DESVENDANDO O DIAGNÓSTICO DA LVCDIAGNÓSTICO DA LVC

Dr. Luiz Eduardo RistowDr. Afonso Alvarez Perez Junior

LVC (Leishmaniose Visceral Canina) ETIOLOGIA

Protozoário: Leishmania chagasida família dos Trypanosomatidae,

pertencente ao Complexo Leishmania pertencente ao Complexo Leishmania donovani

Vetor: “mosquito palha” Lutzomyialongipalpis - Prefere picar ponta de orelha e nariz. Crepuscular e Noturna –voa baixo – 1 a 3 mm.

LVC (Leishmaniose Visceral Canina)epidemia em franca expansão geográfica

Ocorre em 20/27 Estados do

Brasil!

Mais de 90% dos casos de Leishmaniose Visceral das Américas ocorrem no Brasil

LVC – Etiologia e VetorEste protozoário necessita de 2 hospedeiros, sendo um hospedeiro vertebrado (homem, canídeos, etc.)

e um hospedeiro invertebrado (mosquito palha)

LVC –VetorImportante ressaltar que flebotomíneos não são mosquitos pois não tem fase larval na

água e sim na matéria orgânica;

Não tem preferência pelo interior das residências: 84% está no Peridomicílio.

No hospedeiro vertebrado ele penetra através da picada do

mosquito infectado, as promastigotas se transformam em amastigotas,são fagocitadas, se dividem – rompem os

macrófagos e são novamente fagocitadas- e pelo sistema hémato-fagocitadas- e pelo sistema hémato-

linfocitário alcançam os órgãos do sistema mononuclear fagocitário

(medula óssea, baço, fígado, sistema linfático, etc) onde se reproduzem mais por fissão binária na forma amastigota. JÁ NAS 1ª HORAS.

LVC - Patogenia• Tempo de incubação bastante variado que vai de 2 meses

até 6 anos. Em geral os primeiros anticorpos são observados após 45 dias da infecção.

• No mosquito, o período entre a contaminação e a • No mosquito, o período entre a contaminação e a eliminação da forma infectante (promastigota metacíclica), atinge de 4 a 21 dias.

• A doença decorre da invasão do agente nas vísceras, sua reprodução e colonização das células do hospedeiro vertebrado, principalmente as células do Sistema Mononuclear Fagocitário. Naqueles animais sensíveis haverá maior manifestação dos sinais clínicos.

Implicações imunológicas

•

Resistência•Resposta imune celular•Resposta Th1•Aumento nos níveis de IFN-γ

•Aumento dos níveis IL- 2 e IL-12

• Aumento dos níveis de IgG2

www.fcfrp.usp.br

• Aumento dos níveis de IgG2

Susceptibilidade

• Resposta imune humoral• Resposta Th2

• Níveis baixos de IFN-γ

• Aumento dos níveis de IL-10 e IL- 4

• Aumento dos níveis de IgG1

Novos mecanismos de transmissão da LVC

• Transmissão vertical da LVC -TRANSPLACENTÁRIA

- Andrade et al., (2002): Placenta de cadelas- Rosypal e Lindsay (2005): Modelo murino- Rosypal (2005): Cadela Beagle- Silva et al., (2009): 1º relato no Brasil- Santos et al., (2009): Cadelas sintomáticas e assintomáticas

Transmissão Venérea da LVCPrimeiro relato de transmissão venérea da LVC (Silva et al.,

2009);

- 6 das 11 cadelas foram positivas para Leishmania sp pela técnica da PCR;

- 2 das 11 cadelas apresentaram soroconversão detectadas pelas técnicas de ELISA e RIFI,

A transmissão venérea da LVC é unidirecional, partindo do macho infectado para fêmeas susceptíveis.

Transmissão por Transfusão da LVC

•Leishmania sp. pode ser transmitida pelosangue total ou frações de célulasmononucleares de cães infectados paraanimais receptores, independentemente daanimais receptores, independentemente dacondição clínica do doador (de Freitas et al.,2006);

•Três dos sete cães que receberam sanguede doadores infectados desenvolveramtítulos sorológicos para LVC por IFA (Owenset al., 2001);

Leishmaniose felinaUm Novo Desafio?

Sinais ClínicosFase Aguda

Linfadenomegalia generalizadaFebreProstraçãoAusência de lesões na peleAusência de lesões na pele

Fase CrônicaLinfadenomegaliaCaquexiaAlopeciaÚlceras cutâneasDermatites esfoliativa

• Onicogrifose• Anemia• Hepatoesplenomegalia• Disfunção renal• Trombose

LVC – Sinais Clínicos

Dermatológicos:• Reação no local da infecção = associado à picada do

mosquito vetor. “Cancro de inoculação”; cerca de 20 dias após a infecção.

• dermatite seborréica• dermatite seborréica• alopecia periorbital• hiperqueratoses• nódulos subcutâneos• Onicogrifose ( unhas grandes ) • ausência de prurido• erosões e úlceras (pontas de orelha/focinho)

LVC – Sinais Clínicos• linfadenomegalia • emagrecimento• abatimento, fadiga, prostração• febre• anemia• nefrite• nefrite• hepatoesplenomegalia• hemorragias (melenas, epistaxe)• poliartrites• lesões oculares (blefaroconjuntivites/ceratoconjuntivite/hemor-ragias

retinianas)

Em condições naturais 60% dos cães infectados são assintomáticos ou seja sem sinais clínicos!!

Prevenção e ControleControle – Vetor

• Ação inseticida e repelente: Plantas

repelentes (Citronela

e Neem)

• Controle do meioambiente

Controle – Vetor• Controle com Inseticida:

- Direcionado para as formas adultas

- inseticidas residuais são eficientes

em reduzir a população de flebotomosem reduzir a população de flebotomos

- aplicação de inseticidas nas casas e

redes impregnadas com inseticidas

- Utilização num raio de 150 metros (caso humano)

- Dificuldade: custos e liberação dos moradores

Controle do Vetor• CONTROLE REPELENTE

• Coleira impregnada com DTM a 4% / Dissolução lenta

na camada lipídica da pele do cão - Ótimos níveis em

todo o corpo após 2 a 3 semanas

• Indicada somente para cães (não p/ Felinos)

• Proteção permanente até 6 meses

•CONTROLE REPELENTE

Controle do Vetor

�Combinação de Permetrina x Imidacloprida

– demonstrou ação repelente e inseticida em áreas endêmicas

(Mencke et al., 2003)

� Recomenda-se a aplicação a cada 21 dias (90-92%)

Imunoprofilaxia

Leish-tec®

Leishmune®

Canileish ® - Europa

Impedem a transmissão

Educação

Para isto contamos com o apoio laboratorial. Exames Laboratoriais são uma importante fonte de informações,

Em condições naturais 60% dos cães infectados são assintomáticos ou seja sem sinais clínicos!!

uma importante fonte de informações, indispensáveis para tomada de decisões na busca de soluções para cada situação.

Achados Laboratoriais

Parâmetro Frequência (%)

Hipergamaglobulinemia 70 – 100

Baixa relação Alb/Glob 76

Elevação Proteína Sérica Total 64 – 91

Anemia Normocítica/cromica 21 – 94

LeucopeniaLeucopenia 22

Leucocitose 8 – 24

Trombocitopenia 29 – 50

Hiperazotemia e Creatininemia 38 – 45

Elevação das enzimas hepáticas 16 – 61

Proteinúria 29 – 91

Positividade Autoimune (ANA) 31 - 47

QUEM DÁ O DIAGNÓSTICO É O MÉDICO VETERINÁRIO

Juntamente com a avaliação clínica dos animais; dados epidemiológicos, freqüência e incidência de sinais clínicos, freqüência e incidência de sinais clínicos, nos permitem a definição do diagnóstico (Medicina veterinária baseada em evidencias).

• Os exames laboratoriais individuais devem ser usados para fins diagnósticos (CERTEZA) a fim de evitar uso errôneo de medicamentos e vacinas baseado apenas medicamentos e vacinas baseado apenas em suposições já que muitas doenças apresentam sinais clínicos similares.

• No caso LVC, define prognostico legal de morte (MS – RIFI 1:40).

Existem 4 expectativas ou “ Desejos “ envolvidos no Diagnóstico Laboratorial

da Leishmaniose:1- Proprietário quer que dê Negativo ;2- Serviço de Zoonose (Saúde Pública) quer controlar (suspeito = positivo);2- Serviço de Zoonose (Saúde Pública) quer controlar (suspeito = positivo);3- M. Veterinário quer esclarecer “DE

UMA SÓ TACADA”;4- Laboratório quer relatar o resultado encontrado e não pode se envolver nos

desejos para evitar influências.

TESTES SOROLÓGICOS:���� RIFI * + ELISA* * Técnicas aceitas pelas autoridades sanitárias Brasil – REALIZAR APENAS C/ KITS REGISTRADOS NO MAPAC/ KITS REGISTRADOS NO MAPA .

- FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO;- HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA;- AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX;- IMUNOPRECIPTAÇÃO EM GEL - WESTERN BLOT

• Coleta do Sangue para obter o SORO – mínimo 1 ml – colhido na seringa e colocado no Tubo de Tampa Vermelha – sem anticoagulante (MAS COM ACELERADOR DA COAGULAÇÃO, para não dar hemólise e falso positivo).

SEMPRE USAR SORO !!!SEMPRE USAR SORO !!!

Métodos disponíveis no TECSA:1-Sorologia LVC- ELISA + RIFI -2 dias2-Sorologia LVC+ Pesq. de Hemat. -2 dias3-Sorologia LVC+PTF - 2 dias3-Sorologia LVC+PTF - 2 dias4-Sorologia LVC+Imunohist. - 5 dias5-Imunohist. para LVC - 5 dias6-Pesquisa Direta para LVC- 5 dias7-PCR para LVC - 3 dias8-Perfil Diag.: Sorologia+IHQ+Cultura-25 dias

FUNDAMENTOS

• Positivo ou Reagente ?Palavras com significados diferentes e

conseqüências diferentes

• Indeterminado?• Indeterminado?• Indeterminado num teste sorológico significa que o

resultado obtido apresentou-se perto do ponto de corte (valor teórico estabelecido pelo fabricante ou legislação a partir de uma equação teórica. No caso de RIFI significa observação de fluorescência não típica devido a característica do soro.

IFI (RIFI) – Reação de Imunofluorescência Indireta

Resultados:• Reagente (1:40 ou maior)• Reagente (1:40 ou maior)• Não Reagente• Indeterminado

L. major-likelike

( Inesp.)

• RIFI: se não L. chagasi, se for L. major (rede MS) resultado positivo para todos os tripanosomatídeos!!!!

Ponto de Corte

– No Brasil positivo é > ou = 1/40 para inquéritos

caninos

– No Brasil é > ou = 1/80 para sorologia humana

– E no resto do mundo ?

PONTO DE CORTE DA RIFI• O MS, LACEN e SERVIÇOS DE ZOONOSE CONSIDERAM O

TÍTULO DE 1/40 COMO POSITIVO EM CÃO ( E 1/80 PARA HUMANOS);

• A maioria dos pesquisadores hoje • A maioria dos pesquisadores hoje considera 1/160 como título mínimo.

• Dr. Luigi Gradoni –Istituto Superiore de Sanitá -Itália –1/160• Dra Joaquina Martín-Sanches-1/160 trabalho publicado

pelo CDC dos EUA em 2009 • Dr Lluis Ferre - 1/320

TECSA utiliza kits importados

que contem antígeno específico

do parasito causador da LV : do parasito causador da LV :

L. chagasi

• Nossas leituras são realizadas por Profissionais com vários anos de experiência em Leitura de Leishmaniose .

• Na nossa larga experiência em Laboratório Diag. é por realizarmos milhares de exames de LVC.

• Uma das mais importantes formas de aumento do poder diagnóstico,

ou seja obter fechamento conclusivo, é o SOMATÓRIO DE conclusivo, é o SOMATÓRIO DE

EXAMES.

Ex. HIV { ELISA + RIFI}

Diagnóstico sorológico ELISA

http://www.managingdesire.org

KIT ELISA BIOGENE•Especificidade MEDIA de 94,3% (pode alcançar 100%)

•Sensibilidade MEDIA de 89% (pode alcançar 96,4%)

Dados da BULA DO KITbaseado em trabalhos UFPE, UFCG, UFRN.

Resultado da OD – densidade ótica – é estabelecido em Relação ao

Cutoff

120

140

0

20

40

60

80

100

-0,05 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,55 0,6 0,65 0,7

Frequency

S/P

Cut-off: 0,100

Kits ELISA Bio-Manguinhos

ELISA (triagem) e RIFI (confirmação)– rede pública: Ag total de Leishmania major.

Inform. de bula RIFI ELISA ELISAAmostra soro soro Papel de filtro

(eluato)(eluato)Sensibilidade 90% 94,5% 79,5%

Especificidade 80% 91,8% 90,2%

Atenção para a sensibilidade e especificidade diferentes de cada método e

para cada teste(antígeno)!

Cad Saúde Pública 2004 Jan-Feb; 20(1):259-65 Pub 2004 Mar 08

[Quality of diagnosis of canine visceral leishmaniasis in epidemiological

surveys: an epidemic in Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil, 1993-1997]

Alves WA, Bevilacqua PDAlves WA, Bevilacqua PD

“... Como implicações práticas nas atividades de controle da LV canina na

capital mineira, o programa sacrificou 12.924 animais falsos positivos e

deixou de sacrificar 2.003 animais falsos negativos...”

• O resultado depende do Ag usado nos testes

–ELISA utilizado TECSA : Ag HSP70= proteína recombinante (S7) Biogene. Mais especifico para L chagasi Mais especifico para L chagasi NEGATIVO em cães vacinados

–ELISA inquéritos: Ag = bruto L. majorBaixa especificidade (alto FALSO-POSITIVO)

• Fechamento conclusivo é necessário o SOMATORIO DE EXAMES.

PRIMEIRO PASSO• Sorologia ELISA S07 + RIFI (L. chagasi)• Sorologia ELISA S07 + RIFI (L. chagasi)

• Hemograma / Proteínas totais e frações• Pesquisa/Sorologia de Hematozoários

(Erlichia, Babesia, Neospora e Trypanosomas)

• Fechamento conclusivo é necessário o SOMATORIO DE EXAMES.

SEGUNDO PASSO• Reteste nova amostra após 30 ou 60 dias

• Parasitologico = IHQ = PCR = Pesquisa do agente

Alterações na detecção Sorológica:-Fase de Pré-soroconversão-Animal antes de 4 meses de idade -Após 2 anos de infecção -Após 2 anos de infecção -Animais em Tratamento-Uso contínuo de Corticosteróides -Hemólise acentudada-Leishmaniose Tegumentar

Examesconfirmatórios

Parasitológicos:Pesquisa DiretaImunohistoquímica.

Moleculares:PCR

Microbiológicos:Cultura

ImunohistoquímicaAUMENTA A SENSIBILIDADE DO TESTE

PARASITOLÓGICO .ESPECIFICIDADE: 100%SENSIBILIDADE: 80% Poli-sintomáticos SENSIBILIDADE: 80% Poli-sintomáticos

Depende do grau de parasitemia , do tipo de

material biológico coletado e do Profissional que

fará a leitura da lâmina.

Em todos os estudos apresentados a maior carga parasitária foi encontrada em LINF. Reativos.

<= Aspirado de linfonodo

Aspirado de medula óssea =>

Biópsia para exame histológicoe

imunocitoquímico

Pesquisa de amastigotas

Biópsia para exame histológicoe

imunocitoquímico

• A técnica de imuno-histoquímica utiliza-se da junção da técnica de histopatologia e parasitológico com técnicas imunológicas.

• O material é tratado com anticorpos anti-leishmania e posteriormente são leishmania e posteriormente são adicionados anticorpos anti-IgG canino monoclonais, marcados com a enzima peroxidase.

• A reação ou marcação positiva revela-se em tom castanho-claro a castanho-escuro

Material biológico:Fragmentos em formol a 10%.

• Linfonodos• Punção de Baço• Medula óssea• Pele• São confeccionadas dois cortes

histológicos, um para coloração em H&E e outro para a IHQ propriamente dita.

• Parasitológico – Imuno-histoquímico

MolecularPCR - Polimerase Chain Reaction

SENSIBILIDADE : 50% A 88% e ESPECIFICIDADE DE 100% (?)

Material:• 1º Linfonodos;• 1º Linfonodos;• 2º Medula óssea;• 3º Biopsias Cutâneas ����NÃO REALIZAR COM SANGUE

Técnica Real Time – apenas quando se trata o paciente- é quantitativa.

Método Sensibilidade

IHQ 70 - 80%

PCR 38 – 76%

Cães PCR positivos apenas diz que o animal está infectado mas não doente –títulos altos de IgG comprovam a Doença.

PCR 38 – 76%

Pesquisa

agente

O – 60

Deu resultado inconsistente, o que pode ser?

1- Pode ser pessoal mal treinado em RIFI ou com pouca experiência

2- ou algum problema sério na conservação desta 2- ou algum problema sério na conservação desta amostra – por exemplo amostra congelada

3- contaminação bacteriana.

Discuta com o suporte técnico do laboratório

Elisa R e RIFI 160

Sorologia – Elisa + RIFI

Elisa – NR // RIFI - NR Elisa R // RIFI = 1/80

Animal sadio Animal c/Falência Imunológica? – fazer

IHQ

de linfonodo ou medula

Nova sorologia PTF após 30 dias

Confirma DiagnósticoLeishmaniose

IHQ - IHQ +

Não Descarta

Leish

ConfirmaLeish

Elisa R Relação

RIFI 1/80 A/G < 0,60

Aguardar 30 diasrefazer

Confirma LVC

s/sintomas c/sintomas Animal s/sintomas Animal c/sintomas

1-ALGORITMO DIAGNÓSTICO LVC

Leish Leish

Elisa R / RIFI 1/160

Elisa RRIFI 1/40 ou 1/80

Relação A/G <0,60

Aguardar + 60 dias

e refazer

ParasitológicoPCR punção de Medula ou IHQ

ou

IHQ + ou PCR +IHQ - ou PCR -

Perseguir sorologia

Após + 60 dias

Legenda: NR = não reagente, R = reagente, IHQ = Imunohistoquímica, PTF = Proteínas totais e fração, A/G = relação albumina/Globulina

Novo Parasitológico :PCR punção de Medula ou IHQ

IHQ - ou PCR - IHQ + ou PCR +

ConfirmaLeish

DescartaLeish

Sorologia – Elisa + RIFI

Elisa – R // RIFI - NR Elisa NR RIFI =1/40 ou 1/80

Repetir nova amostra De imediato ELISA + RIFI

_ Crioaglutininas?_ Erro do Laboratório?_ ”Fim” de soroconversão?

ALGORITMO DIAGNÓSTICO LVC -DISCORDANTES

_ Reação cruzada?_ Soro hemolizado?_ Leish tegumentar?_ Cão vacinado?_ Animal 5 meses – títulos inespecíficos_ Animal em tratamento ou tratado_Início da soroconversão -Uso Prolongado de corticóide?

Repetir Leish e PTF após 30 a 60 diasElisa R

RIFI 1/40 – 1/80Elisa e RIFI - NR

Animal sadioSeguir os passosdo algoritmo 1

-Uso Prolongado de corticóide?

ELISA R // RIFI= 1/40 ou 1/80

Animal s/sintomas AnimalSintomático?

Seguir Algoritmo 1

Confirma LVC

• Exames Sorológicos de animais vacinados.

Animais vacinados apresentam sorologia Não Reagente na Animais vacinados apresentam sorologia Não Reagente na RIFI e ELISA

OBRIGADO!!!OBRIGADO!!!

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Palestra disponível no site a Palestra disponível no site a partir da semana que vem –

página CURSOS eEVENTOS.

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