ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ …i.vietnamdoc.net/data/file/2015/Thang07/01/gen-ma-hoa-cho-enzyme... · Hình 3.25. Kết quả cắt plasmid tái

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

LÊ PHƢƠNG DUNG

PHÂN LẬP PROMOTER CỦA GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMYL

ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN

GEN MANG ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMOYL CoA

REDUCTASE (CCR) TỪ CÂY BẠCH ĐÀN URO (EUCALYPTUS

UROPHYLLA S.T. BLAKE)

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2009


THAI NGUYEN UNIVERSITY

COLLEGE OF EDUCATION

LE PHUONG DUNG

CLONING PROMOTER REGION OF GENE ENCODING CINNAMYL

ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) AND CONSTRUCTING PLANT

TRANSFORMATION VECTOR CARRYING CINNAMOYL CoA

REDUCTASE GENE FROM EUCALYPTUS UROPHYLLA S.T. BLAKE

Speciality: Genetics

Code: 60.42.70

MASTER’S THESIS SUMMARY

Supervisor: Dr. Nguyen Huu Cuong

Thai Nguyen, 2009


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả

nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chƣa có ai công bố trong

một công trình nào khác.

Tác giả

Lê Phƣơng Dung


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................

1.1. Tổng quan về cây bạch đàn .........................................................................

1.2. Tình hình trồng bạch đàn ở Việt Nam ........................................................

1.3. Tình hình sinh trƣởng của cây bạch đàn ở Việt Nam …………………….

1.4. Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật .....................................

1.4.1. Lignin ..................................................................................................

1.4.2. Chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật .............................................

1.4.3. Giới thiệu về gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase

(CAD)

1.5. Tổng quan về promoter ...............................................................................

1.5.1. Mô hình điều hoà biểu hiện gen ở sinh vật nhân chuẩn. .......................

1.5.2. Cấu trúc và chức năng của promoter ....................................................

1.5.3. Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học ...........................

1.5.4. Promoter điểu khiển hoạt động gen ở tầng xylem Error! Bookmark

not defined.

1.5. Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................

2.1. Vật liệu nghiên cứu .....................................................................................

2.1.1. Vật liệu: ...............................................................................................

2.1.2. Hoá chất: ..............................................................................................

2.1.3. Máy móc, thiết bị .................................................................................

2.1.4. Địa điểm nghiên cứu

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................


2.2.1. Phƣơng pháp tìm kiếm thông tin về trình tự gen mã hóa cho enzyme

CAD trên ngân hàng gen quốc tế .......................................................................

2.2.2. Thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng gen/promoter. ....................................

2.2.3. Tách chiết và tinh sạch DNA – RNA từ mô gỗ ....................................

2.3.4. Tổng hợp cDNA

2.2.5. Khuếch đại đoạn promoter EuCAD và đoạn gen CCR bằng phản ứng

PCR .....

2.2.6. Phƣơng pháp tách dòng .......................................................................

2.2.7. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) Error!

Bookmark not defined.

2.2.8. Phƣơng pháp xác định trình tự của gen. ...............................................

2.2.9. Phƣơng pháp Gateway. ........................................................................

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................

3.1. Tách chiết DNA bạch đàn...........................................................................

3.2. Khuếch đại promoter bằng PCR .................................................................

3.3. Tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter EuCAD ..............................

3.3.1. Tinh sạch sản phẩm PCR và tạo vector tái tổ hợp ....................................

3.3.2. Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5. ................

3.3.3. Chọn dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp. .....................................

3.3.4. Tách chiết plasmid tái tổ hợp ...................................................................

3.3.5. Kết quả đọc trình tự nucleotide của hai đoạn promoter CAD1 và CAD2....

3.3.6. Phân tích các nhân tố điều hòa dạng cis có mặt trong trình tự của

promoter gen CAD tách dòng đƣợc từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T

Blake..... ............................................................................................................

3.3.7. Kết quả đăng tải trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl

alcohol dehydrogenase tại ngân hàng gen quốc tế NCBI ...................................

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………….

TÀI LIỆU THAM KHẢO



DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm tách chiết … 19

Bảng2.2. Thành phần dung dịch đệm tách chiết ... 21

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng khử DNA ... 22

Bảng 2.4A. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ... 23

Bảng 2.4B. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ... 23

Bảng 2.4C. Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA ... 24

Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR ... 24

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng ..26

Bảng 2.7. Thành phần hoá chất tách plasmid .. 28

Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt ... 29

Bảng 2.9. Thành phần phản ứng colony-PCR ...29

Bảng 2.10. Thành phần phản ứng ghép nối ... 31

Bảng 2.11. Thành phàn phản ứng cắt plasmid pENTR/CCR ... 32

Bảng 2.12. Thành phần phản ứng LR ... 33

Bảng 2.13. Thành phần phản ứng cắt plasmid pBENDER/CCR .. 34

Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của các mồi ... 35

Bảng 3.2. Trình tự và các thông số cần thiết của hai mồi CCR entr-F, CCR-R ...

52

Bảng 3.3. Kích thƣớc các phân đoạn thu đƣợc khi cắt plasmid tái tổ hợp

pBENDER/CCR bằng XhoI ... 64


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin …………………………………... 9

Hình 1.2: Sinh tổng hợp lignin trong thực vật .................................................. 10

Hình 1.3.Lát cắt thân cây chuyển gen CCR.H (A) và cây không chuyển gen (B)..15

Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ......................................................... 25

Hình 2.2. Sơ đồ vector pBT ..................................................................................... 26

Hình 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR ........................................... 30

Hình 2.4. Sơ đồ vector pENTRTM

/D-TOPO

......................................................... 31

Hình 2.5. Sơ đồ vector pBENDER .................................................................... 32

Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm tách DNA từ gỗ bạch đàn ....................... 34

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 .................... 35

Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 .................... 36

Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 sau tinh sạch.....37

Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 sau tinh sạch .37

Hình 3.6: Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến .................... 39

Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc .....41

Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc .... 41

Hình 3.9: Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E.coli DH5α ……. 42

Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter

CAD1 ................................................................................................................ 43


CAD2 ................................................................................................................. 44

Hình 3.12: Kết quả điện di kiểm tra phản ứng nối hai đoạn promoter CAD1 và

CAD2 ................................................................................................................. 45

Hình 3.13: Kết quả so sánh trình tự DNA với gen CAD của E. gunnii ............ 46

Hình 3.14: Kết quả phân tích promoter của gen CAD ……………………….. 48

Hình 3.15: Kết quả điện di RNA tổng số trên gel agarose 1% .............................. 51


Hình 3.16: Kết quả điện di khử DNA ................................................................ 51

Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR .......................................... 53

Hình 3.18. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1% .... 54

Hình 3.19. Kết quả dựng cây phát sinh chủng loại của gen CCR ..................... 56

Hình 3.20. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả

biến E.Coli DH5 ...... 56

Hình 3.21. Kết quả điện di plasmid pENTR/CCR .... 58

Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen CCR ...

59

Hình 3.23. Kết quả colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu CCR entr F và CCR R

.... 61

Hình 3.24. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR .... 61

Hình 3.25. Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR bằng enzyme XhoI .. 62


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hữu Cường – Phòng

Công nghệ tế bào thực vật – Viện công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ

bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS. TS. Lê Trần Bình, TS. Chu

Hoàng Hà - Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và đóng góp những ý kiến

quý báu cho tôi trong thời gian thực tập tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật,

Viện Công nghệ sinh học.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm Khoa Sinh – KTNN

cùng toàn thể cán bộ nhân viên trong khoa đã tạo mọi điều kiện và tận tình giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Hoàng Hà và tập thể cán bộ Phòng Công

nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành

luận văn này.

Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, động

viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận văn

này.

Thái Nguyên, ngày 09 tháng 9 năm 2009

Học viên

Lê Phương Dung


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

bp base pair

cDNA Complementary DNA

DNA Deoxyribonucleic Acid

DEPC Diethyl pyrocarbonate

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

E.coli Escherichia coli

EDTA Ethylen dimine tetra acetic acid

g/l Gam/lít

IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside

Kb Kilobase

kDa KiloDalton

LB Luria Bertani

mg/l miligam/lít

OD Optical density

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonucleic Acid

RNase Ribonuclease

SDS Sodium dodecyl sulphate

TAE Tris - Acetic acide - EDTA

Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase

TE Tris – EDTA

v/p vòng/phút

X-gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl--D-galactosidase

CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide



TÀI LIỆU TRONG NƯỚC

1. Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000), Thực vật rừng. NXB Nông nghiệp, Hà

Nội, tr. 311- 317.

2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005). Sinh học phân tử. Nxb Giáo Dục, tr101-112.

3. Trần Duy Hưng, Đỗ Ngọc, Nguyễn Thị Chương (1991), Cây rừng. Trường

công nhân Kỹ thuật Lâm nghiệp 4, Bộ Lâm nghiệp, tr. 96 – 100.

4. Nguyễn Dương Tài (1994). Bước đầu khảo nghiệm xuất xứ bạch đàn

Eucalyptus urophylla S.T. Blake tại vùng nguyên liệu giấy trung tâm Bắc Bộ,

Việt Nam. Luận án PTS khoa học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp

Việt Nam.

5. Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005), Giáo trình Sinh lý thực

vật. NXB Hà Nội, tr 214 – 221.

6. Hà Văn Tuế (1993), Nghiên cứu cấu trúc và năng suất của một số quần xã

rừng trồng nguyên liệu giấy tại vùng trung du Vĩnh Phú. Tóm tắt luận án tiến

sĩ sinh học. Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Hà Nội, 24trang.

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI

7. A. Baghdady, A.-S. Blervacq, L. Jouanin, J. Grima-Pettenati, P. Sivadon, S.

Hawkins (2006), Eucalyptus gunnii CCR and CAD2 promoters are active in

lignifying cells during primary and secondary xylem formation in

Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry 44, pp. 674–683.

8. Aldwin M. Anterola, Norman G. Lewis (2002), Trends in lignin

modification: a comprehensive analysis of the effects of genetic

manipulations/mutations on lignification and vascular integrity.

Phytochemistry 61 (2002) 221–294.

9. Artem Evdokimov, DNA cloning for protein expression using Gateway©

technology.


10. Barakat A., Bagniewska-Zadworna A., Choi A., Plakkat U., DiLoreto

D.S., Yellanki P., Carlson J.E. (2009), The cinnamyl alcohol

dehydrogenase gene family in Populus: phylogeny, organization, and

expression. BMC Plant Biology. 9(26): 1-15.

11. Chiang, V. L., (2006). Understanding Gene Function and Control in

Lignin Formation in Wood. NABC Report.

12. Ellen McCrady (1991), The Nature of Lignin. Volume 4, number 4.

13. Feuillet C., Lauvergeat V., Deswarte C., Pilate G., Boudet A., and Grima

P.J. (1995), Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol

dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants. Plant Molecular

Biology. 4(27): 651-667.

14. Fiona S. Poke1, René E. Vaillancourt, Robert C. Elliott and James B.

Reid (2003), Sequence variation in two lignin biosynthesis genes,

cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase 2

(CAD2). Molecular Breeding 12: 107–118, 2003.

15. Gawel N. J. and Jarret R. L. (1991), A modified CTAB DNA extraction

procedure for Musa and Ipomoea. Plant Molecular Biology Reporter.

3(9): 262-266.

16. Goicoechea M., Lacombe E., Legay S., Mihaljevic S., Rech P., Jauneau

A., Lapierre C., Pollet B., Verhaegen D., Chaubet G.N., Grima P.J.

(2005), EgMYB2, a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem,

regulates secondary cell wall formation and lignin biosynthesis. The Plant

Journal. 43(4): 553-567.

17. Hai L., Qingyin Z., Yan L.Z., Shasheng W. and Xiangning J. (2003),

Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in

transgenic tobacco. Plant Growth Regulation. 41: 279-286.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Goicoechea%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Lacombe%20E%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Legay%20S%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Mihaljevic%20S%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Rech%20P%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Jauneau%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Lapierre%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Pollet%20B%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Verhaegen%20D%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Chaubet-Gigot%20N%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Grima-Pettenati%20J%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus


18. Hawkins S., Samaj J., Lauvergeat V., Boudet A., and Pettenati J. C.

(1997), Cinnamyl alcohol dehydrogenase: Identification of new sites of

promoter activity in transgenic Poplar. Plant Physiology. 113: 321-325.

19. Hu W.J., Harding S.A., Lung J., Popko J.L., Ralph J., Stokke D.D., Tsai

C.J. & Chiang V.L. (1999), Repression of lignin biosynthesis promotes

cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature

Biotechnology. 17: 808-812.

20. Johan Wadenback, Sara von Arnold, Ulrika Egertsdotter, Michael H.

Walter, Jacqueline Grima-Pettenati, Deborah Goffner, Goran Gellerstedt,

Terry Gullion, David Clapham (2008), Lignin biosynthesis in transgenic

Norway spruce plants harboring an antisense construct for cinnamoyl

CoA reductase (CCR). Transgenic Res (2008) 17:379–392

21. Kim S.J., Kim M.R., Bedgar D.L., Moinuddin S.G., Cardenas C.L.,

Davin L.B., Kang C., Lewis N.G. (2004), Functional reclassification of

the putative cinnamyl alcohol dehydrogenase multigene family in

Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences.

101:1455-1460.

22. Simon Hawkins, Jozef Samaj, Virginie Lauvergeat, Alain Boudet, and

Jacqueline Crima-Pettenati (1997), Cinnamyl Alcoholl Dehydrogenase:

Identification of New Sites of Promoter Activity in transgenic Poplar.

Plant Physiol 113: 321-325.

23. Lauvergeat V., Rech P., Jauneau A., Guez C., Coutos T.P. and Grima P.J.

(2002), The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii

cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among

woody and herbaceous plant species. Plant molecular biology. 50(3): 497-

509.

24. Matthieu Chabannes, Abdellah Barakate, Catherine Lapierre, Jane M.

Marita, John Ralph, Michel Pean, SaoEda Danoun1, Claire Halpin,

Jacqueline Grima-Pettenati and Alain Michel Boudet1 (2001), Strong

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=journals&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=1201&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Journals.Journals_ResultsPanel.Journals_RVDocSum


decrease in lignin content without significant alteration of plant

development is induced by simultaneous down-regulation of cinnamoyl

CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) in

tobacco plants. The Plant Journal (2001) 28(3), 257±270.

25. pENTR™ Directional TOPO® Cloning Kits (6 April 2006). Invitrogen

26. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989). Molecular Cloning: A

Laboratory Manual. Vol. 1, 2, and 3. Cold Spring Harbor Laboratory

Press, Cold Spring Harbor, New York.





28. Tsutomu Kawasaki, Hisako Koita, Tomoyuki Nakatsubo, Kana Hasegawa,

Kenichi Wakabayashi, Hiroki Takahashi, Kenji Umemura, Toshiaki

Umezawa, and Ko Shimamoto (2005), Cinnamoyl-CoA reductase, a key

enzyme in lignin biosynthesis, is an effector of small GTPase Rac in

defense signaling in rice. PNAS vol. 103 no. 1, pg. 230–235.

28. Whettena R. and Sederoffa R. (1995), Lignin Biosynthesis. The Plant Cell.

7: 1001-1013.

29. Xu Q., Wen X.P., and Deng X.X. (2004), A Simple Protocol for Isolating

Genomic DNA from Chestnut Rose (Rosa roxburghii Tratt) for RFLP and

PCR Analyses. Plant Molecular Biology Reporter. 22: 301a-301g.

TÀI LIỆU WEB

30. http://www.ncbi.nlm.nih.gov

31. http://www.community.h2vn.com/index.php?action=printpage%3Btopi

c=061.0.

32. http://vi.wikipedia.org/wiki/Xylem.

33. http://www.ebi.ac.uk/embl/Submission/webin.html.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

http://www.community.h2vn.com/index.php?action=printpage%3Btopic=061.0


http://vi.wikipedia.org/wiki/Xylem


Phụ lục 1. Kết quả phân tích độ tương đồng giữa 26 loài thực vật

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

1 Zea_mays

2 Arabidopsis_thaliana 0.49

3 Lycopersicon_esculentum 0.52 0.38

4 Hordeum_vulgare 0.17 0.42 0.49

5 Triticum_aestivum 0.18 0.43 0.51 0.05

6 Vitis_vinifera 1.00 0.94 0.86 0.91 0.96

7 Solanum_tuberosum 0.46 0.36 0.19 0.45 0.49 0.94

8 Saccharum_officinarum 0.07 0.48 0.53 0.15 0.19 0.98 0.47

9 Populus_trichocarpa 0.39 0.34 0.28 0.36 0.38 0.87 0.27 0.39

10 Prunus_persica 0.41 0.35 0.30 0.39 0.40 0.80 0.24 0.42 0.21

11 Capsicum_annuum 0.43 0.36 0.19 0.40 0.43 0.88 0.09 0.43 0.27 0.25

12 Fragaria_ananassa 0.39 0.34 0.32 0.38 0.41 0.89 0.25 0.41 0.25 0.16 0.25

13 Eucalyptus_globulus 1.34 1.31 1.24 1.25 1.24 1.63 1.28 1.40 1.28 1.33 1.22 1.33

14 Linum_album 0.39 0.36 0.33 0.39 0.41 0.87 0.31 0.41 0.27 0.29 0.30 0.28 1.27

15 Eucalyptus_gunnii 0.37 0.38 0.36 0.35 0.36 0.81 0.32 0.38 0.25 0.25 0.30 0.27 1.41 0.31

16 Eucalyptus_nudicaulis 1.34 1.29 1.24 1.23 1.24 1.61 1.28 1.38 1.25 1.35 1.21 1.34 0.03 1.28 1.41

17 Eucalyptus_chloroclada 1.37 1.32 1.25 1.26 1.25 1.63 1.28 1.40 1.29 1.38 1.21 1.37 0.04 1.31 1.44 0.02

18 Eucalyptus_brassiana 1.34 1.30 1.23 1.23 1.23 1.63 1.28 1.37 1.27 1.34 1.20 1.35 0.03 1.27 1.40 0.01 0.01

19 Eucalyptus_cordata 1.33 1.29 1.23 1.23 1.23 1.60 1.27 1.38 1.27 1.32 1.20 1.31 0.01 1.26 1.40 0.03 0.03 0.02

20 Eucalyptus_vicina 1.35 1.30 1.24 1.24 1.24 1.59 1.27 1.38 1.26 1.35 1.20 1.34 0.03 1.29 1.41 0.01 0.01 0.01 0.03

21 Eucalyptus_saligna 0.39 0.38 0.36 0.36 0.37 0.83 0.32 0.40 0.25 0.25 0.30 0.26 1.36 0.31 0.02 1.36 1.39 1.35 1.35 1.36

22 Eucalyptus_blakelyi 1.36 1.31 1.25 1.25 1.26 1.61 1.28 1.39 1.27 1.37 1.21 1.35 0.04 1.30 1.42 0.01 0.02 0.01 0.03 0.00 1.37

23 Eucalyptus_alba 1.32 1.29 1.23 1.21 1.22 1.67 1.31 1.36 1.27 1.34 1.23 1.32 0.03 1.28 1.40 0.02 0.03 0.02 0.03 0.02 1.35 0.03

24 Eucalyptus_punctata 1.32 1.26 1.22 1.21 1.21 1.57 1.26 1.35 1.24 1.32 1.20 1.30 0.03 1.25 1.38 0.03 0.03 0.02 0.02 0.03 1.33 0.03 0.02

25 Eucalyptus_grandis 1.36 1.29 1.23 1.23 1.25 1.59 1.28 1.39 1.28 1.35 1.21 1.34 0.03 1.27 1.39 0.01 0.02 0.02 0.03 0.02 1.35 0.02 0.02 0.02

26 Eucalyptus_urophylla 0.39 0.38 0.35 0.36 0.37 0.81 0.32 0.39 0.25 0.25 0.30 0.27 1.36 0.31 0.02 1.37 1.39 1.35 1.36 1.37 0.02 1.38 1.35 1.34 1.35


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 1

MỞ ĐẦU

1.1. Lý do chọn đề tài

Lignin là một trong hai loại polymer sinh học phổ biến trong cây, sau

cellulose. Nó chiếm khoảng 30% lượng cacbon hữu cơ trong sinh quyển và

gần 35% lượng vật chất khô trong gỗ của các loài thực vật. Quá trình tổng

hợp lignin là một trong những cách thức thích nghi của thực vật trong quá

trình tiến hóa khi thực vật thay đổi môi trường sống từ nước lên cạn. Lignin

giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc thành tế bào và thân.

Thêm vào đó lignin tham gia vào quá trình vận chuyển nước, các chất dinh

dưỡng thông qua hệ thống bao mạch và giữ vai trò quan trọng trong việc đảm

bảo sự chắc chắn của cây trong không gian, cũng như bảo vệ cây khỏi các

nhân tố gây bệnh [7]. Hàm lượng lignin cao trong gỗ giúp gỗ bền. Bởi vậy, nó

là nguyên liệu thô tốt cho nhiều ứng dụng (trong xây dựng, nội thất,...) và là

một loại nhiên liệu hoàn hảo.

Tuy nhiên trong một số lĩnh vực như sản xuất sợi, sản xuất giấy thì hàm

lượng lignin cao lại là một trở ngại. Việc loại bỏ lignin trong quy trình sản xuất

bột gỗ bằng cách xử lý hóa học là một trong những biện pháp tốn kém đối với

điều kiện kinh tế và môi trường nước ta hiện nay [27]. Vậy làm thế nào để điều

chỉnh được hàm lượng lignin trong cây theo hướng có lợi cho bản thân sinh vật

và con người, như: tăng hàm lượng lignin trong cây trồng làm nhiên liệu, trong

xây dựng, trong cây nông nghiệp (cây lúa – chống đổ) hay giảm hàm lượng

lignin trong cây bạch đàn nhằm tạo thuận lợi cho quá trình sản xuất giấy.

Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu (chủ yếu là ở nước ngoài) về lignin,

quá trình sinh tổng hợp lignin, các enzyme tham gia vào quá trình này như

enzyme cinnamoyl coenzymeA reductase (CCR) và enzyme cinnamyl alcohol

dehydrogenase (CAD), nhưng đa phần là trên các cây mô hình (Arabidopsis

thaliana, Populus trichocarpa) [7],[10],[18].


Nhằm mục đích điều khiển sự biểu hiện của một số enzyme tham gia

vào quá trình sinh tổng hợp lignin ở mô phân sinh gỗ cho một số đối tượng cây

lâm nghiệp bằng phương pháp chuyển gen, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân

lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase

(CAD) và thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa cho enzyme

cinnamoyl coA reductase (CCR) từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla

S.T. Blake)” làm vật liệu để thiết kế các cấu trúc vector chuyển gen ở thực vật.

1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

1.2.1. Mục tiêu

Tách dòng, phân tích trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme

cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) và thiết kế vector chuyển gen mang

đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coA reductase (CCR) từ cây bạch đàn

urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake).

1.2.2. Nội dung nghiên cứu

- Tập hợp thông tin về trình tự nucleotide đoạn promoter của gen mã hóa

cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) và trình tự nucleotide

đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coA dehydrogenase (CCR) đã công

bố trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để thiết kế cặp mồi khuếch đại đoạn gen

này từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake).

- Tách dòng, phân tích trình tự đoạn promoter của gen mã hóa cho

enzyme CAD và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã hóa cho

enzyme CCR từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake).


CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây bạch đàn

Chi Bạch đàn Eucalyptus thuộc họ Sim Myrtaceae có hơn 700 loài, hiện

đã được trồng ở hơn 30 nước trên thế giới từ vĩ độ 580 Bắc đến 46

0 Nam. Bạch

đàn mọc tự nhiên và có nguồn gốc từ châu Úc, chúng có thể sinh trưởng dưới

một phổ sinh thái rộng như tập trung ở các vùng thấp ven biển, nhưng cũng có

thể mọc ở những vùng cao (2000m so với mặt biển) hay vùng khô cạn (sa mạc

hoặc bán sa mạc) [4].

Cây bạch đàn thuộc loại đại mộc, cao 25 – 50m, có cây cao tới 100m.

Đường kính thường đạt 120-180 cm. Vỏ ngoài màu xám trắng hoặc nâu, đỏ

nâu, xám xanh…, bong mảng hoặc nứt dọc, vỏ thân chứa tinh dầu

Eucalyptone thơm mùi dầu tràm. Lá đơn, khi cây còn non lá thường mọc đối,

sau đó có dạng lá đơn mọc cách, không có lá kèm; mép lá nguyên, phiến lá

dày, gân phụ thường nối với nhau ở đầu gân thành một đường song song với

mép lá. Hoa lưỡng tính, nụ hình thoi. Khi hoa nở nửa trên hình chóp nón rụng

đi, để lộ nhị và nhụy. Nhị nhỏ, rời nhau, rất nhiều, màu trắng vàng. Nhuỵ có

bầu trung, một phần gắn liền với ống đài, một phần nhô lên. Quả khô, khi

chín nứt ở đỉnh. Hạt nhiều, thường có góc cạnh, rất nhỏ.

Ngày nay bạch đàn là một trong những loài cây gỗ lâm nghiệp rất quan

trọng, được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới đặc biệt là ở các

vùng nhiệt đới và ôn đới, giữa các vĩ độ 45oN và 40

oB như: Braxin, Trung

Quốc, Ấn Độ, … với diện tích canh tác khoảng 12 triệu hecta [4]. Ở Việt Nam

đã gây trồng bạch đàn từ những năm 1930 ở cả hai miền Nam, Bắc. Hiện nay

có 10 loài bạch đàn đang được trồng phổ biến là:


+ Bạch đàn urô Eucalyptus urophylla, thích hợp với vùng đất đồi

trung du.

+ Bạch đàn trắng Eucalyptus camaldulensis, thích hợp với vùng

đồng bằng.

+ Bạch đàn trắng Eucalyptus alba, thích hợp với vùng gần biển.

+ Bạch đàn lá nhỏ Eucalyptus tereticornis, thích hợp với vùng đồi Thừa

Thiên Huế.

+ Bạch đàn liễu Eucalyptus exserta, thích hợp với vùng cao miền

Bắc Việt Nam.

+ Bạch đàn chanh Eucalyptus citriodora, thấp, lá có chứa tinh

dầu mùi sả.

+ Bạch đàn lá bầu Eucalyptus globules, thích hợp với vùng cao

nguyên.

+ Bạch đàn to Eucalyptus grandis, thích hợp với vùng đất phù sa.

+ Bạch đàn ướt Eucalyptus saligna, thích hợp với vùng cao nguyên Đà Lạt.

+ Bạch đàn Mai đen Eucalyptus maidenii, thích hợp với vùng cao Lâm Đồng.

Cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake), vật liệu mà chúng

tôi chọn nghiên cứu là loài cây gỗ lớn, sinh trưởng nhanh, chiều cao có thể đạt

tới 20-25m, đường kính có thể đạt tới 100cm. Thân thẳng, vỏ trơn nhẵn với

nhiều vết đốm màu trắng hoặc hồng. Tán hình tháp, phân cành thấp. Cành và

lá non có màu đỏ tía. Lá đơn mọc cách hình ngọn giáo dài, phiến lá dài 16-

19cm, rộng 3,5-4cm, cuống lá mảnh dài 1,5cm, hơi lõm ở mặt trên. Hoa tự

tán, thường gồm 4-7 hoa trong một cụm, cuống hoa rất ngắn. Quả nang nứt ở

đỉnh, nhiều hạt nhỏ. Mùa quả chín từ tháng 4-5.

Bạch đàn urô là cây ưa sáng, mọc nhanh, cho năng suất cao. Cây ưa đất

ẩm sâu, nhưng cũng có thể mọc được trên đất đồi trọc khô, nghèo dinh dưỡng.

Bạch đàn urô sinh trưởng ở độ cao 1200m so với mực nước biển, với nhiệt độ


trung bình năm khoảng 24-280C và lượng mưa trung bình từ 2000-

3000mm/năm. Trên vùng đất đồi trung du Phú Thọ, bạch đàn urô 4 tuổi có

chiều cao trung bình là 10,34m, đường kính trung bình của thân đạt 9,54cm

và sinh khối gỗ đạt 34.108kg/ha [6].

Cũng như nhiều loài bạch đàn khác, bạch đàn urô cho gỗ cứng làm

nguyên liệu sản xuất giấy, đóng đồ dùng thông thường… Ngoài ra, nó còn

được dùng làm cực truyền điện, các cột trụ lâu dài và cột xây dựng, trong

kết cấu nặng hoặc nhẹ, đồ mỹ nghệ và làm gỗ dán boong tàu. Nó có vai trò

bảo vệ trên các bờ sông và tạo bóng mát. Vì các loài này không có nhu cầu

thổ nhưỡng lớn, nên nó thích hợp cho việc tái sinh rừng ở cả đất bị ngập

nước và đất khô của vùng nhiệt đới thấp.

Với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, hiệu suất

cao và tin sinh học, nhiều nghiên cứu về bộ gen của các loài cây đã được giải

mã thành công, như cây (Arabidopsis thaliana) và đặc biệt trong số này bao

gồm cả những loài cây quan trọng trong nông nghiệp như lúa (Oryza sativa)

và trong lâm nghiệp như cây dương (Populus trichocarpa). Thông tin về bộ

gen của những loài cây này đã trở thành những công cụ rất có giá trị trong các

nghiên cứu về chức năng và sự tương tác giữa các gen, những nghiên cứu về

tiến hoá và sự phân bố gen trong các quần thể thực vật. Thực vật hạt kín được

cho là có nhiều điểm tương đồng về bộ gene, các quá trình trao đổi chất với

các loài cây mô hình, chính vì vậy mà những nghiên cứu trên các loài cây này

là những thông tin và công cụ quan trọng cho các loài cây thuộc họ khác, ví

dụ chi Bạch đàn (Eucalyptus) của họ Sim (Myrtaceae) [10].

Những nghiên cứu về gen trên cây bạch đàn bao gồm nhiều khía cạnh

về cấu trúc, chức năng và thành phần trong trình tự của bộ gen. Đặc điểm của

bộ gen, bao gồm trong nhân và ngoài nhân, được xác định dựa trên việc tạo ra

bản đồ liên kết các vị trí chỉ thị phân tử và các locus tính trạng số lượng.


Những nghiên cứu về chức năng của gen chủ yếu tập trung vào việc tách dòng

và xác định các gen mới, phân tích sự biểu hiện của gen, định vị gen trên các

locus quy định tính trạng số lượng, mối liên kết giữa tính đa hình DNA và

hình thái cá thể, và cuối cùng là tạo ra các dòng cây chuyển gen mang các tính

trạng mong muốn.

1.2. Tình hình trồng bạch đàn ở Việt Nam

Bạch đàn được nhập vào Việt Nam từ những năm 1930, tuy nhiên đến

đầu những năm 1960 mới được phát triển mở rộng và sau đó được xem như là

một trong những loài cây chủ lực để phủ xanh đất trống đồi trọc và trồng cây

phân tán. Tính đến tháng 12/1999, cả nước đã trồng được 349.043 ha rừng

bạch đàn. Trong đó: rừng trồng bạch đàn thuần loài là 249.324 ha và rừng

trồng hỗn giao với các loài cây khác là 69.719 ha. Ở vùng Đông Bắc có diện

tích trồng bạch đàn lớn nhất (88.341ha), tiếp theo là duyên hải Nam Trung Bộ

(77.538 ha), Bắc Trung Bộ (67.910 ha), đồng bằng sông Cửu Long (58.643

ha), ít nhất là ở vùng Tây Nguyên (10.556 ha). Theo số liệu thống kê của Ban

chỉ đạo kiểm kê rừng Trung ương (2001), thì diện tích rừng trồng các loài

bạch đàn hiện nay lớn nhất so với các loài cây khác, đạt 349.043 ha và chiếm

24.03% so với tổng diện tích rừng trồng của cả nước (1.452.470 ha).

Vào những năm 1970, diện tích rừng trồng bạch đàn mới chỉ chiếm

khoảng 10% so với tổng diện tích rừng trồng của toàn quốc. Giai đoạn 1986-

1992 diện tích rừng trồng bạch đàn cũng chỉ chiếm khoảng 11.75%. Nhưng

đến hết năm 1999, diện tích rừng trồng bạch đàn đã tăng lên 24.03%. Từ năm

2000 đến 2003 tuy chưa tập hợp được số liệu kiểm kê cho từng loài cây, song

kết quả điều tra khảo sát cục bộ ở một số địa phương đến tháng 9 năm 2003

cho thấy diện tích trồng bạch đàn tăng khá nhanh trong giai đoạn vừa qua. Cụ

thể ở Công ty Lâm nghiệp Đông Bắc đã trồng được 4.400 ha, chủ yếu là bạch

đàn uro (E. urophylla). Thực hiện dự án 661 từ 1999 đến 2003, tỉnh Phú Thọ

đã trồng được 6.900 ha, trong đó phần lớn diện tích là bạch đàn uro và một số


loài keo. Lâm trường sông Hậu (Cần Thơ) đã trồng được 5 triệu cây bạch đàn

(Eucalyptus – W5) phân tán trên các bờ kênh, tương đương với trên 3000 ha

(mật độ trồng quy đổi là 1660 cây/ha).

Như vậy, có thể thấy rừng trồng bạch đàn đã chiếm một tỷ lệ khá lớn

trong diện tích rừng trồng của cả nước, đồng thời diện tích trồng bạch đàn đã

tăng khá nhanh trong giai đoạn từ 1993-1999 và tiếp tục phát triển với tốc độ

nhanh từ năm 2000 trở lại đây. Điều đó cho thấy vai trò của cây bạch đàn rất

quan trọng trong cơ cấu cây trồng rừng ở nước ta trong những năm qua, đồng

thời loài cây này cũng là nguồn nguyên liệu chủ yếu phục vụ ngành công

nghiệp giấy sợi và ván nhân tạo, đóng góp không nhỏ vào sự phát triển của

nền kinh tế quốc dân.

1.3. Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật

1.3.1. Lignin

Lignin được tìm thấy trong hầu hết những cây có mạch, chúng nằm xen

kẽ giữa các tế bào, bên trong tế bào và trong thành tế bào. Nó có chức năng

điều khiển sự vận chuyển các chất trong thực vật (một phần tham gia vào việc

giữ vững cho thành tế bào, mặt khác tham gia điều chỉnh sự vận chuyển của

chất lỏng), cho phép cây lớn lên và cạnh tranh để giành ánh sáng mặt trời.

Trong thiên nhiên, lignin có khả năng chống chịu lại sự thoái hóa và

được gắn kết với nhau một cách phức tạp nhờ những liên kết hóa học bền

vững. Nó thực sự không chỉ là một hợp chất mà bao gồm rất nhiều hợp chất.

Đó là những polymer ba chiều, phức tạp và vô định hình. Chúng có một cấu

trúc chung là một vòng benzen với một đuôi gồm 3 cacbon. Cấu trúc tự nhiên

của lignin quá phức tạp đến nỗi không một cấu trúc nào có thể được mô tả

một cách đầy đủ và ước tính trọng lượng phân tử của chúng khoảng 15.000

kDa hoặc nhiều hơn [12].

Lignin có cấu trúc phức tạp, là một polyphenol có mạng không gian mở.

Thành phần thay đổi theo từng loại gỗ, tuổi cây hoặc vị trí của nó trong cấu

trúc gỗ. Lignin là các phức hợp dị polymer thơm và hiếm, được tổng hợp từ


ba loại đơn phân hydroxycinnamyl alcohol. Ba loại đơn phân này phân biệt

với nhau tuỳ thuộc vào mức độ methoxyl hóa, với tên hóa học là: p-coumaryl

M1H, coniferyl M1G và sinapyl M1S alcohol [28], [31] (Hình 1.1).

Hình 1.1: Đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin

Từ ba loại đơn phân này, các chất p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) và

syringyl (S) phenylpropanoid được tạo ra. Các chất này sau đó sẽ kết hợp lại

để tạo ra phân tử lingin.

Mặc quá trình sinh tổng hợp các monolignol (đơn phân tạo ra lignin) đã

được xây dựng lại nhiều lần nhưng đến nay nó vẫn còn là vấn đề bàn cãi trong

các nhà khoa học. Tương tự như vậy, thì các quá trình khử và polymer hóa

các monolignol trong thành tế bào cũng vẫn là những chủ đề đang được

nghiên cứu và thảo luận.


1.3.2. Chu trình sinh tổng hợp lignin

Thành phần và hàm lượng lignin khác nhau giữa các loài, loại

tế bào và các phân lớp của vách tế bào thực vật, và chúng thay đổi

dưới các tác động của môi trường và các giai đoạn phát triển của

cây. Thông thường, lignin từ các loài thực vật hạt kín hai lá mầm

(cây gỗ cứng) bao gồm ba thành phần (G), (S) và (H), trong khi đó

các loài thực vật hạt trần (gỗ mềm) chỉ bao gồm (G) và (H). Lignin

từ các loài cây một lá mầm thường bao gồm hai thành phần (G) và

(S) với tỉ lệ thích hợp. Thành phần (H) thường tồn tại nhiều hơn ở

các loài cây hai lá mầm, thành phần này được hình thành do sự kết

hợp của monolignol p-coumaryl alcohol M1H vào trong phân tử

lignin và thường hay bị nhầm với p-coumarate Y3 ở các loại lignin

đang bị acyl hóa tách chiết từ cỏ [11, 19].

1.3.3. Các loại promoter điều khiển biểu hiện gen ở tầng xylem

Mạch gỗ (xylem) là tổ chức dẫn truyền nhựa nguyên (khoáng

và nước) trong thân cây, chỉ có ở cây gỗ lá rộng. Mạch gỗ chiếm

20-30% thể tích thân cây. Cấu tạo mạch gỗ là tập hợp của các tế

bào mạch gỗ nối tiếp nhau thành ống dài theo chiều dọc của thân

cây. Mạch gỗ là thành phần lớn nhất trong cấu tạo thô đại của gỗ nên dễ quan

Hìn

h 1

. 2:

Sin

h t

ổn

g h

ợp

lig

nin

tron

g t

hự

c v

ật


sát nhất [32], ở thực vật tầng xylem là nơi quá trình sinh tổng hợp lignin diễn

ra mạnh nhất [13], do vậy để điều khiển hoạt động của các gen trong tầng

xylem với mục đích làm tăng hàm lượng và chất lượng lignin đòi hỏi phải sử

dụng promoter mạnh có khả năng biểu hiện đặc hiệu các gen thuộc tầng

xylem.

Năm 1995, Feuillet và cộng sự lần đầu tiên phân lập thành công

promoter của gen CAD từ cây bạch đàn Eucalyptus gunii (EuCAD promoter).

Theo tác giả thì chiều dài của promoter này là khoảng 2,5 kb. Để nghiên

cứu hoạt động của promoter này, tác giả đã thiết kế cấu trúc chuyển gen

vào cây bạch dương trong đó gen GUS chịu sự điều khiển của promoter

này. Sau khi phân tích cây chuyển gen mang cấu trúc này tác giả nhận thấy

rằng gen GUS biểu hiện chủ yếu ở phần xylem và các tế bào bó mạch. Đây

là nơi mà sự lignin hóa diễn ra mạnh nhất [13]. Các kết quả của nghiên cứu

này là nguyên liệu rất tốt cho đề tài của chúng tôi.

Cinnamyl alcohol dehydrogenase là enzyme xúc tác cuối cùng trong con

đường sinh tổng hợp lignin. Năm 2002, tác giả Lauvergeat cho rằng sự biểu

hiện của promoter EuCAD trong các tế bào bó mạch là sự bảo tồn và phát

triển hệ mạch của những thực vật hạt kín (Vitis vinifera L.), cũng như trong

một số loài cây thảo mộc (Nicotiana tabacum L.). Hơn nữa, việc loại bỏ một

vài đoạn trình tự promoter để phân tích sự biểu hiện của promoter này đã giúp

xác định các vị trí cần thiết ảnh hưởng tới tầng phát sinh gỗ [23].

Năm 2003, tác giả Lu đã tiến hành nghiên cứu sự hoạt động của

promoter GRP1.8 trong đối tượng cây thuốc lá, trong nghiên cứu này tác giả

đã sử dụng cấu trúc promoter và gen chỉ thị GUS kết quả nghiên cứu cho thấy

gen GUS biểu hiện rất mạnh trong tầng xylem của thân. dựa trên những kết

quả đã đạt được tác giả đã tiếp thực nghiên cứu sự biểu hiện đặc hiệu của

promoter GRP1.8 bằng việc sử dụng cấu trúc promoter với gen mục tiêu


4CL1 và cấu trúc này được chuyển thành công vào cây thuốc lá. Kết quả cho

thấy gen 4CL1 biểu hiện rất mạnh ở trong thân theo tác giả lượng enzyme

4CL1 tồn tại trong thân đã ra tăng gấp từ 1 – 2 lần so với cây đối chứng chỉ

chuyển gen 4CL1, tuy nhiên sự biểu hiện của gen 4CL1 lại hầu như không có

tại các mô khác như lá. Điều này càng khẳng định hơn nữa sự biểu hiện đặc

hiệu của promoter GRP1.8 trong tầng xylem của thân [17].

1.3.4. Enzyme cinnamoyl CoA reductase và vai trò trong quá trình sinh

tổng hợp lignin

Có thể nói rằng cinnamoyl CoA reductase là một trong hai enzyme quan

trọng tới sự hình thành các phân tử monolignol, tiền chất của lignin, ở thực

vật. Trong quá trình này, các phân tử cinnamolyl CoA ester, là tiền chất của

các phân tử monolignol, được hình thành từ chu trình sinh tổng hợp các

phenylpropanoid sau đó được chuyển hóa thành các phân tử monolignol

thông qua các phản ứng được xúc tác bởi hai enzyme là cinnamoyl CoA

reductase (CCR) và cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) [28]. Trong đó

CCR xúc tác cho các phản ứng tiêu thụ NAPDH chuyển hóa p-coumaroyl

CoA, feruloyl CoA và sinapoyl CoA thành các dạng aldehyde tương ứng.

Chính vì CCR xúc tác cho phản ứng chuyển hóa 3 dạng cơ chất khác nhau

nên cho đến nay các nhà khoa học vẫn đang đặt ra câu hỏi rằng liệu trong cây

CCR tồn tại ở các dạng isoform khác nhau hay chỉ duy nhất một dạng isoform

có phổ xúc tác rộng với cả 3 loại cơ chất trên, ví dụ thực vật hạt kín là

sinapoyl CoA [8]. Ở cây Arabidopsis các nhà khoa học đã phân lập được hai

isoform của CCR là AtCCR1 và AtCCR2, và tương tự như vậy ở cây ngô là

ZmCCR1 và ZmCCR2, mặc dù khi thực hiện các nghiên cứu chức năng thì

chỉ một trong hai dạng isoform này tham gia vào quá trình lignin. Ngay cả ở

cây Arabidopsis cũng tồn tại khoảng 8 dạng protein có trình tự giống với

AtCCR1 với độ tương đồng khoảng 40 - 50%. Ở các loài cây khác như bạch


đàn, bạch dương, thuốc lá, mía đường và cây thông, chỉ duy nhất một gen mã

hóa cho enzyme CCR được xác định cho đến thời điểm hiện tại [8]. Do đó

nếu ở thực vật tồn tại các dạng isoform khác nhau đặc hiệu cho từng cơ chất ở

các dạng tế bào khác nhau thì có thể các enzyme này được mã hóa bởi các

gen có độ tương đồng rất thấp với CCR, và/hoặc các gen này chỉ được biểu

hiện tạm thời và rất khó phát hiện [7].

Năm 1998, Piquemal và cộng sự đã chỉ ra rằng CCR giữ vai trò trong

việc điều tiết nguồn cacbon trong chu trình tổng hợp các loại monolignol.

Chính vì lý do này mà CCR được coi là bước tổng hợp đặc hiệu lignin đầu

tiên trong chu trình phenylpropanoid. Tuy nhiên ở trong tế bào thực vật, các

phân tử monolignol không chỉ dùng cho quá trình sinh tổng hợp lignin mà còn

được dùng để tổng hợp các phân tử lignan và cinnamaldehyde và các sản

phẩm có nguồn gốc monolignol. Hơn nữa, nếu quá trình sinh tổng hợp các

phân tử monolignol được thực hiện đầy đủ và liên tục như giả thiết, ví dụ như

đối với các quá trình đường phân và pentose phosphate, thì CCR sẽ không giữ

chức năng điều hòa. Tuy nhiên, ở các dòng cây đột biến làm giảm tối đa hoạt

động của CCR xuất hiện những dấu hiệu bất thường về sinh lý trong quá trình

sinh trưởng và ngay cả hoạt tính enzyme của các bước trong chu trình sinh

tổng hợp monolignol cũng bị giảm. Ví dụ, nếu hoạt tính của CCR bị ức chế

hoàn toàn thì sự tích lũy các phân tử cinnamoyl CoA ester tương ứng sẽ giảm

xuống do nguồn CoA bị giới hạn. Trong khi các phân tử cinnamoyl CoA ester

này sẽ bị giới hạn để tổng hợp nên thành tế bào đang ở trong trạng thái lignin

hóa, nguồn CoA giới hạn cũng sẽ kéo theo những ảnh hưởng đến các quá

trình sinh tổng hợp khác trong tế bào (trừ khi chu trình phenylpropanoid được

thay thế hoàn toàn). Vì vậy có thể xem rằng nguồn cacbon dùng cho chu trình

phenylpropanoid sẽ được sử dụng, hoặc là để tổng hợp phân tử trung gian

(bao gồm các phân tử CoA ester) hoặc là tổng hợp các sản phẩm cuối cùng.


Khi nguồn các phân tử monolignol giảm sẽ dẫn đến sự thay đổi đáng kể bộ

máy bó mạch, tuy nhiên những nhận định này vẫn còn đang được các nhà

khoa học tìm lời giải đáp. Khi chuyển đoạn đối mã (antisense) của gen CCR

vào cây thuốc lá thì các dòng cây chuyển CCR.H (p-coumaryl) gen xuất hiện

những thay đổi bất thường trong quá trình sinh trưởng và phát triển như lá

nhỏ, tròn dạng thìa và màu sắc tối hơn so với cây không chuyển gen và các

dạng chuyển gen khác. Ở các dòng cây chuyển gen này thì hàm lượng lignin

cũng giảm đáng kể. Khi quan sát các lát cắt thân cho thấy nhiều yếu tố mạch

bị đứt gẫy [7] (Hình 1.3).

Hình 1.3: Lát cắt thân cây chuyển gen CCR.H (A) và cây không chuyển gen (B)

Thực hiện các thí nghiệm liên quan đến độ bền của thân cũng bị ảnh

hưởng do các thành phần bó mạch bị yếu bởi sự mất cân bằng hàm lượng

lignin. Những kết quả này cũng được khẳng định lại bởi các nghiên cứu trên

dạng đột biến irx4 (thiếu hụt enzyme CCR). Hàm lượng lignin ở các dạng đột

biến này giảm khoảng 50%. Thân cây rất mẫn cảm dưới tác động của các yếu

tố cơ học [24]. Năm 2001, Chabannes và cộng sự chỉ ra rằng khi hoạt tính

CCR giảm (khoảng 3% so với dạng ban đầu), thì sự hình thành monolignol


giảm dẫn đến hàm lượng lignin giảm tối đa 50% so với cây không chuyển

gen. Trong đó thành phần giảm chủ yếu là signapyl và coniferyl.

Ở cây bạch đàn, đoạn gen mã hóa cho CCR mới chỉ được xác định đầy

đủ ở cây bạch đàn gunnii (Eucalyptus gunnii) và đã được đăng kí trên trên cơ

sở dữ liệu NCBI [30]. Và đối với cây bạch đàn uro thì đây là công trình tách

dòng đầu tiên ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Năm 2006, các nhà khoa

học Pháp công bố tương đối chi tiết đến hoạt động và chức năng của promoter

của gen mã hóa cho enzyme CCR ở cây bạch đàn. Kết quả chỉ ra rằng gen chỉ

thị được điều khiển bởi promoter này biểu hiện mạnh đặc biệt ở các tế bào

đang trong giai đoạn lignin hóa. Phân tích chi tiết hơn sự biểu hiện của gen

mã hóa cho enzyme CCR trên cây Arabidopsis cũng cho thấy quá trình lignin

hoá của các tế bào tần xylem diễn ra rất giống nhau ở cả mô xylem sơ cấp và

thứ cấp [7].

Những bằng chứng khoa học về vai trò của enzyme CCR đến hàm lượng

lignin và quá trình lignin hóa của các tế bào cho thấy đây là một enzyme quan

trọng, tiềm năng và có ý nghĩa ứng dụng trong cải tạo giống cây lâm nghiệp

theo hướng làm giảm thiểu lượng lignin trong cây.


CHƢƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu

Vật liệu thực vật sử dụng trong nghiên cứu là các mẫu gỗ bạch đàn nâu

(Eucalyptus urophylla S.T. Blake) do Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp.

2.1.2. Hoá chất

Các loại hóa chất thông dụng: thang DNA 1 kb (Fermentas), kit tinh sạch

DNA (QIAgen), TA cloning kit (Invitrogen), ampicillin, IPTG, X-gal, agarose

của hãng Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech.

Hóa chất dùng cho tách chiết RNA tổng số: nitơ lỏng, CTAB, EDTA,

NaCl, ethanol, isopropanol, -mercaptoethanol, chloroform, isoamylalcohol,

LiCl, Rnase.

Hóa chất dùng cho tách dòng gen: enzyme cắt hạn chế BamHI; chủng

E.coli DH5, môi trường LB lỏng (1% tripton, 0,5% dung dịch chiết nấm

men, 1% NaCl), X-gal, vectơ tách dòng pBT, IPTG do Phòng Công nghệ tế

bào thực vật cung cấp.

Dung dịch điện di DNA: dung dịch đệm TAE 50X (Tris base, acid

acetic, EDTA), agarose 1%, ethidium bromide (EtBr), đệm kiểm tra mẫu

DNA 5X (Tris-HCl, EDTA, glycerol, bromphenol blue).

2.1.3. Máy móc, thiết bị

Máy PCR system 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac

300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, BioRad, Mỹ),

máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex

(Minishaker, IKA, Đức), máy ly tâm lạnh, Tủ lạnh sâu – 800C và – 20

0C

Sanyo – Nhật Bản, máy đọc trình tự tự động (3100-Avant Genetic analyser)


cùng các trang thiết bị khác của phòng Công nghệ Tế bào Thực vật và Phòng

thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học.

2.1.4. Địa điểm nghiên cứu

Luận văn được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực

vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp tìm kiếm thông tin về trình tự gen mã hóa cho enzyme

CAD và CCR trên ngân hàng gen quốc tế

Thông tin về promoter của gen mã hóa cho enzyme CAD và trình tự

nucleotide của gen mã hóa cho enzyme CCR được khai thác trên cơ sở dữ

liệu NCBI có địa chỉ tại http://www.ncbi.nlm.nih.gov [30].

2.2.2. Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng promoter của gen CAD

và gen CCR

Dựa trên trình tự nucleotide của gen mã hóa cho enzyme CCR của cây

bạch đàn Eucalyptus gunnii (Genbank) có mã số X75480 và khai thác dữ liệu

trong ngân hàng gen để tìm ra các trình tự gen CCR của bạch đàn và các đối

tượng có liên quan. Sử dụng phần mềm DNAstar và BioEdit để so sánh các

trình tự cDNA của gen CCR với nhau nhằm thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch

đại đoạn cDNA của gen CCR và trình tự promoter EuCAD. Trên cơ sở đó

đoạn cDNA của gen CCR và promoter của gen CAD được nhân bản sử dụng

các cặp mồi như sau:

1. Cặp mồi nhân bản đoạn promoter CAD1 kích thước khoảng 987 bp

Trình tự mồi Kích thƣớc

Mồi xuôi (Forward) 5’-ctgcagtgaacggttcgatctcaaca-3’ 26 nucleotide

Mồi ngược (Rev) 5’-cacgttctctgacgccctat-3’ 20 nucleotide



2. Cặp mồi nhân bản đoạn promoter CAD2 kích thước khoảng 1149 bp


Mồi xuôi (Forward) 5’-cacgttctctgacgccctat-3’ 20 nucleotide

Mồi ngược (Rev) 5’-ctcatctctgctcctacccg-3’ 20 nucleotide

3. Cặp mồi nhân bản đoạn cDNA của gen CCR kích thước khoảng 1156 bp


Mồi xuôi (Forward) 5’-cacccacctcctgaacccctctc-3’ 23 nucleotide

Mồi ngược (Rev) 5’-ctgcagtcatccctgaatacgcac-3’ 24 nucleotide

2.2.3. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA từ mô gỗ

2.2.3.1. Quy trình tách chiết DNA tổng số từ mô gỗ bạch đàn:

Hóa chất

Bảng 2.1: Thành phần dung dịch đệm tách chiết

STT Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng Trong 20ml

1 Tris – HCl 1 M, pH = 8,0 0,1 M 2ml

2 NaCl 5 M 1,4 M 5.6ml

3 EDTA 0,5 M 0,02 M 0.8ml

4 CTAB 2% 0.4g

5 H2O 11.2ml

Quy trình:

Cân 200 mg mẫu và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng bằng cối chầy sứ

cho đến khi thành dạng bột mịn.

Bổ sung thêm 700µl dung dịch đệm tách chiết DNA và trộn đều bằng

cách đảo ngược nhẹ.

Ủ ở nhiệt độ 650C khoảng 1 giờ (cứ 5 phút đảo nhẹ một lần).


Thêm 600µl dung dịch Chloroform: Isoamyl (24: 1) và đảo đều, để 5

phút ở nhiệt độ phòng.

Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 40C, Trong 5 phút. Dùng

pipette hút lấy 500µl dịch sang ống Eppendorf 1,5 ml, ủ vào đá.

Thêm 500µl isopropanol lạnh, ủ hỗn hợp trong đá 15 phút. Ly tâm hỗn

hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 40C, trong 10 phút.

Loại bỏ phần dịch nổi phía trên rửa DNA kết tủa dưới đáy ống bằng

cồn 70% (1 lần). Ly tâm 13000 v/p và làm khô DNA kết tủa ở đáy ống

eppendorf.

Thêm 50µl nước khử ion và 2µl RNAse, ủ ở 370C trong 30 phút.

Bảo quản DNA tổng số ở -200C.

Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA

Việc xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA được thực hiện bằng

cách đo độ hấp thụ tia UV ở các bước sóng 230, 260, 280 nm trên máy đo

quang phổ. Khi đó DNA có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 260 nm. Từ giá

trị OD260 ta sẽ tính được hàm lượng của DNA thu được (giá trị OD = 1,0

tương ứng với hàm lượng DNA là 50 µg/l mẫu). Độ tinh sạch của DNA có thể

được xác định bằng tỷ số OD260/280 và OD260/OD230. Các tỷ số này lần lượt chỉ

ra sự có mặt của tạp chất là protein, các hợp chất polyphenol và cacbon

hydrate. Một mẫu DNA được coi là tinh sạch nếu tỷ số OD260/280 và

OD260/OD230 đạt 1,8 – 2,0.

Các bước đo được tiến hành như sau:

Chỉnh cân bằng máy: dùng nước cất 2 lần khử ion, vô trùng để làm chuẩn.

Kiểm tra máy: đo một mẫu DNA có nồng độ chuẩn đã biết trước

(DNA của thực khuẩn thể λ).

Đo mẫu ở bước sóng λ = 260 nm và λ = 280 nm.


DNA được pha loãng 200 lần theo công thức: lấy 995µl nước cất + 5µl

DNA mẫu, lắc đều, cho vào cuvette, đặt vào máy đo.

Sau mỗi lần đo phải rửa sạch cuvette bằng nước cất.

In kết quả đo được.

Hàm lượng và độ sạch của DNA được tính theo công thức:

o Hàm lượng DNA: E = 50 x HSPL x OD260

o Độ sạch của DNA: OD260/280 và OD260/OD230

Trong đó: E: Hàm lượng DNA (ng/µ).

50: Hằng số.

HSPL: Hệ số pha loãng.

OD230: Chỉ số đo được ở bước sóng 230 nm.



2.2.3.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số

Hóa chất

Bảng 2.2: Thành phần dung dịch đệm tách chiết

STT Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng Trong 20 ml

1 Tris – HCl 1 M, pH = 8,0 0,1 M 2 ml

2 NaCl 5 M 2 M 8 ml

3 EDTA 0,5 M 0,0625 M 2.5 ml

4 CTAB 2% 0.4g

5 PVP 2% 0.4g

6 -mercaptoethanol 2% 0.4 ml

7 H20 (khử ion) Tổng 7.1 ml

Ủ ở 650C đến khi CTAB tan hoàn toàn.

Quy trình


Cân 200 mg mẫu và nghiền kĩ trong nitơ lỏng bằng cối chầy sứ cho đến

khi thành dạng bột mịn.

Bổ sung thêm 700µl dung dịch đệm tách và trộn đều bằng cách đảo

ngược nhẹ.

Ủ ở nhiệt độ 650C khoảng 10 phút

Thêm 700µl dung dịch Chloroform : Isoamyl (24 : 1) và đảo đều, để 5

phút ở nhiệt độ phòng.

Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 40C, trong 20 phút. Dùng pipet

hút lấy 600µl dịch sang ống Eppendorf 1,5 ml, ủ vào đá.

Thêm 150µl dung dịch muối LiCl 10M để ở 40C qua đêm. Ly tâm hỗn

hợp với tốc độ 13000 v/p ở 40C, trong 10 phút.

Loại bỏ phần dịch nổi phía trên sau đó rửa kết tủa dưới đáy ống bằng

cồn 70% (1 đến 2 lần). Ly tâm 13000 v/p và làm khô kết tủa ở đáy ống

eppendorf.

Thêm 50 µl nước khử ion và điện di kiểm tra sản phẩm.

2.2.3.3. Phương pháp khử DNA

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng khử DNA

STT Thành phần Thể tích (μl)

1 Mẫu RNA 8 μl

2 Đệm 10X 1 μl

3 DNAse 1 μl

4 Tổng 10 μl

Quy trình:

Ủ hỗn hợp trên ở 370C trong 30 phút.

Bổ sung vào hỗn hợp 2μl EDTA 25 mM sau khi ủ để bất hoạt DNAse.


Ủ ở 650C trong 10 phút.

Điện di kiểm tra sản phẩm.

2.2.4. Phương pháp tổng hợp cDNA

RNA tổng số được sử dụng để nhân gen bằng phương pháp tổng hợp

cDNA theo quy trình sau:

Bảng 2.4A: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA


1 Mẫu RNA tổng số 2 μl

2 Mồi ngẫu nhiên (0,2g/l) 1 μl

3 Nước khử DEPC 9 μl

4 Tổng 12 μl

- Ủ hỗn hợp ở 700C trong 5 phút.

- Tiếp tục bổ sung thêm hỗn hợp sau đây:

Bảng 2.4B: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA


1 Đệm 5X 4 μl

2 Ribolock ribonuclease inhibitor 1 μl

3 10mM dNTPs 2 μl

- Ủ ở 250C trong 5 phút.

- Cuối cùng bổ sung thêm 1 μl Revert Aid H Minus M-MuLV RT.

- Tiến hành đặt hỗn hợp trong chu trình nhiệt sau:

Bảng 2.4C: Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA

Bƣớc Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút)


1 250C 10 phút

2 420C 60 phút

3 720C 10 phút

2.2.5. Phương pháp khuếch đại đoạn promoter EuCAD và đoạn cDNA

CCR bằng phản ứng PCR

Sử dụng thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt như sau để tiến hành

khuếch đại đoạn cDNA/promoter.

Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR

STT Thành phần Nồng độ

1 Đệm PCR 10X 2,5 µl

2 MgCl2 (25mM) 2,5 µl

3 dNTPs (10 mM) 2,0 µl

4 Taq DNA polymerase (5 đơn vị/µl) 0,5 µl

5 DNA khuôn (10 – 20 ng/µl) 1 µl

6 Nước khử ion 15,5 µl

7 Mồi xuôi (10 pmol/µl) 0,5 µl

8 Mồi ngược (10 pmol/µl) 0,5 µl

9 Tổng thể tích 25µl


94oC

Tm

72oC 72

oC

4oC

30 giây

45 giây

1 phút 30

giây 10 phút

∞

35 chu kỳ

5 phút 94

oC

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:

Hình 2.1: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

2.2.6. Phương pháp tách dòng

2.2.6.1. Tinh sạch và gắn đoạn cDNA/promoter vào vector tách dòng pBT

Tinh sạch sản phẩm PCR:

Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm.

Bổ sung đệm hòa tan (QG) theo tỉ lệ: Vmẫu : V QG = 1 : 3 ( 1 µl tương

ứng với 1 mg mẫu).

Ủ ở 500C 15 phút trộn nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút

cho gel tan hoàn toàn.

Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel Qiaquick spin column, ly

tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.

Bổ sung thêm 500µl QG, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch

chảy qua cột.

Thêm 750µl đệm rửa PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ

sung 1 phút để loại hết PE.

Hòa tan DNA trong 30 – 50µl H20 khử ion đã được làm ấm đến 500C

để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm 13000 v/p trong 1 phút.


Điện di kiểm tra sản phẩm.

Gắn đoạn cDNA/promoter vào vector tách dòng pBT:

Bảng 2.6: Thành phần phản ứng gắn đoạn cDNA/promoter vào vector

tách dòng

STT Thành phần Thể tích

1 DNA 13 µl

2 Ligation buffer 10X 2 µl

3 Vector pBT 2 µl

4 PEG 4000 2 µl

5 T4 ligase 1 µl

Tổng 20 µl

Hỗn hợp trên được ủ ở 22oC trong 2 giờ, sau đó được biến nạp vào tế bào

khả biến E.coli chủng DH5α.

Hình 2.2: Sơ đồ vector pBT


2.2.6.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α

Tạo tế bào khả biến:

Tế bào E.coli DH5α được cấy ra môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở

370C.

Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 5 ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370C, qua

đêm.

Hút 1% dịch khuẩn ở trên cho vào 50ml LB, lắc 200 v/p, ở 370C trong

2-3 giờ. Đo OD600nm đạt 0,4 - 0,6 thì chuyển dịch sang cấy ống ly tâm,

để 15 phút trong đá (hoặc ở 40C).

Ly tâm 4000 v/p, ở 40C, trong 5 phút (lặp lại 3 lần, để trong đá lần thứ

hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút). Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml

CaCl2/100ml LB ban đầu, sau đó bổ sung 15 – 20% glycerol.

Chia 50µl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống Eppendorf 2,5ml. Bảo quản

tế bào khả biến trong tủ lạnh – 840C.

Biến nạp:

Bổ sung 5µl vectơ đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ.

Hỗn hợp được đặt trong đá 15 phút. Với nhiệt độ lạnh để mẫu trên đá

và sau 30 phút đặt ngay hỗn hợp vào bể ổn nhiệt ở 42 0C chính xác 1

phút 30 giây

Sau khi sốc nhiệt, hỗn hợp được đặt ngay vào đá trong thời gian 5 phút.

Bổ sung 150 - 300µl môi trường LB lỏng. Hỗn hợp được nuôi ở 370C,

lắc 200 v/p trong vòng 1 giờ.

Sử dụng que cấy trải đã khử trùng trải 150 – 250 µl dịch khuẩn lên đĩa

môi trường LB đặc có chứa kháng sinh phù hợp (pBT: 100mg/l

ampicillin, X-gal 0,004 ‰, IPTG 100µM; pENTR: 50mg/l kanamicine;

pBENDER 50mg/l carbenicillin).

Ủ đĩa petri ở 370C qua đêm trong vòng 16 giờ.


2.2.6.3. Tách chiết plasmid tái tổ hợp

Bảng 2.7: Thành phần hoá chất tách plasmid

Ký hiệu Thành phần

Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM ETDA pH8

Sol II 0.2 NaOH, SDS 1%

Sol III 60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml H20

Chú ý: Sol I phải khử trùng ở 117oC và giữ ở 4

oC [26].

SDS (Sodium dodecyl sulfate) pha mới trước khi dùng

Các bước tiến hành:

Lấy 1 khuẩn lạc nuôi qua đêm ở 370C trong 3ml môi trường LB (có

chứa kháng sinh thích hợp).

Lấy 2ml dịch khuẩn nuôi cho vào ống Eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p

trong 2-3 phút.

Loại dịch nổi, thu cặn, sau đó bổ sung 200µl sol I, đảo đều cho tới khi

phần cặn tế bào tan hoàn toàn.

Bổ sung 150µl sol II, đảo nhẹ bằng cách đảo ngược ống Eppendorf;

Bổ sung 200µl sol III, đảo nhẹ bằng cách đảo ngược ống Eppendorf,

sau đó ly tâm 13000 v/p trong 10 phút.

Thu dịch nổi sau đó bổ sung hỗn hợp chloroform: isoamyl (24 : 1), đảo

nhẹ. Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút.

Thu phần dịch nổi sau đó bổ sung isopropanol lạnh theo tỉ lệ 1 : 1.

Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút sau đó thu tủa.

Bổ sung 500µl cồn 70%, lắc nhẹ sau đó ly tâm 13000v/p trong 10 phút.

Lặp lại bước rửa cồn 70%. Thu tủa sau đó làm khô trong thời gian 15-

20 phút.

Bổ sung 40l H2O khử RNAse.


Tiến hành điện di kiểm tra sản phấm tách plasmid trên gel agarose

0,9%.

2.2.6.4. Phương pháp cắt plasmid

Bảng 2.8: Thành phần phản ứng cắt


1 Đệm 10x 1 μl

2 Plasmid 5 μl

3 Enzyme cắt hạn chế 0,5 μl

4 H2O khử ion 3,5 μl

5 Tổng thể tích 10 μl

- Ủ hỗn hợp dung dịch ở 370C trong 2 giờ.

- Điện di kiểm tra kết quả.

2.2.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)

Bảng 2.9: Thành phần phản ứng colony-PCR

STT Thành phần Nồng độ

1 Đệm PCR 10X 2,5 µl

2 MgCl2 (25mM) 2,5 µl

3 dNTPs (10 mM) 2,0 µl

4 Taq DNA polymerase (5 đơn vị/µl) 0,5 µl

5 DNA khuôn (10 – 20 ng/µl) 1 µl

6 Nước khử ion 15,5 µl

7 Mồi xuôi (10 pmol/µl) (pUC18 F) 0,5 µl

8 Mồi ngược (10 pmol/µl) (pUC18 R) 0,5 µl

9 Tổng thể tích phản ứng 25µl


94oC

530C

72oC 72

oC

4oC

30 giây

45 giây

1 phút 30

giây 10 phút

∞

30 chu kỳ

5 phút 94

oC

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Hình 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng colony-PCR

2.2.8. Phương pháp Gateway

2.2.8.1. Dòng hóa đoạn cDNA của gen CCR quan tâm vào vector nhân dòng

pENTRTM

/D-TOPO®

+ Phương pháp thiết kế mồi nhân đoạn cDNA của gen CCR quan tâm

+ Phương pháp PCR nhân đoạn cDNA của gen CCR

+ Thôi gel và tinh sạch sản phẩm thôi gel

+ Tạo plasmid tái tổ hợp pENTRTM

/D-TOPO® có gắn đoạn cDNA của gen

CCR (ký hiệu: pENTR/CCR)

Hình 2.4. Sơ đồ vector pENTRTM

/D-TOPO


Vector pENTRTM

/D-TOPO là vector tiếp nhận có kích thước 2580 bp,

trên vector này có hai vị trí attL1 và attL2, đoạn gen cần chuyển sẽ được gắn

vào giữa hai vị trí này. Ngoài ra trên vector này còn có gen kháng kháng sinh

kanamycin và vị trí gắn mồi pUC18 phục vụ cho việc chọn các dòng khuẩn

lạc mang plasmid mong muốn. Đặc biệt, nhờ enzym topoisomerase I có sẵn

trên vector nên việc thực hiện phản ứng gắn gen vào vector xảy ra với thời

gian rất ngắn (chỉ mất 5 phút) và đạt hiệu quả rất cao lên tới 90%. Thành phần

phản ứng ghép nối như sau:

Bảng 2.10. Thành phần phản ứng ghép nối


1 DNA 0,5 - 4l

2 Salt solution 1l

3 H20 khử ion 0 – 3,5l

4 Vector pENTR 1l

5 Tổng thế tích 6l

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Đặt phản ứng

trên đá và thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5.

+ Biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả biến E.coli

DH5.

+ Chọn dòng bằng các phương pháp:

PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) sử dụng mồi pUC18.

Tách chiết plasmid theo bộ kit Plasmid Extraction Kit (Bioneer).

Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn với thành phần và thể tích như sau:


Bảng 2.11. Thành phàn phản ứng cắt plasmid pENTR/CCR


1 Đệm 10X 2l

2 Enzyme giới hạn NotI 0,4l

3 Enzyme giới hạn XhoI 0,8l

4 Plasmid 3,5l

5 H20 deion 3,3l

6 Tổng thể tích 10l

2.2.8.2. Tạo vector chuyển gen mang đoạn cDNA của gen CCR quan tâm

+ Phản ứng LR tái tổ hợp giữa plasmid pENTR/CCR và vector chuyển

gen pBENDER theo kĩ thuật Gateway® để tạo plasmid tái tổ hợp pBENDER

mang đoạn cDNA của gen CCR (ký hiệu là pBENDER/CCR). Phản ứng được

xúc tác bởi hỗn hợp enzyme Gateway® LR Clonase

TM II.

Hình 2.5. Sơ đồ vector pBENDER

Plasmid sau khi được tinh sạch theo bộ kit sẽ được bổ sung thêm các

thành phần để thực hiện phản ứng LR. Thành phần và thể tích như sau:


Bảng 2.12. Thành phần phản ứng LR


1 Plasmid pENTR/CCR 0,5l

2 Vector pBENDER 0,5l

3 H2O khử ion 3l

4 Enzyme LR clonase 1l

Ủ hỗn hợp phản ứng trên ở 250C trong 90 phút. Sau đó bổ sung 1l dung

dịch proteinase K để kết thúc phản ứng. Vontex nhẹ nhàng. Ủ hỗn hợp phản

ứng ở 370C trong 10 phút.

+ Biến nạp plasmid pBENDER/CCR vào tế bào khả biến E.coli DH5

theo quy trình biến nạp bằng sốc nhiệt như mục 2.3.10.1, sau đó sản phẩm

biến nạp được cấy trải trên môi trường LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc

carbenicillin.

+ Chọn dòng bằng các phương pháp:

PCR dùng cặp mồi đặc hiệu CCR entr F – CCR R.

Tách chiết plasmid theo bộ kit Plasmid Extraction Kit (Bioneer)

Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn với thành phần phản ứng và thể

tích như sau:

Bảng 2.13. Thành phần phản ứng cắt plasmid pBENDER/CCR


1 Đệm 10X 2l

2 Enzyme giới hạn XhoI 0,5l

4 Plasmid 3,5l

5 H20 deion 4l

6 Tổng thể tích 10l


CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl

alcohol dehydrogenase (CAD)

3.1.1. Kết quả thiết kế mồi

Sử dụng phần mềm DNAstar và trình tự của gen mã hóa cho enzyme

CAD khai thác trên ngân hàng gen quốc tế (Genbank) có mã số đăng ký là

X75480 thiết kế mồi để khuếch đại đoạn promoter EuCAD. Do đoạn

promoter EuCAD dài 2043 bp nên bước đầu đã thiết kế hai cặp mồi đặc hiệu để

khuếch đại promoter. Các cặp mồi có kí hiệu là CADpro1-F; CADpro1-R và

CADpro2-F, CADpro2-R. Trong đó cặp mồi CADpro1 được thiết kế để

khuếch đại đoạn DNA có kích thước 987bp, cặp mồi CADpro2 được thiết kế

để khuếch đại đoạn DNA có kích thước 1149 bp. Trình tự và các thông số của

các cặp mồi này được trình bày trong bảng 3.1.

Bảng 3.1: Trình tự và các thông số cần thiết của các mồi

Tên mồi Trình tự Nhiệt độ

gắn mồi Kích thƣớc

CADpro1-F 5’-ctgcagtgaacggttcgatctcaaca-3’ 53,5oC 26 nucleotide

CADpro1-R 5’-cacgttctctgacgccctat-3’ 53,9 oC 20 nucleotide

CADpro2-F 5’-cacgttctctgacgccctat-3’ 53,9 oC 20 nucleotide

CADpro2-R 5’-ctcatctctgctcctacccg-3’ 53,6 oC 20 nucleotide

3.1.2. Kết quả tách chiết DNA bạch đàn

Tách chiết DNA bộ gen từ mô và tế bào thực vật là một trong những

bước quan trọng nhất khi tiến hành các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR,


SSR, RFLP, AFLP, RAPD hoặc Southern Blot [29]. Độ tinh sạch và hàm

lượng DNA tách chiết được sẽ ảnh hưởng trực tiếp sự thành công của các thí

nghiệm tiếp theo. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng vật liệu thực vật là

tầng xylem của các dòng bạch đàn nâu E. urophylla S.T Blake do Viện Khoa

học lâm nghiệp Việt Nam cung cấp. Các bước tách chiết DNA được thực hiện

theo quy trình chuẩn theo mô tả của Gawel năm 1991 [15] với một số thay đổi

mô tả ở mục 2.2.3. Các mẫu DNA tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp

điện di trên gel agarose nồng độ 0,8 %. Kết quả được thể hiện ở hình 3.1:

Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA từ gỗ bạch đàn

Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1: DNA tổng số

Trên giếng điện di chỉ xuất hiện một băng DNA có trọng lượng phân tử

cao, sắc nét, kết quả đo OD cho thấy tỷ số OD260/OD280 bằng 1.85 và khoảng

200 ng/µl. Điều này chứng tỏ rằng mẫu DNA tách chiết có chất lượng tốt,

không bị đứt gãy và có đủ điều kiện để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.


3.1.3. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của phản ứng PCR như:

nồng độ dung dịch mẫu, nồng độ Mg++, chu trình nhiệt ... và đặc biệt là nhiệt

độ gắn mồi. Thông thường, ở nhiệt độ càng cao thì mức độ đặc hiệu càng tăng

vì tránh được hiện tượng nhiễm các nguồn gen lạ. Ở thí nghiệm này chúng tôi

tiến hành phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu với các thành phần phản

ứng và chu trình nhiệt được trình bày ở bảng 2.5 và hình 2.1 trên dải nhiệt độ

từ 550C đến 64

0C nhằm tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp của các mồi.

Các đoạn promoter được tiến hành khuếch đại theo phương pháp PCR.

Khi sử dụng các cặp mồi CADpro1 và CADpro2 để khuếch đại hai đoạn trình

tự của promoter EuCAD. Các đoạn promoter CAD 1 và 2 được nhân bản

bằng việc sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu thiết kế dựa trên trình tự nucleotide

của promoter của gen CAD ở cây bạch đàn gunnii do vậy chúng tôi đã tiến

hành phản ứng PCR với việc sử dụng dải nhiệt độ khác nhau. Sản phẩm PCR

được điện di trên gel 0.8%, kết quả điện di thể hiện trong hình 3.2 và hình 3.3:

Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1

Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 55 – 64: Nhiệt độ gắn mồi (oC)


Do việc khuếch đại đoạn promoter của cây bạch đàn urô được thực hiện

sử dụng cặp mồi thiết kế dựa trên trình tự đã công bố của cây bạch đàn E.

gunnii, vì vậy trên hình ảnh điện di ngoài các băng vạch có kích thước đúng

như dự đoán khoảng 987 bp còn thấy xuất hiện các băng vạch không đặc hiệu.

Trong thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn các băng vạch có kích thước đúng

theo tính toán lý thuyết khoảng 987 bp làm vật liệu cho các thí nghiệm tiếp

theo. Kết quả nhân bản tốt nhất tương ứng với băng vạch đậm nhất có nhiệt

độ bắt mồi là 55oC.

Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2

Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 53 – 60: Nhiệt độ gắn mồi (oC)

Kết quả điện di trên hình 3.3 cho thấy trên bản điện di ngoài các băng vạch

đúng như kích thước dự đoán khoảng 1149 bp còn xuất hiện các băng vạch không

đặc hiệu là do việc khuếch đại đoạn promoter của cây bach đàn urô được thực hiện

sử dụng cặp mồi thiết kế dựa trên trình tự đã công bố của cây bạch đàn E. gunnii,

trong thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn các băng vạch đúng theo tính toán lý thuyết

làm vật liêu cho các thí nghiệm tiếp theo. Từ hình ảnh điện di cho thấy các băng

vạch đậm nhạt ứng với các nhiệt độ khác nhau, nhiệt độ càng cao sự bắt cặp giữa

mồi và đoạn DNA càng đặc hiệu, băng vạch càng rõ nét. Băng vạch rõ nét nhất ứng

với nhiệt độ gắn mồi là 59oC.


3.3. Tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter EuCAD

3.3.1. Tinh sạch sản phẩm PCR và tạo vector tái tổ hợp

Quá trình tách dòng được thực hiện bằng cách lai sản phẩm PCR vào

vector tách dòng pBT (hình 2.2) do Phòng công nghệ tế bào thực vật - Viện

công nghệ sinh học cung cấp đây là vector được cải tiến từ pUC18. Để việc

lai sản phẩm PCR và vector tách dòng tạo vector tái tổ hợp có chứa đoạn

promoter EuCAD có hiệu suất cao thì đoạn PCR chỉ thu 1 băng duy nhất và

phải được loại bỏ các thành phần tạp chất trong sản phẩm PCR như mồi, đệm,

dNTPs… bởi các muối có trong đệm PCR sẽ làm ảnh hưởng đến nồng độ

đệm thích hợp cho enzyme thực hiện phản ứng lai. Các băng DNA sản phẩm

phụ của PCR có thể ảnh hưởng tới việc chọn dòng sau này. Tinh sạch sản

phẩm PCR sử dụng bộ Kit QIAquick Extraction, sản phẩm sau khi tinh sạch

được điện di trên gel 0.8%. Kết quả điện di sản phẩm PCR sau khi tinh sạch

trên hình 3.4 và 3.5 cho thấy có thể tiến hành phản ứng gắn sản phẩm PCR

vào vector tách dòng tiếp theo.

Hình 3.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR

với cặp mồi CADpro1 sau tinh sạch

Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1:

Đoạn DNA sau tinh sạch

Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR với

cặp mồi CADpro2 sau tinh sạch

Giếng M: Thang DNA 1 kb;

Giếng 1: Đoạn DNA sau tinh sạch


Phản ứng ghép nối là phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa

base Adenin ở đầu 5’ của sản phẩm PCR với base Thymine ở đầu 3’ của

vector tách dòng nhờ hoạt tính nối của enzyme T4 ligase được thực hiện như

mục 2.3.6.1. Kết quả ghép nối được thể hiện ở sản phẩm biến nạp vector tái tổ

hợp vào vi khuẩn E. coli DH5.

3.3.2. Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5.

Sản phẩm thu được sau khi ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến

E.coli DH5 sau đó được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung

ampicillin 100mg/l, X-gal 0.004% và IPTG 100M. Hiệu suất ở bước biến

nạp phụ thuộc vào hai yếu tố:

Thứ nhất là sản phẩm PCR phải tinh sạch và đặc hiệu.

Thứ hai là tế bào khả biến phải được chuẩn bị tốt.

Hình 3.6: Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến

Kết quả hình 3.6 cho thấy đã thu được một số lượng lớn dòng các khuẩn

lạc xanh trắng trên môi trường LB. Các tế bào có mang plasmid có chứa gen

kháng kháng sinh có thể phát triển được trên môi trường chọn lọc này và phát


triển thành các khuẩn lạc. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vector không

có đoạn gen ngoại lai nào chèn vào mà do vector tự đóng vòng. Do vector có

mang operon lacZ nên khi operon này hoạt động bình thường và có cảm ứng

IPTG sẽ tổng hợp enzyme -galactosidase, enzyme này sẽ chuyển hóa cơ chất

X-gal thành hợp chất có màu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng có thể là do

nhận được plasmid mang operon không hoạt động. Do đó, khi có chất cảm

ứng IPTG thì gen không tổng hợp enzyme -galactosidase và không xảy ra sự

chuyển hóa X-gal. Lac operon mất hoạt động là do đoạn DNA ngoại lai xen

vào giữa promoter của operon lacZ. Do đó, lac-promoter không thể điều khiển

gen cấu trúc phiên mã, nên không thể dịch mã thành enzyme được. Tuy nhiên

không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn

promoter CAD1 và CAD2 có thể là chứa đoạn gen là sản phẩm phụ của phản

ứng PCR, sự đột biến trên promoter lac hay sự đứt gãy base thymine đầu 3’ của

vector cũng có thể làm cho khuẩn lạc mang màu trắng. Vì vậy các khuẩn lạc

trắng mang plasmid tái tổ hợp được chọn lọc bằng phương pháp colony-PCR để

phục vụ cho bước tiếp theo.

3.3.3. Chọn dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp

Để chắc chắn rằng các đoạn promoter CAD1 và CAD2 có mặt trong các

dòng khuẩn lạc thu được chúng tôi tiến hành phản ứng colony-PCR. Phương

pháp này giúp chúng ta phát hiện nhanh những dòng khuẩn lạc nào mang gen

mục tiêu, giảm chi phí và tiết kiệm thời gian. Tiến hành phản ứng với 11

khuẩn lạc trắng cho mỗi đĩa khuẩn lạc, sau đó thực hiện phản ứng colony-

PCR với các cặp mồi pUC18F1 và pUC18R1 để chọn dòng khuẩn lạc mang

đoạn promoter CAD1 và CAD2. Sở dĩ trong thí nghiệm này chúng tôi không

dùng các cặp mồi CADpro1 và CADpro2 là do khi thực hiện phản ứng ghép

nối sản phẩm PCR được sử dụng với một lượng lớn. Ngoài những đoạn DNA

quan tâm đã được gắn vào vector còn có rất nhiều đoạn DNA còn dư thừa,


chúng tồn tại bên trong hoặc xung quanh các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch khi

biến nạp. Vì vậy khi thực hiện phản ứng colony-PCR với các cặp mồi

CADpro1 và CADpro2 thì chúng ta vẫn có thể thu được các băng vạch có

kích thước mong muốn tuy nhiên trên thực tế các đoạn promoter CAD1 và

CAD2 có thể chưa được gắn vào vector. Mồi pUC18 được thiết kế nằm trên

vector pBT và ở hai phía đối với đoạn cắt đa điểm. Khoảng cách giữa hai mồi

trên vector này khoảng 200bp. Do đó khi tiến hành phản ứng colony-PCR thì

đối với các khuẩn lạc trắng do vector tự đóng vòng thì sẽ thu được băng có

kích thước khoảng 200bp, còn với plasmid tái tổ hợp sẽ chứa các đoạn chèn

có kích thước thực tế bằng kích thước băng điện di trừ đi 200 bp (kích thước

đoạn nằm trên vector). Sản phẩm colony-PCR được điện di trên gel 0,8%, kết

quả điện di được thể hiện trên hình 3.7:

Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc

Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1 – 11: Các dòng khuẩn lạc

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR trên hình 3.7 cho thấy có

10 dòng khuẩn lạc cho kết quả dương tính, các mẫu đều có băng duy nhất

kích thước khoảng 1187 bp kết quả này phù hợp với kích thước dự tính và có

1 dòng khuẩn lạc âm tính, như vậy hiệu suất biến nạp là khá cao. Như vậy, kết

quả bước đầu đã chọn được dòng plasmid mang đoạn promoter CAD1 tái tổ


hợp. Các dòng mang plasmid có đoạn promoter CAD1 được nhân lên để tách

plasmid.

Cũng làm tương tự với đĩa khuẩn chứa đoạn promoter CAD2 :

Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc


Kết quả điện di trên hình 3.8 cho thấy dòng khuẩn lạc số 6 xuất hiện

băng DNA có kích thước vào khoảng 1349 bp đúng với kích thước đã tính

toán. Như vậy bước đầu khẳng định dòng khuẩn lạc số 6 mang plasmid tái tổ

hợp có chứa đoạn promoter CAD2.

Từ kết quả thu được chúng tôi tiến hành nuôi khuẩn trên môi trường LB

lỏng và tách plasmid.

3.3.4. Tách chiết plasmid tái tổ hợp

10 dòng khuẩn lạc chứa đoạn promoter CAD1 và 1 khuẩn lạc chứa đoạn

promoter CAD2 được lựa chọn sau đó nuôi trong môi trường LB lỏng và tách

plasmid, đây là phương pháp khá đơn giản nhưng có độ tinh sạch khá cao.

Plasmid được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di plasmid

tinh sạch được trình bày trên hình 3.9:


Hình 3.9: Ảnh điện di plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E.coli DH5α


Kết quả điện di trên hình 3.9 cho thấy các plasmid tái tổ hợp đều có 3

băng rõ nét và không bị đứt gãy. Để kiểm tra sự có mặt của các đoạn

promoter CAD1 và CAD2 trong các plasmid tái tổ hợp chúng tôi tiến hành xử

lý plasmid thu được bằng enzyme cắt giới hạn BamHI.

Kiểm tra sự có mặt của promoter trong plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt

giới hạn: Theo lý thuyết trong sản phẩm thu được sẽ có hai phân đoạn DNA:

Thứ nhất là đoạn promoter CAD1, CAD2 cần chèn.

Thứ hai là vector pBT.

Kết quả điện di sản phẩm cắt được thể hiện trên hình 3.10 và 3.11:

Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn

promoter CAD1



Kết quả điện di như hình 3.10 cho thấy sản phẩm cắt phân thành hai băng

tương ứng với phần vector pBT có kích thước 2705 bp và đoạn promoter

CAD1 khoảng 987 bp. Như vậy có thể bước đầu kết luận chúng tôi đã thu

được dòng khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD1. Để

chắc chắn đây có phải là chính xác đoạn promoter CAD1 mong muốn, chúng

tôi lựa chọn plasmid tách từ dòng số 9 để xác định trình tự trên máy đọc trình

tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer.

Hình 3.11: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn

promoter CAD2

Giếng M : DNA 1 kb; Giếng 1 : plasmid tách từ dòng số 6;

(+) : Sản phẩm colony-PCR từ dòng số 6

Kết quả điện di như hình 3.11 cho thấy sản phẩm cắt phân thành hai băng

rõ nét tương ứng với phần vector pBT khoảng 2705 bp và đoạn promoter

CAD2 khoảng 1149 bp. Như vậy có thể có thể bước đầu khẳng định chúng tôi

đã tạo được dòng khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter

CAD2. Để chắc chắn đây chính xác là đoạn promoter mong muốn, chúng tôi

đã mang dòng khuẩn số 6 đi đọc trình tự.


3.3.5. Kết quả đọc trình tự nucleotide của hai đoạn promoter CAD1 và

CAD2

Kết quả phân tích trình tự nucleotide ở cả hai đoạn promoter CAD1 và

CAD2 cho thấy, hai đoạn promoter tách dòng được có kích thước đúng so với

dự tính khi thiết kế mồi. Từ kết quả cho thấy đây chính là các trình tự

promoter dự kiến. Đoạn promter tách dòng được có chiều dài lần lượt là 987

bp và 1149 bp. Như vậy nghiên cứu này đã bước đầu thành công trong việc

tách dòng và xác định trình tự promter EuCAD.

Từ kết quả đọc trình tự và so sánh với trình tự nucleotide của gen CAD

đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế, chúng tôi khẳng định đã tách dòng

được hai đoạn promoter từ gen CAD. Từ kết quả kể trên chúng tôi thực hiện

phản ứng nối hai đoạn DNA này sử dụng phản ứng PCR với cặp mồi sử dụng

là CADpro1-F và CADpro2-R. Kết quả của phản ứng nối được kiểm tra trên

gel agarose 0,8%; hình 3.12:

Hình 3.12: Kết quả điện di kiểm tra phản ứng nối hai đoạn promoter

CAD1 và CAD2

Giếng M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1: Đoạn CAD1;

Giếng 2: Đoạn CAD2; Giếng 3: Sản phẩm nối


Từ kết quả điện di cho thấy đã thu được một băng kích thước khoảng

2043 bp, phù hợp với kích thước dự tính. Như vậy có thể kết luận chúng tôi

đã tách dòng thành công và hoàn chỉnh promoter EuCAD. Đoạn promoter này

sẽ được dùng để thiết kết cấu trúc vector chuyển vào cây để kiểm tra hoạt

động và vị trí biểu hiện của gen ở tầng xylem do promoter này điều khiển.


promoter gen CAD tách dòng được từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla

S.T Blake

Sau khi có được trình tự của đoạn DNA chúng tôi đã tiến hành so sánh

trình tự này với trình tự gen CAD của cây bạch đàn gunnii kết quả được thể

hiện trên hình 3.13:

Hình 3.13: Kết quả so sánh trình tự DNA với gen CAD của E. gunnii

Từ kết quả so sánh cho thấy đoạn trình tự promoter thu được nằm trùng

với vị trí của promoter của gen CAD của cây bạch đàn gunnii ở vị trí từ [-

2143] đến [- 382] bp, điều này cho phép bước đầu kết luận đây chính là

promoter của gen CAD của cây bạch đàn urô. Và để khẳng định điều này

chúng tôi tiến hành phân tích trình tự DNA thu được nhằm tìm ra các trình tự


(motif) tham gia vào quá trình điều hòa hoạt động của gen ở các điều kiện và

giai đoạn phát triển nhất định của cây. Từ các công bố trước đây các nhà khoa

học đã phát hiện được các trình tự đặc trưng của promoter tham gia vào quá

trình điều hòa sinh tổng hợp lignin ở thực vật như các trình tự Myb hay Zinc

finger [16]. Để thực hiện được công việc này chúng tôi đã sử dụng cơ sở dữ

liệu phân tích chuyên dụng PLACE (Plant Cis-acting Regulatory DNA

Elements) (Higo và cộng sự, 1999). Kết quả phân tích thể hiện ở hình 3.14:

Hình 3.14: Kết quả phân tích promoter của gen CAD


Từ kết quả phân tích này, có thể nhận thấy rằng promoter của gen CAD

tách dòng được từ cây bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T Blake có mang

đầy đủ các trình tự đặc trưng của một promoter điển hình như CAATBOX,

GATABOX, TATABOX. Đặc biệt trong đó chúng tôi phát hiện được các

trình tự có vai trò điều hòa hoạt động của các gen ở tầng xylem và các gen

tham gia vào quá trình sinh tổng hợp lignin như đã được công bố bởi các nhà

khoa học khác như MYB1AT, MYBPLANT [16]. Những phân tích tin sinh

học trên đây là cơ sở lý thuyết rất tốt cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm thiết

kế vector chuyển gen có mang đoạn promoter mà chúng tôi đã tách dòng

thành công trong nghiên cứu này với mục đích cuối cùng là điều khiển quá

trình sinh tổng hợp lignin ở các đối tượng cây rừng quan tâm.

3.3.7. Kết quả đăng tải trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme

cinnamyl alcohol dehydrogenase tại ngân hàng gen quốc tế NCBI

Mặc dù đã có rất nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến việc tách

dòng và giải trình tự nhiều gen và promoter từ cây bạch đàn, nhưng cho đến

này thông tin về trình tự promoter của gen CAD từ cây bạch đàn nâu

Eucalyptus urophylla S.T Blake chưa được công bố trên ngân hàng gen quốc

tế. Chính vì những lý do này mà chúng tôi đã sử dụng trình tự mà chúng tôi

tách dòng được để đăng kí lên ngân hàng gen quốc tế với mục đích chính là

chia sẻ kết quả chúng tôi thu được từ nghiên cứu này với các nhà khoa học

khác đang nghiên cứu sinh học phân tử trên cây bạch đàn. Ngoài DDBJ (DNA

Data Bank of Japan), EMBL (European Molecular Biology Laboratory) thì

ngân hàng gen quốc tế NCBI (National Center for Biotechnological

Information) đặt tại Thư viện quốc gia Mỹ là một trong 3 cơ sở dữ liệu lớn

nhất trên thế giới về thông tin công nghệ sinh học. Một trong những ưu điểm

lớn nhất của cơ sở dữ liệu này đó là nó cho phép các nhà khoa học có thể

đăng tải miễn phí những kết quả nghiên cứu của mình bao gồm các ấn phẩm


khoa học, các trình tự DNA, protein… Để làm được điều này chúng tôi sử

dụng chương trình chuyên dụng từ cơ sở dữ liệu EMBL để đăng tải các trình

tự sinh học là Webin [33]. Kết quả chúng tôi đã công bố thành công trình tự

promoter của gen CAD với mã số (Accession number) là FN393045.

3.2. Kết quả tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã

hóa cho enzyme cinnamoyl coa reductase (CCR)

3.2.1. Kết quả thiết kế mồi

Thiết kế mồi cho đoạn cDNA của gen CCR là yêu cầu đầu tiên để tách

dòng gen này. Các trình tự cDNA của gen CCR đã được khai thác trong

NCBI và so sánh với nhau trên phần mềm DNAstar. Với mục đích chỉ sử

dụng một cặp mồi có thể tách dòng được trình tự cDNA của gen CCR từ đối

tượng bạch đàn uro. Chúng tôi đã chọn được vùng trình tự có độ bảo thủ cao

nhất và kết quả đã thiết kế được cặp mồi cho trình tự cDNA của gen CCR.

Đồng thời thiết kế thêm 4 nucleotide CACC ở đầu 5’ nhằm mục đích thiết kế

vector chuyển gen sử dụng công nghệ Gateway. Các trình tự này sẽ bắt cặp

với đầu GTGG trên vector nhân dòng pENTRTM

/D-TOPO® .

Bảng 3.2: Trình tự và các thông số cần thiết của hai mồi CCR entr-F, CCR-R

Mồi Trình tự mồi Tm (0C) %GC

CCR entr-F 5’ cacccacctcctgaacccctctc 3’ 63,7 65%

CCR-R 5’ ctgcagtcatccctgaatacgcac 3’ 61,5 54%

Theo tính toán lý thuyết đoạn gen được nhân lên có kích thước 1156kb.

3.2.2. Kết quả tách chiết RNA tổng số bạch đàn

Sau khi thiết kế thành công mồi cho gen mã hóa enzyme cinnamoyl

coA reductase (CCR) thì yêu cầu tiếp theo là tách chiết được RNA từ mẫu gỗ

bạch đàn đảm bảo chất lượng tốt cho những thí nghiệm tiếp theo. Để đáp ứng

yêu cầu này chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết RNA tổng số là


phương pháp CTAB. Các mẫu RNA tách chiết được kiểm tra bằng phương

pháp điện di trên gel agarose nồng độ 1%. Kết quả được thể hiện ở hình 3.15:

Hình 3.15. Kết quả điện

di RNA tổng số

M: Thang DNA 1kb

Hình 3.16. Kết quả điện

di khử DNA

M: Thang DNA 1kb

Từ kết quả hình 3.15 cho thấy, chúng tôi đã tách chiết thành công RNA

từ mẫu gỗ bạch đàn. Tuy nhiên hàm lượng DNA trong dịch tách còn cao

(được thể hiện ở băng vạch đầu tiên của đường chạy), do đó chúng tôi tiến

hành khử DNA theo quy trình đã được mô tả ở mục 2.2.3.3 và thu được kết

quả trên hình 3.16.

3.2.3. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của phản ứng PCR như: nồng

độ dung dịch mẫu, nồng độ Mg++

, chu trình nhiệt ... và đặc biệt là nhiệt độ

gắn mồi. Thông thường, ở nhiệt độ càng cao thì mức độ đặc hiệu càng tăng vì

tránh được hiện tượng nhiễm các nguồn gen lạ. Do đó, chúng tôi tiến hành tối

ưu hóa nhiệt độ bắt mồi của phản ứng PCR trên dải nhiệt độ từ 500C đến 60

0C


có sử dụng cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế ở trên với các thành phần phản

ứng và chu trình nhiệt được trình bày ở bảng 2.5 và hình 2.1.

Kết quả trên hình 3.17 cho thấy ở tất cả các dải nhiệt độ đều xuất hiện

một phân đoạn DNA đặc hiệu có kích thước khoảng 1156bp, phù hợp với

kích thước phân đoạn dự đoán khi thiết kế mồi. Tuy nhiên ở nhiệt độ bắt cặp

mồi 600C xuất hiện một phân đoạn có kích thước sáng rõ nét nhất. Do đó, có

thể xác định nhiệt độ bắt mồi đặc hiệu nhất của phản ứng PCR với đoạn

cDNA của gen CCR là 600C. Từ đó, chúng tôi sơ bộ kết luận đã nhân bản

thành công đoạn cDNA của gen CCR bằng kỹ thuật PCR và lựa chọn nhiệt

độ này làm nhiệt độ gắn mồi ở các thí nghiệm tiếp theo trong quá trình tách

dòng gen CCR.

Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR

M: Thang DNA 1Kb, 50 – 60: dải nhiệt độ bắt cặp của mồi trong phản ứng PCR

3.2.4. Kết quả thôi gel và tinh sạch sản phẩm thôi gel

Quá trình tách dòng gen được thực hiện bằng cách gắn sản phẩm PCR

vào vector tách dòng gen pBT. Tuy nhiên, sản phẩm nhân đoạn cDNA của

gen CCR bằng phương pháp PCR có chứa những đoạn mồi, sợi khuôn,

dNTPs, đệm PCR ... Vì vậy, để việc dòng hóa có hiệu quả, chúng tôi tiến

hành thôi gel và tinh sạch sản phẩm thôi gel với mục đích chỉ thu duy nhất

một băng DNA đặc hiệu chứa đoạn cDNA của gen CCR mong muốn đồng

thời loại bỏ hết các thành phần tạp chất. Quá trình tinh sạch DNA (thôi gel)


được thực hiện theo sự hướng dẫn của bộ kit Accuprep® Gel purification

Kit cho hiệu suất rất cao (lớn hơn 85%). Quy trình này được mô tả trong mục

2.3.6.1. Sản phẩm được điện di trên gel agarose 1% và thu được kết quả như

hình .

Hình 3.18. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1%

M: Thang DNA 1kb; Giếng 1: đoạn cDNA của gen CCR

Kết quả trên hình 3.18 cho thấy, sản phẩm thôi gel có hàm lượng cao

tương đối sạch, không còn sản phẩm đứt gẫy và đúng với kích thước 1156bp.

Điều này chứng tỏ việc tinh sạch đã thực hiện đúng theo bộ kít và các thao tác

thí nghiệm chính xác. Sản phẩm này tiếp tục được dùng để tiến hành các thí

nghiệm tiếp theo.

3.2.5. Kết quả phân tích và so sánh trình tự cDNA của gen CCR

Sau khi đã tách dòng được trình tự cDNA của gen CCR từ cây bạch đàn

uro vào vector pBT, chúng tôi tiến hành đọc trình tự gen này trên hệ thống

đọc trình tự tự động ABI PRIMS

3100. Tiến hành so sánh trình tự cDNA

của gen CCR nhận được với cơ sở dữ liệu NCBI bằng chương trình BLAST,

chúng tôi thấy rằng đoạn cDNA mà chúng tôi tách dòng được có độ tương

đồng cao nhất (98%) với gen CCR tách dòng được từ cây bạch đàn gunnii

(Eucalyptus gunnii) có mã số đăng ký là X79566. Dựa trên trình tự cDNA của

gen CCR tách dòng được chúng tôi tiến hành xây dựng cây phát sinh chủng

loại và độ tương đồng với 26 trình tự cDNA của gen CCR phân lập từ các loài


thực vật khác nhau bằng chương trình MEGA4 (Kuma và cộng sự, 2008), kết

quả thể hiện ở hình 3.19 và phụ lục 1. Cây phát sinh chủng loại được chia làm

2 phân nhóm lớn. Phân nhóm thứ nhất bao gồm chỉ các trình tự cDNA của

gen CCR phân lập được từ các loài bạch đàn và cây Vitis vinifera. Tuy nhiên

trình tự cDNA của gen CCR phân lập được từ cây bạch đàn uro, gunnii và

saligna lại được xếp vào phân nhóm còn lại. Kết quả này cho thấy sự đa dạng

về trình tự cDNA của gen CCR giữa các loài thực vật. Mặc dù được phân lập

từ cùng cây bạch đàn nhưng trình tự cDNA của gen CCR của ba loài bạch đàn

nói trên lại có độ tương đồng rất khác với các loài bạch đàn khác. Đây là

nghiên cứu đầu tiên về tách dòng gen CCR từ cây bạch đàn uro, do đó chúng

tôi đã tiến hành đăng kí trình tự này lên ngân hàng gen quốc tế với mã số là

FN554865.


Hình 3.19. Kết quả dựng cây phát sinh chủng loại đoạn cDNA của gen CCR

3.2.6. Kết quả tạo plasmid tái tổ hợp pENTRTM

/D-TOPO® có gắn đoạn

cDNA của gen CCR và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5

Sản phẩm thôi gel sau khi tinh sạch được gắn vào vector tách dòng

pENTRTM

/D– TOPO dựa vào sự hình thành mối liên kết hydro giữa 4

nucleotide CACC đầu 5’của sản phẩm PCR với 4 nucleotide GTGG đầu 3’

trên vector và nhờ enzyme topoisomerase (TOPO) ở trên vector nối các đầu


của sản phẩm PCR vào vector mà plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR được tạo

thành (thành phần phản ứng được trình bày ở mục 2.2.8.1 và bảng 2.10).

Sản phẩm gắn pENTR/CCR được biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli

DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt để dòng hóa và nhân nhanh plasmid với số

lượng lớn. Kết quả ghép nối được thể hiện ở sản phẩm biến nạp vector tái tổ

hợp vào vi khuẩn E. coli DH5 (hình 3.20).

Hình 3.20. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào

khả biến E.Coli DH5

Vì plasmid pENTR/CCR có gen kháng kháng sinh Kanamycin còn tế

bào khả biến E.Coli DH5 không kháng bất kì kháng sinh nào nên khi biến

nạp có các trường hợp sau xảy ra:

- Các tế bào không chứa plasmid tái tổ hợp sẽ không mọc được trên môi

trường có chứa kháng sinh kanamycine.

- Các tế bào chứa plasmid pENTR nhưng chưa gắn cDNA của gen CCR

vẫn có khả năng mọc trên môi trường chọn lọc.

- Các tế bào có chứa vector tái tổ hợp pENTR/CCR có khả năng mọc

được trên môi trường chọn lọc

Từ kết quả thu được biểu hiện trên hình 3.20 có thể kết luận sơ bộ rằng

đã biến nạp thành công vector tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả biến

E. coli DH5. Tuy nhiên, không phải tất cả khuẩn lạc này đều mang


plasmid tái tổ hợp. Vấn đề đặt ra là trong những khuẩn lạc thu được, khuẩn

lạc nào mang vector chứa đoạn cDNA của gen CCR mong muốn còn

nguyên vẹn. Do đó để kiểm tra sự có mặt của đoạn cDNA này trong các

dòng khuẩn lạc chúng tôi tiến hành tách chiết và cắt plasmid.

3.2.7. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp

Lựa chọn 8 dòng khuẩn lạc một cách ngẫu nhiên trên đĩa thạch, sau đó

nuôi qua đêm ở 370C trong môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh

kanamicin. Các dịch khuẩn lạc được tách chiết plasmid theo quy trình được

trình bầy ở mục 2.2.6.3. Đây là phương pháp tách plasmid khá đơn giản

nhưng có độ tinh sạch khá cao, đảm bảo thu được lượng plasmid cần thiết với

chất lượng tốt cho các bước thí nghiệm tiếp theo trong thời gian ngắn (khoảng

1h). Sản phẩm tách plasmid được điện di trên gel agarose 0,8%.

Hình 3.21. Kết quả điện di plasmid pENTR/CCR

M: Thang DNA 1kb; Giếng 1 – 8: Các dòng khuẩn lạc

Kết quả trên hình 3.21 cho thấy sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp đều

xuất hiện các băng vạch rõ nét và không bị đứt gãy, đảm bảo chất lượng cho

các thí nghiệm tiếp theo.

Để kiểm tra sự có mặt của đoạn cDNA của gen CCR trong các plasmid

tái tổ hợp chúng tôi tiến hành xử lý các plasmid trên bằng enzyme cắt giới hạn

XhoI và NotI. Theo tính toán lý thuyết, khi cắt bằng hai enzyme giới hạn này

sản phẩm thu được sẽ có các phân đoạn DNA:


- Đoạn cDNA của gen CCR cần chèn bị cắt hai đầu bởi 2 enzyme giới

hạn có kích thước 828 bp.

- Khung vector pENTR.

Kết quả điện di sản phẩm cắt được thể hiện trên hình 3.22. Tại các

giếng điện di xuất hiện băng vạch tương ứng với kích thước mong muốn, điều

này chứng tỏ đoạn cDNA của gen CCR đã được chèn thành công vào vector

pENTR.

Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn cDNA của

gen CCR

M: Thang DNA 1 kb; Giếng 1 – 3: Các dòng khuẩn lạc

3.2.8. Kết quả phản ứng LR tái tổ hợp tạo plasmid pBENDER/CCR theo kĩ

thuật Gateway®

Với mục đích nghiên cứu chức năng của đoạn cDNA của gen CCR tách

dòng từ cây bạch đàn uro, chúng tôi tiến hành thiết kế vector chuyển gen

mang đoạn gen này bằng kỹ thuật Gateway (Invitrogen)[9], [25]. Các plasmid

sau khi được tinh sạch theo bộ kit và được định lượng theo thang DNA chuẩn

sẽ được ghép nối với vector pBENDER theo quy trình của phản ứng LR.

Phản ứng này được thực hiện giữa plasmid pENTR/CCR và vector

pBENDER để tạo cấu trúc vector chuyển gen pBENDER/CCR. Phản ứng


được xúc tác bởi hỗn hợp enzyme Gateway® LR Clonase

TM II (mục 2.2.8.2,

bảng 2.12). Kết quả của phản ứng này được thể hiện ở kết quả biến nạp sản

phẩm lai vào tế bào khả biến E.coli DH5.

3.2.9. Kết quả dòng hóa plasmid pBENDER/CCR vào tế bào E.coli DH5

Để thu nhận dòng plasmid pBENDER/CCR, hỗn hợn phản ứng LR được

biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt ở

420C. Kết quả thu được một lượng lớn khuẩn lạc trắng trên đĩa thạch LB có

chứa kháng sinh carbenicillin 50mg/l.

Vì chủng E.coli DH5 không kháng bất kỳ loại kháng sinh nào, còn

vector pBENDER/CCR có gen kháng kháng sinh carbenicillin do đó những

khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch có thể là những khuẩn lạc có mang plasmid

pBENDER/CCR. Tuy nhiên, không phải tất cả các khuẩn lạc đều mang

plasmid pBENDER/CCR mong muốn. Do đó, để chắc chắn rằng cấu trúc

pBENDER/CCR có mặt trong các dòng khuẩn lạc, chúng tôi tiến hành phản

ứng colony-PCR bằng các cặp mồi đặc hiệu nằm trên đoạn gen. Phương pháp

này cho phép phát hiện nhanh những dòng khuẩn lạc mang gen đích, giảm chi

phí trong nghiên cứu và tiết kiệm thời gian. Các bước của phản ứng cũng

tương tự như phản ứng PCR thông thường nhưng DNA được thay thế bằng

dịch tế bào vi khuẩn.

Trước tiên, chúng tôi chọn 10 khuẩn lạc trắng chạy phản ứng colony –

PCR với cặp mồi đặc hiệu : CCR entr-F và CCR-R. Theo lý thuyết, với cặp

mồi CCR entr F – CCR R thì sản phẩm colony-PCR sẽ cho một phân đoạn

DNA có kích thước là 1156 bp.


Hình 3.23. Kết quả colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu CCR entr F và

CCR R

M: Thang DNA 1kb

Giếng: 1-10: Các dòng khuẩn lạc được đánh số theo thứ tự từ 1-10

Dựa vào kết quả điện di kiểm tra trên hình 3.23, chúng tôi nhận thấy

rằng trong 10 dòng được chọn, thì cả 10 dòng đều cho một phân đoạn DNA

duy nhất có kích thước khoảng 1156 bp đúng như mong đợi, điều đó chứng tỏ

rằng chúng tôi đã biến nạp thành công vector pBENDER/CCR vào tế bào

E.coli DH5.

Để khẳng định một cách chắc chắn hơn các dòng khuẩn lạc này mang

plasmid pPENDER/CCR, chúng tôi tiến hành nuôi các khuẩn lạc này trong

môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh carbenicillin 50 mg/l qua đêm ở

37oC để tách chiết plasmid. Kết quả thể hiện trên hình 3.24.

Hình 3.24. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR

M: Thang DNA 1kb

1 - 10: Mẫu có chứa các khuẩn lạc được đánh số theo thứ tự từ 1-10


Kết quả trên hình 3.24 cho thấy thu được một lượng lớn sản phẩm tách

plasmid là những băng vạch sáng rõ nét, không bị đứt gãy, đảm bảo cho các

phản ứng tiếp theo. Để khẳng định một lần nữa, các dòng khuẩn lạc trên là

các dòng mang cấu trúc pBENDER/CCR như mong muốn, chúng tôi tiến

hành chọn 2 khuẩn lạc trong số các khuẩn lạc trên để kiểm tra phản ứng

cắt bởi enzyme giới hạn XhoI. Theo sơ đồ vector pBENDER thì trên

vector không có điểm cắt của enzyme XhoI, tuy nhiên trên đoạn cDNA của

gen CCR có hai điểm cắt của enzyme XhoI. Do đó sản phẩm thu được sau

khi xử lý với enzyme XhoI sẽ cho hai phân đoạn DNA có kích thước như

trình bày trong bảng 3.3.

Bảng 3.3. Kích thƣớc các phân đoạn thu đƣợc khi cắt plasmid tái tổ hợp

pBENDER/CCR bằng XhoI

Mẫu pBENDER/CCR

Phân đoạn 1 828 bp

Phân đoạn 2 ~ 8000 bp

Plasmid được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% và được trình bày

trên hình 3.25:

Hình 3.25. Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR bằng enzyme XhoI

M: Thang DNA 1kb; Giếng 1 – 2: Các dòng khuẩn lạc

Giếng 3 -4 (Đối chứng): Sản phẩm colony-PCR


Từ kết quả trên hình 3.25, chúng tôi thấy sản phẩm của phản ứng cắt

thu được các phân đoạn có kích thước đúng như dự tính. Điều này thêm một

lần nữa khẳng định các dòng khuẩn lạc 1 và 2 mang cấu trúc vector chuyển

gen CCR như mong muốn. Kết quả này cho thấy chúng tôi đã thiết kế thành

công vector chuyển gen mang đoạn cDNA của gen CCR tách dòng từ mô

xylem của cây bạch đàn Eucalyptus urophylla S.T. Blake.


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

I. KẾT LUẬN

1. Tách dòng thành công đoạn promoter của gen mã hóa cho enzyme

cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) từ cây bạch đàn uro (Eucalyptus

urophylla S.T Blake). Kết quả phân tích cho thấy promoter có chứa các trình

tự đặc trưng của một promoter CAATBOX, GATABOX, TATABOX và các

trình tự đặc trưng biểu hiện cho tầng xylem bao gồm MYBPLANT và

MYB1AT. Trình tự này đã được đăng kí trên ngân hàng gen quốc tế NCBI

với mã số FN393045.

2. Tách dòng thành công gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl CoA

reductase từ mô xylem của cây bạch đàn uro (Eucalyptus urophylla S.T

Blake). Xác định được trình tự cDNA của gen CCR có kích thước 1156bp và

đăng ký trên ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số FN554865.

3. Phân tích độ tương đồng đoạn cDNA của gen CCR của cây bạch đàn

uro với 26 trình tự cDNA của gen CCR phân lập từ các loài thực vật khác

nhau cho thấy sự đa dạng về trình tự cDNA của gen CCR giữa các loài thực

vật, đặc biệt là trình tự cDNA của gen CCR phân lập được từ cây bạch đàn

uro, gunnii và saligna.

4. Thiết kế thành công vector chuyển gen ở thực vật mang đoạn gen mã

hóa cho enzyme cinnamoyl CoA reductase (CCR) từ cây bạch đàn uro

(Eucalyptus urophylla S.T Blake).


II. KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục nghiên cứu hoạt động của promoter CAD trên cây mô hình

(thuốc lá, Arabidopsis) để khẳng định sự biểu hiện đặc hiệu trong xylem của

promoter này.

2. Chuyển cấu trúc pBENDER/CCR vào cây mô hình (thuốc lá,

Arabidopsis) để nghiên cứu chức năng của gen CCR tách dòng từ cây bạch

đàn uro (Eucalyptus urophylla S.T Blake).

3. Từ kết quả thu được từ cây mô hình có thể sử dụng promoter và

vector chuyển gen này cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm cải thiện chất lượng

gỗ của các cây lâm nghiệp.



TÀI LIỆU TRONG NƢỚC

1. Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000), Thực vật rừng. NXB Nông nghiệp,

Hà Nội, tr. 311- 317.

2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005). Sinh học phân tử. Nxb Giáo Dục, tr101-112.

3. Trần Duy Hưng, Đỗ Ngọc, Nguyễn Thị Chương (1991), Cây rừng. Trường

công nhân Kỹ thuật Lâm nghiệp 4, Bộ Lâm nghiệp, tr. 96 – 100.

4. Nguyễn Dương Tài (1994). Bước đầu khảo nghiệm xuất xứ bạch đàn

Eucalyptus urophylla S.T. Blake tại vùng nguyên liệu giấy trung tâm Bắc

Bộ, Việt Nam. Luận án PTS khoa học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm

nghiệp Việt Nam.

5. Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005), Giáo trình Sinh lý thực

vật. NXB Hà Nội, tr 214 – 221.

6. Hà Văn Tuế (1993), Nghiên cứu cấu trúc và năng suất của một số quần xã

rừng trồng nguyên liệu giấy tại vùng trung du Vĩnh Phú. Tóm tắt luận án tiến sĩ

sinh học. Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Hà Nội, 24 trang.

TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI

7. A. Baghdady, A.-S. Blervacq, L. Jouanin, J. Grima-Pettenati, P. Sivadon,

S. Hawkins (2006), Eucalyptus gunnii CCR and CAD2 promoters are

active in lignifying cells during primary and secondary xylem formation in

Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry 44, pp. 674–

683.

8. Aldwin M. Anterola, Norman G. Lewis (2002), Trends in lignin

modification: a comprehensive analysis of the effects of genetic

manipulations/mutations on lignification and vascular integrity.

Phytochemistry 61 (2002) 221–294.

9. Artem Evdokimov, DNA cloning for protein expression using Gateway©

technology.


10. Barakat A., Bagniewska-Zadworna A., Choi A., Plakkat U., DiLoreto

D.S., Yellanki P., Carlson J.E. (2009), The cinnamyl alcohol

dehydrogenase gene family in Populus: phylogeny, organization, and

expression. BMC Plant Biology. 9(26): 1-15.

11. Chiang, V. L., (2006). Understanding Gene Function and Control in

Lignin Formation in Wood. NABC Report.

12. Ellen McCrady (1991), The Nature of Lignin. Volume 4, number 4.

13. Feuillet C., Lauvergeat V., Deswarte C., Pilate G., Boudet A., and Grima

P.J. (1995), Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol

dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants. Plant Molecular

Biology. 4(27): 651-667.

14. Fiona S. Poke1, René E. Vaillancourt, Robert C. Elliott and James B. Reid

(2003), Sequence variation in two lignin biosynthesis genes, cinnamoyl

CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase 2 (CAD2).

Molecular Breeding 12: 107–118, 2003.

15. Gawel N. J. and Jarret R. L. (1991), A modified CTAB DNA extraction

procedure for Musa and Ipomoea. Plant Molecular Biology Reporter.

3(9): 262-266.

16. Goicoechea M., Lacombe E., Legay S., Mihaljevic S., Rech P., Jauneau

A., Lapierre C., Pollet B., Verhaegen D., Chaubet G.N., Grima P.J.

(2005), EgMYB2, a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem,

regulates secondary cell wall formation and lignin biosynthesis. The Plant

Journal. 43(4): 553-567.

17. Hai L., Qingyin Z., Yan L.Z., Shasheng W. and Xiangning J. (2003),

Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in

transgenic tobacco. Plant Growth Regulation. 41: 279-286.

18. Hawkins S., Samaj J., Lauvergeat V., Boudet A., and Pettenati J. C.

(1997), Cinnamyl alcohol dehydrogenase: Identification of new sites of

promoter activity in transgenic Poplar. Plant Physiology. 113: 321-325.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Goicoechea%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Lacombe%20E%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Legay%20S%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Mihaljevic%20S%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Rech%20P%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Lapierre%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Pollet%20B%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Verhaegen%20D%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Chaubet-Gigot%20N%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Grima-Pettenati%20J%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus


19. Hu W.J., Harding S.A., Lung J., Popko J.L., Ralph J., Stokke D.D., Tsai

C.J. & Chiang V.L. (1999), Repression of lignin biosynthesis promotes

cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature

Biotechnology. 17: 808-812.

20. Johan Wadenback, Sara von Arnold, Ulrika Egertsdotter, Michael H.

Walter, Jacqueline Grima-Pettenati, Deborah Goffner, Goran Gellerstedt,

Terry Gullion, David Clapham (2008), Lignin biosynthesis in transgenic

Norway spruce plants harboring an antisense construct for cinnamoyl

CoA reductase (CCR). Transgenic Res (2008) 17:379–392

21. Kim S.J., Kim M.R., Bedgar D.L., Moinuddin S.G., Cardenas C.L., Davin

L.B., Kang C., Lewis N.G. (2004), Functional reclassification of the

putative cinnamyl alcohol dehydrogenase multigene family in

Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences.

101:1455-1460.





23. Lauvergeat V., Rech P., Jauneau A., Guez C., Coutos T.P. and Grima P.J.

(2002), The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii

cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among

woody and herbaceous plant species. Plant molecular biology. 50(3): 497-

509.

24. Matthieu Chabannes, Abdellah Barakate, Catherine Lapierre, Jane M.

Marita, John Ralph, Michel Pean, SaoEda Danoun1, Claire Halpin,

Jacqueline Grima-Pettenati and Alain Michel Boudet1 (2001), Strong

decrease in lignin content without significant alteration of plant

development is induced by simultaneous down-regulation of cinnamoyl

CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) in

tobacco plants. The Plant Journal (2001) 28(3), 257±270.

25. pENTR™ Directional TOPO® Cloning Kits (6 April 2006). Invitrogen

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=journals&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=1201&ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Journals.Journals_ResultsPanel.Journals_RVDocSum


26. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989). Molecular Cloning: A

Laboratory Manual. Vol. 1, 2, and 3. Cold Spring Harbor Laboratory

Press, Cold Spring Harbor, New York.





28. Tsutomu Kawasaki, Hisako Koita, Tomoyuki Nakatsubo, Kana

Hasegawa, Kenichi Wakabayashi, Hiroki Takahashi, Kenji Umemura,

Toshiaki Umezawa, and Ko Shimamoto (2005), Cinnamoyl-CoA

reductase, a key enzyme in lignin biosynthesis, is an effector of small

GTPase Rac in defense signaling in rice. PNAS vol. 103 no. 1, pg. 230–

235.

28. Whettena R. and Sederoffa R. (1995), Lignin Biosynthesis. The Plant Cell

7: 1001-1013.

29. Xu Q., Wen X.P., and Deng X.X. (2004), A Simple Protocol for Isolating

Genomic DNA from Chestnut Rose (Rosa roxburghii Tratt) for RFLP and

PCR Analyses. Plant Molecular Biology Reporter. 22: 301a-301g.

TÀI LIỆU WEB

30. http://www.ncbi.nlm.nih.gov

31. http://www.community.h2vn.com/index.php?action=printpage%3Btopic=

061.0.

32. http://vi.wikipedia.org/wiki/Xylem.

33. http://www.ebi.ac.uk/embl/Submission/webin.html.




http://vi.wikipedia.org/wiki/Xylem


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và

kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa có ai

công bố trong một công trình nào khác.

Tác giả

Lê Phương Dung


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hữu Cường – Phòng

Công nghệ tế bào thực vật – Viện công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn,

chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS. TS. Lê Trần Bình, TS.

Chu Hoàng Hà - Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và đóng góp

những ý kiến quý báu cho tôi trong thời gian thực tập tại Phòng Công nghệ tế

bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm Khoa Sinh –

KTNN cùng toàn thể cán bộ nhân viên trong khoa đã tạo mọi điều kiện và tận

tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Hoàng Hà và tập thể cán bộ Phòng

Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi

hoàn thành luận văn này.

Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình và bạn bè đã giúp đỡ,

động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công

luận văn này.

Thái Nguyên, ngày 09 tháng 9 năm 2009

Học viên

Lê Phương Dung


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

bp : base pair

cDNA : Complementary DNA

DNA : Deoxyribonucleic Acid

DEPC : Diethyl pyrocarbonate

dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate

E.coli : Escherichia coli

EDTA : Ethylen dimine tetra acetic acid

g/l : Gam/lít

IPTG : Isopropylthio-beta-D-galactoside

Kb : Kilobase

kDa : KiloDalton

LB : Luria Bertani

mg/l : miligam/lít

OD : Optical density

PCR : Polymerase Chain Reaction

RNA : Ribonucleic Acid

RNase : Ribonuclease

SDS : Sodium dodecyl sulphate

TAE : Tris - Acetic acide - EDTA

Taq polymerase : Thermus aquaticus polymerase

TE : Tris – EDTA

v/p : vòng/phút

X-gal : 5-brom- 4-chloro-3-indolyl--D-galactosidase

CTAB : Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

---------------------------

LÊ PHƢƠNG DUNG

PHÂN LẬP PROMOTER CỦA GEN MÃ HÓA CHO ENZYME

CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) VÀ THIẾT KẾ

VECTOR CHUYỂN GEN MANG ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO

ENZYME CINNAMOYL CoA REDUCTASE (CCR) TỪ CÂY BẠCH

ĐÀN URO (EUCALYPTUS UROPHYLLA S.T. BLAKE)

CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN

MÃ SỐ: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Cường

Thái Nguyên – 2009


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần dung dịch đệm tách chiết .......................................... 17

Bảng 2.2: Thành phần dung dịch đệm tách chiết .......................................... 19

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng khử DNA................................................... 20

Bảng 2.4A: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ...................................... 21

Bảng 2.4B: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ...................................... 21

Bảng 2.4C: Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA ........................... 21

Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR........................................................... 22

Bảng 2.6: Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng ..... 24

Bảng 2.7: Thành phần hoá chất tách plasmid ................................................ 26

Bảng 2.8: Thành phần phản ứng cắt ............................................................. 27

Bảng 2.9: Thành phần phản ứng colony-PCR ............................................... 27

Bảng 2.10. Thành phần phản ứng ghép nối ................................................... 29

Bảng 2.11. Thành phàn phản ứng cắt plasmid pENTR/CCR ........................ 31

Bảng 2.12. Thành phần phản ứng LR ........................................................... 31

Bảng 2.13. Thành phần phản ứng cắt plasmid pBENDER/CCR ................... 31

Bảng 3.1: Trình tự và các thông số cần thiết của các mồi ............................. 32

Bảng 3.2: Trình tự và các thông số cần thiết của hai mồi CCR entr-F, CCR-R ... 47

Bảng 3.3. Kích thước các phân đoạn thu được khi cắt plasmid tái tổ hợp

pBENDER/CCR bằng XhoI.......................................................................... 58


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin .......................................................... 8

Hình 1.2: Sinh tổng hợp lignin trong thực vật ....................................................... 9

Hình 1.3: Lát cắt thân cây chuyển gen CCR.H (A) và cây không chuyển gen (B) ...... 13

Hình 2.1: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ...................................................... 23

Hình 2.2: Sơ đồ vector pBT ................................................................................. 24

Hình 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng colony-PCR .......................................... 28

Hình 2.4. Sơ đồ vector pENTRTM/D-TOPO ...................................................... 28

Hình 2.5. Sơ đồ vector pBENDER ...................................................................... 30

Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA từ gỗ bạch đàn ............ 33

Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 ....................... 34

Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 ....................... 35

Hình 3.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 sau tinh sạch ........ 36

Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 sau tinh sạch .......... 36

Hình 3.6: Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến ....................... 37

Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc ...... 39

Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc ...... 40

Hình 3.9: Ảnh điện di plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E.coli DH5α ................. 41


CAD1 ................................................................................................................... 41


CAD2 ................................................................................................................... 42

Hình 3.12: Kết quả điện di kiểm tra phản ứng nối hai đoạn promoter CAD1 và

CAD2 ................................................................................................................... 43

Hình 3.13: Kết quả so sánh trình tự DNA với gen CAD của E. gunnii ............... 44

Hình 3.14: Kết quả phân tích promoter của gen CAD ......................................... 45


Hình 3.15. Kết quả điện di RNA tổng số.................................................................. 48

Hình 3.16. Kết quả điện di khử DNA .................................................................. 48

Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR ............................................ 49

Hình 3.18. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1% ....... 50

Hình 3.19. Kết quả dựng cây phát sinh chủng loại của gen CCR ........................ 52

Hình 3.20. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả biến

E.Coli DH5 ........................................................................................................ 53

Hình 3.21. Kết quả điện di plasmid pENTR/CCR .............................................. 54

Hình 3. 22. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn cDNA của gen CCR

.............................................................................................................................. 55

Hình 3.23. Kết quả colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu CCR entr F và CCR R .. 57

Hình 3.24. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR .............................. 57

Hình 3.25. Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR bằng enzyme XhoI ............. 58


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1

1.1. Lý do chọn đề tài ...................................................................................... 1

1.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu ............................................................. 2

1.2.1. Mục đích ............................................................................................... 2

1.2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3

1.1. Tổng quan về cây bạch đàn ...................................................................... 3

1.2. Tình hình trồng bạch đàn ở Việt Nam ....................................................... 6

1.3. Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật .................................. 7

1.3.1. Lignin .................................................................................................... 7

1.3.2. Chu trình sinh tổng hợp lignin ............................................................... 9

1.3.3. Các loại promoter điều khiển biểu hiện gen ở tầng xylem...................... 9

1.3.4. Enzyme cinnamoyl CoA reductase và vai trò trong quá trình sinh tổng

hợp lignin ........................................................................................... 11

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 15

2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................ 15

2.1.1. Vật liệu ................................................................................................ 15

2.1.2. Hoá chất .............................................................................................. 15

2.1.3. Máy móc, thiết bị ................................................................................. 15

2.1.4. Địa điểm nghiên cứu............................................................................ 16

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 16

2.2.1. Phương pháp tìm kiếm thông tin về trình tự gen mã hóa cho enzyme

CAD và CCR trên ngân hàng gen quốc tế .......................................... 16

2.2.2. Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng promoter của gen CAD

và cDNA của gen CCR ....................................................................... 16


2.2.3. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA từ mô gỗ ................. 17

2.2.4. Phương pháp tổng hợp cDNA .............................................................. 21

2.2.5. Phương pháp khuếch đại đoạn promoter EuCAD và đoạn cDNA của

gen CCR bằng phản ứng PCR ........................................................... 22

2.2.6. Phương pháp tách dòng ....................................................................... 23

2.2.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) ...................... 27

2.2.8. Phương pháp Gateway ......................................................................... 28

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................. 32

3.1. Kết quả phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol

dehydrogenase (CAD) ........................................................................ 32

3.1.1. Kết quả thiết kế mồi ............................................................................ 32

3.1.2. Kết quả tách chiết DNA bạch đàn ........................................................ 32

3.1.3. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR........................................................ 34

3.3. Tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter EuCAD .......................... 36

3.3.1. Tinh sạch sản phẩm PCR và tạo vector tái tổ hợp ................................ 36

3.3.2. Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5. ............ 37

3.3.3. Chọn dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp .................................. 38

3.3.4. Tách chiết plasmid tái tổ hợp ............................................................... 40

3.3.5. Kết quả đọc trình tự nucleotide của hai đoạn promoter CAD1 và CAD243


promoter gen CAD tách dòng được từ bạch đàn nâu Eucalyptus

urophylla S.T Blake ............................................................................ 44

3.3.7. Kết quả đăng tải trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme

cinnamyl alcohol dehydrogenase tại ngân hàng gen quốc tế NCBI ..... 46

3.2. Kết quả tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã hóa

cho enzyme cinnamoyl coa reductase (CCR) ...................................... 47

3.2.1. Kết quả thiết kế mồi ............................................................................ 47


3.2.2. Kết quả tách chiết RNA tổng số bạch đàn ............................................ 47

3.2.3. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR........................................................ 48

3.2.4. Kết quả thôi gel và tinh sạch sản phẩm thôi gel ................................... 49

3.2.5. Kết quả phân tích và so sánh trình tự cDNA của gen CCR .................. 50

3.2.6. Kết quả tạo plasmid tái tổ hợp pENTRTM

/D-TOPO® có gắn đoạn cDNA

của gen CCR và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5 ....................... 52

3.2.7. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp .................................................. 54

3.2.8. Kết quả phản ứng LR tái tổ hợp tạo plasmid pBENDER/CCR theo kĩ

thuật Gateway®

................................................................................... 55

3.2.9. Kết quả dòng hóa plasmid pBENDER/CCR vào tế bào E.coli DH5 .. 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 60



Phụ lục 1. Kết quả phân tích độ tƣơng đồng giữa 26 loài thực vật

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

1 Zea_mays

2 Arabidopsis_thaliana 0.49

3 Lycopersicon_esculentum 0.52 0.38

4 Hordeum_vulgare 0.17 0.42 0.49

5 Triticum_aestivum 0.18 0.43 0.51 0.05

6 Vitis_vinifera 1.00 0.94 0.86 0.91 0.96

7 Solanum_tuberosum 0.46 0.36 0.19 0.45 0.49 0.94

8 Saccharum_officinarum 0.07 0.48 0.53 0.15 0.19 0.98 0.47

9 Populus_trichocarpa 0.39 0.34 0.28 0.36 0.38 0.87 0.27 0.39

10 Prunus_persica 0.41 0.35 0.30 0.39 0.40 0.80 0.24 0.42 0.21

11 Capsicum_annuum 0.43 0.36 0.19 0.40 0.43 0.88 0.09 0.43 0.27 0.25

12 Fragaria_ananassa 0.39 0.34 0.32 0.38 0.41 0.89 0.25 0.41 0.25 0.16 0.25

13 Eucalyptus_globulus 1.34 1.31 1.24 1.25 1.24 1.63 1.28 1.40 1.28 1.33 1.22 1.33

14 Linum_album 0.39 0.36 0.33 0.39 0.41 0.87 0.31 0.41 0.27 0.29 0.30 0.28 1.27

15 Eucalyptus_gunnii 0.37 0.38 0.36 0.35 0.36 0.81 0.32 0.38 0.25 0.25 0.30 0.27 1.41 0.31

16 Eucalyptus_nudicaulis 1.34 1.29 1.24 1.23 1.24 1.61 1.28 1.38 1.25 1.35 1.21 1.34 0.03 1.28 1.41

17 Eucalyptus_chloroclada 1.37 1.32 1.25 1.26 1.25 1.63 1.28 1.40 1.29 1.38 1.21 1.37 0.04 1.31 1.44 0.02

18 Eucalyptus_brassiana 1.34 1.30 1.23 1.23 1.23 1.63 1.28 1.37 1.27 1.34 1.20 1.35 0.03 1.27 1.40 0.01 0.01

19 Eucalyptus_cordata 1.33 1.29 1.23 1.23 1.23 1.60 1.27 1.38 1.27 1.32 1.20 1.31 0.01 1.26 1.40 0.03 0.03 0.02

20 Eucalyptus_vicina 1.35 1.30 1.24 1.24 1.24 1.59 1.27 1.38 1.26 1.35 1.20 1.34 0.03 1.29 1.41 0.01 0.01 0.01 0.03

21 Eucalyptus_saligna 0.39 0.38 0.36 0.36 0.37 0.83 0.32 0.40 0.25 0.25 0.30 0.26 1.36 0.31 0.02 1.36 1.39 1.35 1.35 1.36

22 Eucalyptus_blakelyi 1.36 1.31 1.25 1.25 1.26 1.61 1.28 1.39 1.27 1.37 1.21 1.35 0.04 1.30 1.42 0.01 0.02 0.01 0.03 0.00 1.37

23 Eucalyptus_alba 1.32 1.29 1.23 1.21 1.22 1.67 1.31 1.36 1.27 1.34 1.23 1.32 0.03 1.28 1.40 0.02 0.03 0.02 0.03 0.02 1.35 0.03

24 Eucalyptus_punctata 1.32 1.26 1.22 1.21 1.21 1.57 1.26 1.35 1.24 1.32 1.20 1.30 0.03 1.25 1.38 0.03 0.03 0.02 0.02 0.03 1.33 0.03 0.02

25 Eucalyptus_grandis 1.36 1.29 1.23 1.23 1.25 1.59 1.28 1.39 1.28 1.35 1.21 1.34 0.03 1.27 1.39 0.01 0.02 0.02 0.03 0.02 1.35 0.02 0.02 0.02

26 Eucalyptus_urophylla 0.39 0.38 0.35 0.36 0.37 0.81 0.32 0.39 0.25 0.25 0.30 0.27 1.36 0.31 0.02 1.37 1.39 1.35 1.36 1.37 0.02 1.38 1.35 1.34 1.35


Phụ lục 2. Kết quả đăng ký trình tự gen CCR trên ngân hàng gen quốc tế

Documents

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ …i.vietnamdoc.net/data/file/2015/Thang07/01/gen-ma-hoa-cho-enzyme... · Hình 3.25. Kết quả cắt plasmid tái