Marzo 2003

DIVERSIDAD DE LYCASTE SKINNERI (BATEM EX. LINDL.) LINDL. EN GUATEMALA: ANÁLISIS DE GERMOPLASMA PARA SU CONSERVACIÓN.

FODECYT 59-00

TITULO DE PROYECTO:

DIVERSIDAD DE LYCASTE SKINNERI (BATEM. EX LINDL.) LINDL. EN GUATEMALA:

ANÁLISIS DE GERMOPLASMA PARA SU CONSERVACIÓN. FINANCIADO POR: SENACYT LÍNEA DE FINANCIAMIENTO: FODECYT

NUMERO DE PROYECTO: 59-00 INSTITUCIÓN EJECUTORA: UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA INVESTIGADOR PRINCIPAL: GERDA MARIA HUERTAS DE ORDÓÑEZ INVESTIGADOR ASOCIADO: MAYRA MALDONADO INVESTIGADOR ASOCIADO: MARGARET ANN DIX INVESTIGADOR ASOCIADO: MICHAEL WILLIAM DIX TÉCNICO REPRODUCCIÓN IN VITRO: LISBETH PANIAGUA TÉCNICO ANÁLISIS GENÉTICO: LUIS CARLOS CASTELLANOS FECHA DE INICIO: 03 DE SEPTIEMBRE 2001 FECHA FINAL: 28 DE FEBRERO 2003

Índice Temático Contenido Pag. AGRADECIMIENTOS vI. INTRODUCCIÓN 1II. ANTECEDENTES 1

A. Análisis Morfométrico 4B. Análisis Genético 5C. Cultivo de Tejidos in vitro 11

III. OBJETIVOS 15IV. HIPÓTESIS 15V. METODOLOGÍA 16

A. Fuente de Muestreo 16B. Análisis Morfométrico 16C. Análisis Genético 18

1. Extracción de ADN 182. Cuantificación de ADN por fluorimetría 183. Amplificación de ADN por medio de la Reacción en Cadena de la

Polimerasa (PCR) 19

4. Técnicas de “Touchdown” para la amplificación de ADN por medio de PCR

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5. Electroforesis en Agarosa 226. Visualización en Gel de Agarosa 23

D. Cultivo de Tejidos in vitro 231. Selección de Tejidos 232. Desinfección de muestras 243. Siembra in vitro 24

VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 25A. Fuente de muestreo 25B. Análisis Morfométrico 25C. Análisis Genético 31

1. Extracción de ADN 312. Cuantificación de ADN por Fluorimetría 313. Visualización de ADN en gel de Agarosa 32

D. Cultivo de Tejidos in vitro 39

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Índice Temático (continuación)

Contenido

Pag.

VII. CONCLUSIONES 41VIII. RECOMENDACIONES 42IX.BIBLIOGRAFÍA 44ANEXOS 47ANEXO A. SOLUCIONES MADRE ANÁLISIS GENÉTICO 48ANEXO B. MEDIOS DE CULTIVO IN VITRO 49ANEXO C. INFORME FINANCIERO 54

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Índice de Cuadros Contenido Pag.Cuadro 1. Comparación de los tres genomas en la célula vegetal (Judd et al., 1999)

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Cuadro 2. Datos continuos medidos (en mm) y proporciones basadas en estas mediciones de partes florales de Lycaste skinneri

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Cuadro 3. Estadígrafos que describen las partes florales de Lycaste skinneri (n=110).

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Cuadro 4. Análisis de componentes principales de las características florales de Lycaste skinneri

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Cuadro 5. Cantidades de ADN cuantificado (ng/ml) de las extracciones realizas de hojas de orquídeas del género Lycaste

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Cuadro 6. Cantidad de muestras amplificadas y visualizadas en agarosa, clasificadas por gen analizado, incluye extracciones en triplicado

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Cuadro 7. Cantidad de muestras de ADN amplificadas y visualizadas en agarosa, por experimento, bajo distintas condiciones.

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Cuadro 8. Cantidad de muestras sembradas en los diferentes medios 40

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Índice de Figuras Contenido Pag.Figura 1. Distribución histórica de Lycaste skinneri en Guatemala (Modificado de Chavaría Samayoa, 1982).

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Figura 2. Localización de genes en el ADN cloroplásmico de Oryza sativa L. (Hiratsuka et al., 1989).

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Figura 3. Diagramas de la localización de los cebadores en las regiones amplificadas. (Tomados de Neyland y Urbasch, 1995; Johnson y Soltis, 1995; modificado de Bodo Slotta, 2000; y Saar Polans, 2000) A. Gen de la subunidad F de la NADH deshidrogenasa; B. Gen de la subunidad K de las madurasas C. Epaciador Interno Transcrito de unidad del ADN ribosomal en el núcleo.

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Figura 4. Partes florales, mostradas en Lycaste skinneri var. rosea (en cultivo).

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Figura 5. Localidades historicas de Lycaste skinneri comparadas con localidades de germoplasma disponible y no disponible para el año 2001-2002 en Guatemala

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Figura 6. Variabilidad de Coloración y Forma del Labio de Lycaste skinneri de Guatemala

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Figura 7. Cladograma que agrupa las localidades de las flores medidas de Lycaste skinneri en base a sus características morfométricas.

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Figura 8. Amplificación del gen ITS-1 en muestras de orquídeas del género Lycaste (2-9).

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Figura 9. Amplificación del gen ITS-1 e ITS-2 en muestras de Solanum sp (1-5).

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Figura 10. Amplificación del gen ITS-1 e ITS-2 en muestras de Lycaste del Sección Xanthanthae

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Figura 11. Amplificación del gen ITS-1 en muestras de Lycaste skinneri var. rosea en cultivo en Baja Verapaz (2-11)

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Figura 12. Amplificación del gen ITS-2 en muestras de Lycaste skinneri var. rosea en cultivo de Baja Verapaz (2-11).

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Figura 13. Metodología de PCR touchdown con tres distintas muestras de Lycaste skinneri var. rosea (1, 2, 3) utilizado 3 cebadores (A=matK, B=ITS-1 y C=ITS-2)

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Figura 14. Producto esperado de seis muestras de Lycaste de la sección Xanthanthae utilizando cebadores para el gen matK realizado en el año 2000 (datos no publicados)

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Figura 15. Partes de plantas de Lycaste vivas y muertas en los diferentes medios de cultivo

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AGRADECIMIENTOS A la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología por el financiamiento otorgado (Proyecto FODECYT 59-00) y la ayuda y orientación a través del apoyo prestado por el personal de la línea FODECYT. A los integrantes de la Asociación Guatemalteca de Orquídeologia (AGO) y a los de la Asociación Verapacense de Orquideología por proporcionarnos muestras de flores y hojas de sus plantas, en especial a Regina Lizama, Regina de Castejón, Mario Palmieri y Silvia de Palmieri. A los Drs. Dix por su asesoría durante el proceso, y apoyo en viajes de campo y muestras de sus plantas cultivadas. A la Licenciada Margarita Palmieri por su asesoría en el cultivo de tejidos y uso de espacio en el laboratorio de cultivo de tejidos. Al Dr. Paul Manos de la Universidad de Duke, Carolina del Norte (EE.UU.) por su asesoría en el análisis genético y obsequio de cebadores ITS.

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I. INTRODUCCIÓN

En el campo de la horticultura las especies del género Lycaste son muy cotizadas porque sus híbridos con otras especies son muy vistosos y de variados colores. Por esta razón y el avance de la frontera agrícola, las plantas en el campo casi han desaparecido en su totalidad, y han sufrido erosión genética porque pocos fenotipos son apreciados por los horticultores. La mayoría de plantas de la especie Lycaste skinneri, cuya variedad alba es la flor nacional de Guatemala, se pueden encontrar en colecciones privadas y muy pocas veces en su hábitat natural. Se realizaron análisis morfométricos de flores y análisis genéticos de la porción matK y ndhF en ADN cloroplásmico y de la porción ITS1 e ITS2 de los ribosomas nucleares para tratar de determinar la procedencia genética de Lycaste skinneri, además se evaluó el crecimiento in vitro de diferentes porciones de la planta y sus semillas en 8 medios diferentes. El análisis morfométrico muestra 8 grupos de caracteres medidos que presentan mayor varianza y sirven para poder agrupar los diferentes tamaños de las flores de las plantas dentro de Lycaste skinneri. Estos datos muestran una tendencia de aumentar el tamaño de la flor desde las poblaciones en el Sur hacia el área de las Verapaces. No hay suficiente evidencia en los caracteres medidos como para separar la especie en varios grupos. En el análisis genético no se puede alcanzar una conclusión ya que el método es altamente sensible a la contaminación por ARN y a la degradación del ADN de las muestras obtenidas. En el cultivo de tejidos se logró poca producción de embriones a partir de meristemos. Los más exitosos son los meristemos de partes florales y raíces. Las hojas presentan una alta tasa de sobrevivencia pero no han producido embriones explantables. Las semillas tienen buena sobrevivencia. Se mantienen los clones sobrevivientes en el laboratorio de cultivo in vitro de la UVG.

II. ANTECEDENTES

Las orquídeas han sido depredadas de los bosques tropicales desde su descubrimiento. Las especies del género Lycaste no han sido la excepción. Se distribuyen en Latinoamérica, desde México hasta Perú, con unas pocas especies en el Caribe y Brasil. Las especies guatemaltecas son las más utilizadas para la hibridación ex situ en el mundo(Ames y Correl, 1953; Oakeley, 1998). Fueron introducidas, junto con otras especies de orquídeas y plantas epífitas, al Viejo Mundo durante el siglo XVIII, en embarques medidos en toneladas. Entre los cargamentos de plantas llevadas a Inglaterra durante los años comprendidos entre 1840 y 1870, fue descubierta Lycaste skinneri (Batem ex Lindley) Lindley. Esta especie consta de muchas variedades, entre ellas la L. skinneri var. rosea, que es la más común y la L. skinneri var. alba, la flor nacional de Guatemala, que es la

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más cotizada por los horticultores. Las variedades presentan colores que van desde el rojo y morado hasta el blanco. De la variedad alba, solo se puede encontrar una planta en 2,000 plantas de Lycaste skinneri (Ames y Correl, 1953; Dix y Dix com. pers.; Oakeley, 1993). El 70% de los híbridos, registrados para este género, tiene en su acervo genético a L. skinneri. Este interés ha mermado el banco de germoplasma que se encontraba en los bosques nubosos de Guatemala, Chiapas (en México) y el norte de Honduras y El Salvador. El hábitat natural de esta especie es el bosque premontano húmedo y pluvial, con una precipitación anual entre 1,900 mm a 4,000 mm, ver Fig. 1. En Guatemala se encuentran en los bosques de la parte norte del país como Huehuetenengo, Quiche, Alta Verapaz, baja Verapaz, Zacapa e Izabal. En la parte sur existen dos áreas, una en el suroeste en San Marcos, Quetzaltenango, Totonicapán y Sololá y en el sureste en Jalapa, Jutiapa y Chiquimula. Cohabita con árboles como encinos, liquidambar, aguacatillo, laureles, y pino de candelaria, y también con helechos arborescentes (chipe), epífitas y otras plantas ornamentales (Dix y Dix, com. pers.). La gran cantidad de variedades de L. skinneri ha impulsado a que los expertos y cultivadores de este género aventuren hipótesis sobre su origen. Las dos hipótesis más difundidas exponen que (i) al menos dos especies están unidas en una sola descripción (Archila, 1998; Dix y Dix, 2000; Tinschert, 1983) y (ii) existe una especie central y un enjambre de híbridos con las siguientes especies: L. cruenta, L. macrophylla, L. lasioglossa y L. deppei (Dix y Dix, 1992; Oakeley, 1991). El hábitat de L. skinneri ha sido reemplazado por cultivos como el café de montaña, la agricultura tradicional (maíz y frijol) y por el monocultivo propiciado por el PINFOR. Además, fue colectada de forma que las poblaciones originales de L. skinneri no pudieron volver a recuperarse. La mayor diversidad genética real para esta especie, se encuentra en las plantas de colecciones o invernaderos privados; una forma de conservación ex situ. Para asegurar la conservación de la especie se propone analizar muestras foliares de las distintas variedades de esta especie y crear un banco de germoplasma para la misma en el invernadero de la Universidad del Valle de Guatemala. Las colecciones de germoplasma son ensambles de genotipos o poblaciones representativas de cultivares, grupos genéticos, especies silvestres, etc. Que son mantenidas en forma de plantas, semillas y cultivo de tejidos. Se ha considerado que la variación genética en plantas es una fuente ilimitada. Pero últimamente se ha registrado que la mayoría de la variación genética solo la encontramos en centros de diversidad natural que pronto desaparecerán si no se toman las acciones necesarias (Ramanatha Rao y Riley, 1994).

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Figura 1. Distribución histórica de Lycaste skinneri en Guatemala (Modificado de Chavarría Samayoa, 1982).

Mar de las Antillas

14°

16°

92° 90°

18°

Km 100 50 0

Belice

México

Honduras

El Salvador

Océano Pacífico

Clave

Distribución Histórica de L. skinneri

Departamentos AV Alta Verapaz

BV Baja Verapaz

Cm Chimaltenango

Cq Chiquimula

Es Escuintla

EP El Progreso

Gu Guatemala

Hu Huehuetenango

Iz Izabal

Ja Jalapa

Ju Jutiapa

Pe Petén

Qz Quezaltenango

Qc Quiché

Re Retalhuleu

Sa Sacatepéquez

SM San Marcos

SR Santa Rosa

So Sololá

Su Suchitepéquez

To Totonicapán

Za Zacapa

EPZa

Re

To SM Qc

Gu

SR Es

Ju

Sa

Hu Iz

AV

Su

BV

Pe

Cm Qz Ja

Cq So

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A. Análisis Morfométrico:

La descripción de especies se basa mayormente en sus características morfológicas como tamaño y descripción de la planta, sus flores y frutos. Este conjunto de características es el que nos ayuda a reconocer cuáles son las especies más emparentadas y cuáles menos. Como se utilizan muchas características para describir cada uno de los organismos estos datos se muestran complejos, con ruido (información no valiosa), con redundancia y con relaciones internas o externas que los modifican. Estos grupos de datos son voluminosos y alguna información sólo se puede interpretar de forma indirecta. Los métodos multivariados hacen más fácil el manejo de estos datos (Jongman, TerBraak y VanTongeren, 1995). Se utiliza el análisis multivariado para analizar estas características ya que al ser muchas, se necesita poder unificar las que se comportan de forma más parecida y las que no. El análisis de componentes principales es uno de los procedimientos que se recomienda antes que cualquier otro análisis multivariado, ya que agrupa las unidades experimentales en subgrupos semejantes e identifica las variables significativas subyacentes (Gauch, 1982; Johnson, 2000). El análisis de componentes principales resume la redundancia de los datos localizándolos en entidades similares próximas en el espacio ordenado y produce una descripción económica de los datos en términos de unos pocos gradientes dominantes de variación. En el grupo original de datos encontramos mucha redundancia por lo que los análisis de componentes principales extraen la mayoría de la variación en la menor cantidad posible de dimensiones (Matus, González y del Pozo, 1999; McGarigal, Cushman y Stafford, 2000; Molina Cano, 1977). El análisis de componentes principales permite la reducción de la complejidad o dimensión del problema mediante la creación de nuevos componentes, fuera de las variables originales que maximizan la variación entre los individuos a partir de un modelo linear dado en valores Eigen (Matus, González y del Pozo, 1999; McGarigal, Cushman y Stafford, 2000). El análisis de componentes principales agrupa varios caracteres relacionándolos en factores, y muestra como cada uno de los factores encontrados, contribuye a separar grupos (Rojas, Barriga y Figueroa, 2000). Se toman en cuenta todos los componentes principales cuyo valor Eigen es mayor de 1.00 y se explica con base a la cantidad de varianza acumulada en esos datos (Matus, González y del Pozo, 1999). El significado biológico de cada componente se refleja en la importancia de cada variable que define el componente. Esto es, mientras más importancia tenga la variable medida, más extremo será el valor del componente (McGarigal, Cushman y Stafford, 2000).

El uso de los fenotipos morfológicos para la caracterización de los genotipos tiene

sus ventajas y desventajas. La naturaleza multialélica de estas características provee de información muy útil a los cultivadores. Aun así, lo complejo de su herencia hace que las predicciones de los cruces realizados sea difícil (Ramanatha Rao y Riley, 1994). Las características morfológicas del individuo prevalecen en el ADN nuclear que es heredado de ambos padres por lo que estas técnicas son utilizadas para complementar el análisis genético.

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B. Análisis Genético La sistemática es la ciencia de la diversidad, es decir, la organización del conjunto total del conocimiento sobre los organismos, dentro de estos conocimientos incluimos los análisis de los genomas o fuentes de información genética. La célula vegetal contiene tres diferentes genomas: núcleo, mitocondria y cloroplasto. Para estudios en sistemática se han utilizado datos producidos de los tres. Los organelos, y por lo tanto sus genomas, son heredados uniparentalmente (en Lycaste es heredado maternalmente, Dressler 1981); en el caso del núcleo y su información genética se hereda biparentalmente. Como se puede ver en el Cuadro 1, los tres genomas difieren notablemente entre ellos, principalmente en su tamaño. El tamaño del genoma de núcleo es el más grande y puede medir millones de kilobases (kb); mientras que la mitocondria tiene un genoma relativamente pequeño de hasta 2,500 kb y el genoma del cloroplasto es el más pequeño alcanzando a medir hasta 160 kb (Judd et al., 1999). Cuadro 1. Comparación de los tres genomas en la célula vegetal (Judd et al., 1999) Organelo Tamaño en Kilobases (Kb) Tipo de Herencia Cloroplasto 135-160 Maternal generalmente Mitocondria 200-2,500 Maternal generalmente Núcleo 1.1x106 hasta 110x109 Biparental Las mitocondrias y los cloroplastos son eubacterias que poseen genomas circulares. Los genomas de las mitocondrias son variables y están separados por grandes regiones de ADN que no codifican. Frecuentemente, los genomas de las mitocondrias se rearreglan ellos mismos, y pueden existir muchas dentro de una misma célula. Esto indica que los rearreglos del genoma se pueden dar dentro de un mismo individuo, y que no son útiles para identificar y caracterizar especies y grupos de especies. No son adecuadas para inferir relaciones filogenéticas. Por el contrario, el cloroplasto es estable, tanto celular como molecularmente. La característica más obvia del genoma cloroplásmico es la presencia de dos regiones que codifican para los mismos genes pero en dirección opuesta, regiones conocidas como secuencias invertidas. Entre ellas existen una región pequeña y una región grande de copia sencilla. Los rearreglos en el genoma cloroplásmico son tan poco frecuentes que permiten el uso de este genoma para estudios filogenéticos para delimitar a los taxones mayores. La ganancia o perdida de genes o sus intrones son tan poco frecuentes que pueden ser utilizados como marcadores estables de cambios evolutivos (Judd et al., 1999). Se tiene evidencia que el orden de los genes en el genoma nuclear es estable, al menos dentro de especies y puede que también sea estable entre grupos de especies. Dicha evidencia ha sido mostrada a través de mapeos genómicos. Las secuencias de ADN cambian a distintas velocidades comparadas con la velocidad de cambio genómico. Los genes cloroplásmicos tienden a acumular mutaciones más rápido de lo que lo hacen los genes mitocondriales. Es difícil generalizar acerca de los genes nucleares por el poco conocimiento que se tiene de ellos y la gran cantidad de genes presentes en el núcleo celular (Judd et al., 1999).

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El ADN cloroplásmico (ADNcp) es circular y de hebra doble. Dentro del organelo se pueden encontrar muchas copias del mismo. El ADNcp está organizado en unidades discretas llamadas nucleoides, en los que se cree que están localizados en el estroma del cloroplasto y están asociadas con las membranas de los tilacoides (Coleman, 1985). El genoma del cloroplasto varía entre 120 a 217 kb. En la mayoría de las angiospermas estas secuencias de cientos de kilobases miden entre 39 y 46 micrómetros (μm) en dicotiledóneas, y entre 37 y 55 μm en monocotiledóneas (Palmer, 1985). La estructura típica del ADNcp consiste de dos segmentos compuestos de secuencias invertidas (IR) de 20 a 30 kb separadas por una copia única corta (SSC) y una copia única larga (LSC), ver Fig. 2 (Hiratsuka et al., 1989; Palmer y Thompson, 1981).

Figura 2. Localización de genes en el ADN cloroplásmico de Oryza sativa L. (Hiratsuka et al., 1989). SSC Copia única pequeña (Small Single Copy); IR Secuencias Invertidas (Inverted Repeats) y LSC Copia única larga (Large Single Copy). Los genes en el interior del círculo se transcriben en el sentido de las agujas del reloj; los del exterior, en contra sentido. Los asteriscos resaltan los genes de fisura (split genes). La flecha azul y el sombreado marcan al gen ndhF en la SSC. La flecha roja y el sombreado muestran el gen matK, en la región trnK en la LSC.

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En la última década el uso del ADNcp ha aumentado su valor en estudios evolutivos y en sistemática. La invención de nuevas técnicas moleculares más simples y eficientes para la extracción y purificación de ADN, ha ayudado al progreso general que se da en la biología molecular. Los avances alcanzados utilizando el ADNcp son recientes, pero ampliamente documentados contribuyendo con información sobre la sistemática y evolución de las angiospermas a todo nivel taxonómico. El mayor énfasis se ha realizado en plantas de importancia económica, a pesar de que los casos más interesantes se presentan en otras especies de plantas (Hilu, 1987). Existen numerosas dificultades en la sistemática de angiospermas como en el caso de estudios morfológicos en la cual la microscopía para determinar caracteres, no es suficiente. El uso de ADNcp puede ayudar a aclarar incógnitas (Hilu, 1987). La sistemática molecular difícilmente hubiera sido posible sin la invención del ADN recombinante, mejoramiento de las técnicas de secuenciación y el uso de la reacción en cadena de la polimerasa. También hay que agregar los avances en la secuenciación automatizada, la cual hará las técnicas notablemente rápidas (Judd et al., 1999). Inicialmente la mayoría de estudios genéticos se habían realizado utilizando análisis de sitios de restricción. La cuál había sido utilizada para la generación de mapas de genes individuales o genomas enteros. La mayoría de lo que se conoce de genomas mitocondriales y cloroplásmicos, proviene de estudios utilizando enzimas de restricción. La técnica consiste en la extracción del ADN y luego cortar en sitios específicos de la hebra de ADN con éstas enzimas. Un mapa genético se puede construir cortando el ADN con una enzima y examinando el patrón del tamaño de los fragmentos resultantes. Se repite el mismo procedimiento utilizando otra enzima de restricción y se analiza. Por último, el procedimiento se repite utilizando las dos enzimas de restricción al mismo tiempo. Este análisis crea una especie de rompecabezas, el cuál, para formarlo se necesitan colocar en orden las combinaciones de los fragmentos de restricción (Judd et al., 1999). El procedimiento utilizado anteriormente era muy laborioso, debido a que se realizaba una separación de organelos del resto del tejido vegetal, para luego separar el ADN de dichos organelos, cortarlo con las enzimas de restricción y visualizarlo en gel teñida con bromuro de etidio. Dicho análisis fue simplificado por la introducción de la hibridación de hebras de ADN (llamado Southern Blot) y luego su visualización con autoradiografía. El análisis de los sitios de restricción es actualmente más útil para estudios de variación en el genoma cloroplásmico y en los espaciadores del ARN ribosomal, además para aumentar la variación en los fragmentos amplificados por reacción en cadena de la polimerasa. El proceso del análisis requiere de mucho tiempo y esfuerzo pero es el que se aplica en el mapeo del genoma nuclear para el análisis de los polimorfismos del individuo y sus dos padres. La secuenciación de genes, partes de genes o regiones no codificantes, son las que se han vuelto cada vez más comunes y ampliamente utilizadas en sistemática. La dificultad principal de la secuenciación es tener la cantidad adecuada de ADN. Antiguamente, se realizaba por medio de la clonación de los genes a bacterias y permitiendo que estas se

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replicaran. Era un método lento pero permitía la utilización de metodologías más eficientes (Judd et al., 1999). La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, siglas en inglés) sustituyó el procedimiento de clonación de genes. El PCR requiere algún conocimiento de la secuencia que se va a estudiar. Pequeñas piezas de ADN de hebra sencilla (llamados “primers” o cebadores) son producidas para encajar en las secuencias de ADN que interesan. Dichos cebadores son colocados en un recipiente junto con el ADN a estudiar, nucleótidos libres y una enzima ADN polimerasa. Esta mezcla es expuesta a diversos cambios de temperatura. Al calentar la muestra, la hebra doble se desnaturaliza y se vuelve una hebra sencilla. Al enfriarse, los cebadores se unen al final y al principio de su hebra complementaria de la región de interés de la hebra de ADN. Luego, la temperatura es aumentada al punto en donde la polimerasa se activa para unir al cebador con los nucleótidos libres; formando una hebra complementaria a la que se usó como molde o patrón. Se continúa con una elevación de temperatura para que se vuelva a desnaturalizar el ADN y se repite el ciclo (Judd et al., 1999). El surgimiento de la biología molecular aplicada a resolver preguntas sistemáticas y evolutivas ha permitido el establecimiento de la sistemática molecular como un campo interdisciplinario muy sólido en la actualidad. La secuenciación de ADN se ha convertido en una de las técnicas más populares utilizadas en la sistemática molecular. Un número considerable de secuencias ha sido utilizado, entre las secuencias más destacadas están las regiones codificadas y no codificadas del genoma tanto nuclear, mitocondrial y cloroplásmico. Entre los genes más utilizados son el gen cloroplásmico rbcL y el gen nuclear que codifica para regiones codificantes y no codificantes del ADN ribosomal que es nuclear, por ejemplo, el gen ITS (Liang, 1997). El gen matK, conocido también como orfK o como parte de la región trnK, ha surgido como uno de potencial uso a la sistemática y evolución molecular en plantas. El gen consta de aproximadamente 1,500 pares de bases (pb) y está localizado adentro del intrón del gen cloroplásmico trnK, que se encuentra adyacente a la repetición invertida de la copia larga del ADN cloroplásmico (ver Figs. 2 y 3). La función de este gen está relacionada con el proceso extracelular de preparación de intrones, antes de ser decodificados como proteínas. En un estudio de homología se puede observar que los 102 últimos aminoácidos están relacionados con los polipéptidos análogos a las madurasas. También hay indicios que pueden estar relacionados con las madurasas y con el procesamiento de intrones del tipo II (Liang, 1997). El gen matK es desde un punto de vista filogenético, una de las regiones más evolucionadas del genoma cloroplásmico. Según Hilu y Liang (1997) el gen matK presenta las siguientes propiedades para estudios filogenéticos: -Tamaño razonablemente grande (1,500) pares de bases -Alta tasa de sustitución

-Alta proporción de variación en la primera y segunda posición en los codones -Tasas de transición y transversión bajas

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-Presencia de sectores conservados potencialmente mutables. -Presencia de una región 3´ más conservada que la región 5´ le permite versatilidad para trabajar distintos niveles taxonómicos.

El gen cloroplásmico ndhF ha sido utilizado tanto para el estudio de individuos vegetales de una especie, así como, para los miembros de un género. Terry et al. (1997) se refieren a él como un locus que codifica para un péptido clororespiratorio. Este gen es miembro de los que sintetizan la NADH deshidrogenasa (también llamada subunidad F del gen ndh), los cuales tiene una taza de variación muy baja a nivel de todas las angiospermas (Olmstead y Palmer, 1994). Hay que hacer notar que los genes ndh pueden ser transcritos pero sus productos proteínicos no han sido del todo identificados. En la mayoría de los genomas, ndhF se encuentra localizado en la región pequeña de hebra simple del genoma cloroplásmico (Kim y Jansen, 1995). El uso de secuencias del gen ndhF ha provisto un mayor número de caracteres para analizar relaciones que las que provee el gen rbcL. Al comparar el gen ndhF contra el gen rbcL, se concluye que ndhF es más grande y evoluciona más rápido. El tamaño del gen ndhF en tabaco es de 2,133 pares de bases (por sus siglas en inglés, bp), el cuál es 1.5 veces más grande que el rbcL (Olmstead y Reeves, 1995). En el caso de arroz, se ha visto que es de 2,205 bp (Sugiura, 1989). Los análisis comparativos de ndhF demuestran que la velocidad de sustitución de nucleótidos es dos veces más grande que la que se da en rbcL (Olmstead y Reeves, 1995). En tabaco se ha obtenido el producto de transcripción de este gen y es cuatro veces más grande que el producto del gen rbcL (Kim y Jansen, 1995). El producto obtenido es una proteína de 740 aminoácidos, una subunidad de NADH deshidrogenasa. Esto permite aseverar que ndhF es mucho más informativo que rbcL para fines de reconstrucción filogenética (Catala, Sabater y Guera, 1997; Kim y Jansen, 1995). En estudios realizados con Asteracea, Kim y Jansen (1995) demostraron el potencial del gen ndhF para resolver filogenias dentro y entre familias que han experimentado una radiación reciente y rápida. La variación del gen ndhF solamente es superada por la del gen matK en todos los genes codificantes en el ADNcp mayores de 1000 bp (Olmstead y Palmer, 1994). El gen ndhF ha sido utilizado mucho a nivel interfamiliar (Olmstead y Reeves, 1995). Un gran número de caracteres variables ha hecho que el gen ndhF tenga las secuencias ideales para grupos taxonómicos que no han sido resueltos adecuadamente cuando se usaran datos de rbcL (Smith y Atkinson, 1998). Se ha analizado el gen cloroplásmico ndhF (ver localización en Figs. 2 y 3) para las orquídeas amarillas del género Lycaste (Sección Deciduosae, Subsección Xanthanthae) y se encontraron dos fragmentos diferentes entre las especies que componen este grupo. El fragmento (haplotipo) en L. cochleata tiene entre 200 a 300 pares de bases (pb) más, que el fragmento encontrado en L. cruenta, que mide aproximadamente 1,500 pb (Maldonado, 2001). Por esta razón se cree que este gen puede ser útil para determinar diferencias entre grupos del género Lycaste más alejados evolutivamente.

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Figura 3. Diagramas de la localización de los cebadores en las regiones amplificadas. (Tomados de Neyland y Urbasch, 1995; Johnson y Soltis, 1995; modificado de Bodo Slotta, 2000; y Saar Polans, 2000): A. Gen de la subunidad F de la NADH deshidrogenasa; B. Gen de la subunidad K de las madurasas C. Espaciador Interno Transcrito de unidad del ADN ribosomal en el núcleo. A. Localización aproximada en el ADN cloroplásmico de los cebadores usados para la caracterización del gen ndhF, según Neyland y Urbatsch (1995).

B. Localización relativa del gen matK en el genoma cloroplásmico y la posición de los cebadores utilizados para amplificación y secuenciación de ADN en orquídeas. (Johnson y Soltis, 1995).

C. Diagrama de las las dos regiones (ITS-1 e ITS-2) del Espaciador Interno Transcrito de unidad del ADN ribosomal en el núcleo, en donde se encuentran 3 regiones codificantes (18S, 5.8S y 26S). Los números con flecha indican la localización aproximada de los 4 cebadores utilizados para su amplificación, no dibujado a escala (modificación de Bodo Slotta, 2000; Saar y Polans 2000).

5’ 3’

ndhF ORF 350 1201 +607

400pb

matK1520 matK56F

Rps16 5’ trnK matK 3’ trnK psbA

5’ 3’

100pb

18S ITS-1

5.8S

26S ITS-2

5’ 3’ ITS5a ITS3

ITS2 ITS4

Región ITS

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La región ITS (ver Fig. 3)consiste en dos espaciadores transcritos internamente del ADN ribosomal, ITS1 e ITS2 y el gen intermedio 5.8S de los ribosomas nucleares. La región 5.8S es pequeña y conservada por lo que no nos provee de muchas características útiles para el análisis filogenético, aún entre los taxa de división y clases. Pero las regiones ITS1 e ITS2 son usadas comúnmente para las comparaciones al nivel de especies. Un nivel al cual ha provisto de suficientes caracteres para el análisis genético (Stanford et al., 2000). Este gen fue seleccionado para poder comparar las características morfológicas con los caracteres genéticos. En orquídeas se han realizado varios estudios que incluyen a los genes ndhF (Maldonado, 2001; Neyland y Urtsbatch, 1995 y 1996), matK (Ryan et al., 2000; Whitten, Williams y Chase, 2000) e ITS (Ryan et al., 2000; Salazar, 2001; Sosa et al. 2001; Soto Arenas, 2001; Szalanski et al., 2001; Whitten, Williams y Chase, 2000). Para dilucidar las relaciones genéticas del género Lycaste en Guatemala se han encontrado problemas ya que los estudios que han sido realizados no son concluyentes, o no incluyen todas las especies presentes en la naturaleza (Maldonado, 2001; Neyland y Urtsbatch, 1995 y 1996; Ryan et al., 2000). C. Cultivo in vitro: El pionero en cultivo in vitro de orquídeas fue Bernard en 1909. Él trabajó con el aislamiento de hongos que benefician en la simbiosis raíz-hongo para la germinación de semillas de orquídeas. Él demostró que aumentaba el porcentaje de germinación al cultivar semillas esterilizadas e inoculadas con hongos. Knudson en 1922, 1924 y 1925 aclaró muchas dudas relacionadas con la organogénesis de las semillas. Demostró que los hongos eran los responsables del rompimiento del almidón en azúcares simples, los cuales favorecían la germinación de las semillas de orquídeas. Knudson logró la germinación de las semillas sin la asociación con hongos. En 1949, Vacin & Went desarrollaron un medio ampliamente usado para la germinación de semillas de híbridos. Este ha sido utilizado en el Jardín Botánico de Singapur en las últimas cuatro décadas. A la fecha se conocen por lo menos 25 medios de cultivo, incluyendo Murashige & Skoog, para la germinación de orquídeas (Macz, 1995). El medio Hill de cultivo de orquídeas fue desarrollado hace treinta años por el químico Daniel Hill. Nunca se conocieron los componentes exactos del medio y cuando él murió su receta fue vendida a la única compañía que la produce en la actualidad, Gallup y Stribling. Se cree que esta compañía la ha mejorado para el cultivo exclusivo de orquídeas. Dicho medio, vendido en forma de polvo deshidratado, es destinado para el cultivo in vitro de semillas y otro para promover el enraizamiento y desarrollo de plántulas (Gallup & Stribling, 2003). En 1960, el cultivo de meristemos fue iniciado por el Dr. G. Morel en INRA, Versalles, Francia. Además de ofrecer la ventaja de clones libres de virus, posibilitó una forma importante de multiplicación de plantas y semillas de alto valor comercial en un tiempo

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relativamente corto (Macz, 1995). Técnicas recientes utilizando los tallos florales se realizaron por Intuwong y colaboradores en 1972 en géneros Ascofinetia, Neostylis y Vascostylis. En 1973-74 Intuwong y Sagawa emplearon los géneros Dendrobium, Phalaenopsis y Vanda. Los mismos investigadores continuaron ensayando con la propagación utilizando las yemas axilares dormidas presentes en la base de los tallos florales. Dicha técnica fue aplicada en Costa Rica por Ospina, Intuwong y Sagawa en orquídeas pero no se han logrado resultados consistentes (Macz, 1995). En Guatemala la técnica se ha aplicado para evaluar el comportamiento de especies nativas de importancia económica en los géneros Cattleya sp. y Lycaste sp. Pero no se tienen resultados concretos (Macz, 1995). González (1999) realizó un estudio para desarrollar una metodología in vitro de propagación de Lycaste skinneri var. alba. Evaluó 48 tratamientos consistentes en todas las combinaciones posibles de dos medios de cultivo Murashige y Skoog (desarrollado en 1962) y el medio de Morel (desarrollado en 1965), tres reguladores de crecimiento (Bencilaminopurina, 2,4-Diclorofenoxiacético y cinetina). El tratamiento que dio el mayor número de brotes (4.2 promedio por protocormo), con una adecuada altura de planta (20 mm) a los 50 días de la siembra, fue el medio de Murashigue y Skoog suplementado con 0.1 mg/l de cinetina. El cultivo de tejidos es un método de propagación de tejidos vegetales bajo condiciones controladas. Involucra tres fases: en la primera se aísla el material vegetal de su ambiente original, conocido como explante; en la segunda fase se aplican técnicas asépticas para obtener material libre de contaminantes bacterianos, fúngicos (micóticos), virales y por algas microscópicas; y tercero, el cultivo y mantenimiento de este material in vitro en ambientes químicamente y físicamente controlados. Dependiendo de los fines de la investigación, una posible cuarta fase podría consistir en recuperar plantas enteras para sembrar en recipientes como macetas (Hall, 2000). Para lograr resultados óptimos se deben tomar las siguientes precauciones, sugeridas por Hall (2000):

− Usar material de plantas jóvenes y vigorosas, evitar las que sean muy viejas o enfermas. El uso de semillas puede garantizar que las plantas estén libres de contaminantes;

− Todo equipo utilizado debe mantener condiciones estériles porque los medios, ricos en nutrientes, y los cultivos de crecimiento lento, permiten condiciones favorables a la contaminación por organismos del ambiente. Es necesario utilizar campanas de flujo laminar con o sin irradiación con luz UV y /o mecheros encendidos. En un mismo laboratorio no se deben mezclar estudios con diferentes organismos. Todo instrumento u objeto debe estar esterilizado y desinfectado en el caso del material de siembra. Para la esterilización del equipo como cristalería y medios de cultivo, se debe tener una autoclave;

− Es necesario balanzas adecuadas para pesar en mg y en Kg para la preparación de medios de cultivo así como, aparatos para agitar soluciones y medios simultáneamente;

− Para ajustar el pH de los medios o soluciones es necesario un pHímetro con soluciones preparadas de HCl y KOH (0.01, 0.1, 1.0 y 10 M);

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− Es importante usar cristalería de vidrio o plástico desechable para cultivo, como tubos, Erlenmeyer, frascos, cajas de Petri (9 cm, 6cm, y 3 cm), etc.;

− Se necesita equipo para filtrar, jeringas, recipientes plásticos para congelar medios y soluciones stock por periodos prolongados;

− Las membranas aislantes son necesarias para evitar la entrada de contaminantes y estas pueden ser papel aluminio, papel Parafilm y Saranwrap;

− Para la preparación de medios es necesaria la cristalería para medir volúmenes, probetas, instrumentos de disección, estufas, agitadores magnéticos, gas, agua, electricidad, estereoscopios y microscopios;

− Se necesitan áreas de lavado de cristalería para poder remover toda impureza que quede impregnada de usos anteriores. Residuos de jabón, medios viejos u hormonas pueden contaminar o afectar los cultivos nuevos, si estos no son removidos adecuadamente al lavar la cristalería. Se recomienda lavar con ácido clorhídrico al 2% con regularidad, para eliminar residuos adheridos al vidrio. (Hall, 2000)

Los medios de cultivo proveen todos los nutrientes necesarios para el desarrollo del material vegetal que se va a estudiar. Hall (2000) y Macz (1995) describen los componentes principales:

A. Nutrientes inorgánicos:

1. Macronutrientes: Ca, K, Mg, N, P, y S incluidos en forma aniónica y/o catiónica en concentraciones milimolares (mM). Son esenciales para el crecimiento sostenido in vitro.

2. Micronutrientes: B, Co, Cu, Fe, I, Mo, Mn, y Zn incluidos en concentraciones

micromolares (µM). Algunos como Al y Ni se necesitan en cantidades tan minúsculas que pueden ser suficientes los contaminantes ya presentes en el agar, por ejemplo. Los micronutrientes permiten el funcionamiento metabólico adecuado.

B. Nutrientes orgánicos 1. Vitaminas: generalmente, tiamina(vitamina B1), piridoxina (vitamina B6), ácido

nictotínico (vitamina B3) y mioinositol se incluyen. Tiamina se considera como esencial, otras vitaminas tienen propiedades de mejorar el crecimiento porque participan en reacciones catalíticas en el metabolismo vegetal.

2. Amino Ácidos: algunos medios lo contienen. No son esenciales para plantas

porque la planta los produce. Tienen propiedades de mejorar el crecimiento, como por ejemplo glicina en el medio Murashige y Skoog.

3. Fuente de Carbono: se usa la sucrosa (o sacarosa) normalmente, y ocasionalmente

glucosa o maltosa dependiendo de lo que se va a cultivar.

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4. Fitohormonas: las más utilizadas son las auxinas y citocininas. Para aplicaciones especificas se pueden usar ácido abscísico o ácido giberílico. Las auxinas inducen la elongación celular en material vegetal y pueden estimular la formación de raíces. Existen formas naturales como ácido indol-3 acético, IAA(siglas en inglés) y sintético (Ej. Ácido indol–3 butírico, IBA; ácido naftalenacético, NAA.; ácido 2,4 diclorofenoxiacético, 2,4 –D; ácido p-clorofenacético, pCPA). Todos se utilizan pero el IAA se inactiva rápidamente con la exposición a la luz. Las citocininas son importantes en la división celular. Están involucradas con ARN de transferencia y la síntesis de proteínas. Las sintéticas se utilizan ampliamente, como: benziladenina, BA o 6-benzilaminopurina, BAP; cinetina, K (por su nombre en inglés); e 2-isopentiladenina, 2iP. Alterando el balance hormonal de la planta en el medio de cultivo, especialmente el balance auxina / citocinina, es una de las herramientas más poderosas disponibles para el investigador en determinar la respuesta del material vegetal en el cultivo in vitro.

5. Otros: Se han utilizado otros componentes como suplementos en el cultivo de

tejidos, entre estos se encuentran: hidrolizados de proteínas, extractos de frutas, extractos de levaduras, extractos de papas. El que más se usa es el agua de coco y ya esta disponible comercialmente.

C. Agentes gelificantes: La concentración y el tipo de agente utilizado para los

medios influyen en la respuesta del tejido de cultivo. Existen extractos de algas como agar, agarosa y alginato y recientemente los substitutos como Gelrite y Phytagel obtenidos de la fermentación microbiana. Los agares y agarosas producen geles estables por periodos prolongados y no se enlazan con los componentes excesivamente. Gelrite y Phytagel producen un gel rígido a menores concentraciones que el agar y la agarosa. Estos son mas transparentes y facilitan la detección de contaminantes en etapas tempranas. En cultivos prolongados tienden a licuarse por la disminución de sales o el pH.

Finalmente, para incubar los tejidos que se desean estudiar, es necesario un área cerrada que provea de forma controlada la cantidad de luz(horas de luz), temperatura estable, humedad relativa y circulación de aire adecuada para los tejidos vegetales que se van a evaluar. Un sistema de alarma las 24 horas es indispensable para detectar cambios o cortes del flujo eléctrico para alertar a los técnicos y evitar cambios bruscos que puedan afectar los cultivos. También se debe cuidar de que se realicen investigaciones relacionadas en el mismo lugar para que no sean necesarias muchas variaciones en las condiciones del cuarto de incubación (Hall, 2000).

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III. OBJETIVOS A. General Evaluar la diversidad genética de Lycaste skinneri encontrada en colecciones ex situ. B. Específicos -Realizar estudios de morfometría en flores de las diversas variedades de L. skinneri. -Determinar los posibles haplotipos de L. skinneri basados en la secuencia de los genes matK y ndhF del ADN de cloroplastos e ITS de los ribosomas nucleares para confirmar los resultados obtenidos de la morfometría y compararlos con otras especies que conviven con ellas en forma simpátrica. -Reproducir in vitro clones de las variedades encontradas utilizando diferentes partes de las plantas y de nuevas plantas provenientes de semillas en diferentes medios para iniciar el establecimiento de un banco de germoplasma de esta especie en la Universidad del Valle de Guatemala.

IV. HIPÓTESIS

Existe diversidad genética entre las plantas de la especie Lycaste skinneri que están siendo cultivadas ex situ en Guatemala.

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V. METODOLOGÍA A. Fuente de muestreo

Se usaron flores y material foliar de plantas cultivadas de Lycaste skinneri de los

siguientes departamentos: Alta y Baja Verapaz, Chiquimula y Jalapa. Durante viajes de campo, realizados durante fines de semana, se visitaron los departamentos de Izabal, Suchitepéquez, Sololá y Quetzaltenango.

B. Análisis Morfométrico Se usaron 110 flores de L. skinneri para este análisis. Estas incluyen flores de

plantas en cultivo y las almacenadas en líquido (75% Etanol, 20% agua destilada y 5% glicerina o FAAG) depositadas en el Herbario UVAL, desde 1975 hasta noviembre de 2002. Se midieron 33 características continuas (ver cuadro 2 y Fig. 2), con un vernier, todas con la ayuda de un estereo microscopio.

Se ingresaron los datos en una matriz rectangular en Excel 97, el cual es

compatible con el resto de programas. La interpretación de todos los datos se basa en análisis multivariado (Gauch, 1982; Johnson, 2000; Jongman, Ter Braak y VanTongeren, 1995; McGarigal, Cushman y Stafford, 2000; Molina Cano 1977; Rojas, Barriga y Figueroa, 2000). Con SYSTAT 8.0 (SPSS, 1998) se realizó el análisis de componentes principales para señalar diferencias morfológicas de las diferentes variedades de L. skinneri. Se reportaron las medias y respectivas desviaciones estándar de cada carácter medido.

Cuadro 2. Datos continuos medidos (en mm) y proporciones basadas en estas mediciones de partes florales de Lycaste skinneri. Ver lugar y forma de las mediciones en la figura 4. Caracteres Caracteres Mediciones Absolutas Largo y Ancho de:

Base de la flor Labio Columna Callo del Labio Lóbulos laterales del Labio Lóbulo medio del Labio Sépalos laterales Sépalo dorsal Pétalo

Largo de: Ovario Bráctea floral Primer segmento del Escapo a partir del Ovario

Ancho del istmo del lóbulo medio del Labio

Proporciones entre datos continuos Ancho con respecto a largo de:

Base de la flor Labio Columna Callo del Labio Lóbulos laterales del Labio Lóbulo medio del Labio Sépalos laterales Sépalo dorsal Pétalo

Largo del ovario en proporción al largo de la bráctea floral

Ancho del callo con respecto al ancho del istmo del lóbulo medio del Labio

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Figura 4. Partes florales, mostradas en Lycaste skinneri var. rosea (en cultivo). A. Partes separadas y aplanadas de toda la flor. B. Detalle del Labio, C. Vista lateral de la columna, D. Vista frontal de la columna. Las líneas muestran la posición en la que se midieron las características morfológicas; las sólidas muestran los anchos y las punteadas los largos medidos.

A.

Sépalo Dorsal

Pétalo

Sépalo Lateral

Labio

Lóbulos Laterales

Callo

Bráctea Floral

Columna

Ovario

B.

C. D.

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C. Análisis genético 1. Extracción de ADN (modificación basada en Doyle y Doyle 1990)

Se realizaron 700 extracciones de ADN total de orquídeas del género Lycaste, dentro de estas extracciones se utilizó material de hojas de 45 plantas de L. skinneri. Se procesaron de la siguiente forma: a. Tomar muestra de 0.05 a 0.1 gramos de material foliar fresco o de 0.004 a 0.005

gramos de material foliar seco. b. Agregar 600 microlitros (µl) de CTAB y 3 µl de mercaptoetanol. c. Macerar el material foliar con un pistilo plástico desechable hasta que quede todo el

material resuspendido. d. Agitar en vortex por dos segundos. e. Colocar en el horno a 65° C con agitación constante durante 50 minutos si es un

material fresco y 60 minutos si es material seco. Sí el material es muy antiguo, agregar una hora más.

f. Agregar 500μl de cloroformo y agite suavemente veinte veces por inversión. g. Centrifugar entre 6,000 a 8,000 revoluciones por minuto(rpm), por 5 minutos. h. Remover la fase acuosa, descartando la interfase y la fase orgánica, y colocar en

nuevo tubo de 1.5ml. i. Agregar 7/10 volúmenes de isopropanol y agite hasta ver precipitarse las hebras de

ADN (alrededor de 350 µl fueron utilizados). j. Centrifugar de 8-10 minutos a 12,000 rpm. k. Decantar el isopropanol. l. Lavar el ADN con 100 µl de etanol al 70%. m. Secar con microcentrífuga o dejar secar al aire. n. Resuspender con buffer de Trisma-Base-HCl-EDTA (TE), aproximadamente de 30 a

50 µl. 2. Cuantificación de ADN total por fluorimetría (utilizando protocolos del fabricante, Amersham Bioscience, 1998)

a. Se preparan las siguientes soluciones:

-Solución amortiguadora de Tris- HCl, sal (NaCl) y EDTA disódico (TNE) 10x. -Control positivo de ADN de timo de ternera -Solución Madre de bis-benzimida

b. Se prepara 100 ml de la solución de tinción de bajo rango de ADN para

soluciones de concentración entre 10 y 500 nanogramos (ng) de concentración final. La composición de la solución es la siguiente:

− Solución Madre de bis-benzimida 10 μl − Solución TNE 10 x 10 ml − Agua desmineralizada 90 ml

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c. Calibración del fluorímetro con estándar de ADN de timo de ternera.

i. Encender el fluorímetro 15 minutos antes de realizar las lecturas de las muestras.

ii. Tener preparadas las siguientes soluciones: − Solución de tinción de bajo rango. − Una dilución 1:10 (100 µg/ml) de 1 mg/ml de la solución de timo de ternera.

iii. Cuando esté colocado, remover la celda de la cámara de muestreo, notando su orientación. Agregar 2 ml de solución de tinción. Si es necesario, limpie los lados de la celda con un paño y colocar la celda de regreso a la cámara en su orientación original.

iv. Calibrar a cero (0) de transmitancia: cerrar la tapa y presionar el botón del cero, hasta que en la pantalla de lectura aparezca el cero (000). Una fluctuación aceptable es de +/- 003 unidades.

v. Colocar 2 µl de la dilución de ADN en dos ml de la solución en la celda con una exactitud de la micropipeta a 0.02 µl. Mezclar el tinte con el estándar de ADN por medio de pipeteo dentro de la celda.

vi. Cerrar la tapa del aparato y apretar el botón de SCALE para que se lea en pantalla “100”. Este movimiento ajusta el instrumento a que lea la concentración de ADN directamente.

vii. Repetir los pasos “d” a “g” al menos una vez para verificar que los resultados son reproducibles.

viii. Desechar el contenido de las celdas invirtiéndolas sobre una toalla de papel. d. Lectura de la concentración de muestras desconocidas i. Repetir los pasos “a” a la “h” de la calibración de una solución de celda y reemplace. ii. Tener a mano las soluciones para poder calibrar a cero y una concentración estándar. iii. Colocar 2 μl de la muestra y mezclar con 2 ml de la solución de tinción. iv. Colocar dentro de la cámara de lectura del equipo y apuntar la lectura. v. Limpiar las celdas vi. Trabajar en triplicado y promediar los resultados 3. Amplificación de ADN por medio de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, González et al., 1995) a. Sacar del refrigerador las muestras de ADN que se encuentran suspendidas en Buffer

TE.

LAS MUESTRAS NO DEBEN DE ESTAR CONGELÁNDOSE Y DESCONGELÁNDOSE FRECUENTEMENTE PORQUE SE ROMPEN LAS CADENAS LARGAS DE ADN Y DA LUGAR A PRODUCTOS INESPECÍFICOS DE PCR.

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b. En un tubo de 0.5ml colocar 3 μl de muestra a analizar. Trabajar una muestra por tubo.

LOS SIGUENTES PASOS TRABAJARLOS EN LA CAMPANA CON LUZ FLUORESCENTE, NO USAR LA LUZ UV CUANDO SE TIENEN LAS MUESTRAS DENTRO.

c. Preparar la siguiente mezcla madre (también llamada, master mix o MM) un tubo

Eppendorf de 1.5 ml con los reactivos especiales para PCR.

Reactivo Cantidad Buffer 3.0 μl l * Y Solución de MgCl2 3.0 μl * Y D NTP 1.0 μl * Y Agua desmineralizada 17.7 μl * Y Cebador 5´ (Delantero, F) 1.0 μl * Y Cebador 3´ (Reverso, R) 1.0 μl * Y Taq Polimerasa 0.3 μl * Y

Nota: Y es un factor de multiplicación que depende de la cantidad de muestras que se vayan a trabajar. Por ejemplo, si se van a analizar 20 muestras, la cantidad de reactivos a agregar en la mezcla madre se multiplica por 23, las extras son para control positivo, control negativo, y una extra para contrarrestar el error por pipeteo. Para evitar contaminaciones, procure agregar de último y rápidamente de Taq polimerasa. Los cebadores usados para analizar la estructura genética de las diferentes variedades de Lycaste skinneri, con las mismas metodologías anteriores son: ADN de Cloroplastos:

Región de copia única larga (Large Single Copy) MATK56 F ACT TCC TCT ATC CGC TAC TCC TT 23 BASES MATK 749 F TTG AGC GAA CAC ATT TTT CTA TGG AA 26 BASES MATK 832 R ACA TAA TGT ATG AAA GTA TMT TTG A 25 BASES MATK1520 R CGG ATA ATG TCC AAA TAC CAA ATA 24 BASES matK tiene un producto de ~1,500pb

Región de copia única corta (Small Single Copy) NDHF1201 F AGG TAC ACT TTC TCT TTG CGG TAT TCC 27 BASES NDHF 10 F ATA CTA TGT TAT TTC CTC TC 20 BASES NDHF 10.7 R GAA AAA AGG TTG TCG ATG GAG 21 BASES NDHF607 R ACC AAG TTC AAT GTT AGC GAG ATT AGT C 28 BASES ndhF tiene un producto entre ~1,500 a 1,700pb ADN de Ribosomas Nucleares: ITS 5a F ACG AAT TCA TGG TCC GGT GAA GTG TTC G 28 BASES ITS 2 R GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC 20 BASES ITS 3 F GCA TCG ATG AAG GCA GC 17 BASES ITS 4 R TAG ATT TCC CCG GTT CGC TCG CCG TTA C 28 BASES ITS tiene un producto de ambas regiones de ~ 950pb

d. Luego de mezclada la solución madre, colocar en cada uno de los tubos 27 μl de la

misma.

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e. Colocar los tubos ya preparados para ser amplificados en el termociclador. f. Iniciar el proceso de amplificación utilizando el siguiente programa:

Paso Temperatura (° C) Tiempo (min.) 1 94 10 2 94 0.75 3 54 1 4 72 2 5 Repetir pasos del 2-4 por 30 veces 6 72 10 7 4 Hasta terminar

g. Luego de terminar el proceso, se sacan los tubos y se colocan en el congelador a

–20° C o se analizan en gel de agarosa directamente. 4. Técnica de “Touchdown” para amplificación de ADN por medio de reacción en

cadena de la polimerasa (Court, 2001). a. Prepare los tubos igual que en los pasos 1 al 5 de la metodología anterior b. Coloque en un termociclador para realizar de 35 a 40 ciclos de PCR touchdown como

sigue:

Paso Temperatura (° C) Tiempo (min.) 1 94 4 2 94 0.5 3 65 0.5 4 72 1 5 Repetir los pasos del 2-4 por 20 veces,

bajando la temperatura de alineamiento de 65º C a 45º C en 1º por ciclo

6 94 0.5 7 45 0.5 8 72 1 9 Repetir pasos del 6-8 de 15 a 20 veces 10 72 10 4 Hasta terminar

c. Luego de terminar el proceso, se sacan los tubos y se colocan en el congelador a

–20° C o se analizan en gel de agarosa directamente.

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5. Electroforesis de agarosa (según protocolos del fabricante de la cámara Amersham Pharmacia Biotech 1997 y González et al., 1995)

a. Preparar las siguientes soluciones antes de comenzar la electroforesis (ver proporciones en el ANEXO A):

Solución madre de Ácido Etilendiamino Tetracético Disódico (EDTA), al 0.5 M Solución madre de Trisma-Base-HCl, Ácido Bórico y EDTA (TBE) 10X

b. Preparación de la agarosa i. En un Erlenmeyer se colocan 90 ml de agua y la cantidad de agarosa que se necesita

para hacer el gel. Se utilizaron las siguientes concentraciones

DE LA CONCENTRACIÓN DE AGAROSA DEPENDERÁ LA RESOLUCIÓN DE LOS SEGMENTOS SEPARADOS. A MAYOR CANTIDAD DE AGAROSA, MAYOR RESOLUCIÓN, PERO EL PROCESO ES MÁS LENTO.

ii. Disolver la agarosa en el Erlenmeyer y llevar a ebullición con agitación magnética, hasta que la solución quede cristalina.

iii. Quitar de la estufa y esperar a que la solución esté tibia y sin que empiece a

gelatinizar en el beaker. iv. Colocar la plataforma de cámara de electroforesis en el molde para hacer gel de

agarosa, nivelar y colocar el peine plástico que es el molde de los pocitos donde van las muestras.

v. Agregar de una forma uniforme y rápidamente la solución de agarosa en la

plataforma, a manera que quede homogénea y sin burbujas. vi. Esperar a que enfríe y remover los peines de la plataforma. vii. Llenar la cámara con buffer TBE en disolución 1X a manera que cubra el gel cuando

esté colocado. viii. Sacar la plataforma con gel del molde y colocarla en la cámara.

Concentración de Agarosa (% p/v)

Peso de Agarosa (g)

0.5 0.45 1.0 0.90 1.5 1.35 2.0 1.80

23

ix. Se utilizaron dos tipos de peines para hacer los pocitos del gel de agarosa, dependiendo de la cantidad de muestras amplificadas. El llenado con muestras de los pocitos del gel depende de los peines que se hayan utilizado. En los peines de 15 dientes, los pocitos tienen una capacidad de 10.6μl. En los peines de 20 dientes, los pocitos tienen una capacidad de 7.10μl.

x. En un pocito colocar 3μl de marcador de peso molecular conocido, por cada frente

que vaya a trabajar. xi. En el siguiente pocito colocar 5μl de agua desionizada y 2μl de buffer de cargado. xii. Llenar los siguientes pocitos con las muestras amplificadas en PCR: Sí se va a

trabajar en pozos de 10.6μl de muestra cargue cada pozo con 8μl de muestra y 2μl de solución amortiguadora de cargado (loading buffer). Una muestra por pocito. Sí se va trabajar en pozos de 7.10μl de muestra, cargue cada pozo con 6μl de muestra y 1μl de buffer de cargado. Una muestra por pocito. SIEMPRE SE AGREGA 1/5 DE SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE CARGADO CON RESPECTO A LA CANTIDAD DE MUESTRA A TRABAJAR.

c. En cada frente de corrida se coloca un marcador de peso molecular, un control positivo, control negativo y el resto de muestras que se van a analizar.

d. Luego de haber llenado los pocitos, cerrar la cámara con su tapadera. e. Colocar los electrodos en sus respectivos lugares. f. Conectar y encender la fuente de poder. g. Colocar el voltaje constante de la fuente a 90 voltios por un minuto, luego bájelo a

80volts por alrededor de dos horas y media. h. Al finalizar se apaga la fuente y se remueve la tapadera. i. Se saca el gel y se pasa de inmediato al proceso de tinción y visualización. 6. Visualización de ADN en gel de Agarosa (González et al., 1995)

a. Se coloca el gel en una solución de 0.5 μg/ml de bromuro de etidio para su tinción. b. Se agita por 20 minutos c. Se lava en un recipiente con agua del chorro para remover el exceso de bromuro de

etidio por 10 min. d. Se visualiza con un transiluminador UV y se fotografía para documentar el resultado.

D. Cultivo de Tejidos in vitro 1. Selección de tejidos

a. Tejidos jóvenes de las plantas de orquídeas se cortaron con hojas de afeitar de un solo

filo, estériles y se trasladaron al laboratorio de cultivo de tejidos en cajas de Petri estériles: Se utilizaron las siguientes partes vegetales:

24

i. Hoja ii. Pseudobulbo joven iii. Raíz iv. Flor v. Semillas

b. Las muestras de meristemos colectados se cortaron en 3 pedazos más pequeños (repeticiones) con un bisturí limpio pasado en alcohol al 95% después de cada corte.

c. Las muestras de semillas fueron tomadas de cápsulas que se guardaron en frascos tapados.

2. Desinfección de muestras

Para las muestras de meristemos de hojas y raíces se utilizó el siguiente método: a. Lavar las muestras con agua de chorro abundante para remover polvo y material

vegetal seco. b. Colocar las muestras en beakers con Phisan al 10% por una hora con agitación. c. Seguidamente, trasvasar las muestras a otros beakers con cloro al 10%, agitar

suavemente por 10 minutos. Debido a contaminaciones posteriores, el tiempo de agitación se aumentó en 10 minutos.

d. Trasladar las muestras a una campana donde se colocan en un medio Murashige & Skoog (MSO) para remover completamente el cloro. Las muestras están preparadas para sembrar en medios de cultivo.

e. Se repitió la metodología con hojas y flores. En el caso de las semillas se desinfectó la cápsula antes de abrirla.

3. Siembra in vitro a. Tomar las muestras desinfectadas y partirlas en 3 partes iguales. b. Colocar los pedazos con todos en un mismo tubo de cultivo o caja Petri, según

corresponda. En uno de los siguientes medios de cultivos (ver composición en ANEXO B): MURASHIGE & SKOOG (MSO) Modificaciones de MSO − con Ácido naftalenacético − con Ácido naftalenacético (NAA, por sus siglas en inglés) y bencil amina

(BA) − con agua de coco

KNUDSON .HILL y Agua de Coco (para semillas)

Otros medios utilizados únicamente para hojas y flores fueron:

MEDIO VACIN & WENT MEDIO MSD 20 (pH 5.8)

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VI. RESULTADOS Y DISCUSION A. Fuente de muestreo

Solamente se trabajó con plantas en cultivo de miembros de la Asociaciones Guatemalteca y Verapacense de Orquideología y de los Drs. Dix. Para el análisis morfométrico encontramos 110 flores cuyas localidades originales estaban en Alta Verapaz, Baja Verapaz, Jalapa y Chiquimula. En las localidades visitadas de Izabal, Quetzaltenango, Sololá y Suchitepéquez no encontramos plantas de Lycaste skinneri, por lo que se cree que las poblaciones han sido diezmadas o están extintas, ver Fig. 5. Se necesita realizar viajes de campo a otros invernaderos y localidades donde se cultiva la Lycaste skinneri para completar la información obtenida con esta investigación. Las regiones de mayor importancia a visitar son Huehuetenango, Quiché, San Marcos, Totonicapán, Alta Verapaz, Zacapa, Chiquimula, Jalapa y Jutiapa (ver Fig. 3). Esta priorización se basa en la posible distribución de Lycaste skinneri en el país y los departamentos poco o no representados en el muestreo. B. Análisis Morfométrico

Las mediciones de las flores de Lycaste skinneri se resumen en el cuadro 3. En la

Fig. 6 se observan distintas formas de esta especie y la variación de su coloración. No se encontró diferencia significativa entre los tamaños de las variedades de las Verapaces y las de la forma Ipala. En el cuadro 3 observamos los valores críticos para la Kurtosis, que explica la forma de la distribución de datos en relación a la curva normal, se encuentra entre de ±0.93 (para n=110). Los caracteres que salieron de esta distribución fueron la proporción largo/ ancho del Labio, el largo del ovario y las proporciones largo/ ancho del pétalo y del sépalo dorsal y la proporción ancho del callo contra el ancho del istmo del lóbulo medio del Labio. Las distribuciones de estos caracteres fueron positivas por lo que se dice que sus curvas son supergaussianas. Esto significa que presentan muchos datos cercanos a su media y la distribución de frecuencias es poco variable.

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Figura 5. Localidades históricas de Lycaste skinneri comparadas con localidades de germoplasma disponible y no disponible para el año 2001-2002 en Guatemala.

Departamentos AV Alta Verapaz

BV Baja Verapaz

Cm Chimaltenango

Cq Chiquimula

Es Escuintla

EP El Progreso

Gu Guatemala

Hu Huehuetenango

Iz Izabal

Ja Jalapa

Ju Jutiapa

Pe Petén

Qz Quetzaltenango

Qc Quiché

Re Retalhuleu

Sa Sacatepéquez

SM San Marcos

SR Santa Rosa

So Sololá

Su Suchitepéquez

To Totonicapán

Za Zacapa

EPZa

Re

To SM Qc

Gu

SR Es

Ju

Sa

Hu Iz

AV

Su

BV

Pe

Cm Qz Ja

Cq So

Mar de las Antillas

14°

16°

92° 90°

18°

100 500

Belice

México

Honduras

El Salvador

Océano Pacífico

Clave

Distribución Histórica de Lycaste skinneri

Germoplasma disponible

Germoplasma no localizado

Re

SM Qc

SR Es

Ju

Iz

AV

Su

BV

Pe

Cm Qz Ja

Cq So

Km

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Figura 6. Variabilidad de Coloración y Forma del Labio de Lycaste skinneri de Guatemala. Fotografías tomadas en la Exposición Nacional de Orquídeas, 14 al 17 de febrero de 2002, por la AGO. Fotos por M. Maldonado, L. C. Castellanos.

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Cuadro 3. Estadígrafos que describen las partes florales de Lycaste skinneri (n=110). Parte Floral Máximo Mínimo Media ± Desviación

Estándar Varianza Kurtosis Coeficiente de Asimetría

Ancho Total de la apertura de la flor 130.0 30.0 81.4 ± 22.2 491.4 0.06 0.07 Largo de la Base 33.0 22.0 26.1 ± 2.9 8.5 -0.02 0.68 Largo 55.0 38.0 45.2 ± 4.4 19.0 0.12 0.65

Labio

Ancho 44.0 22.0 34.6 ± 5.4 29.5 0.07 -0.39 Largo 32.0 21.0 25.2 ± 2.5 6.2 0.57 0.62 Columna

Ancho 8.0 4.0 5.8 ± 1.1 1.2 -0.58 -0.32 Largo 14.0 7.0 10.5 ± 1.9 3.5 -0.31 -0.08 Callo del Labio

Ancho 10.0 3.0 6.2 ± 1.7 2.9 0.18 0.25 Largo 6.0 2.0 4.3 ± 1.1 1.2 -0.86 -0.16 Lóbulos

Laterales Ancho 16.0 8.0 12.5 ± 1.9 3.8 -0.39 -0.08 Istmo 15.0 7.0 10.1 ± 2.2 4.9 -0.89 0.13 Largo 27.0 15.0 20.6 ± 2.7 7.2 0.34 0.34

Lóbulo Medio

Ancho 26.0 10.0 18.2 ± 4.1 16.4 -0.45 -0.03 Largo 79.0 53.0 66.4 ± 7.3 53.8 -0.68 0.08 Sépalos

Laterales Ancho 46.0 23.0 34.7 ± 5.9 34.6 -0.53 -0.04 Largo 75.0 48.0 61.3 ± 7.2 52.1 -0.59 -0.08 Sépalo Dorsal

Ancho 47.0 24.0 34.2 ± 6.7 44.6 -0.82 0.32 Largo 55.0 37.0 46.6 ± 4.9 24.0 -0.72 -0.21 Pétalo

Ancho 38.0 16.0 29.2 ± 5.5 29.8 -0.22 -0.40 Ovario Largo 57.0 20.0 31.2 ± 8.1 66.2 2.15 1.24 Bráctea Floral Largo 70.0 26.0 46.0 ± 12.7 161.4 -0.71 0.36 Escapo1 Largo 102.0 34.0 68.7 ± 15.6 242.0 0.86 -0.31 Rel. L/A2 Base de la Flor 4.6 1.1 3.1 ± 0.8 0.6 0.38 -0.32 Rel. L/A Labio 2.0 1.1 1.3 ± 0.2 0.1 2.33 1.59 Rel. L/A Columna 6.3 3.1 4.5 ± 0.9 0.7 -0.24 0.72 Rel. L/A Callo del Labio 2.8 1.0 1.8 ± 0.4 0.2 0.00 0.26 Rel. L/A Lóbulos Lateral 0.6 0.2 0.4 ± 0.1 0.0 0.22 0.60 Rel. L/A Lóbulo Medio 1.8 0.8 1.2 ± 0.2 0.0 0.83 0.81 Rel. L/A Sépalos Lateral 2.7 1.5 2.0 ± 0.3 0.1 0.22 0.38 Rel. L/A Sépalo Dorsal 2.8 1.3 1.8 ± 0.3 0.1 1.45 0.77 Rel. L/A Pétalo 2.4 1.2 1.6 ± 0.2 0.1 1.67 0.84 Rel. L/L3 Ovario- Bráctea Floral 1.4 0.4 0.7 ± 0.2 0.1 -0.18 0.51 Rel. A/A4 Callo-Istmo 2.0 0.6 1.1 ± 0.3 0.1 1.30 1.36 Rel. A/A Lóbulo Medio – Istmo 3.4 1.0 1.9 ± 0.6 0.4 0.19 1.13 1 n=80 2 L/A Largo contra ancho 3 L/L Largo contra Largo 4 A/A Ancho contra Ancho Valor de Kurtosis fuera del intervalo dado por el valor crítico aceptado entre: ± 1.09 para n=80 ± 0.93 para n=110

Valor de Coeficiente de Asimetría fuera del intervalo dado por el valor crítico aceptado entre: ± 0.55 para n=80 ± 0.47 para n=110

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Estos caracteres también presentaron un coeficiente de asimetría mayor que el valor crítico (encontrado entre ±0.47, para n=110), lo que implica que la distribución de los datos se encuentra sesgada hacia la derecha. Otros caracteres con distribución sesgada hacia la derecha son la proporción entre el ancho del lóbulo medio y el ancho del istmo, las relaciones entre largo y ancho del lóbulo medio del Labio, la columna y los lóbulos laterales, la proporción entre largo del ovario y de la bráctea floral y los largos de la base del Labio, el Labio completo y la columna. Para poder continuar con el análisis multivariado se normalizaron los datos. La normalización consistió en restarle a cada dato la media para hacer los más cercanos a ella (cero) y a los más lejanos darles más peso. Esta metodología hace que cada uno de los valores sea más comparable (Zar, 1999). El análisis de componentes principales sirve para encontrar diferencias dentro de las características morfológicas que puedan servir para describir nuevos grupos en base a su tamaño. En el cuadro 4 muestra el análisis de componentes principales entre las diferentes partes de las flores de Lycaste skinneri. Estos ocho factores explican el 86.2% de la varianza total de estas características. En este cuadro el factor uno está conformado por los pétalos, el largo del callo y bráctea floral, y los anchos de los sépalos, lóbulos laterales y medio del Labio. Estas características se relacionan de manera inversamente proporcional a la proporción largo–ancho de la columna, por lo que mientras más grandes sean estas partes florales, menor es la diferencia entre el largo y ancho de la columna, lo que la hace ver más cuadrada.

El factor dos consiste en la relación largo y ancho del sépalo dorsal y el ancho de callo del Labio, relacionándose inversamente con el largo de los lóbulos laterales y la proporción largo y ancho del callo del Labio. El factor tres muestra que la proporción de los anchos del callo y del istmo del lóbulo medio del Labio es una característica importante y que el ancho del istmo del lóbulo medio del Labio es una de las más variables (9% de la varianza total).

El factor cuatro denota que mientras más largo sea el Labio, el largo del ovario y la bráctea floral menos se abre la flor. El factor 5 muestra una relación inversa entre la proporción entre el largo y el ancho del callo y el largo del ovario, por lo que se dice que el ovario será más corto mientras más rectangular se observe el callo. El factor 6, el largo del ovario, la proporción largo–ancho de la flor y el ancho del lóbulo medio del Labio son una fuente alta de variación.

El factor 7 muestra que la proporción entre el largo y el ancho del Labio es inversamente proporcional al largo de la columna. Finalmente, el factor 8 muestra que mientras más grande sea el largo de la columna, el ovario será más corto y menos puntiagudo se verá el lóbulo medio del Labio.

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Cuadro 4. Análisis de componentes principales de las características florales de Lycaste skinneri. Porcentaje total de la varianza explicado 86.2%.

Factores Encontrados Partes Florales 1 2 3 4 5 6 7 8 Ancho Total de la apertura de la flor 0.6 0.0 0.0 -0.6 0.1 0.2 0.3 0.2

Largo de la Base 0.5 0.2 0.3 0.4 0.2 -0.4 0.3 0.1 Largo 0.7 0.3 0.0 0.2 0.0 -0.1 0.2 0.2

Labio

Ancho 0.5 -0.3 -0.2 0.4 0.4 0.2 -0.3 -0.1 Largo 0.3 0.1 0.4 0.1 -0.1 0.0 -0.5 0.4 Columna Ancho 0.9 0.1 0.1 0.0 0.0 -0.3 -0.1 0.1 Largo 0.8 -0.2 0.1 0.2 0.2 -0.1 -0.1 0.1 Callo del Labio Ancho 0.5 0.6 -0.1 0.2 -0.5 -0.1 -0.2 0.1 Largo 0.1 -0.7 0.2 0.4 0.0 -0.1 0.3 0.2 Lóbulos Laterales Ancho 0.9 -0.1 0.2 0.0 0.1 -0.1 0.0 -0.1 Istmo 0.1 0.4 -0.7 0.4 0.2 0.0 0.2 0.1 Largo 0.6 0.1 0.5 0.0 -0.1 0.2 0.0 -0.2

Lóbulo Medio

Ancho 0.8 -0.2 0.0 0.1 0.2 0.4 0.0 0.2 Largo 0.7 0.3 0.4 0.1 0.3 0.2 0.2 -0.1 Sépalos Laterales Ancho 0.9 -0.2 -0.1 0.0 0.0 0.0 0.1 -0.1 Largo 0.7 0.4 0.2 0.1 0.3 0.2 0.1 0.0 Sépalo Dorsal Ancho 0.9 -0.3 -0.1 0.0 -0.1 -0.1 0.1 -0.1 Largo 0.8 0.4 0.3 0.1 0.0 -0.2 0.0 -0.2 Pétalo Ancho 0.9 0.0 -0.2 0.2 -0.1 0.0 0.0 -0.2

Ovario Largo 0.1 0.3 0.3 0.3 -0.5 0.4 0.3 -0.4 Bráctea Floral Largo 0.8 0.3 -0.2 -0.1 0.1 0.1 0.0 -0.2 Rel. L/A Base de la Flor 0.4 -0.1 -0.2 -0.7 0.0 0.4 0.2 0.2 Rel. L/A Labio -0.1 0.5 0.1 -0.3 -0.4 -0.4 0.4 0.3 Rel. L/A Columna -0.8 -0.1 0.1 0.1 -0.1 0.3 -0.1 0.1 Rel. L/A Callo del Labio -0.1 -0.6 0.2 -0.1 0.6 0.0 0.2 -0.1 Rel. L/A Lóbulos Lat. -0.5 -0.5 0.1 0.4 0.0 0.0 0.3 0.3 Rel. L/A Lóbulo Medio -0.6 0.3 0.3 -0.2 0.2 -0.4 0.0 -0.4 Rel. L/A Sépalos Lateral -0.6 0.5 0.4 0.0 0.3 0.2 0.0 0.1 Rel. L/A Sépalo Dorsal -0.4 0.6 0.2 0.1 0.4 0.3 -0.1 0.2 Rel. L/A Pétalo -0.7 0.1 0.5 -0.2 0.1 -0.2 0.0 0.1 Rel. L/L Ovario-Bráctea Floral -0.6 -0.1 0.4 0.4 -0.3 0.2 0.2 -0.1 Rel. A/A Callo-Istmo 0.5 -0.4 0.6 -0.2 -0.1 -0.2 -0.2 0.0 Rel. A/A Lóbulo Medio - Istmo 0.6 -0.4 0.5 -0.2 -0.3 0.2 -0.2 0.1 Varianza explicada por componente 12.9 3.9 3.0 2.4 2.1 1.6 1.4 1.2 % de la Varianza total explicada 39.2 11.9 9.0 7.1 6.4 4.8 4.2 3.6 % de la Varianza total explicada acumulado 51.1 60.1 67.2 73.6 78.4 82.6 86.2 Inversamente relacionadas Directamente relacionadas

1 n=80 2 L/A Largo contra ancho 3 L/L Largo contra Largo 4 A/A Ancho contra Ancho

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Figura 7. Cladograma que agrupa las localidades de las flores medidas de Lycaste skinneri en base a sus características morfométricas.

En la figura 7 encontramos agrupadas a las poblaciones cuyas flores son más

pequeñas y delgadas, y que los horticultores describieron como L. skinneri var. Ipala, e inferimos que a través del transiente altitudinal de la Sierra de las Minas las características morfológicas de las flores se van haciendo más grandes en su distribución hacia las Verapaces. Las plantas que son más grandes son las que provienen de Alta Verapaz. C. Análisis genético

1. Extracción de ADN

Se logró extraer ADN de 45 muestras diferentes de hojas de Lycaste skinneri, sección

Macrophyllae. En total se realizaron 700 extracciones (incluyen al menos dos repeticiones de cada individuo) de ADN de diferentes especies de orquídeas del género Lycaste que incluyen al menos dos especimenes de: L. dowiana, L. macrophylla var. desbosiana (sección Macrophyllae), L. lasioglossa, L. cruenta, L. cochleata y L. suaveolens (sección Deciduosae). Las extracciones de ADN de otras especies de Lycaste sirven para poder comparar los resultados obtenidos con los resultados de investigaciones anteriores (Maldonado, 2001; Ryan et al., 2000).

2. Cuantificación de ADN total por fluorimetría La lectura del ADN total sirve para estimar si se tiene la cantidad mínima de ADN para realizar la amplificación. La cantidad óptima se encuentra entre 3 y 100 ng de ADN total (Hoy, 1994). Se hicieron 398 lecturas de concentración de ADN total; ver en cuadro 5 el resumen de las lecturas obtenidas por fluorimetría. En general la cantidad de ADN total extraída es mayor de 100ng/ml. La cantidad de ADN total extraída es suficiente para poder realizar una amplificación exitosa de PCR.

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Se logró un aumento en la cantidad de ADN extraído con las variaciones en la metodología de extracción implementadas durante el proyecto. Estas variaciones incluyeron el aumento de la solución amortiguadora de extracción al inicio del proceso y la disminución de la solución amortiguadora de suspensión del ADN extraído al finalizar el mismo. En las concentraciones de ADN obtenidas de las modificaciones la Kurtosis indica que la distribución es normal. Mientras que el coeficiente de asimetría, indica que la media está tirada hacia la derecha, esto es que la mayoría de las muestras tienen concentraciones altas de ADN total. Cuadro 5. Cantidades de ADN cuantificado (ng/ml) de las extracciones realizas de hojas de orquídeas del género Lycaste.

Variación de la metodología de Extracción

MEDIA (ng/ml) ±

Desviación Estándar (ng/ml)

n Mínimo Máximo KURTOSIS

Valor Crítico KURTOSIS

COEFICIENTE DE ASIMETRÍA

Valor Crítico COEF. ASIM.

Macerado en 700μl de CTAB, Resuspensión en 10μl de TE 312.9 ± 189.5 137 53 806 0.0368 0.8371 0.9734 0.4185 Macerado en 700μl de CTAB, Resuspensión en 50μl de TE 168.9 ± 84.3 129 24 432 0.4071 0.8627 0.8614 0.4313 Original: Macerado en 600 μl de CTAB, Resuspensión en 50μl de TE 103.9 ± 70.7 132 14 320 0.9770 0.8528 0.9931 0.4264

3. Visualización de ADN amplificado en gel de Agarosa Se analizaron 436 muestras amplificadas por PCR (ver cuadro 6), para poder estandarizar la técnica de amplificación. Para alcanzar la etapa de secuenciación se hicieron varias modificaciones a la metodología (ver cuadro 7). Estas modificaciones incluyeron el cambio en la concentración de ADN total, cambio en la concentración de magnesio, renovación de cebadores, enzimas y nucleótidos y cambio en la temperatura de alineamiento de los cebadores con el ADN. Como se puede observar en las figuras de la 8 a la 13, no se lograron obtener los productos de la calidad esperada en las amplificaciones de ADN de orquídeas que se realizaron. Estas figuras corresponden a las metodologías más representativas, visualizadas por electroforesis en agarosa, ver descripción en el cuadro 7. Cuadro 6. Cantidad de muestras amplificadas y visualizadas en agarosa, clasificadas por gen analizado, incluyen extracciones en triplicado.

GEN MUESTRAS ANALIZADAS matK 208 ndhF 92 ITS-1 68 ITS-2 68

TOTAL DE MUESTRAS ANALIZADAS 436

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Cuadro 7. Cantidad de muestras de ADN amplificadas y visualizadas en agarosa, por experimento, bajo distintas condiciones. Experimento Gen

amplificado

Numero de muestras

trabajadas

Condiciones

1 ADN Total 7 Visualización del ADN presente en las muestras extraídas para confirmar existencia de ADN de alto peso molecular.

2 matK 38 Metodología Original de amplificación 3 ndhF 38 Metodología Original de amplificación 4 ndhF 36 Metodología Original de amplificación, uso de cebadores

nuevos 5 matK 36 Metodología Original de amplificación, uso de cebadores

nuevos 6 ndhF 18 Metodología Original de amplificación 7 matK 16 Metodología Original de amplificación 8 matK 40 Metodología Original de amplificación 9 matK 10 Desarrollo del control positivo con Solanum sp. 10 matK 10 Prueba Mayra Maldonado 11 matK 10 Prueba Luis Castellanos 12 ITS-1 10 Pruebas con ITS-1 13 ITS-2 10 Pruebas con ITS-2 14 matK 10 Con 1 μl de ADN 15 matK 10 Con 2 μl de ADN 16 matK 10 Con 3 μl de ADN 17 matK 12 con polimerasa nueva 18 ITS-1 8 Visualizado en gel de agarosa al 0.5,1(Fig. 8) y 2% en

concentración 19 ITS-2 8 Visualizado en gel de agarosa al 0.5,1 y 2% en

concentración 20 ITS-1 5 Pruebas con Solanum sp. (Fig. 9) 21 ITS-2 5 Pruebas con Solanum sp. (Fig. 9) 22 ITS-1 6 Cambio en la concentración de magnesio (Fig. 10) 23 ITS-2 6 Cambio en la concentración de magnesio (Fig. 10) 24 ITS-1 5 Cambio en las temperaturas de alineación 25 ITS-2 5 Cambio en las temperaturas de alineación 26 ITS-1 18 Cambio en las temperaturas de alineación 27 ITS-2 18 Cambio en las temperaturas de alineación 28 ITS-1 10 Cambio en las temperaturas de alineación (Fig. 11) 29 ITS-2 10 Cambio en las temperaturas de alineación (Fig. 12) 30 matK 3 Cebador experimento PCR tipo “touchdown” (Fig. 13) 31 ITS-1 3 Cebador experimento PCR tipo “touchdown” (Fig. 13) 32 ITS-2 3 Cebador experimento PCR tipo “touchdown” (Fig. 13) 33 matK 3 Segundo experimento PCR tipo “touchdown” (Fig. 13) 34 ITS-1 3 Segundo experimento PCR tipo “touchdown” (Fig. 13) 35 ITS-2 3 Segundo experimento PCR tipo “touchdown” (Fig. 13) TOTAL de muestras 443

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Figura 8. Amplificación del gen ITS-1 en muestras de orquídeas del género Lycaste (2-9). C- control negativo, C+ control positivo, L marcador de pesos moleculares “1 Kb” de la casa Sigma. Otras pruebas con muestras del género Lycaste con el gen ITS-1 pueden observarse en la figura 8. Observamos marcas tenues de los productos esperados, menos de 500pb, en las columnas de la 2 a la 7. En las columnas 8 y 9 presentan las marcas más visibles, pero con mucho barrido. Los controles positivos de macuy funcionaron. Se utilizó material fresco de macuy (Solanum sp.) para producir los controles positivos y confirmar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la figura 9 observamos los resultados de dicha prueba para los genes ITS-1 e ITS-2. Para el gen ITS-1 hay banda del tamaño de producto esperado (~300 pb) en las columnas 1 y 4. Para ITS-2 hay reacción positiva en 1, 2 (la más visible) y 4. Esto muestra que aunque se tenga ADN total suficiente, y la PCR tenga los reactivos en buen estado no siempre se obtendrán los productos esperados. En las ocasiones que se lograron obtener productos, estos fueron muy débiles (Fig. 10). Esto puede deberse a: concentración de cebadores baja, cantidad necesaria de ciclos insuficientes o tiempo de extensión muy corto. Aun así se observa que hay al menos dos tamaños diferentes en los productos de ITS-1 de diferentes especies de Lycaste, comparar columna 1 (tamaño pequeño) con columnas 2, 4, 5 y 6 (tamaño grande) en la Fig. 10. Para ITS-2 no se puede tener una conclusión válida debido a los barridos presentes en las columnas.

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Figura 9. Amplificación del gen ITS-1 e ITS-2 en muestras de Solanum sp (1-5). C- control negativo, C+ control positivo, L marcador de pesos moleculares “PCR marker” de la casa Sigma.

Figura 10. Amplificación del gen ITS-1 e ITS-2 en muestras de Lycaste del Sección Xanthanthae. La muestra 1 es Lycaste cochleata y las demás son de L. cruenta (2 a 6). C- control negativo, C+ control positivo, L marcador de pesos moleculares “1 Kb” de la casa Sigma.

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Figura 11. Amplificación del gen ITS-1 en muestras de Lycaste skinneri var. rosea en cultivo en Baja Verapaz (2-11). C- control negativo, C+ control positivo, L marcador de pesos moleculares “PCR marker” de la casa Sigma, en la columna 1 no se colocó muestra.

Figura 12. Amplificación del gen ITS-2 en muestras de Lycaste skinneri var. rosea en cultivo de Baja Verapaz (2-11). C- control negativo, C+ control positivo, L marcador de pesos moleculares “PCR marker” de la casa Sigma, en la columna 1 no se colocó muestra. Las figuras 11 y 12 muestran los resultados obtenidos para los genes ITS-1 e ITS-2 en muestras de Lycaste skinneri var. rosea provenientes de Baja Verapaz. No se logra tener una buena resolución de las franjas obtenidas. Se pueden ver marcas del tamaño esperado, más definidas en las columnas 6, 7 y 8 en la figura 11 y las columnas de la 7 a la 11 en la figura 12. No se observa diferencia entre el tamaño de los fragmentos obtenidos.

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Los barridos se pueden presentar por diversas razones entre ellas se puede destacar (Sigma, 2002):

- Demasiados ciclos de amplificación de ADN. - Temperatura de desnaturalización muy baja - Tiempo de extensión muy largo. - Exceso de ADN polimerasa en la mezcla de reacción. - Concentración de magnesio muy alta. - Concentración de los cebadores muy alta. - PCR del tipo “Touchdown” es recomendable.

La PCR “Touchdown” sirve para simplificar la determinación de la temperatura óptima de alineamiento de los cebadores. El concepto se basa en que cualquier diferencia en las temperaturas de fusión, correcta e incorrecta, será corregida y no importa que tan inespecífica sea la reacción, se obtendrá un producto favorable (Court, 2001; Don et al., 1991). En la figura 13 se observa la prueba con tres genes y tres muestras para esta técnica En las muestras presentadas encontramos grandes franjas (o barridos) de ADN en lugar de encontrar bandas angostas y definidas. La figura 14 presenta los productos para el gen matK en diferentes especies de Lycaste de la sección Xanthanthae obtenidas con anterioridad (datos no publicados) que muestran la resolución necesaria para poder hacer secuenciación. Muestras del ADN total extraído de varias plantas se llevaron al laboratorio del Dr. Paul Manos, Departamento de Biología, Universidad de Duke, Carolina del Norte, en Estados Unidos, para ayudarnos a determinar posibles fuentes de error. El Dr. Manos (com. pers., 2003) estima que el ADN se encontraba en poca cantidad o degradado, por lo que no continuó con ningún tipo de análisis. Ninguno de los productos obtenidos durante la fase de trabajo de este proyecto presenta la resolución encontrada en experimentos anteriores por lo que no se logró pasar a la siguiente etapa de secuenciación manual de los productos obtenidos por la PCR. Se cree que Lycaste skinneri presenta otros tipos de interferentes que no fueron encontrados en las especies analizadas de este género con anterioridad. Se cree que los interferentes pueden ser polifenoles, ADNasas y ARN. Por no poder realizar los viajes de campo planificados, no se pudo utilizar material foliar fresco en todas las extracciones, sólo 15 de las 45 muestras de Lycaste skinneri eran frescas. Por esta razón se cree que el material almacenado en refrigeración a –20ºC inició el proceso de degradación de ADN antes de que se pudiera extraer.

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Figura 13. Metodología de PCR touchdown con tres distintas muestras de Lycaste skinneri var. rosea (1, 2, 3) utilizado 3 cebadores (A=matK, B=ITS-1 y C=ITS-2). C- control negativo, C+ control positivo, L marcador de pesos moleculares “1 Kb” de la casa Sigma.

Figura 14. Producto esperado de seis muestras de Lycaste de la sección Xanthanthae utilizando cebadores para el gen matK realizado en el año 2000 (datos no publicados). L, marcador de pesos moleculares “1 Kb” de la casa Sigma.

39

D. Cultivo de Tejidos in vitro

El medio de siembra más utilizado en este proyecto fue el Knudson, por ser el más general. Los medios de cultivo ½ MSO y NA, ½ MSO y agua de coco, MSD20 (pH=5.8) y MSDO (pH=7.0) fueron utilizados solamente para un tipo de meristemo; raíces, semillas, hojas y raíces, respectivamente. El medio Vacin y Went fue utilizado para sembrar tejidos foliosos (hojas y partes florales). El medio de Hill con agua de coco utilizado es específico para semillas de orquídea y se utilizó para confirmar su eficacia con otras partes de la planta. En el cuadro 8 encontramos la cantidad de muestras sembradas por medio durante este proyecto. Para cada muestra se contaron con al menos tres pedazos de planta por recipiente. En el caso de semillas no se contabilizaron exhaustivamente, pero fueron sembradas cientos por recipiente. A estos datos se les aplicó un análisis de χ2 con un resultado de 664.32 (grados de libertad = 21) por lo que la probabilidad de que estos datos sean comparables es de 0.0000. Debido a esto, no se realizó ningún análisis estadístico posterior. No se logró obtener mucho material en condiciones óptimas para desarrollar clones por la poca cantidad disponible en cultivos privados de la capital, ya que se podía dañar permanentemente a la planta donadora. Los tejidos debían ser jóvenes y vigorosos para poder resistir el manejo y proceder de plantas sin enfermedades, como virus y bacterias. Al compartir laboratorio de cultivo no se cuenta con las condiciones óptimas de temperatura, luz y humedad para todas las especies cultivadas. Esto colaboró con la mortalidad de plantas por infecciones de hongos y bacterias. Las repeticiones de varios tipos de cultivos se encontraban en el mismo envase de cultivo. Al contaminarse una porción vegetal, se contaminan las demás y se perdía todo el material de ese individuo. Por la consistencia del medio y del tejido sembrado hubo problemas de desecamiento en el caso de los tejidos foliosos. Debido a lo anterior, se cambió el tipo de medio en el cual se sembraron estos tejidos. Para futuros proyectos se recomienda que los tejidos foliosos se coloquen en medios líquidos para evitar su desecación. En el tiempo que se llevó a cabo este estudio solamente tres meristemos produjeron embriones listos para explantar. El resto de material sembrado que sobrevivió no ha desarrollado embriones. Las semillas si presentaron un mayor porcentaje de germinación (76%), pero las plantas provenientes de estas pueden tardar hasta 10 años en producir flores (Dix, com. pers.). En la Fig. 15 observamos las plantas que sobrevivieron y las que no para cada medio. Las partes vegetativas que produjeron embriones listos para ser transvasados fueron el tallo de la flor y las raíces. Las hojas aunque han sobrevivido por más tiempo no han presentado crecimiento de embriones que puedan ser transvasados. Las semillas tienen una buena tasa de sobrevivencia. Las causas de muerte para las partes de la planta en el cultivo in vitro fueron por ataque de hongos, bacterias, en general, o desecamiento en el caso de hojas y partes florales foliosas.

40

Cuadro 8. Cantidad de muestras sembradas en los diferentes medios. Medios de Cultivo Órgano

Sembrado MSO MSO NAA+BA

MSO + coco

Hill + coco Knudson MSD20

pH=5.8MSDO pH=7.0

Vacin & Went

TOTAL

Flor 8 0 0 1 13 0 0 4 26 % Fila 30.8 0 0 3.8 50 0 0 15.4 100 % Columna 26.7 0 0 3.4 36.1 0 0 26.7 20.6 Hoja 0 0 0 0 10 4 0 11 25 % Fila 0 0 0 0 40 16 0 44 100 % Columna 0 0 0 0 27.8 100 0 73.3 19.8 raíces 20 5 0 3 11 0 2 0 41 % Fila 48.8 12.2 0 7.3 26.8 0 4.9 0 100 % Columna 66.7 100 0 10.3 30.6 0 100 0 32.5 Semillas 2 0 5 25 2 0 0 0 34 % Fila 5.9 0 14.7 73.5 5.9 0 0 0 100 % Columna 6.7 0 100 86.2 5.6 0 0 0 27 TOTAL 30 5 5 29 36 4 2 15 126 % Fila 23.8 4 4 23 28.6 3.2 1.6 11.9 100 % Columna 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Foliosos Pruebas Específicos

Figura 15. Partes de plantas de Lycaste vivas y muertas en los diferentes medios de cultivo. Los medios utilizados son A) ½ MSO; B) ½ MSO y NA; C) ½ MSO y agua de coco; D) HILL y agua de coco; E) KNUDSON; F) MSD 20 pH=5.8; G) MSDO pH=7; H) Vacin & Went.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

A B C D E F G H 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

A B C D E F G H

MuertasVivas

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

A B C D E F G H

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

A B C D E F G H

Semillas

Raices Hojas

Partes

Florales

41

VII. CONCLUSIONES

1. La diversidad genética de Lycaste skinneri, basada en morfología, encontrada ex situ, en colecciones privadas, está bien representada.

Análisis Morfológico 2. El análisis morfométrico muestra 8 grupos de caracteres medidos que agrupan los

diferentes tamaños de las flores de las plantas dentro de Lycaste skinneri. 3. Basados en los datos utilizados no podemos separar a Lycaste skinneri en grupos

más pequeños. 4. Los datos morfológicos muestran una tendencia a aumentar el tamaño de la flor

de las poblaciones en el Sur hacia el área de las Verapaces.

Análisis Genético 5. Se encontró diversidad de tamaño entre los fragmentos amplificados de las

Lycaste de la sección Xanthanthae con los de la sección Macrophyllae donde se encuentra la Monja Blanca.

6. No se logró hacer una evaluación exhaustiva de Lycaste skinneri con la información proporcionada por los genes matK, ndhF, ITS-1 e ITS-2 amplificados.

Cultivo in vitro

1. En el cultivo de tejidos se logró poca producción de embriones a partir de meristemos.

2. Los meristemos que lograron producir un embrión que se pueda explantar son los de partes florales y raíces.

3. Los pedazos de hojas presentan una alta tasa de sobrevivencia pero no tienen una alta producción de embriones explantables.

4. Las semillas tienen buena sobrevivencia (76%). 5. Se ha iniciado el establecimiento de un banco de germoplasma de las orquídeas

del género Lycaste en la Universidad del Valle de Guatemala.

42

VIII. RECOMENDACIONES Administrativas

1. Informar por escrito las condiciones permitidas en los proyectos antes de que se sometan a selección para los fondos. Por ejemplo, no se permitieron hacer viajes de campo los fines de semana. La mayoría de investigadores tienen trabajo dentro de la Universidad aparte de sus proyectos de investigación y el único tiempo disponible para viajes es el fin de semana. En el caso del proyecto 59-00 tuvimos que trasladar la cantidad autorizada para viáticos y gasolina a materiales y suministros. Los viajes que se lograron realizar fueron llevados a cabo por los Drs. Dix como parte de cursos del Departamento de Biología.

2. Funcionó muy bien el calendario de entrega de papelería, como informes, facturas y planilla para los pagos mensuales. Fue muy útil, pero también deben planificarse adecuadamente cuando las fechas de entrega coincidan con los feriados y asuetos.

3. La compra de materiales y equipo se atrasó mucho porque no se había definido que todas las compras aunque tengan un tercio del valor importándolas se deben comprar a distribuidores nacionales.

4. La obtención de requisiciones que cumplieran todas las condiciones necesarias para la SENACYT en el extranjero atrasó mucho el inicio del análisis genético. No se esperaban problemas de contaminación en los laboratorios para estos análisis, en especial en la PCR y la secuenciación.

5. El inicio del proyecto debe coincidir con las fechas que sean más propicias para el investigador. Por ejemplo la mejor época para colectar muestras de flores y hojas de Lycaste skinneri debe ser entre noviembre y febrero de cada año. Después de esta época las hojas son muy viejas y las plantas sólo florean una vez al año.

Análisis Morfológico

6. Se necesita realizar más viajes de campo para conseguir más flores de las localidades sureñas en el país para agregar al análisis de componentes principales y poder tener mejor representado a este grupo.

Análisis Genético

7. Tratar de conseguir más muestras de hoja frescas y jóvenes para extraer ADN total.

8. Tratar de tener un laboratorio no compartido para evitar posibles contaminaciones con organismos de otros reinos.

9. En proyectos futuros deben investigarse posibles interferentes a las reacciones en cadena de la polimerasa incluyendo en los materiales ARNasas y otras enzimas que sirven para eliminar interferentes.

Cultivo in vitro

10. Conseguir más muestras de meristemos en invernaderos privados que están fuera de la capital. No se puede sacar mucho material de cada planta para evitar que se dañe permanentemente.

43

11. Tratar de que las repeticiones de tejidos en los medios se encuentren en envases individuales. Esto mejorará la calidad de los datos para un análisis estadístico adecuado.

12. Tener en cuenta que los tejidos foliosos son muy delicados con respecto a la humedad del cuarto y del medio de cultivo, por lo que es mejor sembrarlos en medios con superficie líquida.

13. Tratar de tener un laboratorio no compartido con otros grupos en cultivo para evitar posibles contaminaciones con bacterias y hongos provenientes de otros organismos.

44

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49

X. ANEXOS

50

ANEXO A

SOLUCIONES MADRE ANÁLISIS GENÉTICO Solución madre de Ácido Etilendiamino Tetracético Disódico (EDTA Na2), al 0.5 M -Sal disódica de EDTA* H2O 18.6 g -Agua desionizada 70.0 ml -Hidróxido de sodio(10M) hasta llegar a pH=8 aproximadamente 5 ml. Aforar con agua desionizada hasta 100 ml. Solución madre de Trisma-Base, Ácido Bórico y EDTA (TBE) 10X -Trisma-Base 108.0 g -Ácido Bórico 55.0 g -Solución EDTA(0.5 M, pH=8) 40 ml -Aforar con Agua destilada hasta llegar a 1000 ml

Solución Amortiguadora TNE 10X En 800ml de agua destilada, disolver: -Trisma-Base 12.1 g -Sal disódica de EDTA 3.7 g -Cloruro de Sodio 58.4 g -Ajustar pH a 7.4 con HCl. -Completar con agua destilada hasta 1,000 ml. -Filtrar y almacenar a 4º C

51

ANEXO B

MEDIOS DE CULTIVO IN VITRO MURASHIGE & SKOOG Original (MSO) MS macros 50 ml MS micros 0.5 ml Calcio (Ca) 5 ml Hierro (Fe) 5 ml Vitamina B5 1 ml Sacarosa 15 g Agua destilada para ajustar el volumen a un litro pH 5.8 Gelrite 3 g MURASHIGE & SKOOG modificado con agua de coco MS macros 50 ml MS micros 0.5 ml Calcio (Ca) 5 ml Hierro (Fe) 5 ml Vitamina B5 1 ml Sacarosa 15 g Agua de coco 50 ml Agua destilada para ajustar el volumen a un litro pH 5.8 Gelrite 3 g KNUDSON MS Micro stock 1 mL Stock de hierro l0 mL Ca(NO3)2 4H2O 1g (NH4)2SO4 0.5g KH2PO4 0.25g MgSO4 7H20 0.25g Agua de coco 1ml Sacarosa 20g Ajustar volumen a un litro pH=5.5 Autoclavear y Dejar enfriar Adenina 0.002g Stock NAA lmg/mL 18.6 μl Stock BA lmg/mL 180.24 μl

52

Otros medios utilizados únicamente para hojas y flores fueron: MEDIO VACIN & WENT MS Macro Stock 50 ml MS Micro Stock 1 ml Calcio Stock 5 ml Hierro Stock 10 ml Stock Vitamina B5 4 ml Mn SO4 4H2O 0.0054 g Ajustar volumen con agua destilada a un litro pH 5.4 Gelrite 3.0 g Autoclavear y dejar enfriar Adenina 0.002 g

MEDIO MSD 20 (pH 5.8) con NAA y BA MS Macro Stock 100 ml MS Micro Stock 1 ml Calcio (Ca) 10 ml Hierro (Fe) 10 ml Vitamina B5 2 ml 2,4 diclorofenoxyacético (2.4 D) 100 ml Sacarosa 30 g Agua destilada Ajustar volumen a un litro Gelrite 2 g pH 5.8 Autoclavear y Dejar enfriar NAA stock l mg/mL 18.6 μl BA stock 1 mg/mL 180.24 μl MS Micro Stock Compuesto Para ½ litro H3BO3 3.1000g MnSO4 H2O 8.4500g ZnSO4 7H2O 4.3000g Na2MoO4 2H20 0.1250g CuSO4 5H2O 0.0125g CoCl2 6H2O 0.0125g KI 0.4150g Ajustar volumen con agua destilada a 500ml Autoclavear

53

MS Macro Stock, Compuesto Para ½ litro NH4NO 16.5g KNO3 19.0g MgSO4 7H20 3.7g KH2PO4 1.7g Ajustar volumen con agua destilada a 500ml Autoclavear

Medio MSO con NAA y BA, STOCK Para un litro MS Macro 50 mL MS Micro 0.5 mL Calcio (Ca) 5 mL Hierro (Fe) 5 mL B5 Vitamina 1 mL Sacarosa 15 g Ajustar volumen con agua destilada a un litro pH=5.8 Geltride 3g Autoclavear Dejar enfriar NAA stock 1mg/mL 18.6 μl BA stock 1mg/mL 180.24 μl

CALCIO Stock (100 X relativo a MS) CaCl2.2H20 44.0 g Ajustar con agua destilada a 500ml HIERRO Stock (100 X relativo a MS) EDTA Na2 3.730g FeSO4. 7H20 2.780g Ajustar con agua destilada a 500ml NOTA: El EDTA debe estar completamente disuelto con NaOH (3 M) antes de agregar el Hierro. Vitamina B5 Stock (500X) Tiamina. HCl 2.50g Acido Nicotínico 0.25g Piridoxina. HCl 0.25g Mio-lnositol 25.00g Agua destilada para ajustar a 500ml

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ANEXO C.

INFORME FINANCIERO

RESUMEN DE LA EJECUCIÓN DEL PRESUPUESTO OTORGADO EL PROYECTO FODECYT 59-00: DIVERSIDAD DE LYCASTE SKINNERI

(BATEM. EX LINDL.) LINDL. EN GUATEMALA: ANÁLISIS DE GERMOPLASMA PARA SU CONSERVACIÓN

RUBRO APROBADO POR FODECYT

MONTO EJECUTADO

OBSERVACIONES

Servicios Técnicos y Profesionales

Q. 62, 500.00 Q. 61,707.62

Equipo Q. 16,160.00 Q. 12,730.00 Materiales y suministros

Q. 36,376.00 Q. 33,278.42 + $822.50*

Combustible y lubricantes

Q. 1,600.00 No ejecutado

Publicación de Resultados

Q. 3,000.00 No ejecutado

Gastos no previstos Q. 1,500.00 No ejecutado Gastos Administrativos

Q. 12,533.60 Q.12,533.60

Viáticos Q. 4,200.00 Transferencia Rubro de Materiales y Suministros

*Transacción realizada por SENACYT, se desconoce el cambio en quetzales por dólar de EEUU.

55

INFORME DE LOS PAGOS DE HONORARIOS POR SERVICIOS EN EL PROYECTO FODECYT 59-00: DIVERSIDAD DE LYCASTE SKINNERI (BATEM. EX LINDL.) LINDL. EN GUATEMALA: ANÁLISIS DE GERMOPLASMA PARA SU CONSERVACIÓN.

Los pagos de honorarios por servicios personales se basan en los depósitos hechos por FODECYT en la cuenta de depósitos monetarios número 81-01-54653-5 de BANCAFE.

FECHA MONTO DEPOSITADO en quetzales

MESES QUE CORRESPONDE PAGO

20-11-2001 7,448.66 Septiembre y octubre 2001 17-12-2001 3875.00 Noviembre 2001 29-01-2002 5875.00 Diciembre 2001 05-02-2002 5813.62 Enero 2002 01-04-2002 11,627.24 Febrero y Marzo 2002 08-05-2002 5813.62 Abril 2002 10-06-2002 5813.62 Mayo 2002 08-07-2002 5813.62 Junio 2002 13-08-2002 5813.62 Julio 2002 17-09-2002 3813.62 Agosto 2002 TOTAL 61,707.62

MONTO APROBADO: Q. 62,500.00 DIFERENCIA: Q. 793.00

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Ejecución del presupuesto aprobado por la Linea FODECYT correspondiente al rubro de materiales y suministros en el

Proyecto FODECYT 59-00: DIVERSIDAD DE LYCASTE SKINNERI (BATEM. EX. LINDL.) LINDL. EN

GUATEMALA: ANALISIS DE GERMOPLASMA PARA SU CONSERVACIÓN Fecha Requisición

Descripción de materiales y suministros

Empresa No. Factura

Fecha Factura

TOTAL en Q

TOTAL en US$

4/23/2002 10 cajas de 600 unidades cajas de petri de poliestireno de 100 x 15mm

MERCK C.A.

B13084 16-May-02 Q 4,510.50 4/25/2002 10 paquetes de papel plástico

parafilm de 4" x 125 pies DILAB S.A.

C 15297 16-May-02 Q 1,512.00 4/25/2002 3 kilos de sucrosa (sacarosa)

cristal SOL. ANAL

C00823 21-May-02 Q 744.78 5/7/2002 10 cajas de 20 unidades

respirador para polvos y neblinas 3M

A15908 7-Jun-02 Q 1,400.00 5/14/2002 5 kilogramos de Maltosa

monohidrato MERCK C.A.

B14371 12-Jun-02 Q 2,000.00 5/13/2002 2 kilogramos Nitrato de potasio

P.A.

2 kilogramos Sodio Sulfato

Anhidro P.A.

1 kilogramo Sulfato Potasio P.A. 500 gramos Hierro Sulfato H.P.A. MERCK C.A. B14363 12-Jun-02 Q 1,562.83 6/4/2002 3 frascos de 500 gramos EDTA

sal disódica deshidratada SOL. ANAL

C00819 21-Jun-02 Q 1,290.00 6/3/2002 4 litros propanol (iso) ACS 2.5 litros Acido Acetico ACS MERCK C.A. B17001 9-Aug-02 Q 464.55 9/19/2002 2 Silver Sequence (TM) DNA

sequencing reagents, 100 reactions & freight

PROMEGA

2200919 11-Oct-02 $523.00 11/11/2002 Poliza importación PROMEGA COMBEX IM 943074 30-Oct-02 Q 72.70 11/11/2002 Servicios Aduana PROMEGA AGENCIA

TORUÑO C13334 31-Oct-02 Q 417.87 9/19/2002 5 Acrilamida 100 gramos 1 Bisacrilamida 250 gramos 1 Hexadecyltrimetilo OCTAB 1 TRIS HCl 1 PCR Marker 2 Genomic Ultrapure unit 4 DNTD´s 0.5 ML 1 Agarosa 100gr. 1 Minimum 99% titration,

Biotechnology LABTRONIC

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Fecha Requisición

Descripción de materiales y suministros

Empresa No. Factura

Fecha Factura

TOTAL en Q

TOTAL en US$

500 G. Performance certified, cell culture tested

LABTRONIC (continuación) 351 22-Nov-02 Q18,103.19

9/26/2002 2000 unidades microtubos con tapadera de 1.5 ml

1920 unidades microtubos con tapadera de 0.2 ml

2000 unidades microtubos con tapadera de 0.5 ml

5 unidades gradillas para microtubos

4 unidades cajas para almacenar microtubos

ANAQUI

8/22/2002 PRIMERS (CEBADORES) $299.50 10/11/2002 2000 unidades puntas

micropipetas 10 ul

2000 unidades puntas

micropipetas 200 ul

2000 unidades puntas

micropipetas 1000 ul MERCK, SA

B11687 27-Jan-03 Q 1,200.00 Total ejecutado Q33,278.42 $822.50 Cantidad aprobada Q40,576.00

Ejecución del presupuesto en el proyecto FODECYT 59-00 correspondiente al rubro de equipo

Fecha Requisición Descripción del Equipo

Empresa No. De Factura

Fecha Factura

Total en Q

1 unidad Cámara Sequi-gen Gt 38x50 cm

5/14/2002

1 unidad Sequi-Gen II outer glass plate 38x30 cm BIONUCLEAR 2496 18-Jul-02 Q12,730.00

Cantidad aprobada Q16,160.00