ing. Ionuţ GOTEA

Studiul variabilităţii genetice cu

ajutorul markerilor moleculari la specia dioică Hippophaë rhamnoides L.

ssp. carpatica Rousi

Rezumat al tezei de doctorat

Conducător ştiinţific: Prof. Dr. Doru PAMFIL

Cluj-Napoca 2010

CUPRINS

Cuprins................................................................................................................................................ 1

Introducere ......................................................................................................................................... 3

Capitolul I. Stadiul actual al cunoaşterii.......................................................................................... 4

1.1. Importanţa economică şi culturală a speciei Hippophae rhamnoides....................................... 4

1.2. Stadiul actual al cunoaşterii ...................................................................................................... 5

Capitolul II. Cadrul şi obiectivele cercetărilor ................................................................................ 9

2.1. Particularităţi şi aspecte din zonele studiate ............................................................................. 9 2.2.1. Zona Deltei Dunării ..................................................................................................... 9 2.2.2. Judeţul Mureş ............................................................................................................. 10 2.2.3. Judeţul Cluj ................................................................................................................ 10

2.2. Concluzii privind amplasarea geografică ............................................................................... 12

2.3. Obiective propuse ................................................................................................................... 13

Capitolul. III. Materialul biologic şi metodele de lucru................................................................ 14

3.1. Materialul biologic ................................................................................................................. 14

3.2. Metode de determinare a apropierii genetice la genotipurile studiate.................................... 14

3.3. Metode de determinare a germinaţiei seminţelor ................................................................... 18

3.4. Metode statistico-matematice utilizate în prelucrarea şi interpretarea rezultatelor studiului variabilităţii fenotipice şi genotipice ............................................................................................. 20

3.5. Metode statistico-matematice utilizate în prelucrarea şi interpretarea rezultatelor studiului variabilităţii moleculare................................................................................................................. 20

3.6. Metode pentru determinarea conţinutului de substanţă uscată din fructe .............................. 21

Capitolul IV. Rezultate şi discuţii ................................................................................................... 23

4.1. Rezultate obţinute privind variabilitatea existentă la cătină, prin aplicarea metodelor de determinare a apropierii filogenetice............................................................................................. 23

4.1.1. Rezultatele aplicarii metodei taxonomice la genotipurile provenite din flora spontană, pe baza caracteristicilor plantelor şi semintelor ................................................................... 23

4.2. Rezultate obţinute privind variabilitatea existentă la cătină, prin studiul principalelor caracteristici ale seminţelor ........................................................................................................... 24

4.2.1. Caracteristicile seminţelor obţinute de la plantele din zona Deltei Dunării .............. 24 4.2.2. Caracteristicile seminţelor obţinute de la plantele din judeţului Mureş..................... 25 4.2.3. Caracteristicile seminţelor obţinute de la plantele din judeţului Cluj ........................ 25 4.2.4. Variabilitatea greutăţii seminţelor la populaţiile din cele trei zone luate în studiu.... 25

2

4.3. Rezultate obţinute privind variabilitatea existentă la catină prin aplicarea metodelor de markare moleculară ....................................................................................................................... 26

4.3.1. Rezultatele izolării ADN-ului .................................................................................... 27 4.3.2. Rezultatele amplificării ADN-ului............................................................................. 27 4.3.3. Dendrograma populaţiilor de cătină analizate din flora spontană.............................. 28

4.4. Rezultate obţinute privind variabilitatea existentă la cătină, prin studiul principalelor caracteristici ale fructelor .............................................................................................................. 31

4.4.1. Caracteristicile fructelor obţinute de la plantele din zona Deltei Dunării.................. 31 4.4.2. Caracteristicile fructelor obţinute de la plantele din zona judeţului Mureş ............... 32 4.4.3. Caracteristicile fructelor obţinute de la plantele din zona judeţului Cluj .................. 32 4.4.4. Variabilitatea greutăţii fructelor la populaţiile luate în studiu ................................... 32 4.4.5. Corelaţiile fenotipice dintre greutatea seminţelor şi greutatea fructelor în populaţiile studiate ................................................................................................................................. 33

4.5. Rezultate obţinute privind îmbunătăţirea capacităţii de germinaţie a seminţelor şi posibilitatea aplicării unor tratamente de creştere a procentului de germinare ............................. 34

4.5.1. Rezultate obţinute prin determinarea energiei germinative a seminţelor................... 34 4.5.2. Rezultate obţinute prin determinarea capacităţii de germinare a seminţelor ............. 35

4.6. Rezultate obţinute privind variabilitatea existentă la cătină, prin studiul substanţei uscate din fructe.............................................................................................................................................. 37

Capitolul V. Concluzii şi recomandări ........................................................................................... 38

Bibliografie selectivă ........................................................................................................................ 41

Introduction ...................................................................................................................................... 45

Proposed objectifs ............................................................................................................................ 45

Material and methods ...................................................................................................................... 46

Conclusions ....................................................................................................................................... 47

3

INTRODUCERE Teza de doctorat „ Studiul variabilităţii genetice cu ajutorul markerilor moleculari la specia

dioică Hippophaë rhamnoides L. ssp. carpatica Rousi” are ca obiect studiul variabilităţii fenotipice, genotipice şi moleculare la cătina albă (Hippophaë rhamnoides L. ssp. carpatica Rousi) în trei zone din ţara noastră în care acest arbust creşte în mod spontan, şi anume: judeţul Cluj, judeţul Mureş şi Delta Dunării.

Raportat la cercetările efectuate în ţara noastră până în prezent putem spune că acest studiu se distinge prin originalitate deoarece analiza la nivel molecular pentru această specie a fost făcută pentru prima dată în ţara noastră la această specie. Studiile anterioare, dintre care cel mai amănunţit fiind cel al botanistului Emil Ţopa (Ţopa 1960), si nici cele mai actuale, nu tratează din punct de vedere molecular variabilitatea acestei specii la noi în ţară. La nivel mondial, putem enumera ca şi elocvente în această privinţă studiile lui (Bartish et al. 1999) şi cel a lui (Kun Sun 2006) care tratează problematica variabilităţii genetice la nivel populaţional la alte două subspecii, şi anume subspecia rhamnoides şi sinensis. Rezultatele lor asemănătoare, confirmă rezultatele obţinute în prezenta teză de doctorat.

Motivaţia alegerii acestei teme se datorează dorinţei mele de cunoaştere a acestei plante şi de identificare a unor genotipuri valoroase care să poată fi introduse mai apoi în culturi intensive pentru producerea de fructe.

Toate plantele identificate la noi în ţară corespund subspeciei carpatica, identificate de către Rousi în 1971.

În cadrul tezei mele de doctorat, mi-am propus ca şi primă etapă identificarea pe criterii morfologice a unor genetipuri valoroase din punct de vedere al fructificaţiei, în ceea ce priveşte plantele femele şi din punct de vedere al numărului de muguri florali masculi, în ceea ce priveşte plantele mascule.

Am rămas surprins să constat cât este de mare variabilitate formelor şi a mărimii fructelor întâlnite la această specie în arealele cercetate, cât şi a numărului de amenţi la plantele mascule. Acest lucru este un fapt îmbucurător din punct de vedere al amelioratorului, din prisma numărului mare de posibilităţi de alegere al unor genetopuri valoroase.

Caracterizarea moleculară a indivizilor luaţi în studiu s-a realizat cu ajutorul markerilor RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA). Această etapă s-a desfăşurat în cadrul Departamentului de Biotehnologii al USAMV-Cluj-Napoca, având ca suport financiar grantul CNCSIS tip TD, pe care l-am câştigat în 2006 în cadrul competiţiei CNCSIS. În acelaşi an am obţinut şi o bursă CNCSIS BD pentru tineri doctoranzi care a contribuit de asemenea la finalizarea cercetărilor intreprinse.

Pe parcursul anilor de doctorat am depus o muncă consistentă de aducere din teren şi selectare a unor genotipuri valoroase, în special prin prisma puterii acestora de fructificare, în scopul utilizării lor ca genitori pentru crearea de plantaţii comerciale prin metode de înmulţire vegetative clasice, dar şi pentru selectarea unor genetipuri care să se preteze la modalităţile de înmulţire in vitro.

Selecţiile obţinute astfel au constituit punctul de plecare al unei alte teze de doctorat axată pe înmulţirea in vitro la cătină, activitate desfăşurată în cadrul Departamentului de Biotehnologii Vegetale, care deja are rezultate promiţătoare în acest domeniu, prezentate la simpozione de specialitate internaţionale.

4

CAPITOLUL I. STADIUL ACTUAL AL CUNOA ŞTERII

1.1. IMPORTANŢA ECONOMICĂ ŞI CULTURALĂ A SPECIEI HIPPOPHAE RHAMNOIDES

Cătina (Hippophaë rhamnoides L.) este o plantă vivace, un arbust dioic ce aparţine familei Elaeagnaceae. Acesta produce bace de culoare galbenă-portocalie, care au fost folosite de secole în Europa şi Asia. Habitatul natural al cătinei se întinde pe mari suprafeţe în China, Mongolia, Rusia, şi cea mai mare parte a Europei de Nord.

Este o plantă unică şi valoroasă cultivată actualmente în mai multe părţi ale lumii, inclusiv în Canada. Aceasta poate suporta temperaturi cuprinse între -43°C până la +40°C şi este considerat un arbust rezistent la secetă. Oricum, irigaţia este necesară în regiunile în care precipitaţiile nu depăşesc mai mult de 400 mm pe an (Chen et al. 2005).

Cătina dezvoltă rapid un sistem radicular extensiv, iar pentru acest lucru este considerată o plantă excelentă pentru prevenirea eroziunii solului. Cătina a fost folosită în amelioarea terenurilor pentru capacitatea sa de a fixa azotul şi de a păstra alte elemente esenţiale.

Cătina este un arbust foios, dioic, în mod obişnuit cu spini, ce atinge 2 - 4 m înălţime. Scoarţa este de culoare brună-cenuşie cu frunzişul de culoare verde-cenuşie. Dispoziţia frunzelor este alternă, subţiri, lanceolate, cu o culoare verde-argintie pe partea superioară. Sexul puieţilor nu se poate identifica până când aceştia încep să înflorească. Mugurii florali se formează în special pe ramuri în vârstă de trei ani, care diferenţiază în timpul sezonului precedent de vegetaţie.

Inflorescenţa masculă constă în 4-6 flori apetale. Inflorescenţa femelă constă într-o floare apetală cu un ovar şi un ovul. Planta depinde în întregime de polenizarea făcută de către vânt, nici una dintre flori, mascule sau femele, neavând nectarine, prin urmare nu atrag insectele (Prokkola 2003). Cătina este o plantă ideală pentru a controla eroziunea solului, ameliorarea terenurilor, mărirea habitatului sălbatic şi protecţia fermelor (Qinxiao and Zhao 2003).

Cătina este menţionată în scrierile vechilor învăţaţi greci ca Dioscorid şi Therophast. În vechea Grecie, cătina a fost cunoscută ca un remediu pentru cai. Frunzele şi lăstarii tineri au fost adăugate în hrana animalelor. Acest lucru a provocat o creştere rapidă în greutate şi un păr strălucitor al cailor. Astfel a luat naştere numele plantei, în latină 'Hippo' - cal, 'phaos' - a strălucii (Sanjai K. and Singh 2003).

Valoarea nutriţională şi medicinală a cătinei este în mare parte necunoscută în America de Nord. Oricum, proprietăţile sale au fost cunoscute şi exploatate în Eurasia de secole. Valoarea medicinală a cătinei a fost înregistrată în medicina tibetană clasică "rGyud Bzi" în cel de-al optulea secol. Există multe povestiri care expun minunatele proprietăţi ale cătinei ca un produs hrănitor şi revigorator. Pe baza acestor povestiri cât şi pe cercetările ştiinţifice, cătina a devenit un important produs medicinal şi nutriţional, în special în Rusia unde este cunoscută sub numele 'ananas siberian' sau 'Siberian pineapple' pentru gustul şi suculenţa sa (Natalia 2003).

Industria cătinei s-a dezvoltat în Rusia din anii 1940 când biologii au început să investigheze substanţele active găsite în fruct, frunze şi scoarţă. Prima fabrică rusă pentru dezvoltarea produselor pe bază din cătină a fost în Bisk. Produsele sale au fost folosite în dieta cosmonauţilor ruşi cât şi ca o cremă de protecţie împotriva radiaţiilor cosmice (Aksenova and Dolgacheva 2003).

Experienţa chineză în ceea ce priveşte producerea cătinei la scară mare este mai recentă, chiar dacă utilizările tradiţionale datează în urmă cu multe secole. Cercetările şi plantaţiile au fost începute în anii 1980. Începând cu 1982 peste 300.000 hectare cu cătină au fost plantate în China. Pe lângă acest lucru, 150 de fabrici pentru procesarea acesteia au fost create care produc un sortimen de 200 de produse (Huang 2003).

5

1.2. STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII

Obiectivul major al cercetărilor care au fost întreprinse pe plan naţional în ţara noastră a fost introducerea şi popularizarea culturii cătinei în sistem comercial. În prima perioadă (1975-1989), a fost explorată flora spontană a României, zonele deluroase din jurul munţilor Carpaţi şi din jurul Mării Negre. Au fost identificate numeroase biotipuri ale subspeciei carpatica şi aduse la Institutul de Cercetare Piteşti Mărăcineni.

Cele mai valoroase şi interesante biotipuri au fost înmulţite şi plantate în loturi experimentale. În cea de-a doua perioadă (1989-1999), munca de cercetare s-a canalizat spre îmbunătăţirea şi stabilirea tehnologiei de cultivare: distanţe şi sisteme de plantare, conducerea şi tăierea arbuştilor, metode de înmulţire şi recoltare eficiente. Institutul a studiat caracteristicile varietăţilor şi selecţiilor indigene şi exotice, caracteristicile biochimice ale fructelor diferitelor biotipuri, precum şi alte caracteristici.

Au fost făcute de asemenea studii privind procesarea fructelor şi diferitele utilizări ale produselor pe bază de cătină (studii de nutriţie, utilizări medicinale şi cosmetice).

Obiectivele care trebuie urmărite în continuare şi pe care se va axa Institutul de Cercetare pentru Pomicultură Piteşti-Mărăcineni sunt:

1. Conservarea, evaluarea şi dezvoltarea resurselor genetice de catină; 2. Înfiinţarea plantaţiilor de cătină cu varietăţi care să aibă următoarele caracteristici:

productivitate bună, fructe mari şi cu pedicel lung pentru uşurarea recoltării (pentru recoltat manual sau scuturare), şi cu randament mare la sortare;

3. Identificarea unor noi genotipuri valoroase din flora neexplorată a României; 4. Analize mai detaliate asupra compoziţiei fructelor (carotenoizi, uleiuri, aminoacizi şi alte

componente); 5. Studii cu privire la efectele plantaţiilor de catină asupra ameliorării caracteristicilor fizice

şi chimice ale solului; 6. Studii asupra asocierii simbiotice dintre plante, ciuperci şi bacterii. Pe plan international cercetările în acest domeniu sunt mult mai avansate decat în ţara noatră,

guvernele străine investind din ce în ce mai mulţi bani în programele de cercetare care studiază această specie.

Dintre ţările care au deja o tradiţie în cultivarea cătinei putem enumera: Rusia, Suedia, China şi mai nou Canada.

Astfel, în Rusia regăsim pe un loc aparte între arbuştii fructiferii cultivaţi, cătina albă (Hippophaë rhamnoides L.). Industria cătinei se dezvoltă tot mai mult începând din anii '40, iar in anii următori va fi înfiinţată prima fabrică ce va folosi exclusiv ca materie prima cătina. Amelioratorii din Rusia încearcă crearea unor varietăţi cu productivitate mare şi de calitate deosebită care se pretează pentru recoltatul mecanizat deoarece culesul manual implică costuri economice deosebit de ridicate.

La Institutul de Genetică şi Citologie, împreună cu Staţiunea Regională pentru Pomicultură Novosibirsk, au fost create varietăţi noi având o perioadă diferită de coacere pentru diferite utilizări, ce corespund principalelor cerinţe agrotehnice ale recoltatului mecanizat: fructe tari, care pot fi culese împreună cu peţiolul (desprindere uscată).

Pentru crearea acestor varietăţi s-au folosit metode moderne de genetică şi citologie. O alta ţară cu tradiţie veche deja în cultura catinei este Suedia (Rousi 1965) unde scopul

principal al cercetării cătinei este introducerea acestei plante în culturile comerciale din Suedia.

6

Activităţiile cuprind: ameliorarea plantelor, dezvoltarea sistemelor de cultură, recoltatul mecanizat, analiza calitativă a fructelor şi analiza diversităţii genetice (Bartish et al. 2002).

În programele de ameliorare sunt folosite cu precădere varietăţi din Rusia şi plante din flora spontană a Europei de Nord. La Balsgård există o colecţie mare de germoplasmă pentru evaluarea şi ameliorarea cătinei.

Pentru culturi la scară mare în Suedia este necesar recoltatul mecanic. În acest scop, unul din obiectivele de ameliorare este adaptabilitatea la recoltatul mecanizat. Au fost testate diferite maşini de recoltat şi au fost înfiinţate plantaţii speciale în acest scop la Balsgård şi la Staţiunea experimentală Torslunda.

Recent a fost descoperit un marker molecular pentru identificarea sexului (Persson and Nybom). Din nefericire, acesta nu a fost universal şi sunt necesare noi studii în continuare. A fost urmarită de asemenea diversitatea genetică din populaţiile sălbatice de cătină (ssp. rhamnoides) pentru a obţine informaţii care pot fi folosite la colecţiile de germoplasmă şi conservare (Bartish et al. 1999).

Cercetătorii din Suedia susţin că pe viitor este necesar să se continue munca de ameliorare şi dezvoltare a tehnicilor de cultură. Se vor intensifica studiile pentru calitatea fructelor şi factorii care o influenţează.

O altă ţară cu tradiţie în cultura cătinei este China. Cu toate că, medicina tradiţională chineză menţionează cătina ca fiind o plantă valoroasă, plantaţiile comerciale de cătină au fost înfiinţate începând cu anii 1980. De atunci au fost plantate 300.000 ha cu cătină, înfiinţate peste 150 de fabrici de transformare care produc nu mai puţin de 200 de produse pe bază de cătină.

În ultimii ani, guvernul chinez a acordat multă atenţie cercetării ştiinţifice pentru catină şi extinderea sa la scară naţională. Domeniile de interes sunt: studii asupra biologiei şi ecologiei cătinei, analize fizico-chimice, cercetări aplicate în plantaţiile de cătină, efectul asupra conservării solului şi apei, ameliorarea cătinei, procesarea şi dezvoltarea produselor alimentare şi medicinale .

Totuşi, persistă probleme precum cele legate de standardele ştiinţifice şi lipsa de orientare a pieţei.

În prezent, sunt două domenii de interes ale Chinei în studiul cătinei şi anume: 1. Cercetarea germoplasmei şi colectarea acesteia, ameliorarea pe baza studiilor efectuate,

pentru a stabili condiţiile de bază pentru schimbul de germoplasmă existent şi pentru cercetarea în cooperare pentru a dezvolta produse la scară internaţională (împreună cu Institutul de Biologie din Chengdu, Academia Chineza de Ştiinţe);

2. Cercetarea şi dezvoltarea de produse cu înaltă valoare alimentară şi medicinală. Scopul este acela de a obţine rezultate clinice cu ajutorul tehnologiei moderne, pentru a creşte importanţa cătinei în medicină şi în aplicaţiile acesteia.

Cercetătorii chinezi afirmă că este necesar ca, în viitor sa fie abordate următoarele probleme: 1. Studii de piaţă în China şi în lume referitoare la produsele pe bază de cătină; 2. Determinarea optimului de cules a cătinei în diferitele regiuni ale Chinei şi dezvoltarea

echipamentului de stocare şi recoltare; 3. Ameliorarea cătinei pentru scopuri economice şi ecologice; 4. Studierea fenomenului de fixare a azotului de către cătină şi aplicaţiile acestuia; 5. Dezvoltarea metodelor de multiplicare vegetativă pentru varietăţile superioare; 6. Gestionarea plantaţiilor comerciale. Ţara care înregistrează plantaţii recente de cătină la scară mare este Canada. Baza genetică

de ameliorare din Canada este constituită de germoplasma de la PFRA Shelterbelt Centre, Manitoba, Saskatchewan care cuprinde 2000 de fenotipuri reprezentând 4 specii şi 5 subspecii de Hippophaë.

7

Indivizii cu caracteristici fenotipice dorite vor fi selectaţi şi folosiţi în programele de ameliorare (Thomas 2008).

Obiectivele urmărite sunt: obţinerea unor forme cu creştere pitică, lipsa spinilor, drajonarea redusă, forma tulpinii şi caracteristicile fructelor.

Pentru selecţia exemplarelor se vor evalua exemplarele din ambele sexe selectate în ultimii ani.

Astfel, se vor realiza următoarele activităţi: înmulţirea varietăţilor selectate, efectuarea de teste în 6 locaţii diferite şi analiza detaliată a fructelor, florilor, polenului şi seminţelor în laborator.

Cultivarele femele: Scopul este de a crea cultivare cu producţie mare, compacte, fără drajonare, spini puţini şi care pot fi culese eficient mecanic.

Cultivarele sunt selectate folosind un scuturător de crengi care a fost dezvoltat în Letonia . Obiectivele de ameliorare la arbuşti sunt: rezistenţa la ger, drajonarea slabă, tulpina unică cu

ramuri puternice, forma compactă de coroană, fructele localizate în jurul ramurilor principale, mărimea mare a frunzelor.

Obiectivele de ameliorare la exemplarele femele sunt: productivitatea, mărimea, caracteristicile de desprindere, zaharuri solubile totale, conţinutul în vitamine (C&E), conţinutul în uleiuri şi caroten şi maturarea târzie.

Legat de exemplarele mascule, scopul este acela de a crea cultivare mascule rezistente la ger, cu înflorire abundentă şi cu producţie mare de polen. Pentru a ajuta polenizarea facută de vânt, cultivarele mascule selectate trebuie sa fie mai mici decat cele femele.

O parte din cercetările canadiene se axează pe studiul conţinutului în uleiuri a fructelor de cătină. Proprietăţile fizico-chimice ale seminţelor de cătină (conţinutul iniţial de ulei) sunt determinate folosind spectroscopia cu rezonanţă magnetică nucleară (NMR) .

Este cunoscut faptul că, calitatea uleiului din seminţe la culturile oleaginoase şi la plantele horticole, este controlată genetic, fiind exprimată în compoziţia uleiului fiecărei seminţe. Deoarece cătina este o plantă dioică, seminţele individuale ale diferitelor plante sau populaţii, şi seminţe colectate de pe aceeaşi plantă sunt diferite din punct de vedere genetic, şi deci, heterogene pentru conţinutul în ulei.

Această variaţie poate să fie utilizată comercial prin selectarea individuală a seminţelor, urmată de regenerarea plantelor din seminţele care conţin uleiuri în cantitate mare şi cu calităţi superioare. Pentru acest lucru este necesar să se evalueze seminţele în mod individual, într-o manieră nedestructivă. Plantele cu calităţi deosebite sunt înmulţite vegetativ pentru a înfiinţa plantaţii superioare. Rezonanţa magnetică nucleară (NMR) permite analiza nedestructivă a seminţelor într-un timp foarte scurt şi cu costuri mai mici comparativ cu analizele traditionale: gaz-cromatograf (GC) şi cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC).

Un alt domeniu de studiu în Canada îl constituie dezvoltarea şi verificarea sistemelor de tăiere care vor uşura recoltatul mecanic folosind scuturătoare de fructe (tulpini sau ramuri) şi controlul drajonării prin metode chimice şi mecanice.

Alte proiecte în desfăşurare sunt: dezvoltarea metodelor de cules mecanic, determinarea cerinţelor de irigare şi fertilizare, şi metode pentru controlul buruienilor.

În ceea ce priveşte modalităţile de înmulţire ale acestei specii sunt dezvoltate metode pentru multiplicare vegetativă, în special butăşirea cu butaşi lignificaţi şi semilignificaţi.

Factorii care sunt analizaţi sunt: alegerea locului de recoltare a butaşilor, mediul de înmulţire, tratamentele prealabile înrădăcinării şi facilităţi de înmulţire.

Pentru studii viitoare, cercetătorii canadieni vor aborda următoarele aspecte: 1. Dezvoltarea sistemelor de recoltat mecanizat;

8

2. Dezvoltarea metodelor de manipulare a fructelor şi a echipamentelor pentru a asigura calitatea optimă a fructelor;

3. Elaborarea de standarde pentru controlul calităţii (la nivel mondial) pentru a asigura produse sigure;

4. Studii clinice pentru a valida calitaţile atribuite cătinei; 5. Utilizarea cătinei pentru fito-remedierea mediului poluat; 6. Dezvoltarea tehnicilor de multiplicare in vitro; 7. Biologia moleculară cu transfer de gene şi amprente ADN; 8. Selecţia pentru rezistenţa la dăunători şi boli.

9

CAPITOLUL II. CADRUL ŞI OBIECTIVELE CERCET ĂRILOR

Cadrul de recoltare a plantelor din flora spontană este reprezentat de trei zone din ţara noastră, respectiv zona Deltei Dunării (localitatea Periprava de la capătul Braţului Sulina, pădurea Letea şi localitatea Sfântu Gheorghe de pe bratul Dunării cu acelaşi nume); Judeţul Mureş (localităţile Socol, Crăieşti, Fărăgău); Judeţul Cluj (zonele limitrofe oraşului Cluj-Napoca, localitatea Cătina, localitatea Nicula).

Toate plantele au fost recoltate din flora spontană, din areale naturale, în care intervenţia omului nu poate fi observată iar plantele se regăsesc în habitusul lor natural.

2.1. PARTICULARITĂŢI ŞI ASPECTE DIN ZONELE STUDIATE

2.2.1. Zona Deltei Dunării

Amintită de Ţopa (1960) ca fiind prezentă în această zonă, cătina albă este extrem de răspândită în Delta Dunării, unde creează în perioada de toamnă prin coloritul portocaliu plăcut al fructelor peisaje deosebit de pitoreşti. Zonele cercetate în prezentul studiu au fost localitatea Periprava, Pădurea Letea, Localitatea Sfântu Gheorghe.

Localitatea Sfântu-Gheorghe se intinde pe partea stângă a pe celui mai vechi braţ al Dunării - Sfântu-Gheorghe, în apropierea gurii de vărsare a Dunării în Marea Neagra. Pe o suprafaţă administrativă de 60575,87 ha, comuna este alcatuită din aproximativ 358 gospodarii în care trăiesc aproximativ 971 oameni ce şi-au păstrat tradiţiile şi limba ucraineană.

Aflată în extremitatea estică a Deltei Dunării, localitatea Sfântu-Gheorghe este situată în partea de est a judeţului Tulcea la 120 Km de Tulcea pe braţul Sfântu-Gheorghe şi la 35 Km de orasul Sulina. Comuna este delimitată la nord de comuna Crişan şi orasul Sulina, la est şi sud de Marea Neagră, iar la vest de comuna Murighiol.

Clima este continentală cu veri călduroase, ierni geroase cu vânturi puternice, temperatura medie anuala de 11°C, iar cantitatea medie de precipitaţii este de 440l/mp anual.

Accesul în localitate este posibil doar naval. Se poate lua vaporul din portul Tulcea (Tulcea - Sfântu-Gheorghe 4h), portul Mahmudia (Mahmudia - Sfântu-Gheorghe 2h 30’) sau portul Murighiol (Murighiol - Sfântu-Gheorghe 2h).

Biotopurile care adăpostesc acestă plantă sunt diverse, dar de cele mai multe ori ea apare pe digurile de pe marginea canalelor şi chiar la malul mării.

Alteori apare în luminişurile pădurii din zona Sf. Gheorghe dar mai ales pe teren deschis, neînpădurit, unde se poate desfăşura în voie.

O populaţie abundentă şi deosebit de valoroasă se află pe insula Sacalin, unde localnicii străbat distanţe mari cu barca pentru a recolta uşor fructe de calitate bună şi foarte mari spre deosebire de restul zonelor.

Localitatea Periprava aparţine de comuna C.A. Rosetti, situată în judeţul Tulcea. Aceasta se află la limita nordică a grindului Letea, la 120 km de Tulcea fiind punctul terminus al navigaţiei fluviale de pasageri.

Din Periprava, pe uscat, se poate porni către Sulina, trecând prin aşezarea Cardon, precum şi spre localitatea Letea, în apropierea căreia se află rezervaţia naturală Pădurea Letea (circa 8 km de Periprava).

10

În zona Periprava ea apare frecvent pe digurile canalelor, mai rar pe terenurile mai secetoase, în zona uscată. Porţiunile ocupate de către un individ sunt mai mari decât cele din zona Sf. Gheorghe.

Întâlnită mai ales pe digurile canalelor, în această zonă, cătina formează adevărate cordoane de nestrăbătut. Populaţiile sunt mult mai compacte decât în zona Sf. Gheorghe, în această zonă apărând şi exemplare arborescente. Ca notă generală, plantele au o talie mult mai mare decât în restul zonelor vizitate.

Pădurea Letea ( 2825 ha ) : Pădurea Letea este situată în partea de nord a Deltei, la est de

comuna C.A.Rosetti. Zona strict protejată cuprinde doar o parte din suprafaţa totală a pădurii, parte ce a fost pusă sub ocrotire înca din anul 1930 şi devenită rezervaţie naturală începând cu 1938.

Pădurea s-a dezvoltat sub forma unor fâşii late (“hăşmacuri”) în spaţiile dintre dunele de nisip şi este formată din stejar de luncă, stejar brumăriu, plop alb, frasin de luncă, tei alb.

O caracteristică a pădurii o constituie abundenţa de plante căţărătoare: viţa sălbatică, hameiul, curpenul de pădure şi nu în ultimul rând liana grecească (Periploca graeca), cea care dă pădurii un aspect mediteranean. Totodata, aici au fost identificate peste 2.000 de specii de insecte, vipera de nisip (Vipera ursinii), vulturul codalb (Haliaeetus albicilla) - care cuibăreşte aici, trei specii de şoim, corbul, etc.

Toate aceste specii de plante şi animale, unele dintre ele foarte rare sau cu caracteristici deosebite au făcut ca această pădure să necesite o atenţie deosebită pentru conservarea şi păstrarea valorilor ei naturale.

2.2.2. Judeţul Mure ş

În Judeţul Mureş, judeţul meu natal, am cercetat zonele din jurul localităţilor Crăieşti, Fărăgău şi Socol. Aceste zone se caracterizează printr-un relief colinar de podiş, cu dealuri predominant lipsite de vegetaţie forestieră, unde cătina formează cătinişuri puternice pe suprafeţe întinse.

În regiunea dealurilor carpatiene (Ţopa 1960), situate pe zona flişului, între Olt şi Bistriţa, apare din nou Hippophaë rhamnoides, încetăţenită pe prundişuri, aluviuni, maluri, terase, ori pe câmp. În regiunea aceasta, cătina albă ocupă suprafeţe mult extinse faţă de cele din Delta Dunării. Pe unele porţiuni, cătinişurile albe ocupă 15% din suprafaţa totală a zăvoaielor. Ca şi în Delta Dunării, cătinişurile de aici formează mai multe variante. Prin produsele lor, ele acoperă o bună parte din nevoile în lemn ale locuitorilor, încât merită să fie cunoscute mai îndeaproape.

În această zonă am întâlnit-o frecvent în locurile scurse de apă, pe versanţi însoriţi cu expoziţie sudică, unde datorită drajonării puternice formează grupuri în care abia poate intra un om neînarmat cu unelte pentru tăiat.

2.2.3. Judeţul Cluj

În această zonă am prospectat localităţile Cătina, Nicula şi împrejurimile oraşului Cluj-Napoca.

Comuna Cătina este situată în Câmpia Fizeşului, pe cursul superior al râului Fizeş, în partea estică a judeţului Cluj, la graniţă cu judeţul Bistriţa-Năsăud spre est şi sud-est. Se învecinează la nord cu comuna Buza, la vest cu comuna Geaca, iar în partea de sud-vest cu comuna Cămăraşu, toate cele trei comune fiind situate în judeţul Cluj.

11

Comuna se află la 60 km de Cluj-Napoca şi 35 km sud-est de Gherla, legătura cu cele două oraşe realizându-se pe direcţia nord-vest - sud-est de drumul judeţean 109C Gherla-Cămăraşu-Mociu-Cluj. Drumul comunal DC 18 face legătura între comuna Cătina şi comuna Buza din judeţul Cluj.

Relieful comunei este tipic Câmpiei Transilvaniei, fiind o îmbinare ondulatorie de dealuri şi depresiuni largi, uşor înclinate dinspre hotarele de margine ale comunei spre Lacul Cătina.

O caracteristică a reliefului local este forma de amfiteatru natural ale cărui margini sunt o cunună de dealuri mai înalte, care înconjoară spaţiul geografic comunal şi separă prin culmile lor hotarele Cătinei de celelalte comune învecinate Buza şi Cămăraşu.

Dealurile - cu altitudine cuprinsă între 300 şi 550 m -şi depresiunile au fost modelate prin eroziunea precipitaţiilor şi a apelor curgătoare, în erele geologice în roci moi, argile, marne şi nisipuri.

Spaţiul geografic al comunei Cătina este străbătut de o modestă reţea hidrografică formată din pâraie, văi şi Lacul Cătina.

Valorile climatice în zonă, sunt specifice Podişului Transilvaniei şi respectiv Câmpiei Transilvaniei, temperatura medie anuală fiind de +8,2 grade Celsius. Caracteristic acestei zone sunt vânturile de vest, solurile cernoziom levigat, solurile brune de pădure şi solurile brune de fânaţe.

Condiţiile de relief, sol şi climă au determinat o vegetaţie specifică de silvostepă reprezentată de vegetaţie de lac şi teren mlăştinos (papură, stuf, pipirig, stânjeni de baltă), vegetaţie de păşune şi fâneaţă pe dealuri şi vegetaţie de pădure (stejar, gorun, salcâm, arbuşti etc.).

Localitatea Cătina, este o zonă bogată în plante, de unde derivă şi numele localităţii. Din păcate calitatea plantelor nu iese în evidenţă faţă de celelalte zone ale ţării, ca de altfel şi toată zona judeţului, care se caracterizează prin plante de cătină care sunt greu accesibile, cu drajonare extrem de puternică.

Satul Nicula este o localitate ce aparţine de comuna Fizeşu Gherlii, judeţul Cluj, în partea de nord-est a teritoriului administrativ al comunei şi a judeţului Cluj. Este aşezat într-o vale strâmtă înconjurată de dealuri din toate părţile. Se află la o distanţă de 3 km de municipiul Gherla, la 17,6 km de municipiul Dej şi la 52 de km de municipiul Cluj-Napoca. Accesul dinspre Cluj-Napoca se poate face pe drumul european E 576 până la Gherla, apoi pe drumul judetean 109 D, iar prin sat până la Mănăstire, pe drumul comunal DC 15

Relieful este specific unei zone deluroase. Dealurile care înconjoară satul nu depăşesc 300 m altitudine şi erau în trecut acoperite cu vii şi livezi de pomi fructiferi. Acestea sunt pe alocuri împădurite, iar cele dinspre est sunt erodate din cauza apelor ce provin de la ploile care cad, mai ales primăvara şi toamna. Câmpiile lipsesc, dar sunt suplinite de câteva lunci mai joase care sunt folosite ca fâneţe naturale.

Municipiul Cluj-Napoca este situat în zona centrală a Transilvaniei, având o suprafață de 179,5 km². Situat în zona de legătură dintre Munţii Apuseni, Podişul Someşan şi Câmpia Transilvaniei, oraşul este plasat la intersecţia paralelei 46° 46’ N cu meridianul 23° 36’ E. Se întinde pe văile râurilor Someşul Mic şi Nadăş şi, prin anumite prelungiri, pe văile secundare ale Popeştiului, Chintăului, Borhanciului şi Popii. Spre sud-est, ocupă spaţiul terasei superioare de pe versantul nordic al dealului Feleac, fiind înconjurat pe trei părţi de dealuri şi coline cu înălţimi între 500 şi 825 metri.

12

2.2. CONCLUZII PRIVIND AMPLASAREA GEOGRAFICĂ

Din prezentarea celor trei zone putem observa marea plasticitate de adaptare a speciei pe care o putem întâlnii de la malul mării şi până la mari altitudini (Sinaia).

Cătina albă, în virtutea marei ei puteri de deseminaţie şi regenerare, se ridică de-a lungul văilor, până la altitudinea de 1.100 m, cariera "Piatra Arsă" de la Gîrbova, dintre Sinaia şi Poiana Ţapului, din M-ţii Bucegi. Ea trebuie socotită ca un pionier de primul rang ce poate fixa nisipurile mobile, ameliora terenurile neproductive prin azotul elaborat de bacteriile nitrificante (Schinzia alni), ce trăiesc pe rădăcinile ei.

Mai bine de jumătate de an, fructele cătinei albe oferă hrană abundentă şi de calitate pentru vrăbii, ciocănitoare, corbi, ţărci, gaiţe, stăncuţe alpine, ciori, sturzi, etc. Seminţele ei, trec aproape nevătămate prin tubul digestiv al păsărilor. Odată cu ivirea anotimpului prielnic, cînd temperatura urcă şi se menţine între 5 - 30o C, seminţele germinează în curs de 7 - 60 de zile.

C tina

Nicula

Cluj-Napoca

SocolF r

Cr

Sf. Gheorghe

Periprava

Fig. 1. Zonele studiate reprezentate în roşu pe harta României

Fig. 1. The studied areas represented in red on the Romania map

În raport cu cele trei zone există diferenţieri fenotipice pentru toate aspectele plantelor, dar cele mai evidente, şi tot odată cele mai interesante sunt cele legate de habitusul plantelor. Astfel, putem observa, că în zona Sf. Gheorghe portul plantelor este mai mic, capacitatea de drajonare mai redusă, întâlnim exemplare isolate cu o frecvenţă mult mai mare decât în celelalte zone. Tot odată, şi

13

fructificaţia acestor plante este mai abundentă, prezentă pe ramurile de ordin doi sau trei şi rareori pe tulpina principala. Aceste lucruri constituie avantaje deosebite ce trebuie să fie luate în considerare la formarea unei varietăţi clonale. De asemenea densitatea spinilor nu este aşa de mare în comparaţie cu plantele din celelalte zone.

Spre deosebire de zona Deltei, zona Podişului Transilvaniei ne pune în faţa unor tufe de cătină compacte, foarte greu de străbătut, cu drajonare puternică, care au o rază de raspândire uneori de 20m. Fructificarea acestor plante este prezentă în cea mai mare parte pe axul principal şi mai puţin pe ramuri de ordin doi. Fructifică exemplarele care se găsesc în in mijlocul tufelor, fapt care îngreunează în plus recoltarea fructelor.

De asemenea, faţă de zona maritimă şi de Deltă, plantele mascule nu dezvoltă un frunziş la fel de bogat şi de mare. Drajonarea la plantele mascule este tot aşa de puternică în Podişul Transilvan faţă de zona maritimă.

Având în vedere considerentele enumerate mai sus, putem recomanda fără tăgadă, ca alegerea unor genitori pentru introducerea acestei plante în cultură să se facă din zona Sfântu Gheorghe.

2.3. OBIECTIVE PROPUSE

Datorită interesului deosebit acordat actualmente acestei specii, ne-am propus ca în cadrul doctoratului să studiem din punct de vedere al variabilităţii fenotipice şi genotipice a materialului biologic recoltat din flora spontană din cele trei zone amintite anterior în vederea selectării de genotipuri valoroase din punct de vedere al fructificării (la plantele femele) şi din punct de vedere a producţiei de polen (la plantele mascule) în vederea introducerii ulterioare în circuitul comercial.

Evaluarea fenotipică şi genotipică a presupus analiza caracterelor cantitative şi calitative a genotipurilor luate în studiu, prelucrarea datelor experimentale prin analiza varianţei, aprecierea variabilităţii caracteristicilor pe baza coeficienţilor de variabilitate, estimarea corelaţiilor dintre caracteristicile studiate, prin calculul coeficienţilor de corelaţie.

Evaluarea la nivel molecular s-a realizat prin markarea moleculară PCR-RAPD (Random Amplified Polymorphic, ADN polimorfic amplificat la întâmplare), presupunând testarea primerilor RAPD, extracţia ADN la materialul analizat, efectuarea amplificărilor PCR cu primerii RAPD.

Analiza variabilităţii fenotipice şi genotipice, a urmărit selecţia genotipurilor considerate valoroase, ca şi producţie de fructe, respectiv producţiei de polen. Formele identificate pentru particularităţile lor valoroase s-au utilizat ca genitori, pentru înmulţirea acestora in vitro. Din păcate, din datele pe care le avem până în prezent, nu toţi din aceşti genitori selectaţi, prezintă pretabilitate pentru acest gen de înmulţire.

14

CAPITOLUL. III. MATERIALUL BIOLOGIC SI METODELE DE LUCRU

3.1. MATERIALUL BIOLOGIC

Materialul biologic folosit la determinări a fost recoltat din zona spontană din trei zone ale ţării: Delta Dunării, Judeţul Cluj şi Judeţul Mureş. Aceste zone nu acoperă nici pe departe întregul areal al speciei în ţara noastră, el fiind mult mai larg (vezi cap. 2.2)

Populaţiile au fost împărţite în trei grupe, funcţie de regiunea din care provin. Prima grupă cuprinde populaţiile din Delta Dunării: P1 (Periprava), P2 (Sfântu Gheorghe) şi P3 (Pădurea Letea). A doua grupă cuprinde populaţiile din judeţul Mureş: P4 (Fărăgău), P5 (Crăieşti), P6 (Socol). A treia grupă cuprinde populaţiile din judeţul Cluj: P7 (zonele limitrofe oraşului Cluj-Napoca), P8 (Cătina), P9 (Nicula).

Localizarea acestor populaţii şi numărul de indivizi recoltaţi din fiecare loc sunt prezentate în Tabelul 18.

Tabelul 1/Table 1 Identificare populaţiilor studiate, zona de amplasare şi numărul de indivizi

Identification of the studied populations, area of amplasament and the number of individuals

Numărul populaţiei Population

number

Numărul de indivizi

Individuals number

Locaţia Location

Altitudinea Altitude

P1 18 Loc. Periprava, Delta Dunării 4 P2 19 Loc. Sf. Gheorghe, Delta Dunării 3 P3 22 Pădurea Letea, Delta Dunării 15 P4 20 Loc. Fărăgău, Jud. Mureş 400 P5 21 Loc. Crăieşti, Jud. Mureş 350 P6 19 Loc. Socol, Jud. Mureş 450 P7 20 Oraşul Cluj-Napoca, Jud. Cluj 540 P8 19 Loc. Cătina, Jud. Cluj 400 P9 20 Loc. Nicula, Jud. Cluj 300

Din fiecare populaţie a fost recoltat aproximativ un număr de aproximativ 20 de indivizi, atât

plante mascule cât şi femele, la un interval de cel puţin 50 de m, pentru a preveni recoltarea frunzelor de la acelaşi individ.

Au fost recoltate frunze proaspete care au fost puse în câmp în pungi separate cu silicagel.

3.2. METODE DE DETERMINARE A APROPIERII GENETICE LA GENOTIPURILE STUDIATE

Toate genotipurile studiate în prezenta cercetare au fost analizate utilizând următoarele metode de determinare a apropierii filogenetice: metoda sistematică (taxonomică) şi metoda markerilor moleculari.

15

3.2.2.1. Materialul vegetal utilizat pentru izolarea ADN-ului

Materialul vegetal a fost constituit din 178 de probe cu diferite provenienţe (vezi tabel provenienţe). De la toate aceste provenienţe s-au recoltat frunze tinere în teren care au fost puse în pungi de plastic cu silicagel, iar la întoarcerea în laborator aceste pungi au fost puse în congelator la – 80◦ pentru păstrare (Gotea et al. 2010).

3.2.2.2. Izolarea ADN-ului

Extracţia ADN-ului genomic s-a efectuat în laboratorul de Genomică al Departamentului de Biotehnologii Vegetale, al Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj-Napoca (USAMV-CN).

Procesul de izolare al ADN-ului a cuprins trei etape majore, şi anume: distrugerea integrităţii celulare (liza celulară) şi eliberarea ADN-ului într-un omogenat, numit lizat celular, purificarea unui anumit tip de ADN de restul ADN-ului prezent eventual în lizat, precum şi de ARN, proteine şi alţi compuşi metabolici şi realizarea unei soluţii de ADN de concentraţie dorită şi de puritate cunoscută.

Procesul de izolare al ADN-ului la toate variantele de studiu s-a realizat utilizând protocolul de extracţie ADN a lui (Ge et al. 1999) îmbunătăţit de către (Sun et al. 2006)

Lista reactivilor şi a soluţiilor necesare parcurgerii protocolului de extracţie ADN este prezentată în Anexa I.

Protocolul de izolare al ADN-ului

1. Frunzele uscate au fost mojarate cu azot lichid într-o pulbere fină în tuburi Eppendorf de 1.5 ml

2. S-a repartizat 750 µl tampon de extracţie 2X CTAB care conţine mercaptoetanol (menţinut la 65oC) în fiecare tub şi s-au inversat tuburile de câteva ori pentru a omogeniza amestecul.

3. S-au aşezat probele pe baia marină la 65oC timp de 30 minute şi s-au agitat prin inversare la intervale de aproximativ 5 minute. După aceasta, s-au răcit tuburile la temperatura camerei.

4. S-a adăugat 750 µl de cloroform: alcool izoamilic (24 : 1, v/v) şi s-a amestecat uşor prin inversarea tuburilor timp de 5 minute până la obţinerea unei emulsii.

5. Centrifugarea s-a făcut la 10 000 rpm timp de 5 minute. 6. S-a transferat faza apoasă într-un alt tub steril. Daca faza apoasă este tulbure, se

recomandă repetarea extracţiei cu cloroform: alcool izoamilic (etapele 4-6). 7. S-au adăugat 2/3 volume de alcool izopropilic menţinut în congelator la -20ºC şi s-

au pus tuburile în frigider la 4-6ºC timp de 15-20 minute, până când filamentele de ADN au devenit vizibile în soluţie.

8. S-a centrifugat la 3000 rpm timp de 3 minute, şi apoi s-a mărit viteza la 11 000 rpm pentru încă 5 minute.

9. S-a îndepărtat cu grijă supernatantul, fără a desprinde sedimentul de ADN de pe pereţii tubului Eppendorf.

10. S-au adăugat 500 µl alcool etilic 70% menţinut la 0-4oC.

16

11. S-a centrifugat din nou la 10 000 rpm timp de 5 minute şi s-a îndepărtat cu grijă supernatantul.

12. Tuburile deschise s-au aşezat în hota sterilă pentru evaporarea alcoolului timp de aproximativ 20-30 minute.

13. S-a redizolvat sedimentul de ADN în 100 µl de soluţie tampon TE 1X. ADN-ul obţinut s-a păstrat în congelator la temperatura de -20ºC.

3.2.2.3. Purificarea ADN-ului şi prepararea soluţiei de ADN Din punct de vedere practic, purificarea ADN-ului presupune: îndepărtarea din lizat a tuturor

componenţilor, cu excepţia ADN-ului, fracţionarea ADN-ului, adică separarea diferitelor specii de ADN în categorii distincte.

Cele două aspecte nu se constituie neapărat în evenimente separate. De altfel, procesul de purificare al ADN-ului poate să înceapă încă din stadiul de formare al lizatului celular.

Îndepărtarea (după formarea lizatului) tuturor biomoleculelor şi substanţelor care constituie contaminanţi ai ADN-ului se realizează prin mai multe metode: denaturarea şi precipitarea proteinelor cu solvenţi organici, cum sunt fenolul şi cloroformul; în urma centrifugării, proteinele precipitate pot fi separate de ADN, care rămâne în supernatant.

Fenolul, cloroformul sau o combinaţie a lor sunt foarte eficienţi în precipitarea proteinelor. Amestecarea lor cu lizatul, urmată de centrifugare, a dus la formarea a două faze în tub, cea inferioară, a solvenţilor organici, şi cea superioară, apoasă. ADN-ul rămâne solubilizat în faza apoasă şi a fost transferat într-un alt tub. Proteinele precipită la interfaza celor doua faze. Cele cu masă moleculară mare sedimentează la centrifugare, restul rămâne în stratul solvenţilor organici.

În timpul extracţiei cu cloroform s-a adăugat şi alcool isoamilic, care are rol antispumant şi ajută la separarea clară a fazelor. Extracţia proteinelor poate fi repetată de câteva ori, până când supernatantul devine limpede, transparent. Solvenţii organici prezintă dezavantajul ca sunt toxici şi corozivi, manipularea lor prezentând riscuri. De asemenea, extracţiile repetate pot duce la fragmentarea ADN-ului, iar contaminarea ADN-ului cu mici cantităţi de fenol sau cloroform poate avea consecinţe nedorite pentru aplicaţiile ulterioare.

La plante, cantităţile mari de metaboliţi secundari nu pot fi extrase cu fenol sau cloroform şi pot îngreuna considerabil purificarea ADN-ului. De aceea, pe lângă extracţia proteinelor, se parcurg şi etapele de precipitare a ADN-ului şi separarea sa prin centrifugare. CTAB este folosit la plante, atât pentru liza membranelor celulare cât şi pentru formarea de complexe insolubile reversibile cu ADN. Aceste complexe sedimentează la centrifugare. Supernatantul conţine în urma centrifugării, majoritatea contaminanţilor şi este îndepărtat.

Soluţia finală de ADN se realizează in funcţie de specificul metodei de preparare, fie prin resuspendarea sedimentului de ADN, în urma precipitării sale cu alcooli (etanol sau isopropanol) în prezenţa sărurilor. ADN-ul se păstrează (la -20ºC. ) în soluţie TE dar se poate păstra şi în apă sterilă deionizată. În prezentul experiment s-a resuspendat sedimentul în 100 µl TE pH 8,0 (Anexa I).

Există mai multe metode de verificare a concentraţiei de ADN şi anume: metoda spectofotometrică; metoda minigel.

În prezentul studiu s-a folosit metoda spectofotometrică; citirea cantităţii de ADN s-a realizat cu ajutorul aparatului “Nanodrop spectrophotometer nd-1000”

Raportul absorbţiilor soluţiei la 260 nm şi 280 nm, reprezintă maximul de absorbţie al ADN-ului, respectiv al proteinelor. ADN-ul este considerat suficient de pur dacă raportul celor două citiri (A260-A280) dă o valoare între 1,8 şi 2,0. Valori mai mari de 2,0 indică impurificarea cu ARN, iar valori mai mici de 1,8 indică impurificarea cu proteine sau fenol.

17

Valoarea determinată a concentraţiei ADN-ului nu a fost convenabilă aplicaţiilor ulterioare specifice. Astfel s-a procedat la ajustarea concentraţiei soluţiilor de ADN şi redizolvarea sa în volumul dorit de soluţie (TE sau apă distilată).

3.2.3.1. Amplificarea ADN-ului Amestecul de reacţie pentru toate probele s-a preparat pe suport cu gheaţă în hota sterilă,

(pentru a evita contaminarea ADN-ului) şi s-a repartizat apoi în tuburi Eppendorf de 0,5 ml în vederea amplificării.

Amestecul de reacţie pentru analiza RAPD are un volum de 25µl şi următoarea componenţă: - 3 µl tampon 10 X (Promega) - 2 mM MgCl2 - 200 µM din fiecare dATP, dTTP, dCTP şi dGTP = 0,5µl - 0.2 µmol/L amorsă - 40 ng matriţă AND - 2 unităţi ADN polimerază Amplificarea ADN-ului s-a realizat utilizând următorul program de amplificare, care

a fost setat în memoria Termocyclerului (Eppendorf Mastercycler Gradient): denaturare timp de 120 s la 94°C, 10 s la 35°C, 20 s la 72°C timp de două cicluri, urmat de 40 cicluri de 0 s la 94°C, 0 s la 35°C, şi 60 s la 72°C, şi un stagiu final de 7 min la 72°C.

4oC păstrarea probelor / - 80oC păstrarea pe timp îndelungat

3.2.3.2. Primeri utilizaţi Secvenţele de ADN necunoscute pot fi amplificate cu ajutorul primerilor arbitrari. Cu toate

că alegerea secvenţelor de nucleotide ale unui astfel de primer (pereche) este complet întâmplătoare, de obicei se pot amplifica fragmente caracteristice de ADN în condiţii experimentale apropiate. Această strategie este cea mai utilă în cartarea genică sau pentru stabilirea amprentei ADN.

Primerii folosiţi în experienţele noastre au fost cei utilizaţi de către (Bartish et al. 1999) într-un studiu asemănător făcut pentru Hippophaë rhamnoides ssp. rhamnoides.

Tabelul 2/Table 2 Primeri folosiţi pentru analiza RAPD la populaţiile de cătină recoltate din flora spontană

The RAPD primers used to analize the studied plants Nr. crt. No. of entry

Primer Primer

Secvenţă nucleotidică (5’-3’) Nucleotidic sequence

G-C % Greutatea moleculară Molecular weight

1. OPA-07 GAAACGGGTG 60 3117,1 2. OPA-08 GTGACGTAGG 60 3108,1 3. OPA-10 GTGATCGCAG 60 3068,1 4. OPA-11 CAATCGCCGT 60 2988 5. OPA-15 TTCCGAACCC 60 2948 6. OPB-02 TGATCCCTGG 60 3019 7. OPB-04 GGACTGGAGT 60 3108,1 8. OPB-11 GTAGACCCGT 60 3028 9. OPB-18 CCACAGCAGT 60 2997 10. OPD-03 GTCGCCGTCA 70 3004

18

Pentru amplificarea ADN-ului, la exemplarele de cătină luate în studiu am folosit 10 primeri care au fost achiziţionaţi de la compania Microsynth AG, Elveţia (Tabelul ?). Toţi aceştia au generat produşi de amplificare, aşa cum au fost prezentaţi în studiul lor de către (Bartish et al. 1999).

Conţinutul de guanină-citozină la toţi primerii luaţi în studiu a fost de 60% în afară de unul la care a fost de 70%.

3.2.3.3. Electroforeza ADN-ului în gel de agaroză Electroforeza în gel de agaroză şi poliacrilamidă este o metodă standard de separare,

identificare şi purificare de fragmente de ADN (în soluţie tampon, ADN-ul are o sarcină electrică netă negativă, deci poate migra electroforetic, îndreptându-se spre anod).

Agaroza este un amestec de poliglucide, obţinute din agar. Agarul se extrage din specii de alge roşii (Rodophyta). Agaroza (sub formă de pudră), disponibilă comercial, nu este complet naturală. Ea este contaminată cu alte poliglucide, săruri şi proteine. Gradul de contaminare poate influenţa migrarea ADN-ului.

Moleculele de ADN, care străbat gelul, se găsesc într-un mediu lichid, care este asigurat de tamponul de electroforeză. Există diferite soluţii tampon de electroforeză. Cele folosite pentru migrarea moleculelor de ADN native, dublu catenare, conţin EDTA la pH 8,0 şi Tris-acetat (TAE), sau Tris-borat (TBE), sau Tris-fosfat (TPE). Tampoanele sunt preparate ca soluţii stoc şi sunt păstrate la temperatura camerei.

Migrarea produşilor de amplificare s-a realizat într-un gel de agaroză de concentraţie 1,5%, timp de 3,5 h la 32 V/cm, într-o soluţie tampon de 0,5 x TAE, după protocolul descris de (Ge et al. 1999).

Pentru migrarea în gel de agaroză, s-a pipetat un volum de 8 µl produs amplificare / probă, s-a omogenizat cu 2 µl tampon de încărcare şi astfel (volumul total de 10 µl) s-a injectat în godeurile gelului de agaroză, iar în primul godeu s-a încărcat Ladderul (=100 pb DNA Step Ladder).

Colorarea gelului s-a făcut într-o soluţie de bromură de etidiu 0,5µl/ml, iar vizualizarea fragmentelor de ADN amplificate a fost realizată în lumină UV.

Imaginea gelului a fost preluată cu sistemul ALPHA IMAGE 2 200 şi stocată în baza de date a calculatorului.

În Anexa I sunt prezentate soluţiile şi reactivii utilizaţi în pregătirea amestecului de reacţie şi pentru migrarea în gelul de agaroză a produşilor amplificaţi.

3.3. METODE DE DETERMINARE A GERMINAŢIEI SEMINŢELOR

Germinaţia cuprinde ansamblul transformărilor fiziologice şi biochimice care au loc în sămânţă, în timpul trecerii embrionului de la viaţa latentă, la viaţa activă (DUDA, 2003).

Înmulţirea prin seminţe este o metodă de reproducere cu o importanţă deosebită, deoarece menţine diversitatea genetică a populaţiilor de cătină.

Pentru cătina, semănatul este o metodă relativ simplă pentru producerea unui număr relativ mare de plante la un cost scăzut în comparaţie cu celelalte metode. Seminţele pot să fie păstrate până la trei ani, fără ca acestea să îşi piardă capacitatea germinativă (APAQ 1999). După o perioadă de păstrare de cinci ani, capacitatea germinativă scade la 40% (Rousseau 2002).

Germinaţia seminţelor s-a determinat sub două aspecte: energia germinativă şi facultatea germinativă.

19

Energia germinativă este viteza cu care se declanşează procesul de germinaţie la o sămânţă pusă în condiţii de germinat. S-a exprimat procentul de seminţe pure germinate normal în perioada de 6-7 zile din timpul stabilit pentru determinarea facultăţii germinative la cătină (Rousseau 2002).

Facultatea germinativă (capacitatea germinativă) este capacitatea seminţelor de a germina într-un număr limitat de zile, stabilit pentru fiecare specie în parte, la cătină, 17-20 zile. Se exprimă în procente faţă de numărul de seminţe pure, puse la germinat.

Pentru efectuarea acestei analize s-au folosit diverse materiale, ustensile şi aparate, cum ar fi: vase de vegetaţie, aparate de germinaţie, termostat, planşetă pentru numărarea seminţelor.

Vasele de germinaţie folosite în prezenta cercetare au fost vasele Linhardt. Ca strat de germinaţie poate fi folosit nisipul şi hârtia sugativă. În prezenta cercetare s-a folosit hârtia sugativă (hârtia de filtru), care trebuie să fie din celuloză vegetală 100%, albă, curată, să nu conţină coloranţi toxici şi să nu fie sterilizată chimic. De asemenea, este necesar, să aibă o structură poroasă şi o bună putere de absorbţie, o ascensiune capilară bună a apei (în jur de 30 mm/min) şi un pH cuprins între 6,0 şi 7,5.

Determinarea capacităţii şi energiei germinative (conform SR/99) s-a făcut în patru repetiţii. Seminţelor nu li s-a făcut nici un tratament. Din sămânţa pură s-au luat la întâmplare (randomizat) patru repetiţii, a câte 40 de seminţe, şi s-au aranjat distanţat, cât mai uniform, pe suprafaţa stratului de germinaţie umed.

Înaintea punerii la germinat, hârtia de filtru s-a împărţit în patru sectoare cu ajutorul unui creion negru şi s-a numerotat repetiţia. Apoi s-a umectat cu apă de robinet până la saturaţie, lăsând să se scurgă excesul de apă, şi s-a aşezat pe suport. S-au confecţionat fitile din hârtie de filtru pentru asigurarea umidităţii stratului de germinaţie. S-a trecut apoi la punerea seminţelor pe stratul de germinaţie, cu penseta, cât mai uniform la distanţa de 0,5-1,5 cm între ele.

Probele la care a apărut mucegai ce a acoperit peste 5% din numărul seminţelor germinate s-au trecut pe un strat de germinaţie nou, iar germinaţia s-a repetat cu alte seminţe.

Citirea germinaţiei s-a făcut prin numărarea seminţelor germinate şi aprecierea germenilor. Numărarea seminţelor germinate s-a făcut de două ori. Prima numărare s-a făcut pentru determinarea energiei germinative, iar a doua la sfârşitul perioadei de germinaţie, pentru determinarea capacităţii germinative. Numărarea s-a făcut la fiecare repetiţie în parte, începând cu prima, prin îndepărtarea seminţelor normal germinate cu ajutorul unei pensete.

Structurile esenţiale ale unui germen normal sunt: rădăciniţa, tulpina şi cele două cotiledoane.

Energia şi capacitatea germinativă, s-a calculat făcând media aritmetică a rezultatelor obţinute la numărarea seminţelor care au germinat normal în timpul stabilit.

Procentul de germinaţie pentru facultatea germinativă s-a calculat făcând media aritmetică a celor trei repetiţii, la sfârşitul perioadei de germinaţie, prin rotunjire la un număr întreg.

Din diferite motive (repaus germinativ, testa seminţei) un număr considerabil de seminţe proaspete au putut fi găsite pe substratul de germinaţie la sfârşitul testării germinaţiei (V1).

O germinaţie mult mai completă a fost obţinută prin retestare, folosind trei combinaţii de tratamente, comparate cu o primă variantă de tratament (V1), în care s-a utilizat seminţe ţinute la frigider la o temperatură de 1-2 C (Raţi and Raţi 2003). În cea de-a doua variantă de tratament (V2) s-a folosit seminţe stratificate timp de 90 de zile în nisip umed la temeperatura de 5°C (APAQ 1999) .

În cea de a treia variantă de tratament (V3) s-a folosit seminţe care au fost înmuiate timp de 48 de ore în apă caldă la temperatura de 70°C (APAQ 1999).

20

3.4. METODE STATISTICO-MATEMATICE UTILIZATE ÎN PRELUCRAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR STUDIULUI VARIABILITĂŢII FENOTIPICE ŞI GENOTIPICE

Au fost analizate 178 genotipuri de cătină, provenite din flora spontana astfel: Periprava (18 plante, noua female si noua masculi), Sfântu Gheorghe (19 plante, 9 masculi şi 10 femele), Pădurea Letea (22 de plante, 11 femele şi 11 masculi), Fărăgău (20 de plante, 10 masculi şi 10 femele), Crăieşti (21 plante, 10 masculi şi 11 femele), Socol (19 plante, 10 masculi şi 9 femele), Cluj (20 de plante, 10 masculi şi 10 femele), Cătina (19 plante, 10 masculi şi 9 femele), Nicula (20 de plante, 10 masculi şi 10 femele). La acestea, au fost studiate următoarele particularităţi considerate edificatoare pentru caracterizare, pe baza literaturii de specialitate: greutatea fructelor (g), greutatea seminţelor, numărul de spini, procentul de germinare, lungimea frunzelor, conţinutul de substanţă uscată.

Diferenţele dintre genotipuri, privind greutatea fructelor, greutatea seminţelor şi cantitatea de substanţă uscate au fost analizate statistic folosind analiza varianţei - ANOVA, testul “t”, considerând media experienţei variantă martor. De asemenea, la aceleaşi genotipuri s-a procedat şi la calcularea coeficienţilor de variabilitate şi a corelaţiilor simple dintre caractere.

Datorită procentului relativ scăzut de seminţe germinate şi a datelor contradictorii din literatură, ulterior s-a procedat şi la determinarea germinaţiei în condiţii de laborator, metodă descrisă anterior. Pentru calcularea şi interpretarea rezultatelor germinaţiei în condiţii de laborator s-a apelat la modelul statistic de experienţă bifactorială.

Factorul A, tratamentul a avut trei graduări: V1=seminţe păstrate în frigider la 1-2◦C; V2=seminţe stratificate în nisip; V3= seminţe ţinute în apă caldă. Factorul B, genotipul, a avut 30 de graduări. Experienţa a fost aşezată după metoda blocurilor randomizate, în patru repetiţii (n=b=4), cu un număr de variante v=90.

S-au efectuat mai multe tipuri de comparaţii, studiindu-se influenţa genotipului şi a tratamentului asupra energiei şi facultăţii germinative a seminţelor, dar şi influenţa unilaterală a genotipului, respectiv tratamentului, asupra energiei şi facultăţii germinative, în raport cu media experienţei, considerată martor.

3.5. METODE STATISTICO-MATEMATICE UTILIZATE ÎN PRELUCRAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR STUDIULUI VARIABILITĂŢII MOLECULARE

Analiza statistică a datelor a facilitat calcularea indicelui de similaritate (S), a distanţelor genetice şi, în final, construirea dendrogramei celor 9 populaţii luate în studiu. Această analiză a presupus notarea benzilor prezenţă/lipsă direct pe fotografiile gelurilor (stocate iniţial în baza de date a calculatorului), cu ajutorul unei rigle.

În acest caz, prezenţa sau absenţa fragmentelor la fiecare din cele 9 populaţii s-a notat cu cifra 1 (pentru prezenţa fragmentului) şi cifra 0 (pentru absenţa fragmentului). Toate cifrele au fost introduse în programul Microsoft Excel pentru a pregăti un fişier care să poată fi interpretat cu ajutorul programului Genetix şi PopGene (YEH and BOYLE 1997).

Cu ajutorul acestui program s-au calculat următorii parametrii : procentul locilor polimorfici (PPB), indicele pentru diversitate a lui Nei (h), indicele pentru diversitate a lui Shannon (I), diversitatea genelor în populaţie Aceşti parametrii au fost calculaţi la nivel de populaţie, grup şi subspecie.

21

Arborele filogenetic (istoria dezvoltării evolutive a unui organism) se aseamănă din punct de vedere grafic cu un copac, alcătuit dintr-un nod şi o ramură. Între două noduri ale unui arbore există doar un singur segment. Evolutiv, nodul este reprezentat de o genă, o specie sau o populaţie; ramura, reprezintă relaţia topologică care există între noduri, lungimea acesteia reflectă modificări determinate de mutaţii sau durata evoluţiei.

Scopul reconstruirii unui arbore filogenetic sau a unei dendrograme este de a estima cât mai bine istoria evolutivă a unor specii înrudite.

Pentru realizarea dendrogramei au fost utilizate distanţele genetice calculate cu ajutorul programului PopGene iar apoi modelarea grafică a fost făcute cu programul Mega (Tamura et al. 2007). Construcţia arborilor filogenetici s-a realizat prin metode care se bazează pe matricea distanţelor genetice.

Matricea distanţelor genetice constă dintr-un set de n (n-1) / 2 valori ale distanţelor pentru un număr n de noduri. UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Averages), metoda Neighbor-Joining sau metoda asocierii vecinilor, metoda Fitch şi Margoliash, metoda Wagner şi metoda minimum evolution (evoluţiei minime), sunt metode care utilizează matricea distanţelor.

Metodele care folosesc matricea distanţelor, prezintă arborele filogenetic construit pe baza relaţiei care există între valorile distanţelor din matricea respectivă. Distanţele între noduri au la bază asemănările generale între perechile de noduri. La final se obţine numai o singură dendrogramă optimă, neexistând nici o altă metodă de comparare a dendrogramelor suboptimale sau de stabilire a celei mai bune dintre acestea (Weising et al. 1995).

Arborele filogenetic, reprezentat de dendrogramă, a fost interpretat conform modelelor prezentate de Saitou (1987)

3.6. METODE PENTRU DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE SUBSTANŢĂ USCATĂ DIN FRUCTE

Gradele Brix (simbol °Bx) sunt o unitate reprezentativă pentru conţinutul în zahăr a unei soluţii apoase. Un grad Brix corespunde unui gram de sucroză dizolvate în 100 grame de soluţie şi reprezintă concentraţia soluţiei ca şi procent din greutate (% w/w) (în mod direct, din masă). Dacă soluţia conţine dizolvate alte solide decât sucroză pură, precum alte tipuri de zaharuri, minerale, etc., atunci gradele brix (°Bx) aproximează doar conţinutul de substanţă solidă dizolvată. Gradele brix sunt folosite în mod current în oenologie, industria zahărului, a mierii şi dulceţurilor.

Tabelul 3/Table 3 Conţinutul de substanţă uscată în fructe cu diferite origini (Antoneli et al. 2005)

Soluble solids content in the berries of different origins

Valoare Value range

Specia Species

10,83-15,55 cătină chinezească 10,19-22,74 cătină chinezească

5,6-20,1 subsp. sinensis 0,9-3,2 subsp. rhamnoides

2,85-4,79 cătină rusească

8,9-11,7 Cultivare din zona Altai

Substanţă uscată (◦ Brix)

Soluble solids

8,2-10 Cultivare din zona

22

Moscova

(Antoneli et al. 2005) precizează de asemenea că odată cu procesul de maturare, conţinutul în solide solubile scade vertiginos la unele exemplare de cătină din Germania.

În experienţa noastră am determinat conţinutul în substanţă uscată cu ajutorul unui refractometru de mână de construcţie ALLA, Franţa.

Refractometrul este compus din: prismă, capac, şurub de setare, tub oglindă, obiectiv cu inel de setare a dioptriei.

Pentru executarea măsurătorilor (Gotea et al. 2010) se ajustează linia de citire la zero cu ajutorul şurubului de setare. După calibrare se trece la citirea probelor în felul următor: se ridică capacul şi se pun 1-2 picături pe prismă. Citirea se face pe scala refractometrului cu capacul închis. După efectuarea citirii se curaţă lichidul rămas cu un tifon umed. Citirea se face direct în grade brix.

23

CAPITOLUL IV. REZULTATE ŞI DISCUŢII

4.1. REZULTATE OBŢINUTE PRIVIND VARIABILITATEA EXISTENTĂ LA CĂTINĂ, PRIN APLICAREA METODELOR DE DETERMINARE A APROPIERII FILOGENETICE

Conform literaturii de specialitate, metodele sistematice (taxonomice) se bazează pe clasificările botanice ale familiilor, genurilor şi speciilor, clasificări efectuate în principal pe baza fenotipului plantelor. Principalele caracteristicile morfologice care pot fi luate în considerare la cătină, în aplicarea unor astfel de metode, sunt: greutatea fructelor, numărul de spini, lungimea lor, mărimea frunzelor, etc.

În prezentul studiu au fost analizate cu ajutorul metodei taxonomice (sistematice) 178 de genotipuri de cătină din flora spontană.

Pentru o bună sistematizare, genotipurile au fost împărţite în funcţie de provenienţa lor, precum şi în funcţie de tipul materialului vegetal analizat.

4.1.1. Rezultatele aplicarii metodei taxonomice la genotipurile provenite din flora spontană, pe baza caracteristicilor plantelor şi semintelor

Analiza exhaustivă a caracteristicilor plantelor şi aplicarea metodelor taxonomice de diferenţiere a genotipurilor de cătină provenite din flora spontană, a evidenţiat o variabilitate relativ mare a materialului biologic, în funcţie de genotipul analizat, dar şi în funcţie de caracterul analizat.

În Delta Dunării, variabilitatea puternică existentă la fructele de cătină se caracterizează prin fructe predominant portocalii, de formă predominant alungită, de mărime medie spre mare (300-500 mg/fruct).

În ceea ce priveşte spinii, aceştia au prezentat un număr între 3-14 spini/10 cm lăstar, iar lungimea maximă a acestora este de 2-9 cm.

Frunzele exemplarelor femele din această zonă sunt relativ mici, improprii pentru recoltat frunze în scop medicinal, cu lungimea cuprinsă între 2,5 – 6,4 cm.

În Judeţul Mureş, variabilitatea puternică existentă la fructele de cătină se caracterizează prin fructe predominant portocaliu deschisă cu exemplare care prezintă fructe gălbui. Putem deduce din acest lucru, conform literaturii, că procentul de ulei din fructele de cătină este mai mare, lucru semnalat de culoarea deschisă a acestora. Forma fructelor este predominant sferică, cu mică spre mijlocie (200-400 mg/fruct).

În ceea ce priveşte spinii, aceştia au prezentat un număr între 3-12 spini/10 cm lăstar, iar lungimea maximă a acestora este de 2-9 cm.

Frunzele exemplarelor femele din această zonă sunt relativ mici, improprii pentru recoltat frunze în scop medicinal, cu lungimea cuprinsă între 3 – 6,2 cm.

În Judeţul Cluj, variabilitatea puternică existentă la fructele de cătină se caracterizează prin fructe predominant de culoare portocalie cu exemplare care prezintă fructe gălbui şi albicioase. Putem deduce din acest lucru, conform literaturii, că procentul de ulei din fructele de cătină este mai mare, lucru semnalat de culoarea deschisă a acestora. Forma fructelor este predominant sferică, cu mărime medie spre mijlocie (300-400 mg/fruct).

24

În ceea ce priveşte spinii, aceştia au prezentat un număr între 3-12 spini/10 cm lăstar, iar lungimea maximă a acestora este de 2-9 cm.

Frunzele exemplarelor femele din această zonă sunt relativ mici, improprii pentru recoltat frunze în scop medicinal, cu lungimea cuprinsă între 3 – 6,1 cm.

În ceea ce priveşte exemplarele mascule, în Delta Dunării am găsit în teren exemplare deosebit de atractive care se pot folosi ca şi genitori paterni în plantaţii prin prisma cantităţii de polen care aceştia o pot produce. Astfel, lungimea amenţilor variază de la un minim de 5 mm la un maxim de 16 mm. Forma lor predominantă în Delta Dunării este alungită.

Spinii găsiţi pe 10 cm lăstar prezintă un minim de 3 şi un maxim de 14 iar lungimea acestora este cuprinsă între 2 şi 9 cm.

Ceea ce diferă însă de plantele femele este lungimea frunzelor care este cuprinsă între 6 şi 8,6 cm iar lăţimea între 4,3 şi 7,5 mm. Acest lucru reprezintă o calitate deosebită în ceea ce priveşte posibilitatea de recoltare a frunzelor cu un randament ridicat în scopuri medicinale.

În judeţul Mureş, la genotipurile studiate, mugurii floriferi masculi prezintă o variaţie între 4-14 cm. Forma predominantaă este sferică.

Numărul spinilor pe o porţiune de 10 cm este cuprinsă între 3-13 iar lungimea acestora între 2 şi 9 cm. Observăm aici o reducere a mărimii spinilor faţă de populaţiile din Delta Dunării. Chiar dacă sunt menţionate în literatură exemplare fără spini în Delta Dunării (Raţi and Raţi 2003) nu am avut ocazia să le întâlnesc în teren.

Lungimea frunzelor este cuprinsă între 4,5 – 8,5 cm, deci mai mari decât a populaţiilor din Delta Dunării. Lăţimea frunzelor este cuprinsă între 4-7,6 mmm.

Lungimea amenţilor la genotipurile din zona Cluj este cuprinsă între 5-16 mm, la fel ca şi cele din Delta Dunării.

Spinii sunt prezenţi în număr de 3-14 pe o lungime de 10 cm lăstar. Lungimea frunzelor prezintă un minim de 4,2 cm şi un maxim de 7,1cm, iar lăţimea este cuprinsă între 4 şi 7 mm.

4.2. REZULTATE OBŢINUTE PRIVIND VARIABILITATEA EXISTENTĂ LA CĂTINĂ, PRIN STUDIUL PRINCIPALELOR CARACTERISTICI ALE SEMINŢELOR

Aşa cum s-a prezentat foarte detailat în subcapitolul 3.1, metoda de înmulţire la cătină este folosită pentru obţinerea plantelor folosite în lucrările de împăduriri şi în programele de ameliorare. În prezentul studiu am analizat seminţe provenite de la exemplarele femele din cele trei zone geografice.

4.2.1. Caracteristicile seminţelor obţinute de la plantele din zona Deltei Dunării

În cadrul celor 30 de genotipuri studiate din zona Deltei Dunării, greutatea seminţelor a avut valori diferite, media experimentului fiind de 10,62 mg, iar amplitudinea de variaţie fiind cuprinsă între 7,42 mg la genotipul Sf. Gheorghe 6 şi 13,72 mg la genotipul Periprava 5 (Tabelul 7.26.).

Seminţele cu greutatea cea mai mare au aparţinut genotipurilor : Periprava 6 (12,27 mg), Sf. Gheorghe 3 (12,31 mg), Sf. Gheorghe 11 (12,71 mg), Padurea Letea (12,92 mg), Sf. Gheorghe 10 (13,07 mg).

Seminţele cu greutatea cea mai mică au aparţinut genotipurilor: Periprava 1 (7.50 mg), Periprava 3 (7.69 mg), Sf. Gheorghe 1 (7.83 mg), Sf. Gheorghe 8 (7.88 mg), Padurea Letea 3 (8.13 mg).

25

Pe baza coeficienţilor de variabilitate se poate afirma că variabilitatea caracterului greutatea seminţelor a fost medie, doar genotipul Pădurea Letea 2 a prezentat o variabilitate mare (CV=13,00%).

Potenţiali genitori pentru o plante destinate producerii uleiului din seminţe poate fi genotipul Periprava 5 şi Sf. Gheorghe 10.

4.2.2. Caracteristicile seminţelor obţinute de la plantele din judeţului Mure ş

În cadrul celor 30 de genotipuri studiate din zona judeţului Mureş, greutatea seminţelor a avut valori diferite, media experimentului fiind de 8,05 mg, iar amplitudinea de variaţie fiind cuprinsă între 5,61 mg la genotipul Socol 7 şi 12,28 mg la genotipul Crăieşti 1 (Tabelul 7.26.).

Seminţele cu greutatea cea mai mică au aparţinut genotipurilor : Socol 9 (5.65mg), Fărăgău 5 (5.83mg), Fărăgău 4 (5.91mg), Fărăgău 3 (5.99mg), Fărăgău 8 (6.00mg).

Seminţele cu greutatea cea mai mare au aparţinut genotipurilor: Crăieşti 10(10.00mg), Crăieşti 5(10.07mg), Fărăgău 10(10.27mg), Fărăgău 7(10.35mg), Crăieşti 11(10.65mg)

Pe baza coeficienţilor de variabilitate se poate afirma că variabilitatea caracterului greutatea seminţelor a fost medie, doar genotipul Pădurea Letea 2 a prezentat o variabilitate mare (CV=12,2,00%).

Potenţiali genitori pentru o plante destinate producerii uleiului din seminţe pot fi genotipurile Crăieşti 1 şi Crăieşti 11.

4.2.3. Caracteristicile seminţelor obţinute de la plantele din judeţului Cluj

În cadrul celor 29 de genotipuri studiate din zona judeţului Cluj, greutatea seminţelor a avut valori diferite, media experimentului fiind de 9,53 mg, iar amplitudinea de variaţie fiind cuprinsă între 6,70 mg la genotipul Nicula 9 şi 11,56 mg la genotipul Nicula 8 (Tabelul 7.26.).

Seminţele cu greutatea cea mai mică au aparţinut genotipurilor : Nicula 10 (9.23mg), Cătina 1 (10.65mg), Cătina 2 (13.16mg), Cătina 3 (5.56mg), Cătina 4 (11.06mg).

Seminţele cu greutatea cea mai mare au aparţinut genotipurilor: Nicula 3 (8.39mg), Nicula 4 (8.63mg), Nicula 5 (10.05mg), Nicula 6 (11.66mg), Nicula 7 (11.85mg),

Pe baza coeficienţilor de variabilitate se poate afirma că variabilitatea caracterului greutatea seminţelor a fost medie, doar genotipul Pădurea Letea 2 a prezentat o variabilitate mare (CV=14,67 %).

Potenţiali genitori pentru o plante destinate producerii uleiului din seminţe pot fi genotipurile Nicula 6 şi Cătina 7.

4.2.4. Variabilitatea greutăţii seminţelor la populaţiile din cele trei zone luate în studiu

Analizând media greutăţii seminţelor la toate provenienţele din cadrul celor trei zone, s-a constatat că valoarea medie a caracterului a prezentat diferenţe mici.

26

9.53

8.05

10.62

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

Cluj Mures Delta Dunarii

\

Fig. 2. Media caracterului greutatea seminţelor din fructele populaţiilor studiate Fig. 2. The mean of seeds weight from fruits of the studied populations

Valorile cele mai mari au fost înregistrate în zonele Delta Dunării şi Cluj. Zona Mureş a

prezentat cea mai mică valoare a mediei greutăţii seminţelor (8.05 mg).

21.6822.80

17.14

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

Cluj Mures Delta Dunarii

Fig. 3. Coeficienţii de variabilitate pentru greutatea seminţelor la fructele din populaţiile studiate

Fig. 3. The coefficients of variability for seeds weight from fruits of the studied populations În schimb, analizând coeficienţii de variabilitate, se poate afirma că, variabilitatea greutăţii

seminţelor în cadrul celor trei zone studiate, a fost mijlocie. Limitele coeficienţilor de variabilitate s-au situat între 17,14,0% penutru Delta Dunării şi 22,8 la pentru zona Mureş.

4.3. REZULTATE OBTINUTE PRIVIND VARIABILITATEA EXISTENTA LA CATINA PRIN APLICAREA METODELOR DE MARKARE MOLECULARA

Utilizarea markerilor moleculari, prin analiza genoamelor, a determinat o ascensiune puternică a eficienţei activităţilor de ameliorare, atât la plante cât şi la animale, aplicabilitatea lor

27

fiind demonstrată în: identificarea şi taxonomia genetică a indivizilor, realizarea hărţilor genetice, realizarea studiilor de filogenie (VOS şi colab., 1995). De la aceste considerente, şi de la cele prezentate anterior, în prezenta experienţă, s-a impus analiza diversităţii populaţiilor investigate la nivel molecular, prin analize ADN şi prin întocmirea arborelui filogenetic al acestora.

4.3.1. Rezultatele izolării ADN-ului

Folosind protocolul descris mai sus, cantitatea medie de ADN care s-a obţinut a variat de la 45, 9 ng /µl până la 420 ng /µl.

Probele de ADN cu valori ale citirilor OD260/OD280 cuprinse între 1.70 şi 1.90 au fost alese iar concentraţia de ADN a fost diluată la 20 ng /µl cu ddH2O pentru a reduce erorile şi a creea un standard uniform.

4.3.2. Rezultatele amplificării ADN-ului

Profilului benzilor formate de produşii de amplificare în gelul de electroforeză s-a urmărit prin tehnica RAPD, deseori utilizată în acest scop (Ruan et al. 2004; Sheng et al. 2006; Sun et al. 2006).

Au fost testaţi un număr de 10 primeri decameri, a căror conţinut de guanină şi citozină s-a încadrat între 60%-70%. Din cei 10 primeri decameri folosiţi pentru amplificare, toţi au dat produşi de amplificare, fiind selecţionaţi pentru analiza RAPD.

Tabelul 4/Table 4 Primerii folosiţii în analizele moleculare The primers used in molecular analysis

Nr. crt.

No. of entry Primer Primer

Secvenţă nucleotidică (5’-3’) Nucleotidic sequence

G-C % Greutatea moleculară Molecular weight

1. OPA-07 GAAACGGGTG 60 3117,1 2. OPA-08 GTGACGTAGG 60 3108,1 3. OPA-10 GTGATCGCAG 60 3068,1 4. OPA-11 CAATCGCCGT 60 2988 5. OPA-15 TTCCGAACCC 60 2948 6. OPB-02 TGATCCCTGG 60 3019 7. OPB-04 GGACTGGAGT 60 3108,1 8. OPB-11 GTAGACCCGT 60 3028 9. OPB-18 CCACAGCAGT 60 2997 10. OPD-03 GTCGCCGTCA 70 3004

Primerii OPB-02 şi OPB-04 au generat cel mai mare număr de benzi polimorfice (Tabelul 32). Aşa cum se observă în Tabelul 32. diferenţele dintre numărul de benzi generate de fiecare primer sunt destul de mari. La toate populaţiile, toţi primerii RAPD au determinat formarea unor benzi constante şi bine determinate de-a lungul tuturor probelor.

A fost obţinut un număr de 119 markeri, cu mărimea cuprinsă între 200 şi 1900 pb. Polimorfismul a fost foarte pronunţat, cu o medie de 88,6% markeri polimorfici la toţi primerii.

Numărul de markeri identificaţi şi procentul de loci polimorfici, calculat pentru întregul material, a variat de la 7 şi 71% pentru primerul OPA-15, la 17 şi 100% pentru markerul OPB-04.

28

Tabelul 5/Table 5 Numărul de benzi pentru fiecare amorsă şi procentul locilor polimorfici calculaţi pentru întregul

eşantion cât şi pentru fiecare populaţie The number of obtained bands, percentage polymorphic loci calculated across the entire sample,

as well as in each population

Procentul de markeri polimorfici

În populaţie Primer Număr

markeri

Total P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 Media

OPA-07 12 100 33.3 58.3 75 66.7 58.3 83.3 75 75 83.3 67.58

OPA-08 9 77 55.6 66.7 55.6 81.8 81.8 81.8 81.8 81.8 66.7 72.62

OPA-10 16 81 68.8 50 50 56.3 36.5 50 68.8 68.8 68.8 57.56

OPA-11 11 82 27.3 54.6 45.5 54.6 36.4 45.5 45.5 63.6 54.6 47.51

OPA-15 7 71 14.3 80 42.9 71.4 42.9 42.9 28.6 42.9 57.1 47.00

OPB-02 16 100 62.5 62.5 50 56.3 31.3 81.3 68.8 81.3 81.3 63.92

OPB-04 17 100 64.7 52.9 47.1 47.1 47.1 70.6 35.3 41.2 35.3 49.03

OPB-11 13 85 46.2 69.2 38.5 61.5 53.9 46.2 38.5 61.5 53.9 52.16 OPB-18 10 90 30 50 50 30 50 60 60 60 60 50.00 OPD-03 8 100 75 87.5 37.5 50 50 87.5 62.5 45.5 37.5 59.22

Procentul markerilor polimorfici în populaţie a variat de la 14,3% pentru primerul OPA-15 în populaţia P1, la 87,5% pentru primerul OPD – 03 în populaţia P2 şi P6.

Media procentului de markeri polimorfici în diferitele populaţii a fost cuprinsă între 47% pentru primerul OPA -15 şi 72.62% primerul OPA -08.

(Weising et al. 1995) subliniază faptul că relaţiile filogenetice care rezultă din analiza RAPD se bazează pe două presupuneri: independenţa caracterelor analizate (benzilor) în cadrul fiecărei specii (sunt rare situaţiile în care se ştie, cu certitudine, dacă benzile considerate ca şi caractere independente reprezintă, de fapt, fragmente linkate sau alele); omologia caracterelor (benzilor) la comparaţiile între specii (fragmentele care au migrat în aceeaşi poziţie în gel, reprezintă secvenţe omoloage).

Deşi se consideră că fiecare fragment de ADN este un locus (LANDRY et al. 1994), este posibil totuşi ca unele benzi să reprezinte loci multiplii, care au migrat împreună (PAMFIL et al. 2000). (JÄNTSCHI et al. 2009) sugerează, în acest sens utilzarea algoritmilor genetici pentru elucidarea analizei secvenţelor nucleotidice (alinierea, repetarea secvenţelor, comparaţii între ele).

În 1978, NEI afirma faptul că există un avantaj al utilizării unui număr mare de loci pentru a estima distanţa genetică şi recomanda un număr de cel puţin 50 de loci pentru analiză.

4.3.3. Dendrograma populaţiilor de cătină analizate din flora spontană

În cazul analizelor RAPD, dendrogramele rezultate prin prelucrarea datelor pe computer constituie o reprezentare fidelă a relaţiilor filogenetice dintre diferitele populaţii de cătină analizate precum şi a diversităţii genetice existente în cadrul acestor populaţii de cătină.

29

În dendrograme, variantele (populaţiile) între care există cele mai mici distanţe genetice sunt grupate apropiat, în timp ce variantele între care distanţele genetice sunt mai mari sunt plasate mai depărtat unele de altele (Tabelul 33).

Tabelul 6/Table 6 Distanţele dintre populaţiile de cătină calculate cu ajutorul metodei originale a lui Nei (Nei 1972)

Nei's Original Measures of Genetic Identity and Genetic distance (Nei 1972)

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P1 *** 0.9371 0.9354 0.9337 0.9409 0.9140 0.9327 0.9050 0.9011 P2 0.0650 **** 0.9368 0.9530 0.9372 0.9322 0.9234 0.9227 0.9177 P3 0.0668 0.0653 **** 0.9611 0.9731 0.9218 0.9564 0.9387 0.9444 P4 0.0686 0.0482 0.0397 **** 0.9618 0.9210 0.9458 0.9488 0.9430 P5 0.0609 0.0648 0.0272 0.0389 **** 0.9127 0.9503 0.9164 0.9104 P6 0.0899 0.0702 0.0815 0.0823 0.0913 **** 0.9403 0.9266 0.9252 P7 0.0697 0.0797 0.0446 0.0557 0.0510 0.0616 **** 0.9516 0.9548 P8 0.0998 0.0804 0.0632 0.0525 0.0873 0.0762 0.0497 **** 0.9660 P9 0.1041 0.0859 0.0572 0.0587 0.0939 0.0778 0.0463 0.0346 ****

Cele mai apropiate populaţii din punct de vedere genetic, prin metoda originală a lui Nei sunt

următoarele: Letea (Delta Dunării), Crăieşti (Jud. Mureş) cu distanţa de 0,0272. Cele mai depărtate populaţii din punct de vedere genetic sunt : Periprava ( Delta Dunării) de Nicula (Jud. Cluj) cu distanţa 0,1041.

Tabelul 7/Table 7

Distanţele genetice nedeplasate calculate cu metoda lui Nei (1978) Nei's Unbiased Measures of Genetic Identity and Genetic distance (Nei 1978)

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

P1 *** 0,9556 0,9511 0,9512 0,9562 0,9320 0,9495 0,9228 0,9179 P2 0,0455 *** 0,9540 0,9723 0,9540 0,9520 0,9415 0,9423 0,9363 P3 0,0501 0,0471 *** 0,9778 0,9877 0,9386 0,9724 0,9559 0,9607 P4 0,0500 0,0281 0,0225 *** 0,9781 0,9396 0,9634 0,9680 0,9611 P5 0,0448 0,0471 0,0124 0,0222 *** 0,9290 0,9656 0,9328 0,9257 P6 0,0705 0,0492 0,0633 0,0623 0,0737 *** 0,9586 0,9462 0,9438 P7 0,0518 0,0603 0,0280 0,0373 0,0350 0,0423 *** 0,9701 0,9724 P8 0,0804 0,0594 0,0451 0,0325 0,0696 0,0553 0,0303 *** 0,9855 P9 0,0857 0,0659 0,0401 0,0397 0,0772 0,0578 0,0279 0,0146 ***

Cele mai apropiate populaţii din punct de vedere genetic, prin metoda unbiased mesure sunt

următoarele: Letea (Delta Dunării), Crăieşti (Jud. Mureş) cu distanţa de 0,0124. Cele mai depărtate populaţii din punct de vedere genetic sunt : Periprava ( Delta Dunării) de Nicula (Jud. Cluj) cu distanţa 0,0857.

30

Padurea Letea

Craiesti

Faragau

Periprava

Sf.Gheorghe

Socol

Cluj

Catina

Nicula

Fig. 4. Dendrograma populaţiilor de cătină analizate realizată prin metoda Neighbor-Joining Fig. 4. The dendrogram of sea buckthorn populations analized constructed with Neighbor-Joining

method

Padurea Letea

Craiesti

Faragau

Sf.Gheorghe

Periprava

Socol

Cluj

Catina

Nicula

0.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.035 Fig. 5. Dendrograma populaţiilor de cătină analizate realizată prin metoda UPGMA

Fig. 6. The dendrogram of sea buckthorn populations analized constructed with UPGA method

Pentru a investiga o posibilă asociere între înrudirea genetică şi originea geografică am comparat matricea distanţelor genetice cu matricea distanţelor corespondente. Aceste două matrici nu au fost semnificativ corelate: (r = 0.14 şi P= 0.851)

Procentul mediu de loci polimorfici în cadrul ssp. carpatica este de 56,6 (Tabel 5)

Tabelul 8/Table 8 Procentul mediu de loci polimorfici în cadrul populaţiilor studiate (%P) şi indicele de diversitate a

lui Nei (H) Percentage of polymorphic loci (%P) and mean gene diversity (H)

Populaţia %P H

31

Population P1 47,8 0,179 P2 63,2 0,140 P3 49,2 0,162 P4 57,6 0,170 P5 48,9 0,148 P6 64,9 0,220 P7 56,5 0,175 P8 62,2 0,192 P9 59,9 0,203

Media 56,6 0,175 %P – procentul mediu de loci polimorfici H – indicele mediu de diveristatea a genelor a lui Nei

4.4. REZULTATE OBTINUTE PRIVIND VARIABILITATEA EXISTENTA LA CATINA, PRIN STUDIUL PRINCIPALELOR CARACTERISTICI ALE FRUCTELOR

Principalul produs al acestui minunat arbust sunt fructele. Variabilitatea deosebită pe care o întâlnim în ţara noastră la cătină în ceea ce priveşte culoare, mărimea, forma etc. este extrem de mare. În studiul nostru am întâlnit plante cu fructe mici, sub 0.2 g-fruct până la plante cu fructe mari de 0,5 g/fruct sau chiar mai mult. De altfel, odata cu mărimea fructelor, se schimbă şi culoarea, de la galben auriu, portocaliu spălăcit, portocaliu aprins, portocaliu spre roşu şi combinaţiile acestor culori. Aproape ca nu există două tufe de cătină care să fie asemănătoare din acest punct de vedere.

4.4.1. Caracteristicile fructelor obţinute de la plantele din zona Deltei Dunării

În cadrul celor 30 de genotipuri studiate din zona Deltei Dunării, greutatea fructelor a avut valori diferite, media experimentului fiind de 362,02, mg, iar amplitudinea de variaţie fiind cuprinsă între 233,03 mg la genotipul Pădurea Letea 10 şi 519,96 mg la genotipul Pădurea Letea 4 (Tabelul 7.26.).

Fructele cu greutatea cea mai mică au aparţinut genotipurilor : Padurea Letea 9 (238.56 mg), Sf. Gheorghe 2 (250.17 mg), Sf. Gheorghe 8 (250.60 mg), Padurea Letea 3 (251.47 mg), Sf. Gheorghe 1 (252.61 mg)

Fructele cu greutatea cea mai mare au aparţinut genotipurilor: Padurea Letea 5 (500.46 mg), Padurea Letea 11 (501.53 mg), Periprava 5 (518.13 mg), Sf. Gheorghe 9 (518.89 mg), Sf. Gheorghe 3 (519.27 mg)

Pe baza coeficienţilor de variabilitate se poate afirma că variabilitatea caracterului greutatea fructelor a fost medie, doar genotipul Periprava 2 a prezentat o variabilitate mare (CV=13,19%).

Potenţiali genitori pentru plante destinate producerii de fructe pot fi genotipurile: Padurea Letea 11(501.53 mg), Periprava 5(518.13 mg), Sf. Gheorghe 9(518.89 mg), Sf. Gheorghe 3(519.27 mg), Padurea Letea 4 (519.96 mg).

32

4.4.2. Caracteristicile fructelor obţinute de la plantele din zona judeţului Mure ş

În cadrul celor 30 de genotipuri studiate din zona judeţului Mureş, greutatea fructelor a avut valori diferite, media experimentului fiind de 356,67 mg, iar amplitudinea de variaţie fiind cuprinsă între 245,11 mg la genotipul Fărăgău 10 şi 516,15 mg la genotipul Fărăgău 5 (Tabelul 7.26).

Fructele cu greutatea cea mai mică au aparţinut genotipurilor : Crăieşti 6 (245.53 mg), Socol 1 (246.40 mg), Fărăgău 9 (250.63 mg), Crăieşti 5 (251.06 mg), Crăieşti 11 (251.93 mg)

Fructele cu greutatea cea mai mare au aparţinut genotipurilor: Crăieşti 8 (431.76 mg), Crăieşti 7 (513.83 mg), Crăieşti 1 (514.20 mg), Socol 7 (514.61 mg), Socol 2 (514.89 mg)

Pe baza coeficienţilor de variabilitate se poate afirma că variabilitatea caracterului greutatea fructelor a fost medie, doar genotipul Fărăgău 10 a prezentat o variabilitate mare (CV=11,19%).

Potenţiali genitori pentru plante destinate producerii de fructe pot fi genotipurile: Crăieşti 7 (513.83 mg), Crăieşti 1 (514.20 mg), Socol 7 (514.61 mg), Socol 2 (514.89 mg), Fărăgău 5 (516.15 mg)

4.4.3. Caracteristicile fructelor obţinute de la plantele din zona judeţului Cluj

În cadrul celor 29 de genotipuri studiate din zona judeţului Cluj, greutatea fructelor a avut valori diferite, media experimentului fiind de 355,40 mg, iar amplitudinea de variaţie fiind cuprinsă între 239,21 mg la genotipul Cătina 4 şi 511,02 mg la genotipul Cluj-Napoca 5 (Tabelul 7.26).

Fructele cu greutatea cea mai mică au aparţinut genotipurilor : Cluj-Napoca 10 (239.97 mg), Nicula 1 (240.08 mg), Cătina 3 (244.74 mg), Cluj-Napoca 9 (245.50 mg), Cătina 9(245.61 mg).

Fructele cu greutatea cea mai mare au aparţinut genotipurilor: Nicula 10 (489.63 mg), Cătina 5 (507.51 mg), Nicula 7 (508.29 mg), Nicula 2 (508.57 mg), Cătina 1 (509.07 mg).

Pe baza coeficienţilor de variabilitate se poate afirma că variabilitatea caracterului greutatea fructelor a fost medie, doar genotipul Cluj-Napoca 10 a prezentat o variabilitate mare (CV=11,7%).

Potenţiali genitori pentru plante destinate producerii de fructe pot fi genotipurile: Cătina 5 (507.51 mg), Nicula 7 (508.29 mg), Nicula 2 (508.57 mg), Cătina 1 (509.07 mg), Cluj-Napoca 5 (511.02 mg).

4.4.4. Variabilitatea greutăţii fructelor la popula ţiile luate în studiu

Analizând media greutăţii fructelor la toate provenienţele din cadrul celor trei zone studiate, s-a constatat că valoarea medie a caracterului a prezentat diferenţe mici între zona Cluj şi Mureş. Zona Deltei Dunării s-a remarcat printr-o greutate medie mai mare a fructelor decât în celelalte două zone.

În schimb, analizând coeficienţii de variabilitate, se poate afirma că variabilitatea greutăţii fructelor în cadrul celor trei zone studiate, a fost mare. Limitele coeficienţilor de variabilitate s-au situat între 26,9 pentru zona Mureş şi 28,4 pentru zona Cluj.

33

355.40356.67

363.02

350.00

352.00

354.00

356.00

358.00

360.00

362.00

364.00

mg

cluj Mures Delta Dunarii

Fig. 6. Media caracterului greutatea fructelor din populaţiile studiate

Fig. 6. The mean of fruits weight among the studied areas

28.4

26.9

27.5

26.0

26.5

27.0

27.5

28.0

28.5

Cluj Mures Delta Dunarii

Fig. 7. Coeficienţii de variabilitate pentru greutatea fructelor din populaţiile studiate Fig. 7. The coefficients of variability for fruits weight among the studied areas

4.4.5. Corelaţiile fenotipice dintre greutatea seminţelor şi greutatea fructelor în populaţiile studiate

La populaţiile studiate s-au studiat şi coeficienţii de corelaţie dintre greutatea seminţelor şi greutatea fructelor. Calcularea coeficienţilor de corelaţie fenotipică s-a efectuat conform variantelor existente.

Între cele două caractere s-au pus în evidenţă corelaţii semnificativ pozitive între greutatea seminţelor şi cea a fructelor la populaţiile Periprava şi Letea, aceasta însemnând că greutatea seminţelor influenţează semnificativ greutatea fructelor. Acest lucru înseamnă că întotdeauna în fructele mari există seminţe mari.

34

În restul populaţiilor, greutatea seminţelor a avut o influenţă nesemnificativă asupra greutăţii fructelor, însemnând că există fructe mari cu seminţe mici şi fructe mici cu seminţe mari.

Tabelul 9/Table 9 Corelaţiile fenotipice dintre greutatea seminţelor (mg) şi greutatea fructelor (mg)

Phenotypic correlations between seeds weight (mg) and fruits weight (mg)

Valoarea teoretică The theoretical value Populaţia

The population Nr indivizi

Sample numbers

Corelaţiile fenotipice (r valoarea calculată)

Phenotypical correlations (r calculated value) r5% r1%

Semnificaţia The significance

Periprava 8 0,921 0,71 0,83 ** Sf. Gheorghe 11 0,588 0,60 0,74 -

Letea 11 0,079 0,60 0,74 ** Fărăgău 10 -0,546 0,63 0,76 - Crăieşti 10 0,266 0,63 0,76 - Socol 9 -0,027 0,67 0,80 - Cluj 10 0,380 0,63 0,76 -

Cătina 9 0,164 0,67 0,80 - Nicula 10 0,438 0,63 0,76 -

4.5. REZULTATE OBTINUTE PRIVIND IMBUNATATIREA CAPACITATII DE GERMINATIE A SEMINTELOR SI POSIBILITATEA APLICARII UNOR TRATAMENTE DE CRESTERE A PROCENTULUI DE GERMINARE

Înmulţirea prin seminţe este o metodă de reproducere cu o importanţă deosebită, deoarece produce relativ uşor un număr foarte mare de plante folosite în procesele de împăduriri şi tot odată menţine diversitatea genetică a diferitelor populaţii de cătină. Cu toate acestea, studiile privind viabilitatea, longevitatea seminţelor, precum şi aplicarea unor tehnici de îmbunătăţire a germinaţiei sunt relativ puţine (APAQ 1999).

Pe baza acestor considerente şi datorită faptului că în studiile din litaratură datele referitoare la germinaţia semineţelor în funcţie de tratamentul aplicat nu corespund, s-a iniţiat un alt experiment, în care s-a studiat facultatea germinativă şi capacitatea germinativă a seminţelor în condiţii de laborator. În acest scop, s-au utilizat diferite variante de tratamente (descrise în capitolul de material şi metodă).

4.5.1. Rezultate obţinute prin determinarea energiei germinative a seminţelor

Energia germinativă a seminţelor a prezentat valori diferite în cadrul celor 90 de variante luate în studiu (Tabelul 40), amplitudinea de variaţie fiind cuprinsă între 13,0% (genotipul Socol 6, V1) şi 24,8% (genotipul Crăieşti 8, V3), comparativ cu media experienţei de 18,6% (considerată variantă martor).

Cele mai mari valori ale energiei geminative pentru varianta a doua de tratament (stratificare în nisip) s-au înregistrat la următoarele genotipuri: Crăieşti 8 (23,5%), Cătina 4 (23,5%), Cătina 7 (22,5%).

Pentru cea de-a treia variantă de tratament (seminţe ţinute în apă caldă), cele mai mari valori ale energiei germinative s-au înregistrat la genotipurile: Crăieşti 8 (24,8%), Cătina 4 (22,5%), Cătina 7 (22,5%), Cătina 2 (22,8%) şi Nicula 8 (22 %).

35

În cazul primei variante de tratament (V1), respectiv seminţe puse ţinute în frigider, valori pozitive s-au înregistrat la genotipurile: Periprava 1 şi Cluj-Napoca 6, însă fără abateri asigurate statistic.

Analizând influenţa genotipului asupra energiei de germinare a seminţelor (Tabelul 7.53.) s-a constatat că valorile medii ale energiei de germinare pentru variantele analizate au fost diferite în comparaţie cu martorul experienţei (18,6%) la majoritatea genotipurilor. Cel mai mic procent al energiei germinative a fost înregistrat la genotipul Fărăgău 4 (15,2%), iar cel mai mare la genotipul Crăieşti 8 (21,8%).

Genotipurile Crăieşti 8, şi Cătina 2, Cătina 4 şi Cătina 7 au înregistrat cele mai mari procente ale energiei germinative, în timp ce la genotipurile Crăieşti 4, Fărăgău 4 şi Sf. Gheorghe 6 s-au observat cele mai mici procente.

Cu un procent al energiei germinative relativ mare comparativ cu media experienţei (însă fără diferenţe asigurate statistic), s-au remarcat şi genotipurile Periprava 1, Periprava 3, Periprava 5.

Comparând variantele tratate (Tabelul 40) cu media experienţei, valori asigurate statistic s-au remarcat în toate cele trei variante experimentale. În cazul seminţelor care au fost ţinute la frigider (V1), precum şi în cazul tratării acestora cu apă caldă, valorile energiei germinative au fost foarte distinct semnificative în ambele cazuri. În cazul seminţelor ţinute la frigider, procentul energiei germinative a fost negativ, fiind mult mai mic (16 %) faţă de media experienţei (18%).

Tabelul 10/Table 10 Influenţa tratamentului asupra energiei de germinare a seminţelor

The treatment influence over the germination energy

Tratamentul The treatment

Media energiei germinative ± d (%) Energy germination average ± d (%)

Media relativă (%) Relative average

V 1 16,0 ± 2,6 ooo 86.20 V 2 19,3 ± 0,8 ** 104.10 V 3 20,4 ± 1,8 *** 109.70

Media experienţei (Mt.) Mean of experiment (Control) 18,6 100

DL 5% 0,51 DL1% 0,68

DL 0,1% 0,90

Rezultatul foarte bun în cazul seminţelor tratate cu apă este confirmat şi de cei de la Institutul de Cercetare şi Dezvoltare pentru Agromediu, Canada. (Rousseau 2002)

4.5.2. Rezultate obţinute prin determinarea capacităţii de germinare a seminţelor

În experienţa efectuată, genotipurile de cătină au prezentat valori ale capacităţii germinative semnificativ diferite (Tabelul 41.), amplitudinea de variaţie fiind cuprinsă între 24,0% (Crăieşti 4, seminţe ţinute în frigider) şi 33,3% (Sf. Gheorghe 6, tratament cu apă caldă), comparativ cu media experienţei, de 29% (martor).

Cea mai slabă capacitate de germinare au avut seminţele genotipurilor: Crăieşti 4, Crăieşti 6, Cluj-Napoca 3, Periprava 1, Letea 5, Fărăgău 4.

Cele mai mari valori ale capacităţii de geminare a seminţelor s-au înregistrat la următoarele genotipuri: Sf. Gheorghe 6, Letea 1, Cătina 2 şi Socol 1.

36

Cele trei variante de tratament au influenţat şi ele în mod semnificativ capacitatea de germinare. Cele mai mici valori ale capacităţii de germinare s-au înregistrat la prima variantă de tratament (seminţe ţinute în frigider), cu abateri asigurate statistic, negative.

Stratificarea seminţelor în nisip (V2) a asigurat valori pozitive la unele genotipuri, dar relativ puţine ca număr, comparativ cu V1, sau V3.

La varianta de tratament apă caldă, s-au înregistrat cele mai multe valori pozitive, semnificative sau foarte semnificative, ale capacităţii de germinare la mai multe genotipuri, comparativ cu varianta V2, sau V1 de tratament. S-a confirmat, ca şi în cazul energiei germinative, că tratamentul cu apă caldă poate îmbunătăţi semnificativ capacitatea de germinare a seminţelor de cătină.

Analizând influenţa genotipului asupra capacităţii de germinare a seminţelor (Tabelul 43) se poate afirma că valorile capacităţii de germinare pentru variantele analizate au fost diferite în comparaţie cu martorul experienţei (29%) la majoritatea genotipurilor. Cel mai mic procent al capacităţii de germinare a seminţelor a fost înregistrat la genotipul Crăieşti 4 (26,3%), iar cel mai mare la genotipul Sf. Gheorghe 6 şi Letea 1 (31,1%).

Genotipurile Cluj-Napoca 7, Crăieşti 8, Socol 6, Fărăgău 4, Periprava 3 şi Periprava 1, au înregistrat cele mai mici procente ale facultăţii germinative, în timp ce la genotipurile: Periprava 5, Sf. Gheorghe 1 şi Socol 1 s-au obţinut cele mai mari procente.

Comparând variantele de tratament (Tabelul 44.) cu media experienţei, valori asigurate statistic s-au obţinut la variantele experimentale V1 şi V3. În cazul tratării seminţelor cu apă caldă (V3), valorile capacităţii germinative sunt foarte semnificative. În cazul seminţelor păstrate la frigider, procentul capacităţii germinative este negativ, fiind mult mai mic (27,04%) faţă de media experienţei.

Tabelul 11/Table 11 Influenţa tratamentului asupra capacităţii de germinare a seminţelor

The treatment influence over the germination capacity

Tratamentul The treatment

Media energiei germinative ± d (%) Energy germination average ± d (%)

Media relativă (%) Relative average

V 1 27.04 ± 1,96 ooo 93.2 V 2 29.18 ± 0,19 100.6 V 3 30.77 ± 1,77 *** 106.1

Media experienţei (Mt.) Mean of experiment (Control) 29 100

DL 5% 0,34 DL1% 0,46

DL 0,1% 0,60

Indiferent de genotipul analizat, se poate afirma că tratarea seminţelor la cătină cu apă

caldă îmbunătăţeşte semnificativ atât energia germinativă, cât şi capacitatea de germinaţie a

seminţelor.

37

4.6. REZULTATE OBŢINUTE PRIVIND VARIABILITATEA EXISTENTĂ LA CĂTINĂ, PRIN STUDIUL SUBSTANŢEI USCATE DIN FRUCTE

Prezentăm în tabelele ce urmează conţinutul de substanţă uscată din fructe pentru fiecare exemplar femel luat în studiu. Spre deosebire de datele obţinute de către (Antoneli et al. 2005), conţinutul în substanţă uscată este mult mai mare decât cel prezentat de ei pentru subspecia carpatica.

În măsurătorile efectuate reiese că pentru regiunea Delta Dunării, valoarea maximă este de 15,3 ◦Brix la accesiunea Periprava 4 iar valoarea minimă este de 9 ◦Brix pentru accesiunea Sf. Gheorghe 7.

Pentru judeţul Mureş, valoarea cea mai mare este de 14,2 ◦Brix la accesiunea Crăieşti 2 şi cea mai mică valoare la Fărăgău 4 de doar 8 ◦Brix.

Pentru judeţul Cluj, valoarea cea mai mare este de 12,4 ◦Brix la accesiunea Cătina 9 şi cea mai mică de 7,5 ◦Brix la Cluj-Napoca 2.

Analiza varianţei cu ajutorul ”testului t” pentru datele prezentate s-a facut având ca şi variante experimentale zonele din care s-au recoltat probele, iar ca şi repetiţiile variantelor, plantele din cadrul populaţiei. Astfel, zona Delta Dunării cuprinde populaţiile din Periprava, Sf. Gheorghe şi Pădurea Letea; Zona Mureş cuprinde populaţiile Fărăgău, Crăieşti şi Socol iar zone Cluj cuprinde populaţiile Cluj-Napoca, Cătina şi Nicula. Varianta martor este considerată media experienţei.

Tabelul 12/Table 12

Conţinutul de substanţă uscată în fructele din zonele studiate Soluble solids content in the berries from the studied areas

Solide solubile

(◦ Brix) Soluble solids Nr.

Zona studiată Studied areas

Nr. plante Plants Media ± sx

(◦ Brix) Mean ± sx

“t” Semnif. Signif CV%

1 Delta Dunării 30 12.63±0,33 3.51 ** 14.51 2 Judeţul Mureş 30 11.73±0,31 1.34 - 14.48 3 Judeţul Cluj 29 9.28±0,23 -6.06 ooo 13.06

Media Mean

11.21±0,23

*, **, ***/ o, oo, ooo Semnificaţia pentru P<0,05; 0,01 şi 0,001 (*, **, *** pozitiv; o, oo, ooo negativ) *, **, ***/ o, oo, ooo Significant at P<0.05; 0.01 and 0.001 (*, **, *** positive, o, oo, ooo negative) Din analiza varianţei reiese faptul că zona Delta Dunării prezintă valori semnificative pozitive în ceea ce priveşte conţinutul de substanţă uscată, pe când zona Cluj prezintă valori distinc semnificativ negative faţă de valoarea martor considerată media experienţei. Zona Mureş nu prezintă diferenţe asigurate statistic.

38

CAPITOLUL V. CONCLUZII ŞI RECOMAND ĂRI

Diversitatea genetică şi structura genetică a populaţiilor a speciei H. rhamnoides a fost investigată prin intermediul markerilor moleculari precum alozimele şi markeri RAPD. (Yao 1993; Bartish et al. 1999)

Pe baza a 6 loci izozimi, Yao şi Tigerstedt (1993) au studiat diversitatea genetică a 11 populaţii de H. rhamnoides ssp. sinensis şi au găsit un nivel mic de diversitate genetică la nivel populaţional, cu valoarea lui h de 0.117.

În studiul lor RAPD în 10 populaţii din flora spontană de cătină aparţinând ssp. rhamnoides cu distribuţie în Europa, Bartish et al. (1999) au găsit că 89.7% şi 55.2% dintre markeri au fost polimorfici la nivel de populaţie şi subspecie, şi că în cadrul populaţiei, indicele pentru diversitate genetică (h) a fost de 0.159.

În studiul de fată pentru H. rhamnoides ssp. carpatica, procentul de markeri polimorfici la nivel populaţional a fost de 56,6% iar indicele pentru diversitate genetică a lui Nei a variat de la 0,14 la 0,22 în cele nouă populaţii studiate, cu o medie de 0,175 (Tabel 35).

Este interesant de notat faptul că diversitatea genetică între populaţii studiate aici ale subspeciei carpatica, se poate compara cu cea a subspeciei ssp. rhamnoides (Bartish et al. 1999) şi cu cea a subspeciei sinensis (Sun et al. 2006) chiar dacă distribuţia acestei subspecii este mai mică decât a ambelor subspecii.

Din analiza datelor RAPD publicate, (Bartish et al. 1999) a împărţit studiile precedente în trei grupuri: (1) grupul care cuprinde taxoni cu polenizare străină făcută de vânt, lemnoase şi cu durată de viaţă mare, la care se aşteaptă un nivel mare de variaţie intra populaţională; (2) gruul care cuprinde taxoni cu polenizare străină, plante perene, în principal ierboase, polenizate de către insecte ; (3) grupul care cuprinde plante anuale sau perene cu viaţă scurtă, cu autopolenizare, şi care prezintă în general o diversitata intrapopulaţională mică. Pe această bază, Barthis (1999) concluzionează că sistemul de înmulţire apare să fie un factor critic pentru explicarea variaţiei genetice din cadrul populaţiilor, şi consideră că ceea ce s-a obţinut la H. rhamnoides ssp. rhamnoides, ca plantă lemnoasă, cu viaţă moderat de lungă, cu polenizare obligatoriu străină şi făcută de vânt, este mai mică decât s-a aşteptat.

Barthis (1999) atribuie nivelul mic al diversităţii genetice intrapopulaţionale distribuţiei isolate şi fragmentate între populaţiile continentale. Se pare totuşi, că acest factor nu poate explica nivelul similar de variabilitate la subspecia carpatica, deoarece aceasta are o distribuţie mare în cadrul ţării noastre şi mai puţin izolată. O explicaţie alternativă a acestui lucru poate să fie stagiul succesional. Subspecia carpatica este o specie pionieră şi ocupă teritorii în stagiul succesional timpuriu.

Aşa cum a fost arătat (Hamrick and Godt 1990), speciile care apar timpuriu în stagiul succesional tind să aibă un nivel relativ mic al diversităţii genetice intrapopulaţionale. În plus, subspecia carpatică prezintă un grad ridicat de înmulţire prin drajonare, care determină existenţa unui individ într-o structură aglomerată (Sun et al. 2006).

Datele din literatură şi observaţiile personale arată că subspecia carpatica poate să producă 10 până la sute de noi plante prin drajonare (Sun et al. 2006). Aşadar, nivelul mare de reproducere clonală, poate fi răspunzător de nivelul relativ mic al diversităţii genetice intra populaţionale din cadrul speciilor de cătină, aşa cum s-a arătat la alte plante (Sun et al. 2006)

Merită de menţionat faptul că diversitatea genetică din cadrul populaţiilor subspeciiei carpatica detectată de prezentul studiu este remarcabil similară cu studiile morfologice pe fructe şi trăsături vegetative ale subspeciei, de ex variaţia detectată de către RAPD în cadrul populaţiilor se

39

corelează bine cu ceea ce s-a detectat prin observaţii morfologice. De exemplu, populaţia P2 şi P6, reprezintă valori scăzute, respective ridicate pentru diversitatea genetică, în ceea ce priveşte forma, culoarea şi mărimea fructelor. Acest lucru este arătat şi de către analiza RAPD.

Structura genetică a populaţiilor Bussell (Bussell 1999) face o recenzare a datelor obţinute prin RAPD la 35 de specii şi arată

că în medie, 19.3% din diversitatea genetică totală există în cadrul populaţiilor la 29 de specii cu polenizare străină şi că 62.5% din diversitatea genetică totală există în populaţii la 6 specii cu autopolenizare. De altfel, este de aşteptat faptul că majoritatea diversităţii genetice să existe în populaţii, atât la ssp. sinensis (81.7%) (Sun et al. 2006) cât şi la ssp. rhamnoides (84.9% rezultată din analiza AMOVA) descoperită de (Bartish et al. 1999) deoarece H. rhamnoides este o specie cu polenizare străină şi cu polenizare făcută de vânt.

Aceste valori sunt mai mici decât media la alte specii cu acelaşi tip de polenizare (Bussell 1999). Pe lângă sistemul de polenizare, aşa cum se arată de către mulţi autori, fluxul de gene dintre populaţii are o semnificaţie importantă la distribuţia variaţiei genetice (Hamrick and Godt 1990).

Chiar dacă studiile recente arată că polenul subspeciei sinensis nu se împrăştie pe o distanţă mai mare de 20 m, având 60–90% din pollen care cade până la 12 m (Tian et al. 1993), incidenţa dispersării seminţelor facilitată de către păsări şi animalele mici a fost foarte mare la ssp. sinensis (Sun et al. 2006).

Aşadar, diferenţierea limitată din punct de vedere genetic între populaţiile de cătină poate să fie atribuită distanţei mari de dispersie a seminţelor.

La multe specii de plante există o corelare între poziţia geografică şi distanţele genetice dintre populaţii, care poate fi explicată prin ipoteza izolării prin distanţă (Comes and Abbot 2000).

În studiul pe 10 populaţii de H. rhamnoides ssp. rhamnoides, (Bartish et al. 1999) nu au găsit nici o corelaţie între distanţele genetice şi cele geografice între populaţii, analiză RAPD pe două seturi de date (r = 0.11, P = 0.763; r = 0.04, P = 0.641).

În mod asemănător, datele noastre RAPD nu au arătat o corelare semnificativă între distanţele genetice şi cele geografice pentru 10 populaţii ale subspeciei carpatica (r = 0.14, P = 0.851).

Acest tip de diferenţiere a populaţiilor poate implica adaptarea ssp. carpatica la condiţiile locale de mediu, dat fiind faptul că habitatul ssp. carpatica diferă foarte mult funcţie de distribuţia sa (Ţopa 1960).

O altă explicaţie dată de Bartish et al. 1999, sugerează că, este posibil ca marea dispersie geografică şi diferenţierea ecotipurilor să nu fie reflectată de către profilele RAPD.

Variabilitatea fenotipică per ansamblu caracterlor întâlnită la populaţiile studiate este deosebit de mare, ceea ce constituie un fapt imbucurator pentru pentru amelioratori, care pot selecta în procesul de ameliorare indizi cu caracteriticile dorite de ei.

În ceea ce priveşte variabilitatea greutăţii fructelor, s-a observat în analiza dedicată acestui aspect că aceasta este mare, cu o limită maximă a greutăţii medii a fructelor de 519,96 mg la genotipul Pădurea Letea 4. Comparând acest rezultat cu genotipurile existente pe piaţa din România constatăm cu mândrie că acesta este un genotip care se încadrează în clasa superioară de calitate în oferta actuală românească.

În schimb însă, dacă comparăm acelaşi individ cu ceea ce există pe piaţa internaţională, observăm că este un individ de clasă medie, Rusia propunând la vânzare varietăţi obţinue prin selecţie în hibrizi obţinuţi prin polenizare liberă care au o greutate medie a fructelor de 0,8 – 1,1 g.

40

Acest lucru ne face să afirmăm că există o cale lungă încă în procesul de ameliorare al cătinei în ţara noastră, care abia este pe cale de pionierat, varietăţile existente pe piaţa actuală fiind doar selecţii din flora spontană cu o fişă bogată de observaţii.

Există în curs de desfăşurare alte studii axate pe biologia reproducţiei, ecologie şi genetica populaţiilor care folosesc alte tehnici de analiză moleculară care vor aduce lămuriri pentru conservarea şi folosirea acestei imporatante specii economice.

41

BIBLIOGRAFIE SELECTIV Ă

1. Aksenova, N. A. and V. S. Dolgacheva (2003). Seabuckthorn culture in the botanical garden of the Moscow State University. Seabuckthorn (Hippophae L.) A multipurpose wonder plant. V. Singh. 1: 165-169.

2. Antoneli, M., A. Raffo and F. Paoletti (2005). Biochemichal changes during ripening of Seabuckthorn (Hippophae rhamnoides) fruits. Seabuckthorn, a multipurpose wonder plant. V. Singh, Daya publishing house, New Delhi, India. 2: 285-312.

3. APAQ (1999). Argousier - Guide de production, Mycoflor Inc. 4. Bartish, I. V., N. Jeppsson and H. Nybom (1999). "Population genetic structure in the dioecious

pioneer plant species Hippophae rhamnoides investigated by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers." Molecular Ecology 8(5): 791-802.

5. Bartish, I. V., N. Jeppsson, H. Nybom and U. Swenson (2002). "Phylogeny of Hippophae (Elaeagnaceae) inferred from parsimony analysis of chloroplast DNA and morphology." Systematic Botany 27(1): 41-54.

6. Bussell, J. D. (1999). "The distribution of random amplified polymorphic DNA (RAPD) diversity amongst populations of Isotoma petraea (Lobeliaceae)." Mol. Ecol. 8: 775–789.

7. Chen, Y., G. Liu and B. Xu (2005). "[Effects of artificial seabuckthorn forest on soil and water conservation in loess hilly region]." Ying Yong Sheng Tai Xue Bao 16(4): 595-599.

8. Comes, H. P. and R. J. Abbot (2000). "Random amplified polymorphic DNA (RAPD) and quantitative trait analyses across a major phylogeographical break in the Mediterranean ragwort Senecio gallicus Vill. (Asteraceae)." Mol. Ecol. 9: 61–76.

9. Ge, S., G. C. Oliveira, B. A. Schaal, L. Z. Gao and D. Y. Hong (1999). "RAPD variation within and between natural populations of the wild rice oryza rufipogon from china and brazil." Heredity 82 (Pt 6): 638-644.

10. Gotea, I., D. Pamfil and R. Gotea (2010). "The study of principal characteristics of fruits from different seabuckthorn populations (Hippophae rhamnoides L. ssp. carpatica) and the filogenetics relations among them." Notulae Scientia Biologicae 2(4): in press.

11. Gotea, I., D. Pamfil and R. Gotea (2010). "The variability of soluble solids content in the seabuckthorn fruits (Hippophae rhamnoides L. ssp. carpatica) from three regions of Romania." Bulletin UASVM, Agriculture 67(2): 521.

12. Hamrick, J. L. and M. J. Godt (1990). Allozyme diversity in plant species. Plant population genetics, breeding, and genetic resources. A. H. D. Brown, M. T. Clegg, A. L. Kahler and B. S. Weir. Sinauer, Sunderland, MA.: 43–63.

13. Huang, Q. (2003). Breeding of seabuckthorn (Hippophae rhamnoides L.) in China. Seabuckthorn (Hippophae L.) A multipurpose wonder plant. V. Singh. 1: 187-193.

14. JÄNTSCHI, L., S. D. BOLBOACĂ and R. E. SESTRAŞ (2009). "Hard Problems in Gene Sequence Analysis: Classical Approaches and Suitability of Genetic Algorithms

" Biotechnology & Biotechnological Equipment 23(2): 1275-1280. 15. Kun Sun, W. C., Ruijun Ma, Xuelin Chen, Ang Li, and Song Ge (2006). "Genetic variation in

Hippophaë rhamnoides ssp. sinensis (Elaeagnaceae) revealed by RAPD markers." Biochem. Genet. 44(5-6): 186-197.

16. LANDRY, B., L. R.Q., W. Y. CHEN and R. L. GRENGER (1994). "Phylogeny analysis of 25 apple rootstocks using RAPD markers and tactical gene tagging." Theor. Appl. Genet. 89: 847-852.

42

17. Natalia, D. (2003). Research on the introduction of seabuckthorn varieties in North Russia. Seabuckthorn (Hippophae L.) A multipurpose wonder plant. V. Singh. 1: 125-136.

18. Nei, M. (1972). "Genetic distance between populations." Am. Nat. 106: 283-292. 19. Nei, M. (1978). "Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number

of individuals." Genetics 89: 583-590. 20. PAMFIL, D., R. H. ZIMMERMAN, S. K. NAESS and H. J. SWARTZ (2000). "Investigation of

Rubus Breeding Anomalies and Taxonomy Using RAPD Analysis." Small Fruits Review 1(1): 43-56.

21. Persson, H. A. and H. Nybom (1998). "Genetic sex determination and RAPD marker segregation in the dioecious species sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.)." Hereditas 129(1): 45-51.

22. Prokkola, S. (2003). "Reliability of russian sea buckthorn cultivars in north Ostrobothnia, Finland." ISHS Acta Horticulturae 626 XXVI International Horticultural Congress: Berry Crop Breeding, Production and Utilization for a New Century: 381-387.

23. Qinxiao, W. and H. Zhao (2003). Seabuckthorn for the control of soil erosion in mountainous lands. Seabuckthorn (Hippophae L.) A multipurpose wonder plant. V. Singh. 1: 401-408.

24. Raţi, I. V. and L. Raţi (2003). Cătina albă în exploataţii agricole. 25. Rousi, A. (1965). "Observation on the cytology and variation of European and Asiatic

populations of Hippophaë rhamnoides." Ann. Bot. Fenn. 2: 1-18. 26. Rousseau, H. (2002). Développment des techniques de reproduction végétative et essais de

cultivars d'argousiers. Projet # 0121/IRDA, Institut de recherche et de développement en agroenvironnement, Quebec, Canada,.

27. Ruan, C. J., P. Qin, J. W. Zheng and Z. X. He (2004). "Genetic relationships among some cultivars of sea buckthorn from China, Russia and Mongolia based on RAPD analysis." Scientia Horticulturae 101(4): 417-426.

28. Sanjai K., D. and B. Singh (2003). Research on seabuckthorn in Ladakh. Seabuckthorn (Hippophae L.) A multipurpose wonder plant. V. Singh. 1: 499-503.

29. Sheng, H. M., L. Z. An, T. Chen, S. J. Xu, G. X. Liu, X. L. Zheng, L. L. Pu, Y. J. Liu and Y. S. Lian (2006). "Analysis of the genetic diversity and relationships among and within species of Hippophae (Elaeagnaceae) based on RAPD markers." Plant Systematics and Evolution 260(1): 25-37.

30. Sun, K., W. Chen, R. Ma, X. Chen, A. Li and S. Ge (2006). "Genetic Variation in Hippophae rhamnoides ssp. sinensis (Elaeagnaceae) Revealed by RAPD Markers." Biochem Genet 44(5-6): 186-197.

31. Tamura, K., J. Dudley, M. Nei and S. Kumar (2007). "MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0." Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599.

32. Thomas, S. C. L. (2008). Plantation and management practices of seabuckthorn. Seabuckthorn (Hippophae L.) A multipurpose wonder plant. V. Singh. 3: 27-48.

33. Tian, L. C., F. L. Guan and M. Y. Zhang (1993). "The preliminary study of flowering features in Hippophae rhamnoides L. ssp. sinensis Rousi and artificial hybridization." Hippophae 6: 29–33.

34. Ţopa, E. (1960). "Hippophae rhamnoides în R.P.R." Contr. bot.: 239-245. 35. Weising, K., R. G. Atkinson and R. C. Gardner (1995). "Genomic fingerprinting by

microsatellite-primed PCR: a critical evaluation." PCR Methods Appl 4(5): 249-255.

43

36. Yao, Y. (1993). "Effects of temperature sum on vitamin C concentration and yield of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides) fruit: optimal time of harvest." Agricultural Science in Finland 2: 497-505.

37. YEH, F. C. and T. J. B. BOYLE (1997). "Population genetic analysis of co-dominant and dominant markers and quantitative traits." Belgian Journal of Botany 129: 157.

ing. Ionuţ GOTEA

The study of the genetic variability with molecular markers at the dioecious

species Hippophaë rhamnoides L. ssp. carpatica Rousi

Summary of the PhD Thesis

Scientific advisor: Prof. Dr. Doru PAMFIL

Cluj-Napoca 2010

TABLE OF CONTENTS

Table of contents .................................................................................................................................1

Introduction.........................................................................................................................................3

Chapter I. Curent stage of the researches ........................................................................................4

1.1. Economic and cultural importance of the Hippophae rhamnoides species...............................4

1.2. Curent stage of the researches...................................................................................................5

Chapter II. Research framework and objectives .............................................................................9

2.1. Features and aspects of the studied areas ..................................................................................9 2.2.1. Danube Delta area.........................................................................................................9 2.2.2. Mureş county ..............................................................................................................10 2.2.3. Cluj county..................................................................................................................11

2.2. Conclusions regarding the geographical distribution..............................................................12

2.3. Proposed objectives.................................................................................................................13

Chapter. III. Biological material and working methods ...............................................................14

3.1. Biological material ..................................................................................................................14

3.2. Methods to measure phylogenetical closeness at the studied genotypes ................................15

3.3. Methods to persuade seeds germination .................................................................................18

3.4. Statistical and mathematical methods used for processing the results of the phenotypical and genotypical variability study..............................................................................20

3.5. Statistical and mathematical methods used for processing the results of the molecular variability study.............................................................................................................20

3.6. Methodes to persuade the soluble solid content from berries .................................................21

Chapter IV. Results and discussions ...............................................................................................23

4.1. The obtained results regarding the available variability at seabuckthorn, through applying phylogenetical closeness methods...................................................................................23

4.1.1. The results of the applied taxonomical methods at the genotypes provided from collection, on the base of plants and seeds traits .........................................................23

4.2. The obtained results regarding the available variability at seabuckthorn, through the study of the main traits of the seeds .........................................................................................24

4.2.1. The characteristic features of seed obtained from Danube Delta region....................24 4.2.2. The characteristic features of seed obtained from Mureş county ...............................25 4.2.3. The characteristic features of seed obtained from Cluj county ..................................25 4.2.4. Seed weight variability in populations from the three studied areas ..........................25

4.3. The obtained results regarding the available variability at seabuckthorn, through the applying molecular markers methods ......................................................................................26

4.3.1. The results of the DNA extraction..............................................................................27 4.3.2. The results of the DNA amplification ........................................................................27 4.3.3. The dendrogram of the studied seabuckthorn populations .........................................28

4.4. The obtained results regarding the available variability at seabuckthorn, through the study of berries .........................................................................................................................31

The characteristics of berries obtained from Danube Delta region ......................................31 4.4.2. The characteristics of berries obtained from Mureş county .......................................32 4.4.3. The characteristics of berries obtained from Cluj region ...........................................32 4.4.4. The variability of fruits weight at the studied populations .........................................32 4.4.5. Phenotypic correlations between seed weight and fruit weight in the studied populations ...............................................................................................................33

4.5. The results regarding the improvement of the seeds germination and the possibility to apply treatments to increase the germination percentage.........................................34

4.5.1. The results obtained through the persuade seeds germination energy .......................34 4.5.2. The results obtained through the persuade seeds germination capacity .....................35

4.6. The obtained results regarding the available variability at seabuckthorn, through the soluble solid content in fruits ...................................................................................................37

Chapter V. Conclusions and recomandations ................................................................................38

Selective bibliography.......................................................................................................................41

45

INTRODUCTION The thesis „The study of the genetic variability with molecular markers at the dioecious

species Hippophaë rhamnoides L. ssp. carpatica Rousi” has as objectiv the study of the phenotipic, genotipic and molecular variability of the seabuckthorn (Hippophaë rhamnoides L. ssp. carpatica Rousi) in three areas from our country where this shrub is widely naturaly spread: Cluj county, Mureş county and Danube Delta region.

Raporting this study to the researches made in Romania until now we can say that this study disthinguis by originality because the molecular analysis was made for the first time at this species.

The motivation of this study was my desire to know this plant and to identify valuable genotyps that could be introduced in comercial plantations for fruits productions.

During my research period I had as objectives, for the first period, to identify based on morfological criteria valuable genotips regarding the fructifications, for the female plants, and regerding the number of floral buds, for the male plants.

I was surprised to find out how big is the variability of fruits form and weight, at the female plants, and the form of floral buds at the male plants.

This is a really good breeder's point of view, in light of the large number of choices for valuable genotips.

The molecular characterization of individuals taked into the study was conducted using RAPD markers (Randomly Amplified polymorphic DNA). This phase was conducted in the Department of Biotechnology of Veterinary Medicine, Cluj-Napoca, with financial support from the TD CNCSIS grant that I won in the competition of 2006. In the same year I obtained a scholarship for young PhD BD CNCSIS who has also contributed to the completion of the research undertaken.

The results obtained by RAPD technique have been encouraging us and we have estimated the degree of genetic relationship between populations studied by construction of dendrograms.

Over the years we have made a hard work in the field to bring consistent selection of valuable genotypes, especially in terms of their fructification strength in order to be used as genitors for creation of commercial plantations by classical propagations methods, but also for the selection of somme genotypes that can be propagated trough in vitro methods.

The resulting selections were the starting point of another doctoral thesis focused on the in vitro propagation of sea buckthorn. The researches are made in the Plant Biotechnology Department of our University, and which already has promising results in this field, presented at the international symposiums.

PROPOSED OBJECTIFS

Because of special interest now given to this species, we proposed to study the phenotypic and genotypic variability of biological material collected from spontaneous flora of three areas mentioned above for the selection of valuable genotypes in terms of fructification (for female plants) and in terms of production of pollen (the male plants) for further introduction in commercial distribution.

Evaluation of phenotypic and genotypic characters involved quantitative and qualitative analysis of the genotypes studied, interpretation of experimental data by analysis of variance, the estimation of correlations between the characteristics studied by calculating the correlation coefficients.

Assessment at the molecular level was achieved by PCR-RAPD molecular markers, assuming RAPD primers tests, extraction of DNA from the analyzed material, performing PCR amplifications with RAPD primers.

46

Analysis of phenotypic and genotypic variability, followed the selection of genotypes considered valuable, as a fruit production, pollen production respectively. Forms identified for their valuable features were used as genitors for their propagation in vitro. Unfortunately, the data we have so far conclude that not all of these genitors selected shows suitability for this type of propagation.

MATERIAL AND METHODS

The biologic material used in our researched was harvested from spontaneous flora of three natural areas: Danube Delta, Cluj county and Mureş county. This areas do not represent the entire areal of distribution of this species in Romania.

Populations where diveded into three areas, according to the region of origin. The first group includes populations from the Danube Delta: P1 (Periprava), P2 (Sf. Gheorghe) and P3 (Letea). The second group comprises populations from Mures county: P4 (Faragau), P5 (Craiesti), P6 (Socol). The third group includes populations of Cluj County: P7 (adjacent areas of Cluj-Napoca), P8 (Catina), P9 (Nicula).

The location of these populations and the number of individuals collected from each site are presented in Table 1.

Table 1 Identification of the studied populations, area of amplasament and the number of individuals

Population number Individuals number Location Altitude

P1 18 Loc. Periprava, Delta Dunării 4

P2 19 Loc. Sf. Gheorghe, Delta Dunării 3

P3 22 Pădurea Letea, Delta Dunării 15

P4 20 Loc. Fărăgău, Jud. Mureş 400

P5 21 Loc. Crăieşti, Jud. Mureş 350

P6 19 Loc. Socol, Jud. Mureş 450

P7 20 Oraşul Cluj-Napoca, Jud. Cluj 540

P8 19 Loc. Cătina, Jud. Cluj 400 P9 20 Loc. Nicula, Jud. Cluj 300

From each population was harvested approximately 20 individuals, both male and female

plants at an interval of at least 50 m to prevent collection of leaves from the same individual. Fresh leaves were collected in the field and preserved in separate bags with silica gel.

47

CONCLUSIONS

In the present study for H. rhamnoides ssp. carpatica, the percentage of polimorfic markers at the populational level is 56,6% and Nei index for genetic diversity varied between 0,14 to 0,22 in the nine studied population, with an average of 0,175.

It is interesting to observe that the genetic diversity between the population taken into study from the carpatica subspecies can be compared with the genetic diversity revealed for ssp. rhamnoides (Bartish et al. 1999) and with sinensis suspecies (Sun et al. 2006) even if the distribution of these subspecies is smaller than both subpecies.

Barthis (1999) confer the low level of intrapopulational genetic diversity to the fragmentate and isolate distribution between the continental populations. It seems nevertheless, that this factor can’ot explains the similar level of variability at the carpatica subspecies, because this subspecies has a wider distribution in Romania and is not fragmented. An alternative explanation for this can be the succesional stage. Seabuckthorn is a pionier species and occupy territories in the succesional stage at an earlier time.

As has been shown (Hamrick and Godt 1990), the species wich appear earlier in the succesional stage present a relatively low level of intrapopulational genetic diversity. Besides, carpatica subspecies present a high degree of suckers multiplication which determine the presence of an individual in an agglomerate form (Sun et al. 2006).

The datas from the literature and personal observations show that carpatica subspecies can produce then to hundreds of new plants from suckers. (Sun et al. 2006). Thus, the high level of clonal reproduction can be the cause for the low level of intrapopulational genetic diversity from the seabuckthorn species, situation showed also to other plants. (Sun et al. 2006)

It deserves to mention that the genetic diversity among populations of carpatica subspecies detected by the present study is remarcably similar with morofological stdudies on berries and with the vegetative traits of the subspecies. As an example, genetic variation detected by RAPD markers inside the population is well correlated with the one detected by morphological observations. The population P2 and P6, presents low values, respectevly high values for the genetic diversity, regarding the form, color and the size of the berries. The same values are obtained from the RAPD analysis.

At a lot of plant species there is a positive correlation between geographic position and genetic distances among populations, which can be explained trough the hipothese of isolation by distance (Comes and Abbot 2000).

In their study on 10 populations of H. rhamnoides ssp. rhamnoides, (Bartish et al. 1999) do not found any correlation between geographic and genetic distances, on data resulted from two data sets (r = 0.11, P = 0.763; r = 0.04, P = 0.641).

Similar, our RAPD data has not revealed a significant correlation between genetic and geographic distances for the 10 analysed populations of carpatica subspecies (r = 0.14, P = 0.851).

This type of differentiation can involve the adaptation of carpatica subspecies to the environment condition, because the habitat of the carpatica subspecies differ allot with their habitat (Ţopa 1960).

Another explanation given (Bartish et al. 1999) sugest that, it is possible that the wide geographical dispersion and the differentiation of ecotypes to be not reflected by RAPD profiles.

The phenotypic variability from all plants traits is vert high, which is good news for the breeders that can select in the breeding process individuals that present the desired traits.

Regarding the berries wheight variability it was observed that this is very high, presenting a maximum limit of average berries wheight of 519, 96 mg from Pădurea Letea 4 genotype.

48

Comparing this result whith the genotypes available on the Romanian market we findt out with pride that our genotype can be classified in the superior class of quality.

Instead, if we compare the same genotype with the varieties existing on the international market, we discover that this is a medium class genotype, because Russia offer to the market varieties obtained from selection with berries wheight varies from 0,8 – 1,1 g.

We can conclude that there is still a long way in the seabuckthorn breeding process in Romania, which is only into a pionierat phase, existing Romanian varieties being only selections from spontaneous flora with a rich observation list.