Potencial de la Fijación Biológica de Nitrógeno en Variedades de Caña de Azúcar en Guatemala

Unidades Ejecutoras: • Centro Guatemalteco de Investigación y Capacitación de la Caña de Azúcar.

CENGICAÑA. • Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas. ICTA. • Centro Nacional de Investigación en Agrobiología CNPAB-EMBRAPA, BRASIL Investigadores: • Ing. Agr. MSc. Ovidio Pérez, Investigador Principal • Ing. Agr. MSc. Werner Ovalle, Investigador Asociado • Ing. Químico Juan José López, Investigador Asociado • Dra. Verónica Reis, CNPAB, EMBRAPA, Brasil • Dr. Segundo Urquiaga, CNPAB, EMBRAPA Brasil

Colaboradores • Fernando Hernández, Asistente, CENGICAÑA. • Ronald Pocasangre, EPS, Facultad de Agronomía, USAC. • Elmer Oliva, Asistente, CENGICAÑA. • Dr. Enrique Acevedo, CENGICAÑA. • Ing. María Antonieta Alfaro, actualmente cursa estudios de Postgrado, Brasil. Fecha de Inicio: 02/03/1998 Fecha de Terminación: 28/02/1999 Prórroga: 3 meses del 01/03/99 al 31/05/99 Vo.Bo. Aval. Dr. Mario Melgar

Director de CENGICAÑA

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INDICE GENERAL Pag.1. Resumen ……………………………………………………………………….…. 3 2. Introducción………………………………………………………………………. 4 3. Antecedentes………………………………………………………………….…... 5 4. Objetivos.……………………………………………………………….…….…... 6 5. Metodología………………………………………………………………….…… 6

5.1 Variedades evaluadas………………………………………………….……... 6 5.2 Suelo utilizado………...…………………………………………….……….. 7 5.3 Fertilización………...………………………………………………..…….… 8 5.4 Cosecha……………………………………………………………...……….. 8 5.5 Análisis de laboratorio……………...…………………………….….………. 9 5.6 Análisis de datos…………………...…………………………….…………... 9 5.7 Aislamiento e identificación de bacterias……………………….…………… 9

6. Resultados y Discusión…………………………………………….……………... 11 6.1 Eficiencia de Fijación Biológica de Nitrógeno……………….……………... 11 6.2 Aislamiento e identificación de bacterias fijadoras de N....….……………… 16

7. Discusión general………………………………………………….…………….... 19 8. Conclusiones……………………………………………………….……………... 22 9. Recomendaciones………………………………………………….……………... 22 10. Bibliografía………………………………………………………….………….. 23 11. Resúmenes de Ejecución Financiera………………….…………….…………… 26

11.1 Resumen de ejecución financiera de recursos FONACYT……………….. 27 11.2 Resumen de gastos de contrapartida……………………………..……….. 28

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Descripción de variedades de caña de azúcar evaluadas en el

estudio…………………………………………………………….………

7 Tabla 2. Principales características del suelo utilizado en el estudio………………. 8 Tabla 3. Materia seca, porcentaje de N y acumulación de N en variedades de caña

de azúcar y pasto Napier.………………………………………..………..

11 Tabla 4. Átomos en exceso de 15N en tres secciones y total en la planta y

porcentaje de utilización de Nitrógeno en variedades de caña de azúcar………………………………………………………………….….

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INDICE DE FIGURAS Figura 1. Variedades de caña con coloración verde normal y amarillamiento por

deficiencias de nitrógeno. CENGICAÑA, 1999………………………..

14 Figura 2. Rendimiento de N proveniente de la atmósfera con relación al N total

acumulado en la planta………………………………………………….

15 Figura 3. Colonias de Azospirillum obtenidos en aislamientos hechos en

CENGICAÑA y aislamientos liofilizados y reactivados obtenidos en CNPAB-EMBRAPA, Brasil…………………………………………….

17 Figura 4. Colonias de Herbaspirillum obtenidos en aislamientos hechos en

CENGICAÑA y aislamientos liofilizados y reactivados obtenidos en CNPAB-EMBRAPA, Brasil …………………………………………….

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Figura 5. Colonias de Acetobacter obtenidos de aislamientos en CENGICAÑA y de aislamientos liofilizados y reactivados obtenidos en CNPAB-EMBRAPA, Brasil……………………………………………………...

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1. RESUMEN Con el objetivo de cuantificar la posible contribución de la fijación biológica de nitrógeno (FBN) en la nutrición nitrogenada en caña de azúcar, se estableció un experimento utilizando el método de la dilución isotópica de 15N. El experimento se realizó en macetas con 64 kg de suelo en la Estación Experimental de CENGICAÑA en Santa Lucía Cotzumalguapa, Escuintla. Se evaluaron 13 genotipos de caña originarios de distintos países productores de azúcar y como testigo se usó el pasto Napier (Pennisetum purpureum). El suelo utilizado como sustrato fue un Andisol (Typic Hapludands) de los terrenos de la Estación Experimental de CENGICAÑA. El suelo fue marcado con el isótopo 15N-Sulfato de Amonio (10 % abundancia atómica). Dos tratamientos adicionales fueron evaluados con aplicación de dosis alta de N (340 Kg N/ha). El experimento fue cosechado a los 7 meses de edad. Los resultados indican que las variedades PGM 89968 y SP 792233 son capaces de obtener N en cantidades considerables por FBN, (hasta 60 porciento). El pasto Napier utilizado en el estudio resultó ser una variedad capaz de fijar N por FBN. Se aislaron 3 géneros de bacterias fijadoras de N, Azospirillum sp en tallos de NA 5642; Herbaspirillum sp en hojas de NA 5642 y en hojas de Pennisetum y Acetobacter sp en tallos de PGM 89968.

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2. INTRODUCCIÓN En Guatemala actualmente se cultivan alrededor de 165 mil hectáreas con caña de azúcar y anualmente se incorporan nuevas áreas al cultivo, para responder a la demanda de expansión de la capacidad de molienda de los ingenios azucareros. En los últimos cinco años la actividad azucarera, en lo que a generación de divisas se refiere, pasó a ocupar el segundo lugar después del café (Boesche, 1996) y es una fuente de generación de empleos directos e indirectos. En la zafra 96-97 se alcanzó una producción de 14.5 millones de toneladas de caña, los cuales produjeron 1.5 millones de toneladas de azúcar. El uso de fertilizantes químicos, principalmente nitrogenados, han jugado un papel muy importante en alcanzar estos niveles de producción. Con base en los promedios de fertilizantes usados en los ingenios azucareros reportados en la “Memoria de los resultados de la zafra 95-96" se estima que anualmente se aplican más de 11 mil toneladas de nitrógeno (N) en la producción de caña en el país. Esto equivale a la aplicación de más de 500 mil quintales de fertilizantes en términos de urea (46 % N). En la atmósfera terrestre prácticamente hay una fuente inagotable de nitrógeno (79 % N), pero el mismo se encuentra en la forma elemental formando enlaces triples muy estables y que no puede ser aprovechado por las plantas superiores. La producción de fertilizantes nitrogenados a través de la fijación industrial del N2 del aire requiere altas cantidades en energía (Marschner, 1986). Esta energía viene casi en su totalidad del gas natural (combustibles fósiles); el cual es un recurso natural no renovable. En las últimas décadas se han descubierto hechos importantes en relación al potencial de la fijación biológica de nitrógeno (FBN) en el cultivo de caña de azúcar (Böddey, 1995). La FBN consiste en la conversión de la molécula inerte del N2 del aire a formas combinadas de N asimilables por las plantas; por la acción de bacterias y algas azul-verde (Marschner, 1986). El sistema de FBN más conocido y explotado hasta ahora es el que realizan las bacterias del género Rhizobium en simbiosis con leguminosas. Recientemente, con el uso de las técnicas de dilución isotópica de 15N y balance de N, se demostró que ciertas variedades de caña de azúcar en Brasil obtenían más del 50 porciento de su N de la FBN (Lima et al. 1987), y específicamente variedades como la CB-45-3 y SP701143 fueron capaces de obtener el equivalente de 170 kg de N/ha/año, bajo condiciones óptimas de humedad y nutrientes como P, K y Mo (Urquiaga et al 1992). El incremento de los costos de los energéticos derivados del petróleo y de otras fuentes y de la demanda continúa y cada vez mayor de N en la producción de alimentos, reconocen la necesidad de buscar formas más eficientes para fertilizar la caña de azúcar; con tecnologías que aumenten la producción y sostengan la productividad a largo plazo, con el menor uso de energía de fuentes externas. Con ese propósito se plantea el presente estudio.

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3. ANTECEDENTES Aunque desde los años 50’s se encontró la presencia de la bacteria fijadora de nitrógeno del género Beijerinkia asociada con las raíces de caña de azúcar en Brasil (Döberiener, 1961); y después de Azospirillum en los 70’s, no se conoció en ese entonces la magnitud de la contribución de la FBN a la nutrición nitrogenada de la caña de azúcar. Posteriormente se demostró con la ayuda de técnicas isotópicas de 15N que la magnitud de la fijación de N vía FBN en el cultivo eran importantes (Lima et al, 1987; Urquiaga et al 1992). Las aportaciones de nitrógeno por FBN en caña de azúcar, no son atribuibles a la clásica asociación entre la rizosfera y bacterias diazotrópicas. El descubrimiento de varios organismos diazotrópicos endofíticos dentro de la planta de caña de azúcar en gran número (hasta 107 por g de tallo y hoja) han explicado en mejor forma estos sistemas de fijación (Döbereiner et al, 1993). La primera bacteria aislada con éstas características fue Acetobacter diazotrophicus (Gillis et al, 1989; MacRae, 1991; Li and MacRae, 1992). Acetobacter diazotrophicus tiene ciertas características favorables para la FBN; fija N2 a altas concentraciones de azúcar; puede crecer en pHs muy ácidos y es capaz de fijar N2 en presencia de NO3

- (Boddey, 1995). Las bacterias diazotrópicas endofiticas que viven en plantas ricas en azúcar pueden beneficiar más fácilmente que aquellas bacterias de la rizosfera (Döbereiner, 1995). Posteriormente se aisló Herbaspirillum seropedicae en tallos, hojas y raíces de caña de azúcar (Pimentel et al, 1991). La eficiencia de la FBN en caña de azúcar depende de los genotipos de caña, y el suministro adecuado de los otros nutrientes, principalmente P y Mo (Urquiaga et al, 1992). El hecho de que algunas variedades de Brasil han mostrado buena eficiencia en la FBN, se podría explicar por el hecho de que en este país la hibridación se ha realizado siempre con aplicaciones bajas de N (Döbereiner et al, 1993). De hecho las dosis típicas de N usadas en Brasil (50 kg Nha), están muy por debajo de las dosis utilizadas en cualquier otro país productor de caña (Ricaud et al, 1993). Las respuestas a N observadas en caña de azúcar en Guatemala con la variedad Canal Point 72-2086, indican que en caña plantía las respuestas a N son bajas (50 kg. N/ha); sin embargo en socas las respuestas son mayores (121 kg N/ha), (Pérez, 1996). Se ha determinado que la eficiencia de utilización del fertilizante N-urea medido con el uso de 15N, es menor que el 37 porciento (Pérez, 1998). Altas respuestas a N se han observado en la variedad Mex 68P23 (Pérez et al, 1996), en suelos ricos en materia orgánica. Bajo estas condiciones, en 1996 se realizó un ensayo para evaluar la respuesta de la caña de azúcar (Mex 68P23) a las aplicaciones de molibdeno bajo diferentes niveles de N. El resultado para nitrógeno fue lineal cuando se aplicó solo; sin embargo fue de tipo cuadrático cuando fue aplicado molibdeno. El molibdeno es un componente de la nitrogenasa, el cual es la enzima responsable de la FBN.

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4. OBJETIVOS Identificar variedades de caña de azúcar eficientes para la fijación biológica de nitrógeno. Cuantificar la contribución de la fijación biológica de nitrógeno en la nutrición nitrogenada de la caña de azúcar en variedades sembradas en Guatemala. Evaluar la presencia de Acetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae y otras bacterias fijadoras de nitrógeno asociadas al cultivo de caña de azúcar. 5. METODOLOGÍA El estudio se realizó en la Estación Experimental Camantulul del Centro Guatemalteco de Investigación y Capacitación de la Caña de Azúcar en Santa Lucía Cotzumalguapa, departamento de Escuintla. 5.1 Variedades evaluadas Se evaluaron trece variedades de caña de azúcar originarias de distintos países productores de azúcar, en recipientes de metal grandes utilizando el método de la dilución isotópica de 15N (Hardarson, 1979). Las variedades utilizadas se presentan en la Tabla 1. Se incluyó en el estudio el Pasto Napier (Pennisetum purpureum) como testigo no fijador y se replicaron dos variedades fertilizadas con N en altas dosis.

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Tabla 1. Descripción de variedades de caña de azúcar evaluadas en el estudio.

Variedad Origen Observación

CG 95107 Cengicaña, Guatemala Se encuentran en fase de Prueba Regional.

CG 95125 Cengicaña, Guatemala Se encuentran en fase de Prueba Regional.

CP 722086 Canal Point, Fla., USA Variedad comercial más importante sembrada en Guatemala.

CP 811384 Canal Point, Fla., USA Pasó por Prueba Regional de variedades.

CP 881508 Canal Point, Fla., USA Se encuentra en fase de Prueba Regional de variedades.

Mex 68p23 México Variedad sembrada comercialmente.

Mex 69290 México Pasó por Prueba Regional. NA 5642 Norte Argentina Pasó por prueba Regional.

PGM 89968 Pantaleón-Guatemala-México Variedad comercial en incremento.

PR 752002 Puerto Rico

Se encuentra en Prueba Regional de variedades

PR 872080 Puerto Rico Pasó por Prueba Regional

SP 792233 Brasil Se encuentra en Prueba Regional.

SP 701143 Brasil Variedad eficiente en FBN Brasil. Se tomó semilla de colección de variedades de Ingenio Pantaleón.

Pennisetum purpureum ---- Semilla proviene de colección de pastos de Escuela de Zootécnia USAC, Guatemala.

CP722086+N Fertilizado con N en dosis altas.

SP701143+N Fertilizado con N en dosis altas.

Las variedades fueron sembradas con plántulas, sembrando una plántula por maceta con 64 kg de suelo. Las mismas fueron previamente pregerminadas por medio de yemas en bandejas de pregerminación durante 6 semanas. Las macetas fueron ubicadas en un diseño al irrestricto azar con 6 repeticiones. 5.2 Suelo utilizado El suelo utilizado en las macetas fue una mezcla de los horizontes A (30 %) y B (70 %) de un suelo Andisol (Typic Hapludands) de la Estación Experimental de CENGICAÑA. Esta

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mezcla se hizo con la posibilidad de tener contenidos de materia orgánica menores al 3 porciento. Tabla 2. Principales características del suelo utilizado en el estudio.

K Ca Mg Cu Fe Mn Zn MO (%)

N-O3-

(ppm) PH

(agua) PH

(NaF) P

(ppm) ---Meq/100g--- ppm 2.54 45 6.1 10.9 <10.0 0.20 7.7 0.94 0.08 4.0 13.7 ND

Laboratorio químico de CENGICAÑA. El suelo fue secado al aire, tamizado después a 5 mm y pesado según las correspondientes proporciones de los horizontes (19 kg del A y 45 kg del B); la mezcla fue debidamente homogenizada con una mezcladora manual con capacidad para 200 kg. 5.3 Fertilización El suelo fue marcado con el isótopo 15N a razón de 15 ppm en forma de sulfato de amonio con una abundancia atómica del 10 % (9.633 exceso atómico), el cual fue aplicado al momento de la homogenización del suelo. La fertilización base consistió en la aplicación de fósforo (TSP), Potasio (KCl), Hierro (FeSO4), Manganeso (MnSO4), Cobre (CuSO4), Zinc (ZnSO4), Boro (Bórax) y Molibdeno (Na2MoO4) los cuales se mezclaron con todo el volumen del suelo al momento de la homogenización a excepción del molibdato de sodio que fue aplicado diluido en agua. A todos los suelos se les adicionó 150 gr de paja molida (hoja seca de caña de azúcar) por maceta. Este material con alta relación carbono nitrógeno serviría para minimizar las posibles pérdidas de N-NO3

- a través de la inmovilización temporal del 15N-sulfato de amonio. Las macetas con el suelo debidamente fertilizadas se dejaron en incubación con humedad a capacidad de campo durante 3 semanas. La siembra (transplante) se realizó el 24 de junio de 1998. Las macetas estuvieron al aire libre irrigadas por la lluvia y complementadas con agua de riego en la época de sequía. Los dos tratamientos con N adicional fueron fertilizados con N-urea a razón de 340 kg N/ha, fraccionado en cuatro aplicaciones. 5.4 Cosecha Se colectaron hojas senescentes a partir del mes de agosto con una frecuencia de 45 días. Las hojas secas fueron colectadas a mano y pesadas. De cada tratamiento se tomaron muestras representativas y fueron puestas en bolsas de papel kraft. Del 27 al 30 de enero se realizó la cosecha. Se cortaron y separaron tres partes: tallo, hoja y cogollo de cada planta de todos los tratamientos. Cada sección fue pesada (peso fresco) y de la misma se tomaron las muestras correspondientes las cuales fueron lavadas en agua destilada y picadas en trozos pequeños (3-4 cm), con excepción de los tallos que fueron pasados por una desfibradora mecánica para facilitar la homogenización y secado. Las

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muestras fueron pesadas y llevadas al laboratorio químico del Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas, ICTA. 5.5 Análisis de laboratorio Las muestras fueron secadas en un horno de convección a una temperatura de 70oC, por 48 horas o más hasta alcanzar peso constante. Las mismas fueron pesadas y homogenizadas y se tomaron submuestras que se molieron en un molino de cuchillas para lograr un tamaño de partícula de 1 mm. La digestión de la muestra para la determinación de N total se hizo según el método Kjeldhal (Bremner, 1960). El porcentaje de abundancia de 15N en las muestras se determinó en el espectrómetro de emisión óptica NOI 6e PC, en el laboratorio del ICTA. 5.6 Análisis de datos Se calculó el porcentaje de átomos en exceso (ea 15N) de las muestras mediante la sustracción de la abundancia natural (0.3663 %) de los correspondientes porcentajes de abundancia atómica de las muestras. El porcentaje de N fijado de la atmósfera por la planta (% NFATP) se calculó mediante la fórmula: % NFATP = (Hardarson, 1979). Los análisis estadísticos fueron hechos con el sistema SAS. Se hizo el análisis de varianza correspondiente al diseño completamente al azar a las variables materia seca de hoja, cogollo, tallo y planta total, porcentaje de N en la planta, exceso atómico de 15N en la planta, N acumulado en la planta y porcentaje de fijación de nitrógeno de la atmósfera. Cuando el % NFATP dio valores negativos, este se igualó a cero. El análisis de varianza para los datos expresados en porcentaje se realizó con datos transformados (raíz cuadrada). La prueba de medias utilizada fue la prueba de Student-Newman-Keuls (SNK), al 5 porciento. 5.7 Aislamiento e identificación de bacterias Se colectaron muestras de las variedades SP 701143, NA 5642, PGM 89968 y de Pennisetum, las que se llevaron al laboratorio de Fitopatología de Cengicaña para el aislamiento de bacterias fijadoras de nitrógeno. Las tres variedades de caña fueron muestreadas por presentar buen desarrollo y mantener una coloración verde normal en las primeras etapas de desarrollo del cultivo, y Pennisetum que era el control.

ea 15N control ea 15N variedad 1- *100

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Las plantas fueron seccionadas y sus partes trabajadas de la siguiente forma: Hojas: Se lavaron con agua y detergente enjuagando al final con agua destilada. Se cortaron en trozos con tijera y se licuaron en un pequeño volumen de agua destilada. El producto se filtró con gasa. El filtrado se diluyó en proporciones de 1:10 sucesivas para obtener las diluciones 101, 10-1, 10-2. Las diluciones se sembraron (0.1 cc/en 5cc) en los medios semi-sólidos LGI-P, JNFB, NFB y LGI. (Döbereiner Baldani y Baldani, 1995). Tallos: Se lavaron con agua y detergente enjuagando al final con agua destilada. Se eliminó la corteza, se cortaron en trozos pequeños con navaja y se licuaron con agua destilada. El producto se filtró con gasa. El filtrado se diluyó en agua destilada para obtener las proporciones 101, 10-1, 10-2. Las diluciones se sembraron (0.1 cc/en 5 cc) en los medios semi-sólidos indicadas para hojas. Raíces: Se lavaron, eliminando con los dedos los restos de suelo. Se sumergieron en agua corriente por una hora para eliminar contaminantes. Se cortaron en trozos con tijera y se licuaron en agua destilada. El producto se filtró con gasa y se siguió el procedimiento indicado para hojas. De los frascos con medio semi-sólido en los cuales se observó crecimiento bacterial se tomó una pequeña cantidad con asa de platino y se transfirió dos veces a medio semi-sólido de nuevo, para luego transferir a cajas petri con medios sólidos para finalizar la purificación. En esta fase se hicieron observaciones de tipo, forma, bordes, etc. de las colonias y se hicieron montajes para microscopio de contraste de fases para observar características de las células bacterianas. Tomando en cuenta el medio de cultivo de crecimiento, características de colonia y características de las células bacterianas se hizo una clasificación de los géneros aislados. Para esta clasificación se hicieron comparaciones con aislamientos liofilizados y reactivados obtenidos en EMBRAPA-Seropédica, de Río de Janeiro, Brasil.

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6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 Eficiencia de Fijación Biológica de Nitrógeno En la Tabla 1 se presentan las medias de los pesos secos de biomasa aérea de tres secciones de la planta, y el total, el porcentaje de nitrógeno en las mismas y el nitrógeno acumulado por maceta en todo el período. Tabla 3. Materia seca, porcentaje de nitrógeno y acumulación de nitrógeno en

variedades de caña de azúcar y pasto Napier.

Variedad

Materia seca (g/maceta) N (%) N acumulado

Hojas Cogollo Tallo Total Planta

Hojas Cogollo Tallo Total (g/maceta)

CG 95107 277 192 242 711 bc 0.52 d 0.87 c 0.21 b 3.64 bcCG 95125 227 160 136 523 c 0.46 d 1.18 c 0.13 b 2.94 bcCP 722086 322 191 110 623 c 0.55 d 1.27 c 0.24 b 4.75 bcCP 811384 313 194 166 673 bc 0.64 cd 1.23 c 0.23 b 4.90 bcCP 881508 337 178 196 711 bc 0.60 cd 1.76 bc 0.25 b 5.58 bcMex 68P23 209 180 126 514 c 0.60 cd 0.94 c 0.21 b 2.58 bcMex 69290 227 156 100 483 c 0.42 d 0.88 c 0.19 b 2.63 cNA 5642 294 145 242 681 bc 0.47 d 0.85 c 0.17 b 3.27 bcPGM 89968 505 206 326 1037 b 0.62 cd 1.76 bc 0.33 b 8.08 bPR 752002 192 190 142 524 c 0.75 bcd 1.15 c 0.27 b 4.01 bcPR 872080 269 166 128 564 c 0.56 d 1.25 c 0.20 b 3.76 bcPennisetum 280 170 294 745 bc 1.00 abc 1.34 bc 0.35 b 6.72 bcSP 792233 256 182 122 560 c 0.69 dc 1.79 bc 0.25 b 4.74 bcSP 701143 447 172 176 796 bc 0.50 d 1.36 bc 0.19 b 4.92 bc1/ CP 722086 + N 1156 356 483 1995 a 1.15 abc 2.27 ab 0.97 a 25.7 a1/ SP 701143 + N 994 262 533 1789 a 1.04 abc 2.95 a 0.91 a 22.9 aSign. Est. ** ** ** ** CV % 28 30 44 25 6.2 10.1 4.6 33.5 1/ Variedades fertilizadas sin limitaciones de N. El rendimiento de biomasa total (peso seco) fue muy superior en las dos variedades que recibieron cantidades suficientes de nitrógeno en varias aplicaciones durante el desarrollo del cultivo, con producciones de 1995 gr/maceta para la CP 722086 y de 1789 para la SP 701143. Esta respuesta altamente significativa a la aplicación de Nitrógeno en términos de materia seca total evidencia la baja disponibilidad que hubo de este elemento en el sistema. Con relación a los tratamientos de interés, es decir el grupo de 13 variedades y el pasto Napier que recibieron solo mínimas cantidades de nitrógeno marcado en dosis de 15 ppm, con 10 % abundancia atómica, la producción de materia seca total varió de 483 gr/maceta en la variedad Mex 69290 a 1037 en la PGM 89968. Con las variedades CP 881508, CG965107, SP701143 y Pasto Napier también se obtuvo una producción relativamente buena, aunque estás últimas no difieren estadísticamente del resto de variedades. Se observó mucha variabilidad en el experimento el cual se refleja en los altos coeficientes de

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variación obtenidos. Esta variabilidad ocurre principalmente por el número desigual de rebrotes obtenidos en las macetas aún en la misma variedad, considerando que solo hubo una yema por maceta. Resultados con alta variabilidad se han reportado en otros experimentos similares en macetas con caña de azúcar, siendo aún más altos en segundo corte (Lima et al, 1986). La acumulación de mayor cantidad de materia seca en la variedad PGM 89968 (hasta más de 2 veces de lo que produjo la variedad Mex 69290) indica claramente la mayor capacidad de aquella de obtener nitrógeno del sistema lo cual es determinado por la mayor acumulación de nitrógeno en la biomasa aérea total (8.08 gr N/maceta) en comparación con lo acumulado en la variedad Mex 69290 (2.63 gr/maceta), bajo las mismas condiciones. En las hojas se acumuló la mayor parte de materia seca en todas las variedades de caña con excepción del pasto Napier que en promedio acumuló más en el tallo. La mayor acumulación de materia seca en las hojas en las variedades de caña de azúcar, no es lo que ocurre comúnmente en los campos de cultivo (Pérez et al. 1998). La restricción de espacio, debido al volumen limitado de suelo en las macetas y la edad temprana de corte (7 meses) posiblemente sean los factores que determinaron menor peso seco de tallos en el experimento. Los porcentajes de nitrógeno en las diferentes partes de la biomasa aérea fueron diferentes según las variedades, pero evidentemente en todos los casos fue muy superior el nitrógeno en aquellos tratamientos altamente fertilizados. Independientemente de las variedades, las mayores concentraciones de nitrógeno se encontraron en el cogollo. Esto es así porque en el cogollo hay mayor demanda de nitrógeno por la multiplicación celular intensa que allí ocurre en las fases de crecimiento y desarrollo.

La acumulación de nitrógeno en la planta (gr/maceta) es una relación directa entre el rendimiento de materia seca y la concentración de nitrógeno en la misma, de tal manera que aquí se refleja la misma tendencia de lo discutido para el rendimiento de biomasa. Cabe destacar que el nitrógeno acumulado en la variedad PGM 89968 fue estadísticamente diferente (y mayor) al acumulado en las variedades mexicanas Mex 68P23 y Mex 69290. Así mismo se observa que el Napier acumuló 6.72 gr de nitrógeno/maceta lo cual fue mayor que lo acumulado por el resto de variedades de caña. En la Tabla 2 se presentan las medias de los átomos en exceso de N marcado (ea 15N) de las tres secciones y el ponderado en toda la planta y la eficiencia de utilización del nitrógeno atmosférico en las distintas variedades.

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Tabla 4. Atomos en exceso de 15N en tres secciones y total en la planta y porcentaje de utilización de Nitrógeno (% NFATP) en variedades de caña de azúcar.

Átomos en exceso (ea) 15N Variedad

Hojas Cogollo Tallo Total Planta Utilización de Nde la atmósfera

(%)

CG 95107 0.392 0.419 0.489 0.418 a 22 abcCG 95125 0.585 0.477 0.423 0.506 a 6 bcCP 722086 0.494 0.348 0.426 0.444 a 17 bcCP 811384 0.410 0.314 0.351 0.359 a 33 abcCP 881508 0.371 0.263 0.494 0.322 ab 39 abcMex 68P23 0.496 0.404 0.481 0.448 a 16 bcMex 692902/ 0.615 0.489 0.462 0.536 a --- cNA 5642 0.533 0.463 0.436 0.461 a 14 bcPGM 89968 0.298 0.132 0.252 0.212 ab 60 abPR 752002 0.442 0.319 0.317 0.353 a 34 abcPR 872080 0.528 0.345 0.304 0.414 a 23 abcPennisetum 0.227 0.129 0.355 0.224 ab 58 abSP 792233 0.305 0.213 0.374 0.249 ab 53 abSP 701143 0.448 0.345 0.393 0.394 a 26 abcCP 722086 + N1/ 0.042 0.037 0.176 0.059 b --- SP 701143 + N1/ 0.045 0.044 0.158 0.065 b --- Sign. Est. ** * CV % 6.0 6.4 6.8 5.8 47 1/ Tratamientos que fueron fertilizados con N (altas dosis). 2/ Variedad seleccionada como testigo relativo “no fijador” en el ensayo. El más bajo porcentaje de ea 15N en la planta se obtuvo con la variedad PGM 89968 con 0.212 % ea 15N y a la vez fue la variedad con mayor rendimiento de materia seca y N acumulado en la parte aérea. El Pennisetum y la variedad SP 792233 presentan también altas diluciones, de 15N (0.224 y 0.249 % ea 15N, respectivamente). La alta dilución del N marcado en Pennisetum comparado con la mayoría de variedades evaluadas no se esperaba, ya que éste material fue incluido en el estudio como planta control (no fijadora). Las posibilidades de fijación biológica de nitrógeno en la variedad de Pennisetum purpureum utilizada en el estudio no debe descartarse, considerando la presencia de bacterias fijadoras de Nitrógeno en la planta. Específicamente en hojas tomadas de plantas de Pennisetum en el experimento, se aisló la bacteria Herbaspirillum sp reconocida como bacteria fijadora de Nitrógeno. Acetobacter diazotrophicus se reporta que ha sido aislada en raíces y partes aéreas de Pennisetum purpureum. Var Cameroon (Döbereiner, 1988, citado por Boddey, 1995) y Herbaspirillum seropedicae en raíces (Olivares et al. 1996). Aunque en los primeros meses del experimento, Pennisetum mostró síntomas marcados de deficiencia de Nitrógeno,

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como se muestra en la Figura 1, éste amarillamiento prácticamente desapareció después de los 4 meses.

FOTO 1

Figura 1. Variedades de caña con coloración verde normal y amarillamiento por

deficiencias de Nitrógeno. CENGICAÑA, 1999. La desaparición de los síntomas de deficiencia de N ocurrió semanas después de la aplicación de 15 ppm de Nitrógeno como sulfato de amonio a todas las macetas. La aplicación de una pequeña cantidad adicional de Nitrógeno se justificó por el pobre desarrollo mostrado por las plantas en el experimento. Fue interesante observar que Pennisetum no volvió a presentar síntomas marcados de deficiencia hacia el final de experimento como ocurrió en una gran mayoría de variedades de caña (CP 722086, Mex 68P23, Mex 69290, CG 95107 y CG 95125). Las evidencias indicadas, llevaron a la determinación de descartar a Pennisetum como planta control. Para la estimación del porcentaje de Nitrógeno que proviene de la atmósfera se seleccionó la variedad Mex 69290 como testigo relativo (no fijador) por presentar el más alto porcentaje de ea 15N (0.536 % ea 15N), en la planta total (Tabla 2). En la Figura 2 se muestra gráficamente la relación entre el rendimiento de Nitrógeno de la atmósfera en la planta y el Nitrógeno total acumulado en la misma. Es evidente el mayor rendimiento de nitrógeno de la atmósfera en la variedad PGM 89968 relacionado con una mayor acumulación de N en la biomasa aérea. La variedad Mex 69290 acumuló poco N y se asume que el total de N acumulado vino exclusivamente del suelo y el fertilizante aplicado, dado a que esa variedad fue considerada como planta control.

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0

2

4

6

8

10

CG

95107

CG

95125

CP

722086

CP

811384

CP

881508

Mex 68P

23

Mex 69290

NA

5642

PG

M 89968

PR

752002

PR

872080

Pennisetum

spp.

SP

792233

SP

701143

Variedades

N a

cum

ulad

o (g

/mac

eta)

N del suelo y f ertilizante N de la atmósfera

Figura 2. Rendimiento de N proveniente de la atmósfera con relación al N total

acumulado en la planta. Las variedades PGM 89968, SP 792233 y el pasto Napier (Pennisetum purpureum) presentaron los más altos porcentajes de utilización de N de la atmósfera con 60, 53 y 58 porciento de N vía FBN, respectivamente y fueron estadísticamente diferentes que la variedad de referencia (Mex 69290) (Tabla 2). El resto de variedades presentaron valores de utilización del nitrógeno de la atmósfera menores al 40 por ciento, en cantidades variables y no difieren estadísticamente del control. La variedad SP 701143 en el experimento mostró una mediana eficiencia en la FBN, aunque el inicio presentó un buen desarrollo y una coloración verde normal como se observa en la Figura 1. Los datos a la cosecha en esta variedad mostraron alta variabilidad en cuando a los rendimientos de biomasa. Es importante señalar que la semilla de esta variedad fue tomada de una colección de caña existente por años en el país. La variedad PGM 89968 se caracterizó por no presentar síntomas marcados de deficiencia de Nitrógeno en todo el desarrollo del experimento, en tanto que la SP 792233 tuvo un crecimiento lento y poco desarrollo al inicio y se recuperó después (cuatro meses en adelante), similar a lo que ocurrió con Pennisetum. Contrariamente, la SP 701143 y NA 5642 mostraron buen desarrollo y coloración verde normal al inicio, pero al final mostraron síntomas de deficiencia de Nitrógeno. Lo normal, pero que no fue medido, sería una mayor disponibilidad de Nitrógeno al inicio debido al manejo del suelo (secado, tamizado y homogenizado) y la aplicación del fertilizante marcado. Pero, por otro lado, posiblemente la adición de 150 gr de paja molida (alta relación Carbono: Nitrógeno) cuyo objetivo era minimizar las posibles pérdidas de N-NO3 mediante el proceso de inmovilización microbiológica del Nitrógeno mineral en las primeras etapas, pudo limitar seriamente la disponibilidad del Nitrógeno para las plantas al inicio del crecimiento. De cualquier

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manera, la disponibilidad del elemento fue mejorado con la adición de 15 ppm de N soluble al sistema a los 4 meses. Muestras de hojas de Pennisetum tomadas a mediados de octubre de 1998 mostraron porcentajes de 0.558 ea 15N, sin embargo al momento de la cosecha (enero de 1999) hubo dilución del N marcado presentando un menor enriquecimiento atómico (0.227 % ea 15N). Esta dilución indicaría que Pennisetum tomó mayor cantidad de N de fuentes no marcadas después de los 4 meses, posiblemente esta misma situación habría ocurrido en la SP 792233. 6.2 Aislamiento e identificación de bacterias fijadoras de N Tal como se ha indicado en las secciones precedentes, algunas variedades mostraron buen desarrollo y mantuvieron una coloración verde normal, por lo cual se consideró que estaban obteniendo N de una fuente diferente a la del suelo y el fertilizante. De esas variedades se obtuvo material de campo, se llevó al laboratorio y se sometió a procedimientos para aislamiento de bacterias fijadoras de N. Los géneros de bacterias fijadoras de nitrógeno aisladas e identificadas fueron: a. Azospirillum sp:

Se aisló de tallos de la variedad Na 56-42 en medio de cultivo NFb (Döbereiner, Baldani y Baldani, 1995). Se observaron bacilos levemente curvos con dimensiones promedio de 1.0 x 6.0 µ sobre medio de papa. Estas dimensiones están dentro de la amplitud descrita por Döbereiner, et al. para la especie A. brasilense (Döbereiner, Baldani y Baldani, 1995). Las colonias sobre medio NFb son grandes (5-10 mm de diámetro), de forma ovalada y a veces irregular, de color blanquecino. (Figura 3).

b. Herbaspirillum sp:

Se aisló de hojas de la variedad Na 56-42 y hojas de Pennisetum en medio de cultivo JNBb (Döbereiner, Baldani y Baldani, 1995). Se observaron bacilos levemente curvos con dimensiones promedio de 1.4 x 4.6 µ sobre medio de papa, las cuales están dentro de la amplitud descrita para la longitud celular más no para el ancho (Döbereiner, Baldani y Baldani, 1995). Se observaron células con movimiento vibroide y espiralado con desplazamiento rápido pero solamente cuando las células fueron extraídas de medio JNFb semi-sólido. Las colonias sobre medio sólido NFb con azul de bromotimol son pequeñas (1-3 mm de diámetro), redondas, de color blanquecino brillante con el centro azulado. (Figura 4).

c. Acetobacter sp: Se aisló de tallos de la variedad PGM 89968 en medio de cultivo LGI-P

(Döbereiner, Baldani y Baldani, 1995). Se observaron bacilos con dimensiones promedio de 0.4 x 1.8 µ sobre medio de papa, las cuales están por debajo de la

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amplitud descrita por Döbereiner, et al. 1995. Las colonias sobre medio LGI-P con extracto de levadura son pequeñas (1-5 mm de diámetro), redondas, de color naranja intenso (Figura 5).

De esas bacterias se enviaron muestras preservadas al laboratorio de bacteriología de EMBRAPA-Seropédica, Brasil a la Dra. Verónica Reis, para la verificación taxonómica. 7. DISCUSION GENERAL Las posibilidades de fijación biológica de nitrógeno en la PGM 89968 y SP 79233 y Pennisetum, según los resultados obtenidos por el método de la dilución Isotópica del 15N, estarían apoyadas por la presencia de bacterias fijadoras de N dentro de ellas. En efecto, se determinó la presencia de Acetobacter spp en tallos de la PGM 89968 y de Herbaspirillum spp en hojas de Pennisetum, en tanto que la variedad SP 792233 no fue muestreada. Acetobacter diazotrophicus y Herbaspirillum seropedicae han sido las especies encontradas en mayor número dentro de plantas de caña de azúcar en Brasil y se reportan como las principales responsables de la Fijación biológica de nitrógeno en este cultivo (Boddey, 1995; Döbereiner et al 1996). Aunque se aisló Herbaspirillum spp en hojas y Azospirillum spp en tallos de la variedad NA 5642, ésta presentó un bajo porcentaje de utilización de N de la atmósfera (15%). Al respecto Urquiaga et al 1992, indican que la presencia de bacterias fijadoras de nitrógeno en caña de azúcar, no necesariamente benefician de la misma manera a todas las variedades. Lo que quiere decir que posiblemente haya especificidad entre bacteria fijadora de N y el genotipo de caña, como sucede en muchas relaciones bióticas. Al parecer Herbaspirillum spp y Acetobacter spp, por ser bacterias diazotrópicas obligadas tienen más ventajas sobre otros diazotrópicos facultativos tales como Azospirillum y Azotobacter. Ellos colonizan el interior más que la superficie de las plantas, donde pueden beneficiarse de los sustratos de carbono y nutrientes sin mayor competencia (Döbereiner et al 1995). Los altos porcentajes de utilización del nitrógeno de la atmósfera determinadas en las variedades PGM 68968 (60%) y SP792233 (53%) serían normales; si se considera que se han encontrado porcentajes hasta del 80 porciento en algunas variedades de Brasil (Lima et al 1987; Urquiaga et al 1992). Por otro lado, es importante indicar que se han observado diferencias varietales marcadas en la eficiencia de la planta en la recuperación de nitrógeno de sulfato de amonio. Variedades que no respondieron a nitrógeno recuperaron 24 porciento en tanto que variedades que respondieron a nitrógeno recuperaron 45 porciento del N aplicado (Chang and Weng, 1983). También es posible que la presencia de bacterias diazotrópicas dentro de las plantas puedan beneficiar el crecimiento del cultivo debido a otros procesos no necesariamente por fijación biológica de N, incluyendo la producción de hormonas, aumento de la eficiencia de la absorción de N-mineral y otros (Bashan and Levanony, 1990; Boddey and Döbereiner 1988).

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20

La significativa respuesta de las variedades CP 722086 y SP 701143 a la aplicación de alta dósis de nitrógeno indican claramente que hubo baja disponibilidad de nitrógeno en las macetas; y demuestra que el sistema de fijación biológica de nitrógeno en las condiciones del experimento fue poco eficiente. El mismo se deduce por los rendimientos bajos que produjeron las variedades cuando se aplicó solo modestas cantidades de fertilizante nitrogenado. Resulta relevante que las variedades que en el experimento mostraron porcentajes de utilización de nitrógeno de la atmósfera (PGM 89968 y SP 792233) sean variedades con cierto potencial desde el punto de vista de sus características agroindustriales. La variedad PGM 89968 viene de cruces realizados en el Centro de Hibridación de Tapachula México y ha sido evaluada y seleccionada en las condiciones de Guatemala por el ingenio Pantaleón. Actualmente esta variedad es sembrada a nivel comercial por el ingenio Pantaleón en el 7 porciento del área y a nivel nacional en el 1.2 porciento, (Soto, Orozco y Ceballos 1,999). Con relación a la SP 792233 que es originaria de Brasil actualmente se encuentra en etapa de evaluación regional en la prueba del Programa de variedades de CENGICAÑA y se caracteriza principalmente por los altos tonelajes que produce. Es posible que algunas variedades a nivel comercial no hayan mostrado su potencial en relación a la fijación biológica de nitrógeno, por limitaciones de otros factores de manejo como el riego y nutrientes especialmente Fósforo, Potasio y Molibdeno.

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8. CONCLUSIONES • Los resultados obtenidos por el método de la dilución isotópica de 15N evidencia que las

variedades PGM 89968 y SP 792233 son capaces de obtener nitrógeno en cantidades considerables por la vía de la fijación biológica de la atmósfera.

• La magnitud de la utilización de nitrógeno proveniente de la atmósfera se estimó en 60

y 53 porciento en las variedades PGM 89968 y SP 722233, respectivamente, con relación a la variedad Mex 69290, que fue utilizada como testigo relativo no fijador.

• Se encontró que el pasto Napier (Pennisetum purpureum) utilizado en el experimento

tiene la capacidad de obtener parte de su nitrógeno de la atmósfera vía fijación biológica.

• Se aislaron e identificaron tres géneros de bacterias fijadoras de nitrógeno,

correspondientes a los géneros Azospirillum sp, en tallos de NA 5642; Herbaspirillum sp en hojas de NA 5642 y hojas de Pennisetum y Acetobacter sp en tallos de PGM 89968.

9. RECOMENDACIONES Se recomienda darle seguimiento a los resultados obtenidos en la presente investigación con las siguientes actividades: • Verificar a nivel de campo la respuesta de las variedades PGM 89968 y SP 792233, en

términos de su comportamiento bajo diferentes condiciones de disponibilidad de nitrógeno; asegurando condiciones óptimas de humedad del suelo y nutrientes, principalmente P, K y Mo.

• Verificar el comportamiento de la variedad SP 701143 sembrando material proveniente

directamente de los campos experimentales del CNPAB-EMBRAPA, Brasil. Este material esta actualmente en cuarentena en Guatemala.

• Investigar la respuesta de variedades de caña de azúcar a la aplicación de Molibdeno

con relación a la nutrición nitrogenada, vía fijación biológica. • Continuar con el aislamiento e identificación de bacterias fijadoras de nitrógeno en las

variedades que no fueron muestreadas en el experimento y otras que sean de interés. • Evaluar métodos de inoculación de bacterias fijadoras de nitrógeno en caña de azúcar

que sean eficientes y prácticas. • Investigar más sobre las posibilidades de fijación biológica de nitrógeno a nivel de

campo en otros cultivos, especialmente en pastos.

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10. BIBLIOGRAFIA 1. Bashan, Y. and Levanony, H. 1990. Current status of Azospirillum as a Challenge for

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11. RESÚMENES DE EJECUCIÓN FINANCIERA

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11.1 EJECUCION FINANCIERA DE RECURSOS SOLICITADOS AL FONACYT

Proyecto: Potencial de la Fijación Biológica de Nitrógeno en Variedades de

Caña de Azúcar Proyecto No.: 30 Monto Autorizado: Q.102,182.84

Concepto Autorizado Modificado Gastos Saldo Servicios Personales 10,800.00 10,800.00 10,800.00 0.00Capacitación 19,520.00 19,520.00 19,520.00Equipo Materiales y Suministros 47,949.00 47,949.00 43,867.30 4,081.70Mantenimiento y Reparaciones Documentación e información 1,500.00 1,500.00 1,500.00Publicaciones de resultados 4,500.00 4,500.00 * 4,500.00 0.00Registro de patentes Gastos no previstos 4,423.50 4,423.50 4,423.50Gastos administrativos del FONACYT 9,289.35 9,289.35 9,289.35 0.00Otros gastos transporte 4,200.00 4,200.00 17,503.20 -13,303.20

TOTAL…….. 102,182.84 102,182.84 85,959.85 16,222.00Gastado: 84% Saldo: 16%

* Nota: La cantidad de Q 4,500.00 en el rubro de publicaciones de resultados esta

pendiente de desembolso. El mismo servirá para la publicación "documento técnico" de los resultados del estudio.

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11.2 DESCRIPCION DE GASTOS DE CONTRAPARTIDA Proyecto: Potencial de la Fijación Biológica en Nitrógeno en Variedades de

Caña de Azúcar en Guatemala. Proyecto No.: 30 Monto: Q.88,250.00

Concepto Contra Partida (Q.) Servicios Personales 33,750.00Capacitación 22,800.00Equipo 18,900.00Materiales y Suministros 3,200.00Mantenimiento y Reparaciones -------Documentación e información -------Publicaciones de resultados -------Registro de patentes -------Otros Gastos 9,600.00Gastos no previstos -------Gastos administrativos -------

TOTAL…….. 88,250.00 *Aporte Financiero: Q.32,400.00 a cuenta de CENGICAÑA *Aporte en Especie: Q.55,850.00 a cuenta de CENGICAÑA, ICTA Y EMBRAPA.

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