

- Una muestra fácil es aquella cuya separación se puede conseguir empleando una fase móvil isocrática de acetonitrilo/agua.

- Una muestra tipo medio es aquella que no se separa bien con la mezcla ACN/agua, siendo preciso el empleo de MeOH/agua o THF/agua.

- El resto de las muestra, no encajan en los dos grupos anteriores y se pueden considerar como muestras difíciles.

En este caso se lleva a cabo lo que se llama una optimización sistemática de la fase móvil mediante la elaboración de un mapa de resolución vs composición de la fase móvil. Se ilustran las etapas a seguir mediante el ejemplo siguiente de separación de seis esteroides: Fig 27. Las etapas a seguir son:

1ª) Se comienza por la mezcla metanol/agua y se determina cual es el porcentaje adecuado de disolvente orgánico para obtener un intervalo adecuado de k’. cromatograma 1.

2ª) Probamos la mezcla ACN/agua equivalente a la mezcla MeOH/agua anterior, procurando que el tiempo de análisis sea parecido al del cromatograma anterior. cromatograma 2.

3ª) Idem con la mezcla THF/agua. Cromatograma 3.

4ª) Se mezclan las fases móviles 1,2, y 3, en volúmenes iguales para obtener las fases móviles 4,5,6 y 7.

5ª) Se determina cual es la fase móvil que nos proporciona la mejor separación: Observamos que los cromatogramas 5 y 3 permiten separar las bandas 1, 2 y 3. Asimismo la banda 4 se modifica sensiblemente al variar la proporción ACN/THF ( Cromatogramas 2, 5 y 3).. Esto sugiere que podríamos mezclar la f.m. 5 y 3 para conseguir que la banda 4 salga equidistante entre la banda 5 y 6 . El resultado de esta mezcla se muestra en la fig 28, donde se incluye un posterior ajuste de la separación actuando sobre la columna.

- Si después de todo esto no obtuviéramos la Resolución adecuada hay que actuar sobre otros parámetros, como: Transp. 01

Fuerza iónicapHOtros disolventesAditivos TªTipo de relleno

Optimización de otras variables :

Si después de optimizar la fase móvil como se ha comentado anteriormente no se consigue una buena separación, el siguiente paso consiste en optimizar otras variables:

Fuerza iónica y pH

La retención de analitos con carácter ácido o básico puede variar con la fuerza iónica y el pH:

- Un cambio de pH que produzca un incremento de la ionización de un compuesto hará que disminuya su tiempo de retención. Véase esto con el ejemplo de la Fig 29.

- Los pHs adecuados para una separación van a estar dentro de 2 unidades de los pKa de los compuestos que componen la muestra.

- La retención de moléculas anfóteras depende más de la carga de los grupos individuales que de la carga global de la molécula.

- El aumento de la fuerza iónica hace que los silanoles residuales interaccionen menos con los analitos básicos. Ejemplo Fig 30.

Otros disolventes orgánicos

En separaciones difíciles puede ser valioso el empleo de otro disolvente orgánico distinto a los empleados habitualmente, teniendo cuidado de que no haya problemas de solubilidad. En la fig 31 se da un ejemplo en el que la adición de un 10% de eter etílico mejora la selectividad.

Temperatura

Un cambio en la temperatura, en general va a tener poco efecto sobre la resolución, salvo en algunos casos en los que se puede mejorar la separación de una pareja de bandas variando la Tª.

3.- Optimización de la selectividad en cromatografía de pares iónicos

La cromatografía de pares iónicos es una alternativa útil para aquellas muestras que contienen compuestos iónicos o ionizables.

Componentes de la fase móvil:

Mezcla acuosa/orgánica.+ tampón+agente formador de pares iónicos.

Fase estacionaria

Las mismas empleadas en fase invertida – C18, C8, ciano --

Mecanismo de retención

La hipótesis más aceptada es la de que el agente formador de pares iónicos se adsorbe primero sobre la superficie de la fase estacionaria, y el ión de la muestra es retenido a continuación por un mecanismo de cambio iónico.En la Fig 32 se ilustra la retención de un par iónico, tomando como ejemplo un compuesto ácido AH.

Si no hay agente formador de pares iónicos la retención tiene lugar a través de un proceso de fase reversa (a). En este caso la forma no disociada AH, existente a pH << pK a

es la retenida, mientras que A- no es retenido.

Si hay una gran concentración de contraión, de manera que la fase estacionaria está recubierta con el mismo, el proceso que va a predominar es de cambio iónico, de forma que ahora la especie más retenida es A- , la cual existe predominantemente a pH>>pKa (b). A pH bajo la especie no ionizada AH no será retenida por cámbio iónico (pero puede ser debilmente retenida por un proceso de fase reversa).

Para niveles intermedios de concentración del agente formador de pares iónicos, pueden tener lugar los dos procesos simultáneamente.

Por tanto, para controlar la retención y la selectividad en esta modalidad cromatográfica tendremos que controlar:

- Concentración y tipo de agente formador de pares iónicos.

- pH de la fase móvil.- % de disolvente orgánico.

Protocolo de optimización

- El tratamiento de muestras fáciles y de tipo medio se hace de forma similar a la fase invertida.

- En el caso de muestras difíciles se sigue el esquema de la figura 33, y se ilustra mediante el ejemplo de la figura 34.

Optimización de otras variables:

Temperatura

La temperatura de la columna puede afectar al espaciamiento entre bandas en C.P.I, ya que el grado de ionización de un compuesto depende de la misma. Fig 35.

Aditivos

Aunque la actividad de los silanoles residuales en esta modalidad es menor que en fase invertida, ya que los silanoles estan en parte apantallados por el agente formador de pares iónicos, también será necesario añadir en algunos casos un modificador tipo amina.

Tipo de columna

El tipo de columna tiene poca importancia en esta modalida cromatográfica ya que la fase estacionaria queda cubierta por el agente formador de pares iónicos.

4.- Optimización de la selectividad en cromatografía en fase normal

Si la cromatografía en fase reversa o de pares iónicos no conduce a los resultados esperados se puede acudir a la cromatografía en fase normal. Es una modalidda adecuada para el análisis de compuestos orgánicos poco solubles en disolventes acuosos.

Fases estacionarias

Preferentemente fases ligadas ciano, diol, amino, y en último caso, sílice.

Fases móviles

Mezclas de un disolvente apolar como Hexano o FC-113 con disolventes orgánicos polares como cloroformo, metanol o ACN. Estos últimos disolventes los clasificamos en no localizadores, y localizadores, básicos y no básicos. Fig 8.

Mecanismo de retención

Adsorción de los analitos sobre la fase estacionaria en competencia con las moléculas de la fase móvil. Fig 36.

Optimización de la separación

1º) Se trata de obtener una fase móvil que proporcione un intervalo de k’ entre 1 y 20. Para determinar la fuerza de la fase móvil, 0, se pueden utilizar las tablas II.2 y 4.3 (Fig 37).

2º) Las muestras fáciles y de tipo medio se tratan igual que en fase invertida.

Las muestras difíciles deben seguir el esquema de la Fig 38.

Todo esto se ilustra mediante el ejemplo de la figura 39.

Optimización de otras variables

Tipo de columna

El tipo de columna afecta drásticamente al espaciamiento entre las bandas.

Otros disolventes orgánicos

El empleo de otros disolventes orgánicos como alcoholes puede abrir nuevas posisbilidades en la mejora de la separación. Temperatura

En general va a tener poca influencia un cambio en la temperatura. Fig 40.

4.- Técnicas multidimensionales

La cromatografía multidimensional es aquella que utiliza dos o más separaciones cromatográficas diferentes para alcanzar la resolución deseada. Este enfoque se puede emplear para :

- Analizar todos los componentes de una mezcla compleja.

- Analizar uno o varios analitos de una muestra con una matriz compleja .

Análisis total de la muestra

- Una alternativa para el análisis completo de una muestra compleja consiste en llevar a cabo una separación inicial en gradiente seguida de una separación isocrática de las fracciones individuales obtenidas a partir del gradiente inicial. Ejemplo de la Fig 41. El inconveniente de esta opción es el tiempo excesivamente grande del análisis (10 h).

- Una técnica más poderosa consiste en combinar diferentes modalidades cromatográficas como cambio iónico + fase invertida. Fig 42.

Column Switching

En lugar de recoger manualmente las fracciones resultantes de una separación inicial y después volverlas a inyectar se puede interconectar columnas mediante válvulas, como en ejemplo de la Fig 43, en el que se muestra un sistema para la separación inicial de una mezcla de aminoácidos seguida de la conexión mediante válvula a otro sistema que contiene una columna Chiral que se encarga de separar los isómeros D- y L-.