Artculo

Lutzomyia longipalpis saliva drives apoptosis and enhances parasite burden in neutrophils

Deboraci Brito Prates,*, Theo Araujo-Santos,*, Nvea Farias Luz,*, Bruno B. Andrade, Jaqueline Franca-Costa,*, Lilian Afonso,*, Jorge Clarencio,* Jose Carlos Miranda,*

Patrcia T. Bozza, George A. DosReis, Claudia Brodskyn,*, Manoel Barral-Netto,*,, Valeria de Matos Borges,*,,1,2 and Aldina Barral*,,,1,2

*Centro de Pesquisa Goncalo Moniz (CPqGM)-Fundacao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Salvador, Brazil; Universidade Federal da Bahia, Salvador, Brazil; Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Besthesda, Maryland, USA; Laboratorio de Imunofarmacologia, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brazil; Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro, Brazil; and Instituto Nacional de Ciencia e Tecnologia de Investigacao em Imunologia (iii-INCT), Salvador, Bahia, Brazil

RECEIVED FEBRUARY 25, 2011; REVISED MAY 3, 2011; ACCEPTED MAY 24, 2011. DOI: 10.1189/jlb.0211105

RESUMEN

Los neutrfilos son considerados la primera lnea de la acogida de defensa contra las infecciones y se han implicado en la inmunopatognesis de Leishmaniasis. Parsitos de Leishmania se inoculan junto saliva vectores ', que es una fuente rica de sustancias farmacolgicamente activas que interfieren con la respuesta inmune del husped. En el presente estudio, hemos probado la hiptesis de que los componentes salivales de Lutzomyia longipalpis, un importante vector de la leishmaniasis visceral, aumentar la apoptosis de los neutrfilos. Murinos neutrfilos peritoneales inflamatorios cultivadas en presencia de SGS present un aumento de la expresin en superficie de FasL y se sometieron a dependiente de caspasa y apoptosis mediada por FasL. Este efecto proapoptosis de SGS en los neutrfilos fue abrogado por el pretratamiento con proteasa, as como la preincubacin con anticuerpos antisaliva. Adems, en la presencia de Leishmania chagasi, SGS tambin aument la apoptosis en neutrfilos y aumento de la liberacin de PGE2 y la disminucin de la produccin de ROS por los neutrfilos, mientras que la mejora de la viabilidad del parsito dentro de estas clulas. El aumento de la carga parasitaria fue abrogado por el tratamiento con z-VAD, un inhibidor de la caspasa sartn, y NS-398, un inhibidor de la COX-2. En presencia de SGS, neutrfilos infectados de Leishmania producen mayores niveles de MCP-1 y atrajeron un elevado nmero de macrfagos por la quimiotaxis en ensayos in vitro. Ambos de estos eventos fueron abrogada por el pretratamiento de los neutrfilos con bindarit, un inhibidor de CCL2 / MCP-1 de expresin. Tomados en conjunto, nuestros datos apoyan la hiptesis de que las protenas salivales vector desencadenan la caspasa-dependiente y FasL mediada

Abreviaturas: bindarit 2-metil 2-1- (fenilmetil) -1H-indol-3 il [metoxi] propanoico, CNPq Consejo Nacional de Desarrollo Cient'fico y Tecnologico, CPqAM-FIOCRUZ Centro de Investigacin Gnc alo Moniz-Fundacin C ~ el Oswaldo Cruz, H2DCFDA diclorofluorescena dihidro diacetato, L ligando, PS fosfatidilserina, sonicado SGS glndula salival

apoptosis, lo que favorece la supervivencia Leishmania dentro de los neutrfilos, lo que puede representar un mecanismo importante para el establecimiento de la infeccin por Leishmania. J. Leukoc. Biol. 90: 575-582; 2011.

Introduccin

Los neutrfilos desempean un papel en la infeccin por complejas. Ellos proporcionan un enlace importante entre la inmunidad innata y adaptativa durante las infecciones parasitarias [1, 2], pero tambin se someten a apoptosis y son ingeridos por los macrfagos, iniciando as la secrecin de mediadores antiinflamatorios [1, 3, 4]. En el inicio de la infeccin por Leishmania, los neutrfilos establecen una charla cruzada con otras clulas en el desarrollo de una respuesta inmune [5], pero el resultado final es controversial, como protectora [6 - 8] y [9 deletreo -12] efectos a la el anfitrin se ha demostrado.Leishmania se transmite por la picadura de moscas de arena en busca de una comida de sangre. El dao tisular causado por flebtomo sondeando [10] y la saliva flebtomo [13] es un potente estmulo para el reclutamiento de neutrfilos, que resulta en una rpida migracin y la acumulacin de neutrfilos en el sitio de la mordedura de la vector [10, 12, 14]. Propiedades farmacolgicas de la saliva de los mosquitos son diversas [15, 16], y hemos demostrado recientemente que la saliva de Lutzomyia longipalpis, el principal vector de Leishmania chagasi en Brasil, desencadena los acontecimientos importantes de la respuesta inmune innata [17]. A pesar del reconocimiento de la importancia de la saliva flebtomo y neutrfilos en los pasos iniciales de la infeccin de Leishmania, el papel directo de la saliva en la interaccin-parsito de neutrfilos no se ha abordado.Estudios recientes demostraron la presencia de Leishmania infectado neutrfilos apoptticos en el sitio de la mordedura flebtomo [10];

Estos autores principales contribuyeron igualmente a este trabajo.

Correspondencia: Centro de Pesquisa Goncalo Moniz (CPqGM)-Fundacao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Av. Waldemar Falcao, Candeal, Salvador, Ba-hia, Brasil. E-mail: abarral@bahia.fiocruz.br; vborges@bahia.fiocruz.br

0741-5400/11/0090-575 Sociedad para Biologa de leucocitos Volumen 90, Septiembre 2011 Revista de Biologa de Leucocitos 575

sin embargo, un posible papel de la saliva flebtomo en este fenmeno no est clara. Aqu, mostramos un FasL importante y efecto apoptosis caspasa-dependiente de Lu. longipalpis SGS sobre los neutrfilos. Adems, la apoptosis inducida por SGS favorece L. chagasi supervivencia dentro de los neutrfilos. Estos resultados representan la primera evidencia de efectos directos de Lu. longipalpis SGS en los neutrfilos de acogida y traer implicaciones para la respuesta inmune innata a la infeccin por Leishmania.

MATERIALES Y MTODOS

Ratones y parsitos

Innato macho C57BL / 6 ratones, con edades 6-8 semanas se obtuvieron de la instalacin para animales de CPqGM-FIOCRUZ (Bahia, Brasil). Este estudio se llev a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de los Principios Rectores Internacionales para la Investigacin Biomdica en animales. Se aprobaron y llevaron a cabo todos los procedimientos experimentales de acuerdo con el Comit Brasileo de tica del Experimentacin Animal de la Fiocruz (Nmero de Permiso: 027/2008). L. chagasi (MCAN / BR / 89 / BA262) promastigotes se cultivaron a 25 C en medio de insectos de Schneider, suplementado con 20% FBS inactivo, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, y 100 g / ml de estreptomicina.

Los mosquitos y la preparacin de glndulas salivales.

Flebtomos para Adultos de la Lu. longipalpis colonia de Cavunge (Bahia, Brasil) fueron criados en el Laborato'rio de Imunoparasitologia / CPqGM / Fiocruz, como se describe anteriormente [16]. Las glndulas salivales fueron disecados de 5 a 7 das de edad Lu. longipalpis mujeres menores de un microscopio estereoscpico (STEMI 2000, Carl Zeiss, Jena, Alemania) y almacenados en grupos de 10 pares en 10 l de PBS libre de endotoxinas a -70 C. Inmediatamente antes de su uso, las glndulas se sometieron a ultrasonidos (Sonifier 450; Brason, Danbury, CT, EE.UU.) y se centrifuga a 10.000 g durante 4 min. Los sobrenadantes de SGS fueron utilizados para experimentos. El nivel de contaminacin de las preparaciones de LPS SGS se determin utilizando un lisado de amebocitos kit cromognico disponibles comercialmente Limulus (QCL-1000, Lonza Bioscience, Walkersville, MD, EE.UU.); Se encontraron niveles insignificantes de endotoxina en el sobrenadante de la glndula salival. Todos los procedimientos experimentales utilizados SGS en una cantidad equivalente a 0,5 pares de glndulas salivales / grupo, que representan 0,7 g de protenas [18].

Reactivos

Anti-Gr-1-FITC, anti-ratn CD178L-PE (FasL; CD95L), PE hmster control de isotipo IgG (anti-TNP), kit de la inflamacin del ratn CBA, neutralizar anti-cuerpo anti-ratn FasL, y el hmster de control de isotipo IgG fueron adquiridos de BD Biosciences (San Jose, CA, EE.UU.). Anti-ratn Ly-6G Alexa Fluor 647 fue de BioLegend (San Diego, CA, EE.UU.). Anexina-V, PI (kit de deteccin de apoptosis), y z-VAD-FMK fueron de R & D Systems (Minneapolis, MN, EE.UU.). NS-398 y DMSO eran de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, EE.UU.). Proteinasa K fue de Gibco, Invitrogen (Grand Island, NY, EE.UU.). RPMI-1640 y L-glutamina, penicilina y estreptomicina eran de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Mediano y eto-poside insectos (VP-16) de Schneider fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Nutridoma-SP fue de Roche (Indianapolis, In, EE.UU.) y tioglicolato fue de Difco (Detroit, MI, EE.UU.). Bindarit era de Angelini Farmaceu-Tici (Santa Palomba-Pomezia, Roma, Italia).

Neutrfilos inflamatoriosSe obtuvieron neutrfilos exudado peritoneal tal como se describe anteriormente [19]. Brevemente, ratones C57BL / 6 ratones fueron inyectados ip-edad con solucin de tioglicolato de 3%. Siete horas despus de la inyeccin, se realiz lavado peritoneal usando un medio de 10 ml de RPMI-1640 suplementado con 1% Nutridoma-SP, 2 mM L-glu-tamine, 100 U / ml de penicilina, y 100 g / ml de estreptomicina. Para eliminar las clulas ad-Herent, clulas de exudado se incubaron a 37 C en 5% de CO2 durante 1 h en Frascos de 250 ml (Costar, Cambridge, MA, EE.UU.); clulas en sobrenadantes se recuperan entonces y se cuantificaron en un hemocitmetro por microscopa. La viabilidad celular fue del 95%, como se determin por exclusin de azul de tripano (datos no mostrados). Las clulas no adherentes se tieron con anti-Gr-1 y Ly-6G para evaluar la pureza y se analizaron posteriormente mediante citometra de flujo utilizando el software CellQuest (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA, EE.UU.). Clulas Gr-1 Ly-6G fueron rutinariamente 95% de pureza.

Ensayo de apoptosis en neutrfilos

Para cultivos de clulas, los neutrfilos (5 105 / pocillo) se cultivaron en medio RPMI-200 l 1640, suplementado con 1% Nutridoma-SP, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, y 100 g / ml de estreptomicina en 96- placas de pocillos (Nunc, Dinamarca) en la presencia de diferentes dosis de Lu. longipalpis SGS (0.5, 1.0, y 2.0 pares / pocillo). En algunos experimentos, se us etopsido (20 M) o LPS (100 ng / pocillo) como control positivo. Tres horas y 20 h despus de estmulos, la apoptosis de neutrfilos se evalu por PS, expuesta en el prospecto de la membrana externa a travs del etiquetado con anexina-V-FITC por anlisis FACS en combinacin con PI colorante nuclear [19]. Especificidad Anexina-V fue probada usando tampn libre de Ca2; vinculante no se observ en este caso. Criterios morfolgicos de apoptosis, como la separacin de los lbulos nucleares y ncleos picnticos oscuro manchadas, tambin se aplicaron a efectos de cuantificacin utilizando preparaciones cytospin manchados por Dif rpida con microscopa de luz [19]. Los neutrfilos se calificaron como apoptosis o nonapoptotic previo examen de al menos 200 clulas / diapositiva. Para FasL bloqueado ensayos, los neutrfilos se pretrataron con un anticuerpo neutralizante especfico para FasL (10 g / ml) o un control de isotipo IgG (10 g / ml) durante 30 min antes de su uso. En algunos experimentos, SGS se preincub con suero flebtomo antisaliva (0,5 salival par glndula plus 50 l de suero preincubado durante 1 h a 37 C) [20] o con proteinasa K (10 mg / ml) a 65 C durante 2 h y a continuacin, durante 5 min a 95 C para la inactivacin de la enzima antes de su uso.

Suero de saliva Anti-flbotomo

Se obtuvo el suero Hamster-derive lo descrito previamente [20]. En pocas palabras, los hmsters (Mesocricetus auratus) fueron expuestos a las picaduras de 5 a 7 das de edad, de sexo femenino Lu. longipalpis. Los animales fueron expuestos tres veces a 50 mosquitos cada 15 das. Quince das despus de la ltima exposicin, se recogi suero y se prueba para la deteccin de IgG antisaliva por ELISA.

Ensayo de neutrfilos humanos

La sangre humana de donantes sanos se obtuvo de Hemocentro do Estado deBahia (Salvador, Brasil), despus de los donantes haban dado por escrito, el consentimiento informado. Este estudio fue aprobado por el Comit tico de Investigacin de FIOCRUZ-Baha. Los neutrfilos humanos se aislaron por centrifugacin usando medio PMN, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Brevemente, la sangre se centrifug durante 30 min a 300 g a temperatura ambiente. Los neutrfilos se recogieron y se lavaron tres veces a temperatura ambiente por centrifugacin a 200 g. Las clulas / pocillo (106) se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con FBS inactivado por calor al 10% (Hyclone, Ogden, UT, EE.UU.), 2 mM / ml de L-glutamina, 100 U / ml peni-cillin, y 100 g / ml de estreptomicina (todos de Invitrogen) para 3, 6, y 20 h a 37 C, 5% de CO2, en presencia o ausencia de Lu. longipalpis SGS (0,5 par / pocillo) o etopsido (20 M). Las clulas fueron procesadas por citocentrifugacin y teidas con Diff-Quick y ncleos picnticos fueron analizadas por microscopa de luz.

Infeccin de neutrfilos in vitroNeutrfilos peritoneales se infectaron in vitro con L. chagasi promastigotes de fase estacionaria en una proporcin de 1: 2 (neutrfilos: parsitos) en presencia o ausencia de SGS (0,5 pair / pocillo) en medio suplementado-RPMI-1640. En algunos experimentos, la infeccin de neutrfilos se realiz en presencia de etopsido (20 M). Para los ensayos de inhibicin, los neutrfilos se pretrataron durante 30 minutos con z-VAD-FMK (100 M) para bloquear la activacin de la caspasa o preincubaron durante 1 h con NS-398 (1 M), un inhibidor de COX-2. DMSO (vehculo) 0,4% se utiliz como control. Despus de 20 h, los neutrfilos infectados eran centrfugaron576 Revista de Biologa Leucocitos Volumen 90, Septiembre 2011www.jleukbio.orgPrates et al. Sandfly saliva drives neutrophil apoptosis

Los sobrenadantes que contienen promastigotes no internalizados se recogieron, y medio fue reemplazado por 250 l de medio de Schneider, flexible-mentado con 20% FBS inactivo, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, y 100 g / ml de estreptomicina. Neutrfilos infectados se cultivaron a 25 C durante un perodo adicional de 3 das. Carga intracelular de L. chagasi se estim por la produccin de la proliferacin de promastigotes mviles extracelulares en medio Schneider [21].

Cuantificacin de produccin de ROS

Deteccin intracelular de ROS en los neutrfilos cultiv a 5 105 clulas / pocillo se realiz mediante sonda fluorescente H2DCFDA siguiente anlisis por FACS, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la investigacin de la produccin de ROS, la poblacin de neutrfilos purificado se analiz mediante los parmetros de barrio y de dispersin lateral despus de la aplicacin de la sonda H2DCFDA-FITC.

Medicin de la produccin de PGE2

Los sobrenadantes de cultivos de neutrfilos se recogieron 20 horas despus de la incubacin con L. chagasi o L. chagasi ms SGS y aprobados por centrifugacin. PGE2 se midi por el kit EIA de qumica caiman. Todas las mediciones se realizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Medicin de MCP-1/CCL2

Los sobrenadantes de cultivos de neutrfilos se recogieron 20 h despus de la incubacin con medio RPMI, SGS, L. chagasi, o L. chagasi ms SGS y aprobados por centrifugacin. MCP-1 (CCL2) de quimioquinas se midi usando el kit inflamacin ratn CBA (BD Biosciences), segn las instrucciones del fabricante.

Ensayo de quimiotaxis

Los neutrfilos se pre trataron o no con bindarit propanoico (Angelini Farmaceutici; 100 M) durante 30 min antes de la incubacin con medio, SGS, L. chagasi, L. chagasi o ms SGS, y se recogieron los sobrenadantes. Los sobrenadantes de cultivo se aadieron a los pocillos de fondo de un sistema ChemoTX 96 as microplaca quimiotaxis (Neuro Probe, Gaithersburg, MD, EE.UU.). Los macrfagos se obtuvieron despus de 4 das i.p. inyeccin de la solucin de tioglicolato de 1 ml 3% en ratones C57BL / 6 y resuspendido en medio RPMI-1640 antes de ser aadido a los pocillos superiores (105 clulas / pocillo) y se incubaron durante 1,5 h a 37 C bajo 5% de CO2. Despus de la incubacin, las clulas que migraron a los pocillos inferiores se contaron en un hemocitmetro. La migracin de macrfagos hacia el medio RPMI-1640 solo (quimiotaxis de Radom) se utiliz como control negatia y hacia LPS como control positivo. Los ndices de quimiotaxis se calcularon como la relacin entre el nmero de clulas que migraron hacia sobrenadantes tomados de L. chagasi neutrfilos infectadas o no infectadas se cultivaron en presencia o ausencia de SGS para el nmero de clulas que migraron a medio RPMI-1640 solo.

Anlisis estadistico

Los sistemas in vitro se realizaron con al menos cinco ratones / grupo. Cada experimento se repiti al menos tres veces. Los datos se presentan como media y SE de experimentos representativos y se analizaron utilizando GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.). Distribucin de datos de diferentes grupos se compar mediante la prueba de Kruskal-Wallis con comparaciones mltiples de Dunn, y las comparaciones entre dos grupos fueron exploradas mediante la prueba de Mann-Whitney. Se consideraron diferencias estadsticamente significativa cuando P 0.05.

RESULTADOS

Lu. longipalpis SGS induce la apoptosis de los neutrfilos

Diferentes dosis de Lu. longipalpis SGS (0,5-2,0 pares / pocillo) fueron capaces de inducir la apoptosis de los neutrfilos de ratones C57BL / 6 Ratones (Fig. 1A y C). Este efecto fue significativamente mayor que la observada en los controles no tratados (Fig. 1A y B). La aparicin de apoptosis fue similar entre las condiciones que contienen diversas dosis de SGS (Fig. 1A). Entonces nos decidimos mantener la dosis ms baja de SGS con efecto biolgico en nuestro modelo (0.5 par de glndulas salivales / pocillo) para experimentos adicionales.Los neutrfilos exhiben marcadores de apoptosis de hasta 20 h tras la incubacin con SGS, como la exposicin PS (Fig. 1D) y los ncleos picnticos (Fig. 1E). En 3 h despus de estmulo con SGS, indicadores tenan niveles similares a los observados en las clulas no estimuladas. El etopsido se utiliz como control positivo para inducir la apoptosis de neutrfilos, y su efecto fue evidente en 3 h por un-nexina-V de deteccin (Fig. 1D) y 20 h por anlisis ncleos picnticos (Fig. 1E). Estos resultados confirman el efecto proapopttico de Lu. longipalpis SGS sobre neutrfilos murinos.Nuestro mayor inters fue explorar si Lu. longipalpis SGS muestra un efecto proapopttico en los neutrfilos humanos. Para abordar esta cuestin, los neutrfilos obtenidos a partir de donantes sanos se incubaron en presencia o ausencia de SGS o etopsido (Fig. 1F). Sorprendentemente, 3 h despus de la incubacin, SGS indujo apoptosis de neutrfilos humanos (Fig. 1F). En otras veces (6 y 20 h), este efecto proapopttico ya no era evidente por comparacin con el control negativo.

Apoptosis de neutrfilos inducidas por SGS es la caspasa-dependiente y mediada por FasL

Para evaluar los mecanismos desencadenados por Lu. longipalpis saliva para inducir la apoptosis de neutrfilos, que se incubaron C57BL / 6 neutrfilos murinos con z-VAD, un inhibidor de pancaspase, por 30 min antes de la adicin de Lu. longipalpis SGS (Fig. 2A). El tratamiento de los neutrfilos con z-VAD impedido inducida por SGS apoptosis, en contraste con el tratamiento con el vehculo (DMSO) solo (Fig. 2A). La activacin de la caspasa puede ser inducida por FasL, una molcula cuya expresin se refiere a la susceptibilidad en la infeccin por Leishmania [22]. A continuacin, se evalu la expresin de FasL en los neutrfilos expuestos a Lu. longipalpis SGS, que indujo el aumento de expresin de FasL en los neutrfilos relativos a la intensidad / clula (Fig. 2B) y tambin el porcentaje de neutrfilos que expresan FasL (Fig. 2C). Por otra parte, el bloqueo de FasL impidi la apoptosis de neutrfilos inducida por Lu. longiplapis SGS (Fig. 2D). Estos resultados indican que Lu. longipalpis en SGS-duce apoptosis de neutrfilos por un mecanismo que implica la activacin de las caspasas y la expresin de FasL.

Lu. longipalpis protenas SGS inducen la apoptosis de los neutrfilos

Para representar inicialmente la composicin de la Lu. longipalpis sali-variar componentes responsables del efecto proapoptosis en los neutrfilos, se preincubaron SGS con proteinasa K antes de la estimulacin in vitro de neutrfilos. Se ha observado una reduccin de la actividad pro-apopttica de SGS por incubacin con proteinasa K (Fig. 3A). Este resultado sugiere que la apoptosis de los neutrfilos inducidos por Lu. longipalpis SGS est mediada por uno o ms componentes proteicos. Adems, como muchas evidencias sealan la inmunogenicidad de las protenas salivales sandfly [13, 23, 24], la hiptesis de que la

www.jleukbio.orgVolumen 90, Septiembre 2011 Revista de Biologa leucocitos 577

Figura 1. Efecto de Lu. longipalpis SGS sobre la apoptosis de los neutrfilos. (A-E) Los neutrfilos de ratones C57BL / 6 ratones se mantuvieron sin estimular (-) o estimularon con SGS o etopsido (Etop) 20 M (control positivo). (A) de neutrfilos apoptosis inducida por SGS en diferentes dosis se evalu contando las clulas con ncleos picnticos 20 h despus de la estimulacin. (B y C) imagen representativa de los neutrfilos inflamatorios, no estimulada (B) o estimulado con Lu. longipalpis SGS (0,5 par / pocillo; aumento original, 1000; C). Las flechas apuntan a neutrfilos ncleos picnticos. (D y E) Kinetic de la apoptosis de neutrfilos en respuesta a Lu. longipalpis SGS. Tres horas y 20 h despus de la estimulacin, la apoptosis se evalu por citometra de flujo despus de la tincin con anexina-V (D) y contando las clulas con ncleos picnticos (E) en preparaciones de citospin teidas-Quick-Diff. (F) de la apoptosis de los neutrfilos humanos inducida por SGS (0,5 par / pocillo). Los datos mostrados son de un solo experimento representativo de tres experimentos independientes. * P 0,05; ** P 0,01, en comparacin con las clulas no estimuladas Componente proteico del Lu. longipalpis saliva podra ser dianas para anticuerpos del husped. Para probar esta posibilidad, se pre incub la SGS con sueros de hmsteres encuestados pre-expuestas a Lu. longipalpis picaduras. Sorprendentemente, la pre incubacin de SGS con antisuero especfico abrogado por completo la induccin de la apoptosis de los neutrfilos despus de 20 h en cultivo (Fig. 3B), lo que refuerza que los componentes presentes en Lu. longipalpis saliva con la actividad proapopttica son protenas y puede ser neutralizado por los anticuerpos.

Efecto de Lu. longipalpis SGS en la apoptosis y el parsito carga de neutrfilos infectados

Despus de determinar el efecto proapopttico de Lu. longipalpis SGS, que evalu si L. chagasi, el parsito transmitido por este mosquito, puede modificar este efecto in vitro. Anlisis de la exposicin PS sobre los neutrfilos inflamatorios demostr que L. chagasi tambin fue capaz de inducir la apoptosis de neutrfilos (Fig. 4A). Adems, este efecto fue exacerbado cuando neutrfilos se coincubaron con parsito y saliva (L. chagasi vs. L. chagasi ms SGS: 29,19% vs. 46,39%; Fig 4A.).

Los neutrfilos pueden actuar como clulas husped importantes para Leishmania [10, 25, 26]. Como la saliva flebtomo exacerba la infeccin por Leishmania [27], se determin la infeccin de neutrfilos inflamatorios con L. chagasi en presencia de Lu. longipalpis SGS in vitro. La saliva aumenta la viabilidad de L. chagasi dentro neutrfilos (Fig. 4B). La infeccin en presencia de etopsido no aumentar la carga parasitaria en los neutrfilos en comparacin con los cultivos de control infectados con L. chagasi solo (Fig. 4B). Neutrfilos apoptticos muestran un alto nmero de parsitos (Fig. 4C). Para investigar si la apoptosis de neutrfilos inducida por Lu. longipalpis saliva afecta a este aumento de la carga de parsito in vitro, los cultivos pretratados con z-VAD (Fig. 4D), que suprimi el aumento de la replicacin chagasi L. inducida por SGS (Fig. 4D). La activacin de la COX se asocia con un aumento de la infeccin por Leishmania [28]. En este documento, se evalu el papel de la COX-2, una forma inflamatoria de la COX, en el aumento de la carga parasitaria provocada por SGS. NS-398, un inhibidor de COX-2, condujo a una inhibicin de nmero de parsitos viables (Fig. 4D) cuando se aade a la cultura de neutrfilos antes de la infeccin. Por otra parte, PGE2, un producto de la COX-2, favorece el crecimiento patgeno intracelular, un fenmeno que podra ser revertido por el tratamiento con inhibidores de la COX-2 [29, 30]. De hecho, nuestros experimentos muestran que SGS se increment la produccin de PGE2 por los neutrfilos infectados Leishmania (Fig. 4E).Como la produccin de ROS es un mecanismo importante microbicida principalmente por los neutrfilos, se evalu el efecto de SGS en

578 Revista de Biologa de leucocitos Volumen 90, Septiembre 2011www.jleukbio.orgPrates et al. Sandfly saliva drives neutrophil apoptosis

Figure 2. FasL expression and inhibition of neutrophil apoptosis Figura 2. expresin de FasL y la inhibicin de la apoptosis de neutrfilos por z-VAD y anti-FasL. (A) Los neutrfilos de ratones C57BL fueron pretratados / 6 ratones con el inhibidor pancaspase z-VAD (100 M) o con vehculo (DMSO) antes de la incubacin con SGS. Veinte horas despus de la incubacin, la apoptosis se evalu mediante tincin con anexina-V. (B y C) la expresin de FasL inducida por SGS en los neutrfilos se analiz por citometra de flujo 20 h despus de la incubacin. Los resultados se expresan como la intensidad media de fluorescencia (MFI) (B) y el porcentaje de neutrfilos que expresan FasL en el Gr-1 poblacin (C). (D) los neutrfilos de ratn se trataron previamente con anticuerpo neutralizante especfico para FasL (-FasL; 10 g / ml) o con IgGk1 (10 g / ml). La apoptosis se evalu mediante tincin con anexina-V despus de 20 h. Los datos mostrados son de un solo experimento representativo de tres experimentos independientes. -, Las clulas (Unst) Un estimulada. * P 0,05; ** P 0,01. La produccin de ROS por estas clulas (Fig. 4E). La adicin de SGS en las culturas de neutrfilos inducida por una reduccin parcial en la produccin de ROS 1 h despus de la infeccin con L. chagasi (Fig. 4E). En resumen, estos resultados sugieren que la apoptosis de neutrfilos inducida por Lu. longipalpis SGS favorece L. chagasi infeccin por la COX-2 de activacin y la produccin de PGE2, al tiempo que reduce la generacin de ROS.

Neutrfilos chagasi infectado CCL2 / MCP-1 publicado por L. induce el reclutamiento de macrfagos

A continuacin examin si supernatans de neutrfilos incubados con L. chagasi y SGS son capaces de inducir macro Reclutamiento fago in vitro. Hemos encontrado que los sobrenadantes obtenidos a partir de cultivos de neutrfilos en presencia de L. chagasi podran atraer macrfagos (Fig. 5A) y que Lu. longipalpis saliva indujo un efecto sinrgico (Fig. 5A). Los anlisis de la MCP-1 (CCL2) revelaron que los neutrfilos incubados con L. chagasi ms SGS produjeron cantidades significativamente mayores de este quimioquinas (Fig. 5B). Para investigar si el reclutamiento de macrfagos fue el resultado de la produccin de CCL2 / MCP-1 inducida por L. chagasi ms SGS, se trataron previamente las neutro-phils con bindarit, un inhibidor de CCL2 / MCP-1 sntesis, antes de la incubacin con SGS, L. chagasi, o ambos. El tratamiento con bindarit result en una reduccin total de la quimiotaxis de macrfagos (Fig. 5B) .Taken conjunto, estos resultados indican que SGS sinergia con L. chagasi para mejorar la apoptosis de neutrfilos, CCL2 / MCP-1 de produccin, y el reclutamiento de macrfagosDISCUSIN

El presente estudio proporciona la primera evidencia de que los componentes salivales de un vector de Leishmania juegan un papel relevante y directa sobre los neutrfilos, que a su vez, influye en la carga parasitaria chagasi L.. Encontramos que Lu. longipalpis componentes salivales inducida FasL mediada por neutrfilos y la apoptosis caspasa-dependiente, y este evento se asoci con la supervivencia Leishmania dentro de estas clulas.Los neutrfilos se consideran generalmente un objetivo inicial de parsitos Leishmania [10, 31]. Un nmero significativo de los neutrfilos estn presentes en el sitio de la inoculacin del parsito, as como en las lesiones y que drenan los LN en Leishmania ratones infectados experimentalmente [11, 32-35]. Por otra parte, Lu. longipalpis SGS induce la acumulacin de neutrfilos en un modelo AirPouch [20]. Estos datos experimentales son reforzados por el hecho de que drmicos masiva infiltrados neutrfilos se indican en Lu. longipalpis [13] y Phlebotomus sitios mordedura duboscqi [10], lo que sugiere que la acumulacin de este tipo de clulas pueden ser orquestados, al menos en parte, por los mandantes de saliva flebtomos. Adems de reclutamiento de neutrfilos, no hay informes anteriores sobre el

Figura 3. Inhibicin de la apoptosis de neutrfilos despus de Lu. longipalpis tratamiento SGS con proteinasa K y suero saliva. Tincin con anexina-V de neutrfilos C57BL / 6 ratones se incubaron durante 20 h con SGS pretratados con proteinasa K (PK; A) o con SGS preincubado durante 1 h con anti-Lu. longipalpis suero saliva (B). Los datos mostrados son de un solo experimento representativo de tres experimentos independientes. * P 0,05.

www.jleukbio.orgVolumen 90, Septiembre 2011 Revista de Biologa de Leucocitos 579

Figura 4. Efecto de Lu. longipalpis SGS sobre la apoptosis de neutrfilos y la infeccin

(A) los neutrfilos inflamatorios de C57BL / 6 ratones se mantuvieron sin estimular(-) O se estimularon con SGS (0,5 par / pocillo), L. chagasi (Lc; 2: 1) o SGS L. chagasi. Despus de 20 h, la apoptosis se evalu mediante tincin con anexina-V. (B) En la infeccin de neutrfilos vitro en presencia de SGS o etopsido (20 M), seguido de cultivo a 26 C y los recuentos viables promastigotes despus de 1, 2, y 3 das. (C) Imagen Representante de L. chagasi infectado neutrfilos apoptticos estimulados con Lu. longipalpis SGS (0,5 par / pocillo; aumento original, 1000). Las flechas apuntan a los neutrfilos apoptticos infectados. (D) Tratamiento previo de neutrfilos con z-VAD (100 M) y NS-398 (1 M), seguido de infeccin en presencia o ausencia de SGS. Los recuentos de viables promastigotes se realizaron despus de 3 das. Niveles (E) de PGE2 de los sobrenadantes de neutrfilos se incubaron durante 20 h con L. chagasi y / o SGS (lado izquierdo). La produccin de ROS por los neutrfilos cultivadas con L. chagasi para 1 h en presencia o ausencia de SGS

(Lado derecho). Los neutrfilos se incubaron con H2DCFDA, y la produccin de ROS se evalu por citometra de flujo. Los datos mostrados son de un pecado-gle experimento representativo de tres experimentos independientes. * P 0,05; ** P 0,01.

Otros efectos de la saliva flebtomo sobre los neutrfilos. Curiosamente, los estudios realizados con la saliva de garrapatas revelan que la inhibicin de las funciones crticas de neutrfilos favorece la supervivencia inicial de espiroquetas [36 -38)

Nuestros resultados sobre los neutrfilos humanos confirman la induccin de apoptosis por SGS y curiosamente, indican que los ratones y los neutrfilos humanos tienen una cintica diferente de la apoptosis inducida espontnea y la saliva. Cabe destacar que la apoptosis de los neutrfilos humanos inducida por Lu. longipalpis SGS tambin indica que este mecanismo puede ser importante para la patognesis de la enfermedad humana. De hecho, la fagocitosis de los neutrfilos humanos apoptticas aumenta la carga parasitaria en los macrfagos infectados con Leishmania amazonensis [28].

Es probable que las protenas de gatillo SGS neutrfilos apoptosis, como reincubacin de Lu. longipalpis SGS con proteinasa K derog su efecto proapoptosis. Adems, antisaliva suero fue capaz de la apoptosis de los neutrfilos bloque. Esto es particularmente interesante, ya que refuerza la idea de una proteccin del husped mediada por la respuesta inmune contra la mosca de arena saliva, lo que permite el desarrollo de una respuesta inmune contra Leishmania. Curiosamente, SGS inducida por la apoptosis de neutrfilos se asocia con caspasas y la expresin de FasL. Estudios previos han implicado FasL en neutrfilos apoptosis [39]. Del mismo modo, la vuelta de los neutrfilos mediada por FasL impulsa Leishmania major infeccin [22]. Son necesarios ms estudios para abordar profundamente esta observacin.Nuestros resultados demuestran que SGS aumenta la carga de Leishmania de neutrfilos mediante la induccin de la apoptosis de neutrfilos, como la inhibicin de la apoptosis por z-VAD reducido el nmero de parsitos viables in vitro. De hecho, el tratamiento con z-VAD bloques de linfocitos apoptosis y aumenta in vitro e in vivo de resistencia a la infeccin por Trypanosoma cruzi [30, 40]. Van Zandbergen y colegas [12] han propuesto que infectan los neutrfilos apoptticos pueden servir como "caballos de Troya" para Leishmania. Alternativamente, la absorcin de los parsitos egressing a partir de neutrfilos mueren en un ambiente anti-inflamatoria creado por la fagocitosis de estas clulas, per se, podra favorecer la infeccin (estrategia de "conejo de Troya") [41]. Nuestros resultados que Lu. longipalpis SGS podra favorecer la apoptosis de los neutrfilos y la infeccin por L. chagasi parecen dar apoyo a cualquiera de estas dos hiptesis planteadas.

Encontramos que la infeccin de neutrfilos en presencia de SGS liberacin de PGE2 inducida, pero se redujo en presencia de COX-2 inhibidor de NS-398, indicando la participacin de la COX-2 productos en la supervivencia del parsito. De hecho, PGE2, un importante producto de COX-2, facilita la infeccin Leishmania mediante la desactivacin de funciones microbicidas macrfagos [19, 28 -30]. Por otra parte, la adicin de PGE2 exgena a los cultivos de macrfagos induce una marcada mejora de la infeccin por Leishmania [19, 42]. La exposicin de los neutrfilos a SGS caus una marcada reduccin de la produccin de ROS, que es un mecanismo microbicida principalmente importante de los neutrfilos. En este sentido, Lu. longipalpis protenas salivales podran estar contribuyendo a la desactivacin de la respuesta inflamatoria de neutrfilos, favoreciendo las primeras etapas de la infeccin por Leishmania. Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que la presencia de flebtomo SGS impulsa una respuesta anti-inflamatoria en L. chagasi neutrfilos infectados inicialmente mediante la reduccin de la produccin de ROS, favoreciendo la supervivencia del parsito. Adems, SGS podra estar provocando la desactivacin de neutrfilos a travs de la induccin de la apo-ptosis, la activacin de la COX-2, y la produccin de PGE2 por estas clulas. Promastigotes de L. major en coche una fusin selectiva de azuro-

Prates et al. Sandfly saliva drives neutrophil apoptosis

Figura 5. reclutamiento de macrfagos y CCL2 / MCP-1 liberacin por L. chagasi neutrfilos infectadas en presencia de Lu. longipalpis SGS. Los macrfagos (A) se les permiti migrar hacia los sobrenadantes a partir de neutrfilos infectados o no con L. chagasi en presencia o ausencia de SGS (barras blancas), como se describe en Materiales y Mtodos. La migracin hacia los sobrenadantes de los neutrfilos pretratados bindarit (barras negras). Despus de la incubacin, se contaron los macrfagos migrados, y se calcul el ndice de quimiotctica. Crtl, control negativo de la quimiotaxis de Radom. (B) CCL2 / MCP-1 de produccin (barras blancas) en los sobrenadantes de cultivos de neutrfilos despus de 20 h y su inhibicin por pretratamiento bindarit (barras negras). Los datos son representativos de dos experimentos independientes realizados por triplicado para cada muestra. * P 0,05; #P 0,05, en comparacin con los neutrfilos no hay bindarit tratada.

flico grnulos en fagosomas que contienen el parsito en los neutrfilos humanos [43]. Queda por dilucidar si, en el sistema actual, SGS modula Mobiliza-cin de neutrfilos grnulo y contribuye a la supervivencia temprana L. chagasi.

Los macrfagos son las clulas husped preferentes para Leishma-nia, y el reclutamiento de estas clulas podran proporcionar refugios seguros para el parsito [31]. Los neutrfilos infectados por L.-ma jor quimiocinas producir tales como MIP-1 [12, 44], y la arena-volar SGS conduce a una mayor expresin de la quimiocina MCP-1 de macrfagos en el sitio de inyeccin [20], lo que conduce al reclutamiento de macrfagos . Hemos demostrado aqu que neutro-phils infectados con L. chagasi en presencia de SGS mal-interpretado mayor MCP-1, corroborando con el reclutamiento macro-fago. Este resultado fue reforzada con el uso de bindarit, un derivado de indazolic original que se ha demostrado la capacidad de inhibir CCL2 / MCP-1 sntesis [45]. Como cuestin de hecho, los sobrenadantes de neutrfilos infectados con L. chagasi son capaces de reclutar macrfagos de ratn, a pesar de que no indujeron significativa MCP-1, que sug-gestas que otros factores quimiotcticos podran estar implicados en este caso. Una actividad quimiotctica directa de saliva flebtomo se ha descrito con varios modelos experimentales [13, 20, 46]. En esto, tambin presenta un efecto quimiotctico indirecta de SGS mediante la induccin de la produccin de quimioquinas por los neutrfilos.En resumen, nuestros datos demuestran que Lu. longipalpis saliva orquesta FasL y la caspasa-dependiente de la apoptosis de los neutrfilos. Al mismo tiempo, la actividad saliva proapoptosis es de beneficio para el parsito y puede representar un mecanismo importante para facilitar la infeccin por Leishmania. Estos resultados contribuyen a una mejor comprensin de las interacciones BE-

tween vector saliva y neutrfilos en la inmunidad innata a la infeccin por Leishmania.

AUTORA

D.B.P., T.A-S., B.B.A., M.B-N., V.M.B. y A.B. concebido y diseado los experimentos. DBP, TA-S., NFL, JC, BBA, LA, y JF-C. Realizado los experimentos. DBP, TA-S., JC, LA, MB-N., VMB, y AB analizaron los datos. J.C.M., M.B-N., V.M.B. y A.B. contribuido herramientas reactivos / Materi-ALS / anlisis. D.B.P., T.A-S., B.B.A., M.B-N., Y V.M.B. escribi el documento. DBP, TA-S., BBA, PTB, GAD, CB, MB-N., VMB, y AB participado en la discusin crtica del manuscrito.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue apoyado por el CNPq, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnologa de Investigacin en Inmunologa (iii-INCT) y Fundacin de Amparo a Pesquisa do Estado de Bahia (FAPESB). DBP, TA-S., NFL, y LA son beneficiarios de una beca de CNPq. J.F-C. es el beneficiario de una beca CAPES. P.T.B., G.A.D., C. B., M.B-N., V.M.B. y A.B. son altos Investigado- de CNPq. Agradecemos Edvaldo Passos para la asistencia tcnica con la colonia de insectos.

REFERENCIAS

Nathan, C. (2006) Neutrophils and immunity: challenges and opportuni-ties. Nat. Rev. Immunol. 6, 173182.

Appelberg, R. (2007) Neutrophils and intracellular pathogens: beyond phagocytosis and killing. Trends Microbiol. 15, 8792. Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. (1998) Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF- , PGE2, and PAF. J. Clin. Invest. 101, 890 898.

Savill, J., Dransfield, I., Gregory, C., Haslett, C. (2002) A blast from the past: clearance of apoptotic cells regulates immune responses. Nat. Rev. Immunol. 2, 965975. Charmoy, M., Auderset, F., Allenbach, C., Tacchini-Cottier, F. (2010) The prominent role of neutrophils during the initial phase of infection by

Leishmania parasites. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 719361. McFarlane, E., Perez, C., Charmoy, M., Allenbach, C., Carter, K. C., Alex-ander, J., Tacchini-Cottier, F. (2008) Neutrophils contribute to develop-ment of a protective immune response during onset of infection with

Leishmania donovani. Infect. Immun. 76, 532541. Ribeiro-Gomes, F. L., Moniz-de-Souza, M. C., Alexandre-Moreira, M. S., Dias, W. B., Lopes, M. F., Nunes, M. P., Lungarella, G., DosReis, G. A. (2007) Neutrophils activate macrophages for intracellular killing of Leish-mania major through recruitment of TLR4 by neutrophil elastase. J. Immu-nol. 179, 3988 3994. Rousseau, D., Demartino, S., Ferrua, B., Michiels, J. F., Anjuere, F., Fra-gaki, K., Le Fichoux, Y., Kubar, J. (2001) In vivo involvement of polymor-phonuclear neutrophils in Leishmania infantum infection. BMC Microbiol. 1, 17.

Gueirard, P., Laplante, A., Rondeau, C., Milon, G., Desjardins, M. (2008) Trafficking of Leishmania donovani promastigotes in non-lytic compart-ments in neutrophils enables the subsequent transfer of parasites to mac-rophages. Cell. Microbiol. 10, 100 111.

Peters, N. C., Egen, J. G., Secundino, N., Debrabant, A., Kimblin, N., Ka-mhawi, S., Lawyer, P., Fay, M. P., Germain, R. N., Sacks, D. (2008) In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis trans-mitted by sand flies. Science 321, 970 974. Tacchini-Cottier, F., Zweifel, C., Belkaid, Y., Mukankundiye, C., Vasei, M., Launois, P., Milon, G., Louis, J. A. (2000) An immunomodulatory func-tion for neutrophils during the induction of a CD4 Th2 response in BALB/c mice infected with Leishmania major. J. Immunol. 165, 2628 2636. Van Zandbergen, G., Klinger, M., Mueller, A., Dannenberg, S., Gebert, A., Solbach, W., Laskay, T. (2004) Cutting edge: neutrophil granulocyte serves as a vector for Leishmania entry into macrophages. J. Immunol. 173, 6521 6525.

Silva, F., Gomes, R., Prates, D., Miranda, J. C., Andrade, B., Barral-Netto, M., Barral, A. (2005) Inflammatory cell infiltration and high antibody production in BALB/c mice caused by natural exposure to Lutzomyia lon-gipalpis bites. Am. J. Trop. Med. Hyg. 72, 94 98.

De Almeida, M. C., Vilhena, V., Barral, A., Barral-Netto, M. (2003) Leish-manial infection: analysis of its first steps. A review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 98, 861 870. Andrade, B. B., Teixeira, C. R., Barral, A., Barral-Netto, M. (2005) Haematophagous arthropod saliva and host defense system: a tale of tear and blood. An. Acad. Bras. Cienc. 77, 665 693. Ribeiro, J. M. (1987) Role of saliva in blood-feeding by arthropods. Annu. Rev. Entomol. 32, 463 478. Araujo-Santos, T., Prates, D. B., Andrade, B. B., Nascimento, D. O., Clar-encio, J., Entringer, P. F., Carneiro, A. B., Silva-Neto, M. A., Miranda,

C., Brodskyn, C. I., Barral, A., Bozza, P. T., Borges, V. M. (2010) Lut-zomyia longipalpis saliva triggers lipid body formation and prostaglandin E production in murine macrophages. PLoS Negl. Trop. Dis. 4, e873. Prates, D. B., Santos, L. D., Miranda, J. C., Souza, A. P., Palma, M. S., Barral-Netto, M., Barral, A. (2008) Changes in amounts of total salivary gland proteins of Lutzomyia longipallpis (Diptera: Psychodidae) according to age and diet. J. Med. Entomol. 45, 409 413. Ribeiro-Gomes, F. L., Otero, A. C., Gomes, N. A., Moniz-De-Souza, M. C., Cysne-Finkelstein, L., Arnholdt, A. C., Calich, V. L., Coutinho, S. G., Lopes, M. F., DosReis, G. A. (2004) Macrophage interactions with neutro-phils regulate Leishmania major infection. J. Immunol. 172, 4454 4462. Teixeira, C. R., Teixeira, M. J., Gomes, R. B., Santos, C. S., Andrade,

B., Raffaele-Netto, I., Silva, J. S., Guglielmotti, A., Miranda, J. C., Bar-ral, A., Brodskyn, C., Barral-Netto, M. (2005) Saliva from Lutzomyia longi-palpis induces CC chemokine ligand 2/monocyte chemoattractant pro-tein-1 expression and macrophage recruitment. J. Immunol. 175, 8346 8353.

Gomes, N. A., Gattass, C. R., Barreto-De-Souza, V., Wilson, M. E., Dos-Reis, G. A. (2000) TGF- mediates CTLA-4 suppression of cellular immu-nity in murine kalaazar. J. Immunol. 164, 20012008.

Ribeiro-Gomes, F. L., Moniz-de-Souza, M. C., Borges, V. M., Nunes, M. P., Mantuano-Barradas, M., D'Avila, H., Bozza, P. T., Calich, V. L., DosReis,

A. (2005) Turnover of neutrophils mediated by Fas ligand drives Leish-mania major infection. J. Infect. Dis. 192, 11271134. Souza, A. P., Andrade, B. B., Aquino, D., Entringer, P., Miranda, J. C., Alcantara, R., Ruiz, D., Soto, M., Teixeira, C. R., Valenzuela, J. G., de Ol-iveira, C. I., Brodskyn, C. I., Barral-Netto, M., Barral, A. (2010) Using re-combinant proteins from Lutzomyia longipalpis saliva to estimate human vector exposure in visceral Leishmaniasis endemic areas. PLoS Negl. Trop. Dis. 4, e649. Teixeira, C., Gomes, R., Collin, N., Reynoso, D., Jochim, R., Oliveira, F., Seitz, A., Elnaiem, D. E., Caldas, A., de Souza, A. P., Brodskyn, C. I., de Oliveira, C. I., Mendonca, I., Costa, C. H., Volf, P., Barral, A., Kamhawi, S., Valenzuela, J. G. (2010) Discovery of markers of exposure specific to bites of Lutzomyia longipalpis, the vector of Leishmania infantum chagasi in Latin America. PLoS Negl. Trop. Dis. 4, e638. Belkaid, Y., Mendez, S., Lira, R., Kadambi, N., Milon, G., Sacks, D. (2000)

natural model of Leishmania major infection reveals a prolonged silent phase of parasite amplification in the skin before the onset of lesion for-mation and immunity. J. Immunol. 165, 969 977.

Laufs, H., Muller, K., Fleischer, J., Reiling, N., Jahnke, N., Jensenius, C., Solbach, W., Laskay, T. (2002) Intracellular survival of Leishmania major in neutrophil granulocytes after uptake in the absence of heat-la-bile serum factors. Infect. Immun. 70, 826 835. Belkaid, Y., Kamhawi, S., Modi, G., Valenzuela, J., Noben-Trauth, N., Rowton, E., Ribeiro, J., Sacks, D. L. (1998) Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis: powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of Leishmania major infec-tion in the mouse ear dermis. J. Exp. Med. 188, 19411953. Afonso, L., Borges, V. M., Cruz, H., Ribeiro-Gomes, F. L., DosReis, G. A., Dutra, A. N., Clarencio, J., de Oliveira, C. I., Barral, A., Barral-Netto, M., Brodskyn, C. I. (2008) Interactions with apoptotic but not with necrotic neutrophils increase parasite burden in human macrophages infected with Leishmania amazonensis. J. Leukoc. Biol. 84, 389 396. DAvila, H., Roque, N. R., Cardoso, R. M., Castro-Faria-Neto, H. C., Melo,

C., Bozza, P. T. (2008) Neutrophils recruited to the site of Mycobacte-

rium bovis BCG infection undergo apoptosis and modulate lipid body bio-genesis and prostaglandin E production by macrophages. Cell. Microbiol. 10, 2589 2604.

Freire-de-Lima, C. G., Nascimento, D. O., Soares, M. B., Bozza, P. T., Cas-tro-Faria-Neto, H. C., de Mello, F. G., DosReis, G. A., Lopes, M. F. (2000) Uptake of apoptotic cells drives the growth of a pathogenic trypanosome in macrophages. Nature 403, 199 203. Van Zandbergen, G., Solbach, W., Laskay, T. (2007) Apoptosis driven in-fection. Autoimmunity 40, 349 352. Barral-Netto, M., de Freitas, L. A., Andrade, Z. A. (1987) Histopathologic changes induced by vaccination in experimental cutaneous leishmaniasis of BALB/c mice. Am. J. Pathol. 127, 271278.

De Moura, T. R., Novais, F. O., Oliveira, F., Clarencio, J., Noronha, A., Barral, A., Brodskyn, C., de Oliveira, C. I. (2005) Toward a novel experi-mental model of infection to study American cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania braziliensis. Infect. Immun. 73, 58275834.

Lima, G. M., Vallochi, A. L., Silva, U. R., Bevilacqua, E. M., Kiffer, M. M., Abrahamsohn, I. A. (1998) The role of polymorphonuclear leukocytes in the resistance to cutaneous Leishmaniasis. Immunol. Lett. 64, 145151.

Pompeu, M. L., Freitas, L. A., Santos, M. L., Khouri, M., Barral-Netto, M. (1991) Granulocytes in the inflammatory process of BALB/c mice in-fected by Leishmania amazonensis. A quantitative approach. Acta Trop. 48, 185193.

Guo, X., Booth, C. J., Paley, M. A., Wang, X., DePonte, K., Fikrig, E., Narasimhan, S., Montgomery, R. R. (2009) Inhibition of neutrophil func-tion by two tick salivary proteins. Infect. Immun. 77, 2320 2329.

Montgomery, R. R., Lusitani, D., De Boisfleury Chevance, A., Malawista, E. (2004) Tick saliva reduces adherence and area of human neutro-phils. Infect. Immun. 72, 2989 2994.

Ribeiro, J. M., Weis, J. J., Telford III, S. R. (1990) Saliva of the tick Ixodes dammini inhibits neutrophil function. Exp. Parasitol. 70, 382388. Borges, V. M., Falcao, H., Leite-Junior, J. H., Alvim, L., Teixeira, G. P., Russo, M., Nobrega, A. F., Lopes, M. F., Rocco, P. M., Davidson, W. F., Linden, R., Yagita, H., Zin, W. A., DosReis, G. A. (2001) Fas ligand trig-gers pulmonary silicosis. J. Exp. Med. 194, 155164.

Silva, E. M., Guillermo, L. V., Ribeiro-Gomes, F. L., De Meis, J., Nunes,

P., Senra, J. F., Soares, M. B., DosReis, G. A., Lopes, M. F. (2007) Caspase inhibition reduces lymphocyte apoptosis and improves host im-mune responses to Trypanosoma cruzi infection. Eur. J. Immunol. 37, 738 746.

Ritter, U., Frischknecht, F., van Zandbergen, G. (2009) Are neutrophils important host cells for Leishmania parasites? Trends Parasitol. 25, 505 510.

Lonardoni, M. V., Barbieri, C. L., Russo, M., Jancar, S. (1994) Modula-tion of Leishmania (L.) amazonensis growth in cultured mouse macro-phages by prostaglandins and platelet activating factor. Mediators Inflamm. 3, 137141.

Mollinedo, F., Janssen, H., de la Iglesia-Vicente, J., Villa-Pulgarin, J. A., Calafat, J. (2010) Selective fusion of azurophilic granules with Leishmania-containing phagosomes in human neutrophils. J. Biol. Chem. 285, 34528 34536.

Rupp, J., Pfleiderer, L., Jugert, C., Moeller, S., Klinger, M., Dalhoff, K., Solbach, W., Stenger, S., Laskay, T., van Zandbergen, G. (2009) Chla-mydia pneumoniae hides inside apoptotic neutrophils to silently infect and propagate in macrophages. PLoS ONE 4, e6020. Mirolo, M., Fabbri, M., Sironi, M., Vecchi, A., Guglielmotti, A., Mangano, G., Biondi, G., Locati, M., Mantovani, A. (2008) Impact of the anti-in-flammatory agent bindarit on the chemokinome: selective inhibition of the monocyte chemotactic proteins. Eur. Cytokine Netw. 19, 119 122.

Monteiro, M. C., Lima, H. C., Souza, A. A., Titus, R. G., Romao, P. R., Cunha, F. Q. (2007) Effect of Lutzomyia longipalpis salivary gland extracts on leukocyte migration induced by Leishmania major. Am. J. Trop. Med. Hyg. 76, 88 94.

PALABRAS CLAVES:

Leishmania chagasi jejn- muerte celular - FasL - quimiotaxis