Detección de Estados Detección de Estados Neoplásicos y Pre-Neoplásicos Neoplásicos y Pre-Neoplásicos

en Exámenes de rutina y en Exámenes de rutina y Biología MolecularBiología Molecular

Francisco Gutiérrez C(1); Adolay Sobarzo E(1);Juan Luís Castillo N(2).(1) Alumno carrera de Tecnología Médica, Universidad de Concepción.

(2) Tutor encargado del ramo Biología Molecular, Universidad de Concepción.

18/12/06

¿QUÉ ES EL CÁNCER?¿QUÉ ES EL CÁNCER?

Muerte Muerte celularcelular Proliferación Proliferación

celularcelular

DesequilibrioDesequilibrio

¿Qué es el cáncer?¿Qué es el cáncer?

Neoplasia Maligna

Clon celular

Descontrol Ciclo celular

TumorInfiltración Metástasis

Evolución Natural del CáncerEvolución Natural del Cáncer

• Tejido Normal

• Hiperplasia

• Metaplasia

• Anaplasia

• Displasia

• Neoplasia

Génesis del cáncerGénesis del cáncer

Mutaciones AcumuladasMutaciones Acumuladas?

Mutaciones AcumuladasMutaciones Acumuladas

CÁNCERCÁNCER??

1.1. Continuidad de señales Continuidad de señales positivas de proliferación por positivas de proliferación por activación de oncogenes.activación de oncogenes.

2.Pérdida de señales negativas 2.Pérdida de señales negativas de crecimiento por de crecimiento por inactivación de genes inactivación de genes supresores.supresores.

3. Escape de la apoptosis por 3. Escape de la apoptosis por producción de factores de producción de factores de sobrevida IGFsobrevida IGF

4. Inmortalización atribuible a la 4. Inmortalización atribuible a la activación de la telomerasa.activación de la telomerasa.

5. Angiogénesis sustentada por 5. Angiogénesis sustentada por factores angiogénicosfactores angiogénicos

6. Alteración de las moléculas 6. Alteración de las moléculas de adhesión celular.de adhesión celular.

Genes InvolucradosGenes Involucrados

OncogenesOncogenes

• Oncogen ras

• Oncogen c-myc

• Oncogen c-fos

Supresores de TumoresSupresores de Tumores

• Gen APC (poliposis adenomatosa coli)

• Gen DDC (deleted in cancer colorectal)

• Gen RB

Genes InvolucradosGenes Involucrados

Reparadores del ADNReparadores del ADN• Gen TP53

• Gen MSH-2

• Gen MLH-1

• Gen PMS-1 y PMS-2

Genes InvolucradosGenes Involucrados

Génesis del cáncerGénesis del cáncer

AneuploidíaAneuploidía Mutaciones AcumuladasMutaciones Acumuladas

“Propone que el cáncer es causado por la dosificación anormal de miles de genes normales”“Esta dosificación anormal de genes es generada por la ganancia o pérdida de cromososmas específicos o segmentos de cromosomas, o simplemente una pequeña secuencia de ADN, alias aneuploidía”

Proc Natl Acad Sci USA 94:14506-11 (1997)Biochem J 340:621-30 (1999)Proc Natl Acad Sci USA 97:3236-4 (2000)Cell Motil Cystoskel 47:81-107 (2000)Cell cycle 2:202-10 (2003)IUBMB life 56:65-81 (2004)Nature Biotechnol 21:13-14 (2003)GENES VII (Lewin B.)

Teoría de Aneuploidía

¿Cuál es el origen de la aneuplodía?

Ganancia o pérdida cromosómica durante la división celular:

• Espontánea• Inducción química

Mutat Res. 410:3-79 (1998)Biochem J. 340:621-30 (1999)

División normal V/S aneuploidía

División Normal Aneuploidía

49,9

50,1

Teoría de la Aneuploidía

Aneuploidía al azar

Estado de Aneuplodía

Desestabiliza genes y cromosomas

Reordenamientos y acortamientos cromosómicos

Des balance en grupos de proteínas que segregan, sintetizan y reparan cromosomas

Near diploid (2n)Baja inestabilidad

Near Aneuploid Alta inestabilidad y adaptabilidad

Muerte celular por aneuplodía:

• Nulisomías• Acortamientos

cromosómicos no viables

• Mutaciones letales

Cell cycle 3:823-828 (2004)

Near Triploid (3n)

Near tetraploid (4n)

Aneuploidía Célula no cancerosa

Bajo el límite para el cáncer

Aneuploidía Célula cancerosa

Cytometry 22:307-316 (1995)Biochem J. 340:621-30 (1999)

Se alcanza o sobre pasa el límite para el cáncer (en forma gradual o abrupta)

Métodos de DetecciónMétodos de Detección

Métodos morfológicos

Proteínas

ADN

Biología Molecular

Muestra de tejido o muestra

de sangre del paciente

Genómica

Proteómica

PatologíaMuestra de tejido del paciente

Chip del gen

Detección por MorfologíaCitología

HistologíaHistología

InmunoHístoquímicaInmunoHístoquímica

Tsissue MicroarraysTsissue Microarrays

http://www.mibiopsia.com/images/CITOLOGIA.jpg

www.gyne.cz/fotogalerie/fotogalerie-images/ot-mucinous

%20adenocarcinoma.jpg

www2.udec.cl/~webpatologia/fotos/cancer2/pages/page_3.html

ww.zeiss.com/C12567BE00472A5C/GraphikTitelIntern/TMA_Array/$File/TMA_array_357.jpg

Detección por Biología Detección por Biología MolecularMolecular

Microarrays

Chip de gen

ADN

ADNc fluorescente

Microarreglo escaneado

Microarregloescaneado

No hace juego El rojo hace juego

El rojo hace juego

Célula normal

Aislar a los ARNms

Añadir al microarreglo de ADN

Producir ADNcs fluorescentes

Miocito

El ADNc fluorescente del linfocito “ilumina” al gen de inmunoglobulina

El ADNc fluorescente de la célula muscular “ilumina” al gen de miosina

ADNc fluorescente

ADNc fluorescenteARNm de inmunoglobulina

ARNm de miosina

+ transcriptasa inversa

Microarreglo escaneadoMicroarreglo de ADN

Inmunoglobulina

Linfocito

Miosina

+ transcriptasa inversa

MicroarregloescaneadoMicroarreglo de ADN

Utilizando al ADN para CompararCélulas Cancerosas con Células Normales

Célula normal

Microarregloescaneado

Añadir al microarreglode ADN

Producir ADNcs fluorescentes rojos y verdes

Sólo los verdeshacen juego

Sólo los rojoshacen juego

Ambos, rojos y verdes

hacen juego

Ninguno hace juego

Aislar losARNms

Célula cancerosa

Interpretando los Datos

El gen del cáncer se expresó 18 veces más que el gen normalArtwork by Jeanne Kelly. © 2002.

Citometría de FlujoCitometría de Flujo

Estudio de Ploidía de ADN mediante

estudio del ciclo celular de lesiones pre-neoplasicas y

neoplasicas

ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULARY CICLO CELULAR

• Se evalúa el contenido relativo de ADN en el núcleo de una célula normal o neoplásica.

• Se obtiene una estimación de las fases del ciclo celular.

• Se obtienen resultados de la cantidad de ADN celular, lo que se traduce en discriminar poblaciones diploides y aneuploides.

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

2X

1X

G1 S G2 M G1

FASES CICLO CELULARFASES CICLO CELULAR

CONTENIDO ADN

CANTIDAD DE CANTIDAD DE ADN V/S TIEMPOADN V/S TIEMPO

0 200 400 600 800 1000

PI Fluorescence

Cou

nts

0 7

5 1

50 2

25 3

00

DNA Análisis

2N2N 4N4N

Purdue University Cytometry Laboratories

0 200 400 600 800 1000

PI Fluorescence

Cou

nts

0 7

5 1

50 2

25 3

00

DNA Análisis

Aneuploid peakAneuploid peak

DNA index 1.21DNA index 1.21

Purdue University Cytometry Laboratories

ESTUDIO DE PLOIDIA DE ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULARADN Y CICLO CELULAR

INDICE ADN (ID): Medición de Ploidia de ADN.

ID: Razón de la Cantidad de ADN de la Muestra v/s el control.

ID = Contenido ADN Células G0G1 MuestraContenido ADN Células G0G1 Control

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

ESTUDIO DE PLOIDIA DE ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULARADN Y CICLO CELULAR

PLOIDIA

ADN Diploide

ADN Aneuploide

ADN Hiperdiploide

ADN Hipodiploide

INDICE ADN

= 1

= 1

> 1

< 1

INDICE ADN (ID): Medición de Ploidía de ADN

ProteómicaProteómica

• Entendida como una genómica funcional

• Biomarcadores

• Pautas terapéuticas

Electroforesis BidimensionalElectroforesis Bidimensional

http://www.upf.edu/cexs/sct/proteomi/img/ef2D.gif

Nuevos puntos Puntos perdidos

Protein ChipProtein Chip

www.ipht-jena.de/BEREICH_3/bilder/protein_array.jpg

Espectrometría de Masa

DiscusiónDiscusión

• Faltan mas estudios comparativos entre ambas teorías, motivo por el cual se conoce poco de Aneuploidía.

• Todas las neoplasias presentan aneuploidía, en contraste con mutaciones acumuladas.

• Existen estudios que desprecian la teoría de la Aneuploidía como causa común en neoplasias de Adenocarcinoma esofágico(1).

• La aneuploidía es una consecuencia de inestabilidad genómica de las mutaciones acumuladas.

(1)www.academia.cat/societats/digest/5curs/esofag.htm

DiscusiónDiscusión

• Las técnicas de genómica, detectan los problemas a nivel de Ac. Nucleicos, lo que posibilita un diagnóstico oportuno y a la raíz misma de éste.

• Las técnicas proteómicas detectan el resultado de todo el proceso de expresión génica (inclusive los factores epigenéticos), siendo más efectivo y fácil de dilucidar.

ConclusiónConclusión

La displasia es un concepto en el que ni los propios morfologos están de acuerdo, por lo que las técnicas de biología molecular son la futura solución a este dilema.

• Los diagnósticos morfológicos se hacen cada vez más incompletos sin técnicas complementarias que determinen más certeramente el pronóstico de la neoplasia.

ConclusiónConclusión

• Es importante poder identificar cual técnica es la mas ideal para poder diagnosticar una neoplasia en particular, considerando que en un futuro se harán tratamientos personalizados.

• A futuro, la detección de estados neoplásicos y pre-neoplásicos serán diagnósticados de forma predictiva en base a la proteómica y genómica, identificando tempránamente el cáncer.

AgradecimientosAgradecimientos

• Profesor Juan Luís Castillo N.

• Dr. Marcelo Larremendi.