DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CORONAVIRUS AVIÁRIO EM … · 2017. 5. 17. · RAPHAEL MAUSBACH SIMÃO DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CORONAVIRUS AVIÁRIO EM AVES SILVESTRES DE

RAPHAEL MAUSBACH SIMÃO

DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CORONAVIRUS AVIÁRIO EM AVES

SILVESTRES DE CATIVEIRO

São Paulo

2017

RAPHAEL MAUSBACH SIMÃO

DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CORONAVIRUS AVIÁRIO EM AVES

SILVESTRES DE CATIVEIRO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências

Departamento:

Medicina Veterinária Preventiva e Saúde

Animal

Área de concentração:

Epidemiologia Experimental Aplicada às

Zoonoses

Orientador (a): Profa. Dra. Helena Lage

Ferreira

São Paulo

2017

Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

T. 3466 Simão, Raphael Mausbach FMVZ Detecção e caracterização de coronavirus aviário em aves silvestres de cativeiro /

Raphael Mausbach Simão. -- 2017. 58 f. : il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, São Paulo, 2017.

Programa de Pós-Graduação: Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses.

Área de concentração: Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses. . Orientador: Profa. Dra. Helena Lage Ferreira.

1. Coronavirus. 2. Aves silvestres. 3. Vigilância. I. Título.

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Autor: Simão, Raphael Mausbach

Título: Detecção e caracterização de coronavírus aviário em aves silvestres de

cativeiro.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências

Data: ____/____/____

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. _________________________________________________________

Instituição: ________________________Julgamento: ___________________

Prof. Dr. _________________________________________________________


Prof. Dr. _________________________________________________________


AGRADECIMENTOS

Aos meus amados pais José Roberto e Silvia Helena por todo apoio e constante

estimulo, sem eles, permito-me acreditar que nada disso teria sido possível.

Ao meu irmão Matheus, com toda certeza o melhor irmão que alguém poderia

ter.

À minha querida orientadora Dra. Helena Lage Ferreira, que não poupou

esforços e se mostrou sempre interessada no meu desenvolvimento científico e

pessoal, obrigado pela confiança.

À minha avó Mary e minhas tias Rose e Raquel.

Ao Dr. Paulo Anselmo Nunes Felippe, professor de graduação e grande amigo,

pessoa que despertou meu interesse pela pesquisa.

À Julia, minha grande irmã. Não existem palavras para expressar o que criamos

nesses 2 anos, você me ajudou em todos os momentos e sempre me apoiou,

até mesmo nos momentos mais difíceis, sempre com muita clareza e muita

paciência. Essa é uma daquelas amizades que acontece poucas vezes. Não sei

se algum dia conseguirei te agradecer por tudo.

Ao Alexandre, grande parceiro para qualquer tipo de conversa.

À Laís, amiga desde a primeira semana do mestrado, pessoa pela qual criei

grande carinho, durante esses 2 anos, passamos por momentos de desespero

e extrema alegria.

Ao Guilherme, que sempre me ajudou e que também se tornou um grande

amigo.

À Patrícia Tatemoto, irmã de VPS, com toda certeza, jamais esquecerei das

caminhadas, partos na suinocultura, nossas risadas, nossas conversas e

jantares na casa.

Ao Fernando e Júlio, considero vocês demais.

Ao Thiago e David, grandes amigos que ganhei na pós e que levarei para a vida

toda.

À Marisol, Luana e Mariana, amigas que tornaram minhas noites na casa do VPS

muito mais divertidas, sempre dispostas a escutar e a conversar sobre todos os

assuntos, isso me fará muita falta.

À Bruna, que mesmo conhecendo a pouco tempo se tornou uma grande amiga.

Aos amigos do laboratório: João, Bruna, Jéssica, Lucas, Geovanna, Alessandra,

Lívia, Carol e Izabelle.

Ao Nuno, grande amigo e de uma clareza surpreendente sobre a vida.

À todo o pessoal do LVA da UNICAMP: Leo, Gabi, Carol, Paulo e Matheus. Em

especial o Leo, que me ajudou várias vezes e que foi de vital importância para a

realização deste trabalho.

À Professora Dra. Clarice Weis Arns, por permitir a utilização do espaço e dos

equipamentos do LVA e pelos ensinamentos.

Ao LANAGRO pelas doações de ovos SPF, e à Maria Angela Orsi, por todos

ensinamentos.

Às Professoras Trícia e Lara, sempre atenciosas e dispostas a auxiliar.

Ao Diogo e Júlio, amigos de Ilha Solteira.

À Lívia, minha fisioterapeuta, que tornou essa jornada menos dolorosa,

literalmente.

À Prof. Msc Diana Nascimento, grande amiga e com toda certeza grande

responsável pelo meu ingresso na pós-graduação

Ao Prof. Msc Marcelo Castro, eterno mestre.

Ao Prof. Dr. Reinaldo Orsi, um professor excepcional e um grande amigo.

Ao Marcelo e Pedro, irmãos de graduação e que mesmo com o passar dos anos

a amizade continua a mesma.

Ao Professor Dr. Paulo Eduardo Brandão, que sempre se mostrou disposto a me

auxiliar e pessoa por quem tenho grande admiração.

Ao Danival, pessoa que sempre me ajudou no VPS.

À CAPES pela bolsa.

À todos que colaboraram direta ou indiretamente com a realização do meu

trabalho, assim como meu crescimento profissional e pessoal.

À você, que por qualquer motivo estiver lendo este trabalho.

“É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas, mesmo expondo-se ao fracasso, do que alinhar-se com os pobres de espírito, que nem gozam muito, nem sofrem muito, porque vivem numa penumbra cinzenta, onde não conhecem nem vitória, nem derrota. ”

Theodore Roosevelt

RESUMO

SIMÃO, R. M. Detecção e caracterização molecular de coronavírus aviários em amostras de aves de cativeiro. [Detecção e caracterização molecular de coronavírus aviários em amostras de aves de cativeiro]. 2017.58 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017.

As aves silvestres são consideradas importantes reservatórios de diversos vírus

aviários que podem afetar aves comerciais. Dessa forma, o monitoramento das

aves silvestres é fundamental para garantir a sanidade dos plantéis avícolas

brasileiros. Nos últimos anos, o número de espécies de aves nas quais os

coronavírus aviários foram encontrados aumentou vertiginosamente em diversos

países. Contudo, poucos estudos envolvendo a detecção de coronavírus aviários

em aves de cativeiro e aves silvestres ou sinantrópicas foram realizados no

Brasil. Assim, o presente estudo teve como objetivo identificar a presença dos

coronavírus aviários em aves silvestres no Brasil e caracterizá-los

molecularmente. As amostras foram testadas através do teste de RRT-PCR para

detecção do gene UTR do IBV, bem como uma nested-PCR para detecção do

gene S1 dos coronavírus aviários. O sequenciamento de alto desempenho foi

utilizado para caracterizar os vírus detectados. No total, foram testadas 300

amostras de aves silvestres (147 suabes orofaringeanos e 153 suabes cloacais).

No total, 27 amostras foram positivas pelo teste RRT-PCR. Duas amostras de

Anseriformes das amostras positivas no teste de RRT-PCR foram selecionadas

para sequenciamento de alto desempenho. Em ambas as amostras

sequenciadas foi constatada a co-infecção pelos vírus da bronquite infecciosa e

vírus da doença de Newcastle. A análise das amostras demonstrou alta

identidade com vírus vacinais, o que demonstra que estirpes vacinais utilizadas

na imunização de aves de produção circulam em aves silvestres e de produção

de subsistência.

Palavras-chave: Coronavirus. Vigilância. Aves silvestres.

ABSTRACT

SIMÃO, R. M. Molecular detection and characterization of avian coronavirus in samples from captive birds. [Molecular detection and characterization of avian coronavirus in samples from captive birds]. 2017. 58 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017.

Wild birds are an important reservoir of different viruses that can affect poultry. Viral

surveillance in wild birds is, thus, extremely important to ensure the poultry heal in

Brazil. In recent years, the number of species of birds in which avian coronaviruses

have been found skyrocketed in several countries. However, few studies involving

the detection of avian coronaviruses in captive wild birds or wild life birds were

conducted in Brazil. Thus, the present study aimed to identify the presence of avian

coronaviruses in Brazil and characterize them molecularly. Samples were tested

by RRT-PCR test for detection of the UTR gene of IBV, as well as a nested-PCR

for detection of S1 gene. In total, 300 samples of wild birds (147 oropharyngeal

swabs and 153 cloacal swabs) were tested. In total, 27 samples were positive in

RT-PCR assay. Two positive samples in RRT-PCR assay were selected for Next-

generation sequencing. In both sequenced samples, co-infection with infectious

bronchitis virus and Newcastle disease virus was found. The analysis of samples

showed identity with vaccinal strains used in immunization of commercial flocks

circulate in wild birds and subsistence flocks.

Keywords: Coronavirus. Surveillance. Wild birds.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura e morfologia dos coronavirus ............................................. 16

Figura 2. Desenho esquemático do genoma dos coronavirus e transcrição dos

RNAs subgenômicos ........................................................................................ 18

Figura 3. Desenho esquemático da replicação dos gammacoronavírus .......... 19

Figura 4. Árvore filogenética das variantes de VBI circulantes em diversas

partes do mundo, baseada no gene S1 ........................................................... 20

Figura 5. Diferenças entre as regiões do gene S1 que são utilizadas para o

sequenciamento em diversas posições do genoma de IBV realizada por

diferentes estudos ............................................................................................ 26

Figura 6. Gel de agarose 1,5% das amostras positivas pelo teste específico de

RRT-PCR para detecção de VBI foram testadas pelo teste RT-PCR

convencional .................................................................................................... 42

Figura 7. Análise Filogenética das amostras CA11T e Ganso OP pelo método

Maximum Likelihood ......................................................................................... 44

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Oligonucleotídeos e sondas utilizados para amplificação do material

genético dos testes moleculares ...................................................................... 35

Quadro 2. Amostras inoculadas em ovos SPF ................................................. 36

Quadro 3. Número de acesso das amostras utilizadas para análise filogenética

da amostra CA11T ........................................................................................... 39

Quadro 4. Número de acesso das amostras utilizadas para análise filogenética

da amostra GANSO OP ................................................................................... 39

Quadro 5. Amostras positivas no RRT-PCR para VBI separadas por Ordem

animal ............................................................................................................... 40

LISTA DE ABREVIATURAS

VBI: Vírus da Bronquite Infecciosa

PIB: Produto interno bruto

ICTV: Comitê Internacional de Taxonomia dos Vírus

MERS: Sindrome Respiratória do Oriente Médio

SARS: Síndrome Respiratória Aguda Grave

NSP: Proteína não estrutural

RNA: Ácido ribonucléico

RdRp: RNA-polimerase RNA dependente

S1: Subunidade um da proteína S

S2: Subunidade dois da proteína S

UTR: Região não traduzida

HVR: Região hipervariável

RRT-PCR: Reação em cadeia da polimerse da transcrição reversa em tempo

real

CEUA: Comitê de Ética no Uso de Animais

FMVZ: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

ICMBio: Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade

SISBIO: Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade

USP: Universidade de São Paulo

DNA: Ácido desoxirribonucleico

dsDNA: Ácido desoxirribonucleico de fita dupla

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................... 15

2 JUSTIFICATIVA ........................................................................................ 30

3 OBJETIVOS .............................................................................................. 31

3.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................... 31

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 31

4 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................... 32

4.1 COLETA DE AMOSTRAS ............................................................................ 32

4.2 AMOSTRAS PADRÃO ................................................................................. 32

4.3 PURIFICAÇÃO DO RNA VIRAL ................................................................... 33

4.4 AMPLIFICAÇÃO POR RRT-PCR ................................................................. 33

4.5 AMPLIFICAÇÃO POR RT-PCR .................................................................... 33

4.6 VALIDAÇÃO DOS TESTES .......................................................................... 34

4.7. SEQUENCIAMENTO DOS FRAGMENTOS AMPLIFICADOS ...................... 35

4.8 ISOLAMENTO DE AMOSTRAS POSITIVAS EM OVOS SPF ...................... 36

4.9 PRÉ-TRATAMENTO DAS AMOSTRAS PARA O SEQUENCIAMENTO NGS

37

4.10 PREPARO DAS BIBLIOTECAS .................................................................... 37

4.11 ANÁLISE DE DADOS E ANÁLISE FILOGENÉTICA ..................................... 38

5 RESULTADOS .......................................................................................... 39

5.1 DETECÇÃO DAS AMOSTRAS ..................................................................... 40

5.2 SEQUENCIAMENTO DAS AMOSTRAS ....................................................... 42

5.3 ANÁLISE FILOGENÉTICA ........................................................................... 43

6 DISCUSSÃO ............................................................................................. 45

7 CONCLUSÕES ......................................................................................... 49

8 REFERÊNCIAS ......................................................................................... 50

15

1 INTRODUÇÃO

A bronquite infecciosa das galinhas é uma das principais doenças virais que

causam estas perdas à avicultura comercial. Trata-se de uma doença altamente

contagiosa e com uma grande gama de genótipos, o que torna seu controle

extremamente desafiador. Estas características inerentes ao vírus da bronquite

infecciosa (VBI) proporcionam a este a possibilidade de rápida disseminação e

acometimento de um número elevado de aves (GELB JR et al., 2005). Aves de

corte geralmente apresentam sinais respiratórios como tosse, espirro, estertores

traqueais e aumento de secreção nasal e ocular, já em aves de postura,

frequentemente são observados sinais como mortalidade, diminuição na taxa de

postura e ovos com defeitos na casca (CAVANAGH, 2007; JANG et al., 2007; MA

et al., 2012).

O vírus da bronquite infecciosa pertence à grande família viral dos

coronavírus está classificada dentro da ordem Nidovirales, família

Coronaviridae. O nome Coronavirus foi proposto em 1968, oriundo de sua

morfologia, que quando observada no microscópio eletrônico, lembra o formato

de uma coroa solar (TYRRELL et al., 1968). Recentemente, novos coronavírus

foram relatados e geraram uma reclassificação da família Coronaviridae em

duas subfamílias: Torovirinae e Coronavirinae. A subfamília Coronavirinae foi

subdividida em quatro gêneros: Alphacoronavirus, Betacoronavirus,

Gammacoronavirus, e Deltacoronavirus (ICTV, 2014). Alphacoronavirus e

Betacoronavirus são encontrados principalmente em mamíferos (DONG et al.,

2007), sendo que, no grupo dos Betacoronavirus, estão agrupadas as doenças

de alto potencial zoonótico, como a Sindrome Respiratória Aguda Grave

(SARS) e Síndrome respiratória por coronavírus do Oriente Médio (MERS) (DE

GROOT et al., 2013; HU et al., 2015). Já os Gammacoronavirus e

Deltacoronavirus foram detectados tanto em aves quanto em mamíferos

(MIHINDUKULASURIYA et al., 2008; WOO et al., 2009; WOO et al., 2012).

Os coronavírus aviários são envelopados e seu genoma é composto por

uma fita simples de RNA de sentido positivo, simetria helicoidal e podem

apresentar forma esférica ou pleomórfica, sendo que seu envelope tem

aproximadamente 120 nm de diâmetro, com projeções glicoprotéicas

16

(espículas) de 20 nm (Figura 1). O genoma desses vírus possui

aproximadamente 27.600 nucleotídeos, e codifica três proteínas estruturais

majoritárias: a glicoproteína de superfície (S - espícula), a proteína de

membrana (M), a do nucleocapsídeo (N) e uma quarta estrutural denominada

pequena proteína de membrana (E), que está associada com o envelope viral

em pequenas quantidades, sendo essencial para a formação da partícula viral

(CAVANAGH, 2005; CALLISON et al., 2006). O gene do complexo replicase,

composto por 16 subunidades virais (exceto VBI – 15 subunidades), incluindo

o gene da RNA polimerase dependente de RNA (RdRp), fica situado próximo a

extremidade 5’, ocupa aproximadamente dois terços do genoma vírion

(BRANDÃO; LOVATO; SLHESSARENKO, 2012). Esses vírus apresentam uma

grande variabilidade antigênica devido às altas taxas de recombinação de 10-

3, assim como os vírus de Influenza (JACKWOOD; HALL; HANDEL, 2012).

Figura 1. Estrutura e morfologia dos coronavirus

Fonte: (MASTERS; PERLMAN, 2013) A: Tomografia crio eletrônica de virions de hepatite viral murina (MHV). B: Desenho esquemático da partícula viral com as principais proteínas estruturais, S (proteína de espícula), M (proteína de membrana), E (proteína de envelope) e N (proteína de nucleocapsideo).

A proteína S é determinante para o tropismo celular da estirpe envolvida

e patogênese consequente (GALLAGHER; BUCHMEIERT, 2001). Esta

proteína é composta por aproximadamente 3400 nucleotídeos é clivada em 2

subunidades, na qual a S1 é responsável pela ligação ao receptor celular e a

S2 pela fusão a membrana celular do hospedeiro (BELOUZARD et al., 2012).

17

Trata-se de uma proteína de fusão de classe I, que possui a característica de

clivagem em duas subunidades, que ocorre após o seu contato com as

proteases da célula hospedeira em uma subunidade distal e uma subunidade

ancorada a membrana viral, um acontecimento essencial para a fusão a

membrana da célula hospedeira (BOSCH et al., 2003). A S1 também é principal

proteína responsável pela indução de resposta imune do hospedeiro e da

produção de anticorpos neutralizantes (CAVANAGH; ELUS; COOK, 1997),

Dentro do envelope está localizado o core de ribonucleoproteína, o qual

contém o genoma de RNA e a proteína N. A proteína do nucleocapsídeo (N) é

uma fosfoproteína com aproximadamente 50 a 60 kDa de peso molecular que

junto com o RNA genômico, forma o nucleocapsídeo. A proteína N confere ao

RNA genômico certa proteção contra as ribonucleases e possui domínios de

ligação ao RNA, à membrana e a fosfolipídios que facilitariam a formação das

partículas virais. A ligação da proteína N com terminações 5’ e 3’ do RNA viral

sugere que esta participa na modulação do RNA viral pela capacidade de se

ligar à membrana, possibilitando a formação de complexos de transcrições. A

proteína N também é capaz de incitar a resposta celular. Embora o domínio

terminal de proteínas N (N-NTD) se ligue a todas as formas de polímeros ácido

nucleicos (RNA simples e de cadeia dupla e DNA simples e de cadeia dupla),

a especificidade por RNA sobre DNA é provavelmente fornecida pelo contexto

(localização do complexo replicase), em vez de seletividade bioquímica

(SAIKATENDU et al., 2007).

A proteína E dos coronavírus é uma proteína de membrana integral que

juntamente com a proteína M desempenha um importante papel na montagem

viral. A proteína E, quando expressa sozinha ou quando expressa em conjunto

com a proteína M forma partículas semelhantes às dos vírus (WEISS; NAVAS-

MARTIN, 2005). De acordo com um estudo realizado por pesquisadores

americanos, surpreendentemente foi possível selecionar um MHV

recombinante com uma deleção do gene da proteína E, tal MHV recombinante

apresentou baixa infecciosidade e baixa taxa de replicação, o que indica que

embora não seja essencial, a proteína E desempenha um papel importante na

produção do vírus infeccioso (KUO; MASTERS, 2003).

A proteína M tem como sua principal função a montagem da partícula viral,

na qual interage com outras proteínas de membrana no local de brotamento da

18

nova partícula viral, esta proteína pode adotar duas conformações, na qual, a

conformação alongada está aparentemente associada à rigidez da membrana

e um grande número de espiculas, já a conformação compacta parece estar

associada a grande flexibilidade da membrana e baixa quantidade de

espiculas(NEUMAN et al., 2011). Um estudo realizado demonstrou que a

glicoproteína M apresenta pouca imunogenicidade e que não induziu nenhum

tipo de proteção e aves imunizadas com um purificado da proteína M, e que

foram necessárias pelo menos quatro aplicações para induzir a produção de

anticorpos (IGNJATOVIC; GALLI, 1994).

Além destas proteínas, os Coronavirus ainda possuem o gene replicase -

que ocupa aproximadamente dois terços do genoma - que codifica duas

poliproteínas denominadas pp1a e pp1ab que são clivadas por proteinases

virais e resultam em 16 proteínas não estruturais (Nsp1-Nsp16), exceto os

Gammacoronavirus que não possuem a Nsp1 (ARMESTO; CAVANAGH;

BRITTON, 2009). O gene da replicase é o único que é traduzido diretamente

do genoma viral, todos os outros são traduzidos a partir de sgRNAs (Figura 2)

(MASTERS; PERLMAN, 2013).

Figura 2. Desenho esquemático do genoma dos coronavirus e transcrição dos RNAs subgenômicos

Fonte: (VIRALZONE, 2016)

19

A replicação viral inicia-se com a ligação da proteína S aos receptores

celulares, em seguida é realizada a fusão entre o vírus e a célula hospedeira

(Figura 3). Aparentemente, para o VBI esta fusão é dependente de pH ácido, no

qual o pH ótimo é 5.0, assim como para o vírus da Influenza (CHU, V. C. et al.,

2006). Uma vez dentro do citoplasma, ocorre o desnudamento viral e o RNA

genômico é liberado e dá início a sua replicação, no qual o complexo replicase é

traduzido na proteína RdRp responsável pela transcrição de um RNA

antigenômico que servirá de molde para síntese do RNA de sentido genômico

que será incorporado a partícula viral e também a transcrição de sgRNAs que

serão traduzidos nas outras proteínas necessárias para a montagem viral. A

proteína N liga-se ao RNA genômico e segue em direção ao reticulo

endoplasmático rugoso (RER) no qual as proteínas M, E e S já estão inseridas,

em seguida passa pelo complexo de golgi onde todas as proteínas são

associadas e formam vesículas que acumulam as partículas virais que são

transportadas até a membrana plasmática e são liberadas por exocitose.

Figura 3. Desenho esquemático da replicação dos gammacoronavírus

Fonte: (DECARO, 2011).

Replicação viral dos gammacoronavírus. S (proteína de espícula), M (proteína de membrana), E (proteína de envelope), N (proteína de nucleocapsideo) e NS (proteínas não-estruturais).

20

O VBI foi descrito pela primeira vez nos Estados Unidos em 1930

(MONTASSIER, 2010). No Brasil, o primeiro relato ocorreu em 1957 (HIPÓLITO,

1957).

A variabilidade genética deste vírus culmina com o surgimento de uma

enorme variedade de genótipos, que já foram isolados a partir de amostras de

aves domésticas e silvestres, e descritos em todo o mundo (Figura 4), por meio

do sequenciamento do gene S1, uma das principais ferramentas utilizadas para

o estudo deste vírus (DE WITT; COOK; VAN DER, 2010).

Figura 4. Árvore filogenética das variantes de VBI circulantes em diversas partes do mundo, baseada no gene S1

Fonte: (DE WITT; COOK; VAN DER, 2010)

21

As aves silvestres, especialmente aves aquáticas migratórias, aves de

rapina e passeriformes, são frequentemente consideradas reservatórios ou até

mesmo vetores de diversos patógenos aviários potencialmente deletérios as

aves comerciais, dentre os quais o VBI se insere, o que ressalta a importância

do monitoramento das aves silvestres para a manutenção da sanidade avícola.

(ALEXANDER, 2007; CHU, D. K. et al., 2011; CHA; YU; ZSAK, 2013). Esses

vírus já foram detectados em diversas espécies de aves, inclusive silvestres

(CAVANAGH, 2005), sendo que alguns deles apresentam uma alta identidade

entre os VBI e são identificados como VBI-like (LIU et al., 2005).

Os VBI-like já foram detectados em diversas espécies de aves silvestres

das ordens Anseriformes, Charadriiformes e Galliformes (HUGHES et al., 2009;

TARNAGDA et al., 2011; DOMANSKA-BLICHARZ et al., 2014). Outros autores

têm relatado outros coronavírus aviários que apresentam uma baixa identidade

de nucleotídeos com os VBI em diversas ordens de aves, como Galliformes,

Anseriformes, Columbiformes, Charadriiformes, Passeriformes, Pelacaniformes,

Ciconiiformes e Pssitaciformes (JONASSEN et al., 2005; CULVER; BRITTON;

CAVANAGH, 2008; MURADRASOLI et al., 2009; FELIPPE et al., 2010; KIM;

OEM, 2014). Um estudo recente inclusive demonstra a circulação de um novo

genótipo de coronavírus aviário em patos geneticamente similar aos que circulam

em aves silvestres aquáticas e distintos dos VBI-like (CHEN et al., 2013). Dessa

forma, a epidemiologia dos Gammacoronavírus aviários ainda necessita ser

esclarecida.

No Brasil, diversos estudos apontam uma alta prevalência de VBI em aves

comerciais (TORRES et al., 2013) demonstrando inclusive um genótipo brasileiro

distinto de outros países (VILLARREAL et al., 2007; FRAGA et al., 2013;

MOURA-ALVAREZ et al., 2013). Interessante ressaltar que poucos estudos

envolvendo a detecção de coronavírus aviários em aves de cativeiro (CARDOSO

et al., 2011) e aves silvestres ou sinantrópicas (FELIPPE et al., 2010) foram

realizados no Brasil. O conhecimento sobre os vírus circulantes em aves

silvestres torna-se de suma importância para a avaliação à avicultura comercial

bem como sobre a epidemiologia desses vírus.

O Gallus gallus domesticus era considerado o único hospedeiro natural

do vírus da bronquite infecciosa das galinhas. Agora, sabe-se que este vírus

22

pode infectar perus ou faisões, ao observar-se um marcado grau de semelhança

entre o coronavirus de galinhas, perus e faisões (CAVANAGH et al., 2002).

Estirpes do tipo Massachussets têm sido isoladas nos Estados Unidos,

América Latina, Europa e na Ásia desde 1940 e até o presente (JACKWOOD,

2012; AL-SHEKAILI; BAYLIS; GANAPATHY, 2015). No Brasil, o VBI foi isolado

pela primeira vez no Brasil em 1957 (HIPÓLITO, 1957). Apenas uma única

estirpe vacinal é atualmente liberada para uso pertence ao genótipo

Massachusetts para o controle desse vírus na avicultura comercial. As estirpes

mais utilizadas têm origem holandesa como a Massachusetts H120, H52 e H90,

sendo que o “H” representa “Holland” e os números correspondem o número de

passagens em ovos SPF (BIJLENGA et al., 2004).

No entanto, a maioria dos países tem identificado novas variantes naturais

de sua região (DE WITT; COOK; VAN DER, 2010). Assim, alguns estudos

demonstraram que uma variante brasileira tem circulado e evoluido a campo

desde 1988 indicando que, muito provavelmente, as variantes isoladas com

sorotipos diferentes dos utilizados nas vacinas estão emergindo (VILLARREAL

et al., 2007; FELIPPE et al., 2010; CHACON et al., 2011; FRAGA et al., 2013).

O comportamento biológico e epidemiológico da variante brasileira começa a ser

estudado para auxiliar nos programas de controle da VBI, evidenciado pela

utilização da vacinação monovalente com a vacina do sorotipo Massachusetts

(MONTASSIER, 2010). A intensidade da resposta imune celular e humoral, e

sua habilidade de conferir efetiva proteção é dependente da dose de vacina viva

atenuada administrada do sorotipo Mass (M41) (OKINO et al., 2014).

Diversos sorotipos circulam nos Estados Unidos, além do tipo de VBI

Massachussets originalmente identificado no início dos anos 1950 (FABRICANT,

1951; 1998). O sorotipo Connecticut foi o primeiro sorotipo distinto do

Massachusetts isolado nos Estados Unidos e este não apresentava proteção

cruzada e também não era neutralizado pelo soro para a estirpe Massachusetts

(JUNGHERR; CHOMIAK; LUGINBUHL, 1956). Anos depois, o sorotipo DE072

foi identificado em uma granja de poedeiras nos Estados Unidos (MONDAL;

LUCIO-MARTINEZ; NAQI, 2001). A estirpe Q1 tem sido a mais comumente

reportada na Argentina (COOK et al., 2014). Dezenas de outros sorotipos foram

isolados na África, Ásia, Índia, Austrália, Europa e América do Sul. Surtos de

bronquite infecciosa ocorrem frequentemente, mesmo em planteis vacinados. As

23

estirpes de vírus isolados observados a partir desses focos são frequentemente,

mas nem sempre, um sorotipo diferente do tipo de utilizado na confecção da

vacina, o que demonstra que vários sorotipos podem co-circular em uma

determinada região (CAVANAGH; GELB JR., 2008).

Um estudo realizado em 2008 demonstrou o 4/91 como um dos genótipos

predominantes na Espanha e que este circula no país desde 1992.

Curiosamente, o estudo também mostra uma importante mudança na dinâmica

da subpopulação do vírus ao longo do tempo com uma clara substituição de

genótipos predominantes na Espanha, uma vez que o genótipo 4/91 foi

prevalente no país durante a década de noventa e surpreendentemente deixou

de ser o principal após o aparecimento de um novo genótipo, o Itália 02 que se

tornou o genótipo predominante no final desta mesma década. Vale ressaltar

que no final dos anos noventa as vacinas contra a 4/91 começaram a ser

comercializadas na Espanha. Portanto, é provável que a vacinação contra o

genótipo 4/91 tenha sido muito bem-sucedido, a fim de conseguir um controle de

infecções causadas por este genótipo no país visto que foi observado uma

redução drástica no isolamento do 4/91 de casos clínicos. Por outro lado, é

tentador especular que o status imunológico das aves contra o 4/91 poderia ter

proporcionado um ambiente em que o novo genótipo variante Itália 02 tinha

maior vantagem, contribuindo para um estabelecimento mais rápido e

disseminação desse sorotipo pela Espanha (DOLZ et al., 2008).

Um estudo sobre a epidemiologia do virus da bronquite infecciosa na

Belgica no periodo de 1986 até 1995 e apresentou resultados que sugerem a

provável cocirculação do tipo de vírus vacinal e cepas selvagens, uma vez que

ambas foram coletadas a partir de galinhas vacinadas e não vacinadas. De fato,

dois dos 12 isolados da cepa Massachusetts (linhagens 86/71 e 92/974), a partir

de frangos de corte vacinados de 22 e 35 dias de idade, apresentavam cepa

vacinal de Massachussetts que foi evidenciado pelo fato de que sua sequencia

UTR apresentar caracteristica típica da sequência original encontrado em no

virus vacinal Massachusetts e suas proteinas de espicula S1, ou seja, o

isolamento de cepas semelhantes a do tipo Massachusetts vacinal em plantéis

não vacinados é mais um indício da circulação de cepas vacinais (MEULEMANS

et al., 2001).

24

Na Ásia, a estirpe PDRC/Pune/Ind/1/00 foi isolada de animais com

manifestações clínicas respiratórias e renais em 2005, na Índia. Este isolado

apresentou similaridade inferior a 40% na sequência da proteina S1 àquelas

estirpes circulantes nas Américas como a D1466, Mex/1765 e DE072, no

entanto, quando comparada com a estirpe 6/82 circulante na Europa, chegou a

apresentar similaridade próxima a 68%. Este novo genótipo que apresenta uma

sequência única de S1 e pode ter emergido da recombinação das variantes já

conhecidas e circulantes em outros países e continentes com variantes

circulantes na região ou estirpes vacinais (BAYRY et al., 2005). Em 2004, um

novo genótipo nefropatogênico de VBI identificado como QX, circulante em

plantéis vacinados e não vacinados na China. A similaridade entre estas

amostras e outras 16 estirpes circulantes variou de 60 a 81% mostrando que

tratava-se de um novo genótipo circulante (LIU; KONG, 2004). Em 2009, no

Japão, foi isolado um novo genótipo do VBI designado JP-IV, com base na

análise do gene S1 (MASE et al., 2010). Neste estudo também foi realizada a

vírus neutralização, nenhum dos soros utilizados contra as estirpes circulantes

JP-II, JP-III e 4/91 neutralizou os efeitos deste novo genótipo (JP-IV), sugerindo

que a antigenicidade deste isolado é diferente a dos outros conhecidos no Japão.

A investigação epidemiológica das infecções VBI demonstra que a

propagação de uma estirpe de uma zona ou país para outro pode ser devido,

pelo menos em parte, a sua introdução imprópria pela comercialização de aves

e migração de aves selvagens (CAVANAGH, 2005).

As diferenças de genótipos do VBI devem-se as variações na sequência

de aminoácidos de duas regiões da subunidade S1, chamadas de regiões

hipervariáveis (HRV) (MONTASSIER, 2010). Desse modo, diferenças sutis na

sequência de nucleotídeos do gene codificador da proteína S1, podem dar

origem a novos sorotipos que podem infectar animais previamente expostos a

outros sorotipos do mesmo vírus (CAVANAGH; NAQI, 2003). Estas diferenças

que ocorrem na porção S1 são responsáveis pela grande variedade de

sorotipos de VBI e devem-se, principalmente, a alterações que comumente

estão entre 20-25% na sequência de nucleotídeos e de até 50% na sequência

de aminoácidos, o que ressalta a importância dos estudos sobre o gene

codificador da proteína S (CAVANAGH et al., 2005).

25

No Brasil, amostras de campo tem sido classificadas como dois genótipos

distintos por apresentarem baixa similaridade quando comparadas a amostras

de referência, sendo classificadas como BR-I (CHACON et al., 2011).

Recentemente, um estudo demonstrou o surgimento de um novo genótipo,

denominado BR-II, que apresenta pelo menos oito substituições na sequência

de aminoácidos no gene S1 em comparação com cepas vacinais Mass (FRAGA

et al., 2013).

É notório que o VBI possui uma enorme variedade de estirpes virais

geneticamente distintos, no entanto, não há consonância quanto ao método de

comparação das sequencias do vírus uma vez que, as regiões alvos dos

primers utilizados variam entre os grupos de pesquisa (Figura 5) (DE WITT;

COOK; VAN DER, 2010). Recentemente, foi proposta a comparação utilizando

apenas as sequencias completas do gene S1 depositadas no Genbank entre

os anos de 1937 e 2013, no total, foram utilizadas 1518 sequencias, o que

resultou na definição de 6 genótipos distintos (G-I a G-VI) que abrangem 32

linhagens virais e um número de recombinantes entre elas (VALASTRO et al.,

2016).

26

Figura 5. Diferenças entre as regiões do gene S1 que são utilizadas para o sequenciamento em diversas posições do genoma de IBV realizada por diferentes estudos

Fonte: (DE WITT; COOK; VAN DER, 2010)

O vírus da bronquite infecciosa apresenta um amplo e variado tropismo,

e as manifestações clinicas da doença podem ser diversas, o principal sitio de

replicação do vírus são as células do sistema respiratório, embora o vírus

também apresente capacidade de replicação em outros tecidos tais como o trato

respiratório, trato renal, trato urogenital e trato intestinal (LIMA, 2007; Di FABIO;

BUITRAGO, 2009). No Brasil, o VBI foi detectado em plantéis de poedeiras a

partir de amostras do trato gastrointestinal (METTIFOGO et al., 2014).

Diversos fatores integram a patogenia das doenças causadas pelos

coronavírus, fatores intrínsecos como a idade e genética, sendo relatada uma

maior ocorrência das cepas entéricas em animais jovens, no entanto, cepas

respiratórias podem afetar aves de todas as idades, porém animais jovens

apresentam sintomatologia mais grave. Fatores extrínsecos como nutrição e

27

fatores ambientais também estão relacionados a patogenia, sendo observado o

aumento da mortalidade em aves com nefrite associada com o vírus da bronquite

infecciosa que recebem altas doses de proteína em sua dieta, o estresse por frio

também agrava a doença respiratória nas aves (BRYAN, 2009).

O diagnóstico de campo é apenas presuntivo com base na história clínica,

lesões, disseminação e evolução rápida em torno de 2 a 3 dias. Há dois tipos de

diagnóstico, o direto, em que se deve isolar o agente causal, e indireto pela

soroconversão específica do vírus da bronquite infecciosa ou aumento do título

de anticorpos (CUBILLOS, 2009). O diagnóstico deve incluir, se possível, a

identificação do sorotipo ou genótipo do vírus, devido à grande variação

antigênica exibido pelas diferentes estirpes de VBI e disponibilidade de vacinas

destinadas a diferentes sorotipos (CAVANAGH; GELB JR., 2008).

O teste de RT-PCR é realizado diretamente a partir do material de

galinhas infectadas ou após amplificação preliminar do vírus em ovos

embrionados. O RT-PCR é suficientemente sensível para detectar o RNA viral a

partir de suabes cloacais e de traqueia. Dito isto, pode-se obter um resultado

positivo de PCR que não é suficiente para diagnóstico e para confirmação as

sequências do produto do PCR, devem ser comparadas com as sequências

correspondentes as estirpes da vacina utilizada naquele plantel (CAVANAGH;

GELB JR., 2008).

Os métodos de genotipagem por RT-PCR substituíram em grande parte

as técnicas de HI e SN para a determinação da identidade de uma estirpe. A

base molecular de variação antigênica tem sido investigada, geralmente por

sequenciação de nucleotídeos do gene que codifica para a proteína S, ou mais

especificamente, a subunidade S1 da proteína S, onde a maior parte dos

epítopos aos quais os anticorpos neutralizantes são encontrados (KANT, 1992).

As vantagens dos métodos de genotipagem incluem um tempo de resposta

rápido e mais importante quando comparada aos testes de SN e HI, e a

capacidade de detectar uma grande variedade de genótipos. A passagem em

ovos embrionados pode ser necessária para aumentar o título viral antes da

análise por RT-PCR (CAVANAGH; GELB JR., 2008).

O teste de RT-PCR específico para o gene S1 pode ser usado para

identificar isolados de campo como genótipos de IBV utilizando primers

universais e genótipos específicos a partir das estirpes mais comuns. Primers

28

específicos do gene S1 para os genótipos Massachusetts, Connecticut,

Arkansas, JMK e DE/072/92 têm sido desenvolvidos (KEELER et al., 1998).

O controle dessa doença é baseado principalmente em vacinação embora

muitas falhas ocorram devido às altas taxas de recombinações desses vírus,

dificultando a (JACKWOOD; HALL; HANDEL, 2012).

O controle da bronquite infecciosa das galinhas obtido através da

utilização de vacinas vivas atenuadas ou inativadas. As vacinas vivas atenuadas

são obtidas após passagens seriadas do vírus de campos em ovos embrionados

livres de patógenos específicos conhecidos como SPF (sigla, em inglês, Specific

Pathogen Free) ou em cultivos celulares, à medida que são realizadas estas

passagens, o vírus fica mais adaptado ao ovo embrionado/cultivo celular, mas

perde patogenicidade para a ave, ou seja, mantém a capacidade de replicação

nos tecidos das aves em menor grau que o vírus de campo sem causar a doença,

esta replicação é necessária para induzir uma maior resposta imunitária das

aves. Geralmente são utilizadas para prevenir e controlar infecções em frangos

de corte e servir como primo vacinação de poedeiras comerciais e reprodutoras

(DI FABIO; BUITRAGO, 2009).

É necessário lembrar que as vacinas vivas atenuadas devem se replicar

na mucosa traqueal, portanto verifica-se uma situação crítica, pois vacinas muito

atenuadas não conferem proteção aos animais e vacinas pouco atenuadas

podem causar a doença. As vias de aplicação de vacinas vivas atenuadas são

instilação ocular, aspersão, intranasal ou por água de bebida (CUBILLOS, 2009).

Vacinas inativadas não possuem capacidade de replicação, de modo que a

administração é realizada individualmente. Essas vacinas comumente são

utilizadas em aves previamente imunizadas com vacinas vivas antes da postura

com o intuito de induzir a produção de anticorpos a níveis elevados, uniformes e

de longa duração que serão transmitidos à progênie (CAVANAGH; NAQI, 2003).

O grau e duração de proteção das aves imunizadas são dependentes de

diversos fatores, tais como, a idade em que as aves foram vacinadas, os níveis

de imunidade materna, a capacidade imunogênica da vacina utilizada, via de

aplicação, virulência da estirpe que representará o desafio de campo, intervalo

entre a vacinação e o desafio, assim como a imunocompetência do hospedeiro

(DE WITT; COOK; VAN DER, 2010). Vacinas vivas atenuadas como a H120 têm

sido utilizadas com sucesso nos últimos cinquenta anos, provavelmente pelo fato

29

de resultarem em uma proteção excelente quando desafiadas a sorotipos

homólogos, no entanto, sua eficácia tem sido questionada devido ao surgimento

de novos sorotipos heterológos. O “H” representa Huyben, nome do proprietário

da granja onde o vírus foi isolado pela primeira vez e os números correspondem

às passagens em ovos SPF (BIJLENGA et al., 2004). Vacinas de origem

holandesas sintetizadas a partir de amostras Massachussets são as mais

difundidas, uma vez que, estirpes de campo do sorotipo Massachussets

possuem distribuição mundial e continuam sendo relatadas (CAVANAGH; NAQI,

2003).

No Brasil, surtos de VBI em planteis vacinados são frequentes e

geralmente são causados por sorotipos diferentes do sorotipo Massachussets, o

único utilizado para vacinação no país (VILLARREAL et al., 2007). Atualmente o

programa de controle de VBI no Brasil é ineficiente, pois é baseado somente na

vacinação monovalente com o sorotipo Massachussets, enquanto, claramente

outros sorotipos circulam pelo país, e surtos frequentes continuam a ser

relatados (VILLARREAL et al., 2007; COLVERO et al., 2015).

Medidas de manejo como aplicação de sistemas como “tudo dentro e tudo

fora” (all in – all out), desinfecção de galpões e incubadoras com produtos de

amplo efeito residual e com períodos de descanso prolongado, amostragem de

ambiente dos galpões podem auxiliar no controle e prevenção da bronquite

infecciosa. Devem-se observar também as aves, principalmente no início do

inverno, os sinais respiratórios das aves e os tipos de lesões apresentadas nas

aves mortas, realizando o isolamento do vírus rapidamente, especialmente após

aparição de sinais clínicos. O ideal é utilizar aves sentinelas, vacinadas contra

os sorotipos predominantes na região, a fim de tentar isolar genótipos diferentes

(CUBILLOS, 2009).

30

2 JUSTIFICATIVA

O Brasil é o maior exportador de carne de frango do mundo, ocupa

também a posição de terceiro maior produtor ficando atrás apenas dos Estados

Unidos e da China, sua produção tem uma expectativa de crescimento de 5%

para o próximo ano, com um incremento na produção estimado em 4,8 milhões

de toneladas. No Brasil, a avicultura emprega aproximadamente 3,6 milhões de

pessoas, direta e indiretamente, e responde por aproximadamente 1,5% do

Produto Interno Bruto (PIB) nacional. A importância social também pode ser

observada no interior do país, principalmente nos estados do Sul e Sudeste,

onde a produção de frangos é a principal atividade econômica (UBABEF, 2015).

Além disso, o consumo de carne de frango no ano 2014 foi de 42,7kg de carne

por habitante, um volume extremamente elevado e que tende a aumentar, uma

vez que esse consumo no ano de 2000 era de apenas 29,9kg por habitante

(UBABEF, 2015). Neste cenário, a sanidade dos plantéis avícolas brasileiros

deve ser monitorada devido a sua importância econômica e da segurança

alimentar alcançada nos últimos anos (MONTASSIER, 2010). Em um estudo

recente foi demonstrado que o VBI causa um grande impacto econômico em

aves de produção, custo que pode chegar a US$ 251.4/ 1000 aves, no Brasil,

ressaltando a importância do controle desta enfermidade (COLVERO et al.,

2015). Em relação a esta sanidade, as doenças respiratórias estão associadas

na avicultura a grandes perdas econômicas em todo o mundo, sendo as

enfermidades virais reconhecidas como o maior desafio da avicultura moderna.

Dessa forma, a manutenção da sanidade avícola dos plantéis comerciais

é imprescindível, tendo em vista a relevância da avicultura para a economia

brasileira. Portanto, o presente estudo se revelou de grande importância para a

compreensão dos coronavírus circulantes em aves silvestres no Brasil.

31

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Identificação de coronavírus aviários em aves de cativeiro com potencial

repercussão sanitária, e que permitam o direcionamento de medidas e/ou ações

que visem preservar o status sanitário vigente.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

a) Investigar a presença de coronavírus aviários em amostras de aves de

cativeiro utilizando testes moleculares

b) Analisar filogeneticamente as amostras identificadas buscando avaliar as

relações filogenéticas com estirpes circulantes na natureza e/ou em criações

comerciais;

c) Depositar as informações geradas em bancos de dados e constituir um banco

de amostras de vírus circulantes que possam contribuir para o entendimento

da epidemiologia destas infecções e para a sua profilaxia em criações

comerciais.

32

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 COLETA DE AMOSTRAS

No total o projeto utilizou 300 amostras, no qual 232 amostras foram

coletadas em estudos prévios e 68 pelo presente estudo. As coletas dos estudos

anteriores foram realizadas nos seguintes locais: Parque Ecológico Municipal de

Americana “Eng. Cid Almeida Franco” localizado no município de Americana/SP,

Casa das aves localizada no Município de Pirassununga/SP, Bosque dos

Jequitibás localizado no município de Campinas/SP e no C.R.A.S do Parque

Ecológico do Tietê localizado no Município de São Paulo/SP, com autorização

da CEUA (CEUA-FZEA-USP nº 2012.1.170.74.0 e CEUA-FMVZ 5201050214) e

ICMBio (SISBIO nº3475-1).

As 68 amostras coletadas na Associação Mata Ciliar, localizada no

município de Jundiaí/SP, foram realizadas pelo presente estudo com autorização

da CEUA (CEUA-FMVZ-USP nº 2309251114) e ICMBio (SISBIO nº 3475-1).

O total de 300 amostras é compreendido por 147 (49%) suabes

orofaringeanos e 153 (51%) suabes cloacais. As 148 amostras de Anseriformes

coletadas na Casa das Aves de Pirassununga/SP foram agrupadas em forma de

pools, preparados com amostras de até 5 animais (SPACKMAN et al., 2013),

alocados no mesmo recinto, da mesma espécie, sexo, tipo de suabe resultando

em um total de 40 pools, sendo 20 de suabes orofaringeanos e 20 de suabes

cloacais. As outras 152 amostras foram armazenadas individualmente.

4.2 AMOSTRAS PADRÃO

Para padronização do teste foi utilizada a vacina para bronquite infecciosa

(Bio-Bronk Vet (H120), Laboratório Biovet S/A, Vargem Grande Paulista). Como

controle de especificidade, foram utilizados os vírus da doença de Newcastle

(NDV) (New-Vacin LaSota), Laboratório Biovet S/A, Vargem Grande Paulista),

33

metapneumovírus aviário subtipo A (Poulvac TRT, Zoetis Industria de Produtos

Veterinários Ltda., Campinas), subtipo B (Nemovac, Merial Saúde Animal Ltda.,

Paulínia).

4.3 PURIFICAÇÃO DO RNA VIRAL

Os RNAs virais dos suabes coletados foram extraídos com o kit QIAmp

Viral RNA Mini (Cat# 52906 – Qiagen) conforme as instruções do fabricante.

4.4 AMPLIFICAÇÃO POR RRT-PCR

A reação de RRT-PCR para a detecção do gene UTR do VBI foi baseada

em sondas marcadas com fluorescência FAM. As sequências dos

oligonucleotídeos e sondas foram baseadas em estudos anteriores (CALLISON

et al., 2006). As sequências e o gene alvo estão descritos no quadro 1. A reação

de RRT-PCR foi realizada com o Kit Taqman® Fast vírus 1-Step Master Mix

(Cat# 4444432 – Life Technologies, Foster City) com volume total de 20µl,

contendo 5µl do master mix, 10µl RT-PCR Grade Water, 1µl de cada

oligonucleotídeo (senso e anti-senso), 0,5µl da sonda e 2,5µl de amostra. As

reações foram realizadas com um ciclo de 5 minutos a 50°C para transcrição

reversa, seguido por 1 ciclo de 20 segundos a 95°C para inativação da enzima

RT e ativação da enzima Taq polimerase. Após essa etapa, foram efetuados 50

ciclos: 15 segundos a 95°C (denaturação) e 1 minuto a 60°C (detecção e

anelamento). As reações foram realizadas no termociclador Roche Light Cycler

480II (Roche, Alemanha).

4.5 AMPLIFICAÇÃO POR RT-PCR

34

As reações de RT-PCR e nested-PCR para a detecção do gene S1 do

VBI para posterior caracterização foram realizadas baseadas em

oligonucleotideos descritos em estudos anteriores, o tamanho dos fragmentos

esperados eram respectivamente 572bp e 530bp (BOCHKOV et al., 2007).

As reações de RT-PCR foram realizadas utilizando o Kit SuperScript™ III

One-Step RT-PCR System with Platinum™ Taq High Fidelity DNA Polymerase

(Invitrogen ®) com volume total de 25µl, contendo 12,5µl do Reaction Mix, 5,5µl

de água ultrapura, 1µl de SuperScript™ III/Platinum™ Taq High Fidelity Enzyme

Mix, 0,5µl de cada oligonucleotideo a 20µM (senso e antissenso), 2µl de MgSO4

(5mM), 0,5µl de RNAseout e 2,5µl de amostra. As reações foram realizadas com

um ciclo de 30 minutos a 50°C para transcrição reversa, seguido por 1 ciclo de

5 minutos a 95°C para inativação da enzima RT e ativação da enzima Taq

polimerase. Após essa etapa, foram efetuados 40 ciclos: 1 minuto a 95°C

(denaturação), 1 minuto a 60°C (anelamento) e 1 minuto 72°C (extensão),

seguido de 1 ciclo adicional de 72°C por 7 minutos para extensão final.

As reações de nested-PCR foram realizadas utilizando o kit Invitrogen™

Platinum™ Taq DNA Polymerase (Cat# número) com volume total de 50µl,

contendo 35,8µl de água ultrapura, 5µl de 10X PCR buffer, 2µl de MgCl2 (50mM),

1µl de dNTP mix (10mM), 1µl de cada oligonucleotideo a 10µM (senso e

antissenso), 0,2µl de Platinum™ Taq DNA Polymerase e 4µl do template de DNA

da reação de RT-PCR. Estas reações foram realizadas com um ciclo de 95°C

por 5 minutos, seguido por 40 ciclos: 95°C por 1 minuto, 55°C por 1 minuto e

72°C por 1 minuto e um ciclo para extensão final de 72°C por 7 minutos.

As reações de RT-PCR e nested-PCR foram realizadas no termociclador

C100 Touch™ Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

Os produtos da PCR foram visualizados pela luz ultravioleta (UV) após a

eletroforese em gel agarose 1,5% contendo o corante SYBR safe (Life

Technologies, Carlsbad, EUA) em tampão Tris-borato (pH 8.0) com marcador de

peso molecular de 100pb (Amresco).

4.6 VALIDAÇÃO DOS TESTES

35

Para a validação dos testes de RT-PCR em tempo real (RRT-PCR), foi

utilizada a vacina para bronquite infecciosa (Bio-Bronk Vet (H120), Laboratório

Biovet S/A, Vargem Grande Paulista). Inicialmente, a vacina foi ressuspendida

em 300µl de água ultrapura, em seguida foi realizada a purificação do ácido

nucléicos. Após a purificação, foram realizadas diluições seriadas na base 10 do

RNA extraído em água ultrapura das concentrações de 6ng/µl a 6 x 10-10 ng/µl.

A concentração da diluição 100 foi quantificada no espectofotômetro DeNovix

DS-11 (DeNovix Inc). A eficiência obtida foi de 1,983 e o slope -3.363. O limite

de detecção foi encontrado na diluição de 10-9 (6ag/µl) no ciclo 36.92. Para

calcular o ponto de corte da reação Ct (Cycle Threshold) foi utilizada a fórmula

Ct = Média do ciclo da última diluição detectável + (3 x desvio padrão), que foi

foi calculado em Ct = 40.94. A especificidade dos testes foi determinada

utilizando outros vírus respiratórios, como vírus da doença de Newcastle,

metapneumovírus aviário. Conforme esperado, somente a amostra padrão de

bronquite infecciosa foi amplificada.

Quadro 1. Oligonucleotídeos e sondas utilizados para amplificação do material genético dos testes moleculares

Alvo Nome Sequência Referência

Gene UTR

(IBV) IBV5GU391 5’-GCTTTTGAGCCTAGCGTT-3’

(CALISSON et al. 2006)

IBV5’GP 5’-FAM-CACCACCAGAACCTGTCACCTC-BHQ-3’

IBV5GL533 5’-GCCATGTTGTCACTGTCTATTG-3’

GENE S

(IBV)

S7 Fw 5’-TACTACTACCAGAGTGC(C/T)TT-3’

(BOCHKOV et al., 2007)

S6 Ver 5’-ACATC(T/A)TGTGCGGTGCCATT-3’

S9 Fw 5’-GATGGTTGGCATTT(A/G)CA(C/T)GG-3’

S5 Ver 5’-GTGCCATTGACAAAATAAGC-3’

Fonte: Simão, 2017.

4.7. SEQUENCIAMENTO DOS FRAGMENTOS AMPLIFICADOS

Os fragmentos que fossem amplificados por uma RT-PCR convencional

e seriam submetidos ao sequenciamento parcial do gene S1 a partir de amostras

positivas para VBI, com oligonucleotídeos específicos previamente descritos

(BOCHKOV et al., 2007). As reações de sequenciamento seriam realizadas em

triplicatas para garantir confiabilidade nas sequências geradas. Os fragmentos

de PCR seriam purificados e as amostras e oligonucleotídeos enviados ao

36

Centro de Estudos do Genoma Humano da Universidade de São Paulo,

conforme recomendações do Setor de Sequenciamento de DNA.

4.8 ISOLAMENTO DE AMOSTRAS POSITIVAS EM OVOS SPF

Algumas amostras detectadas pelo teste específico de RRT-PCR para

VBI (Quadro 2) foram inoculadas em ovos embrionados de galinha SPF com 9

dias de incubação para tentativa de isolamento viral (OIE, 2014). Para tanto,

100uL foram inoculados pela via alantóide e os ovos foram monitorados

diariamente durante 7 dias. Ao final dos sete dias ou com a identificação de

mortalidade, o líquido alantóite foi coletado e estocado em freezer -80oC para

análises posteriores (RRT-PCR específicos).

Quadro 2. Amostras inoculadas em ovos SPF Código da Amostra Espécie Tipo de Suabe

AMC02T Aratinga leucophtalma Orofaringeano

AMC03C Aratinga leucophtalma Cloacal

AMC09T Megascops choliba Orofaringeano

AMC28T Falco sparverius Orofaringeano

AMC28C Falco sparverius Cloacal

AMC33T Amazona aestiva Orofaringeano

CA02T Aix galericulata Orofaringeano



CA04C Aix galericulata Cloacal




CA09T Aix sponsa Orofaringeano





CA18T Chenonetta jubata Orofaringeano

A01T Aix galericulata Orofaringeano

A18C Aratinga leucophtalma Cloacal

A20T Aratinga leucophtalma Orofaringeano



A24T Aratinga leucophtalma Orofaringeano

A31T Ara chloropterus Orofaringeano

A32C Ara chloropterus Cloacal


37

4.9 PRÉ-TRATAMENTO DAS AMOSTRAS PARA O SEQUENCIAMENTO

NGS

Duas amostras positivas pelo RRT-PCR foram selecionadas para a

realização do NGS. Uma das amostras (CA11T – 4ª passagem), proveniente de

um pool de amostras de suabes orofarigenanos da espécie Aix galericulata, era

positiva para os vírus da bronquite infecciosa e o vírus de Newcastle. A outra

amostra (ganso OP – 2ª passagem) selecionada se tratava de um suabe

orofaringeano coletado de uma ave (Anser anser) positiva para o vírus da doença

de Newcastle. As amostras foram pré-tratadas independentemente, para evitar

possível contaminação conforme protocolo descrito previamente em outro

estudo (VAN BORM et al., 2016). O pré-tratamento foi dividido em duas etapas

de purificação, uma física e outra química. Na primeira etapa, as amostras foram

centrifugadas por 2 minutos a 8000g a 4°C, após, o sobrenadante foi filtrado em

filtros de 0,45µM. Na segunda etapa as amostras foram submetidas a um

tratamento com nuclease, usando o kit Turbo DNase (Ambion): 100µl da amostra

filtrada, Turbo DNase (50U) e tampão 10X (1X) e depois incubadas por 1 hora a

37°C. Após o pré-tratamento das amostras, foi realizada a extração de RNA com

o reagente TRIzol (Ambion – Life Technologies) para o rompimento das células

seguido de 5 minutos de incubação em temperatura ambiente. Após, foi

acrescido clorofórmio para ocorrer a separação das camadas orgânica, interfase

e aquosa (RNA presente), seguido de outra incubação por 5 minutos em

temperatura ambiente. Depois de uma centrifugação por 15 minutos a 12.000g

a 4°C, a fase aquosa contendo o RNA, foi coletada e prosseguiu-se com os

passos de uma extração de RNA regular usando o kit QIAmp RNA Mini (Qiagen).

Os RNAs após esta etapa foram quantificados pelo espectrofotômetro DeNovix

DS-11 (DeNovix Inc) e pelo fluorímetro Qubit (Invitrogen).

4.10 PREPARO DAS BIBLIOTECAS

38

A síntese de cDNA foi realizada a partir dos RNAs quantificados no item

anterior com o kit SuperScript IV First-Strand cDNA Synthesis (Invitrogen,

Carlsbad, EUA). A síntese do cDNA em dsDNA foi realizada utilizando o kit

mRNA second strand synthesis (New England Biolabs, EUA). As bibliotecas

foram preparadas com o kit NEXtera XT sample preparation (Illumina, EUA) e

marcadas com os adaptadores do kit NEXtera XT index. Para avaliar a qualidade

das bibliotecas, foi realizada a quantificação das bibliotecas preparadas com o

kit SYBR FAST qPCR Master Mix (Kapa, USA) e DNA de referência para a

quantificação). Foi realizado o preparo de um pool com todas as bibliotecas na

concentração de 4nM e as bibliotecas foram denaturadas com o kit v3 600 ciclos

(Illumina, EUA) com a concentração de 20pM para sequenciamento no

equipamento MiSeq (Illumina, EUA). O sequenciamento foi realizado no

Hemocentro, Ribeirão Preto.

4.11 ANÁLISE DE DADOS E ANÁLISE FILOGENÉTICA

Os arquivos FASTQ foram submetidos ao programa Geneious (versão

10.0.6) para o mapeamento sobre a amostra de referência (AY.31651) e

obtenção das sequências consenso (KEARSE et al., 2012). As sequências foram

alinhadas utilizando o programa Bioedit Sequence Alignment Editor versão

7.1.11 (HALL, 1999) e manipuladas utilizando o programa Clustal W

(THOMPSON; HIGGINS; GIBSON, 1994) no programa MEGA versão 6.0

(TAMURA et al., 2013) e a similaridade das sequências foram comparadas com

sequências depositadas no GenBank descritras nos Quadro 4 e 5.

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=

BlastSearch&LINK_LOC=blasthome). As análises filogenéticas foram realizadas

de acordo com o método Maximum Likelihood como implementado pelo

programa Tree finder (OKINO et al., 2014) e MEGA 6.0 (TAMURA et al., 2013).

As árvores consenso foi inferidas com 1000 replicas (FELSENSTEIN, 1985). As

árvores foram editadas no programa FigTree v1.4.2.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome

39

Quadro 3. Número de acesso das amostras utilizadas para análise filogenética da amostra CA11T

Número de Acesso Nome da Amostra

DQ834384.1 Infectious bronchitis virus strain M41

NC001451.1 Avian infectious bronchitis virus

DQ646405.2 Infectious bronchitis virus isolate TW2575/98

KT203557.1 Infectious bronchitis virus isolate B17

AY514485.1 Infectious bronchitis virus serotype California 99

EU817497.1 Infectious bronchitis virus strain H52

EU525388.1 Infectious bronchitis virus strain A2

KR231009.1 Infectious bronchitis virus strain B1648

JF732903.1 Infectious bronchitis virus strain Sczy3

GU393338.1 Infectious bronchitis virus serotype JMK

GU393337.1 Infectious bronchitis virus serotype Iowa 97

GU393336.1 Infectious bronchitis virus serotype Holte

GU393335.1 Infectious bronchitis virus serotype H120

GU393334.1 Infectious bronchitis virus serotype Gray

GU393333.1 Infectious bronchitis virus serotype FL18288

GU393332.1 Infectious bronchitis virus serotype Delaware 072

KF460437.1 Infectious bronchitis virus isolate VicS-v



Quadro 4. Número de acesso das amostras utilizadas para análise filogenética da amostra GANSO OP

Número de Acesso Nome da Amostra


KX258195.1 Avian coronavirus isolate 23/2013

GU393337.1 Infectious bronchitis virus serotype Iowa97

GU393336.1 Infectious bronchitis virus serotype Holte

FJ904715.1 Infectious bronchitis virus strain Cal557 2003

DQ490206.1 Infectious bronchitis virus strain N1-62

GU393338.1 Infectious bronchitis virus serotype JMK

GU393334.1 Infectious bronchitis virus serotype Gray

DQ490215.1 Infectious bronchitis virus strain V2-02

KF377577.1 Infectious bronchitis virus strain 4/91 vaccine

FN430415.1 Infectious bronchitis virus NGA/A116E7/2006

KF696629.1 Infectious bronchitis virus strain Connecticut vaccine

FJ904719.1 Infectious bronchitis virus strain Conn46_1991

DQ160004.1 Pigeon coronavirus strain PSH050513

KR608272.1 Infectious bronchitis virus isolate LDT3-A

GQ504721.2 Infectious bronchitis virus strain Arkansas Vaccine

DQ646405.2 Infectious bronchitis virus isolate TW2575/98

AY646283.1 Avian infectious bronchitis virus partridge/GD/S14/2003

EU359649.1 Infectious bronchitis virus strain ArkDPI-derived commercial vaccine C


5 RESULTADOS

40

5.1 DETECÇÃO DAS AMOSTRAS

O total de 300 amostras testadas é formado por 147 (49%) suabes

orofaringeanos e 153 (51%) de suabes cloacais, coletados de aves pertencentes

a ordens dos Anseriformes (158/52,67%), Psittaciformes (84/28%), Strigiformes

(36/12%), Piciformes (16/5,34%), Falconiformes (4/1,33%) e Cariamiformes

(2/0,66%). No total, 27 amostras foram positivas, sendo algumas em forma de

pool e outras em forma individual, para o teste de RRT-PCR para VBI. Das

amostras detectadas, 13 pools (36,07%) das amostras de Anseriformes, 10

(11,94%) de Psittaciformes, 1 (2,77%) de Strigiformes, 2 (50%) de

Falconiformes. Os animais das ordens Piciformes e Cariamiformes não

apresentaram resultados positivos. Os resultados obtidos pelo teste de RRT-

PCR das amostras positivas para VBI estão descritos detalhadamente no quadro

3.

Quadro 5. Amostras positivas no RRT-PCR para VBI separadas por Ordem animal

Ordem Espécie Tipo de Suabe Ct Local de Coleta

Anseriformes

Aix galericulata Orofaringeano 37.80 PE

Aix galericulata Orofaringeano 32.43 CA *

Aix galericulata Orofaringeano 34.69 CA*


Aix galericulata Cloacal 34.65 CA*








Aix sponsa Orofaringeano 36.04 CA*

Chenonetta jubata Cloacal 38.95 CA*

Psittaciformes

Aratinga leucophtalma Orofaringeano 36.60 PE


Aratinga leucophtalma Cloacal 35.89 PE

Aratinga leucophtalma Cloacal 36.67 PE


Aratinga leucophtalma Orofaringeano 37.98 AMC

41

Aratinga leucophtalma Cloacal 36.13 AMC

Amazona aestiva Orofaringeano 34.76 AMC

Ara chloropterus Orofaringeano 38.24 PE

Ara chloropterus Cloacal 37.49 PE

Strigiformes Megascops choliba Orofaringeano 37.32 AMC

Falconiformes Falco sparverius Orofaringeano 37.99 AMC

Falco sparverius Cloacal 34.88 AMC


*= Amostras testadas em forma de pools. Ct: Cycle Threshold. Local de Coleta: (PE) Pq. Ecológico Eng. Cid Almeida Franco, (CA) Casa das Aves e (AMC) Associação Mata-Ciliar.

As amostras positivas no RRT-PCR foram testadas no RT-PCR

convencional, no entanto, provavelmente pela baixa carga viral presente nestas

amostras, não foi observada amplificação do material genético (Figura 6).

42

Figura 6. Gel de agarose 1,5% das amostras positivas pelo teste específico de RRT-PCR para

detecção de VBI foram testadas pelo teste RT-PCR convencional


A1 – Marcador, 2 – Controle negativo, 3 – Controle positivo, 4 – AMC 9T, 5 – AMC 28T, 6 – AMC 28C, 7 – AMC 33T, 8 – CA14T, 9 – CA02T, 10 – CA09T.; B) 1 – Marcador, 2 – Controle positivo, 3 – Controle negativo, 4 – CA02T, 5 – CA09T, 6 – CA11T.; C) 1 – Marcador, 2 – Controle positivo, 3 – Controle negativo, 4 – A01T, 5 – A18C, 6 – A20T, 7 – A20TII, 8 – A20C, 9 – A23C, 10 – A24T, 11 – A31T, 12 – A32C.

5.2 SEQUENCIAMENTO DAS AMOSTRAS

A amostra CA11T foi selecionada e submetida para o sequenciamento

NGS, esta amostra era positiva para VBI e NDV nos testes de RRT-PCR. Uma

43

outra amostra de um ganso, Ganso OP (Anser anser) positiva para NDV,

também foi submetida ao NGS, e surpreendentemente foi detectado o VBI.

Ambas as amostras apresentaram coinfecção com os vírus de VBI e NDV.

A amostra CA11T apresentou 1.353.162 leituras, que foram mapeadas

em cima da sequência de referência AY.31651, para a tentativa de montagem

do genoma do VBI, o resultado obtido a partir do programa GENEIOUS

apresentou 69 leituras, correspondentes ao VBI.

A amostra Ganso OP apresentou 1.640.612 leituras, que também foram

mapeadas utilizando a sequência AY.31651 como referência, com um resultado

final de 31.419 leituras correspondentes ao VBI.

5.3 ANÁLISE FILOGENÉTICA

Para a análise filogenética da amostra CA11T (Figura 7A), foi utilizado o

fragmento de 492bp correspondente à região entre os nucleotídeos 13781-

14273 do gene RdRp (ZHANG et al., 2010). Esta amostra de Aix galericulata,

não vacinado, apresentou identidade de 99% na região do gene RdRp com as

sequências H120 (GU393335.1), Delaware 072 (GU393332.1) e B17

(KT203557.1).

44

Figura 7. Análise Filogenética das amostras CA11T e Ganso OP pelo método Maximum Likelihood

A. Amostra CA11T nomeada de IBV/Aix galericulada/Brazil/Pirassununga/2016/CA11T●.Análise

filogenética inferida utilizando o método de máxima verossimilhança e bootstrap de 1000 réplicas, baseado no modelo de Tamura-nei. A árvore com maior probabilidade de log (-1747.0335) é mostrada. A porcentagem de árvores nas quais as amostras se agrupam é mostrada ao lado dos

45

ramos. As árvores iniciais para a pesquisa heurística foram obtidas automaticamente aplicando algoritmos Neighboir-Join e BioNJ a uma matriz de distâncias emparelhadas estimadas usando a abordagem de Máxima Probabilidade Composta (MCL) e selecionando a topologia com o valor de verossimilhança logaritmica superior. A análise envolveu 18 sequências de nucleotideos. Houve um total de 492 posições no conjunto final de dados. As analises foram feitas utilizando o MEGA7. B.

Amostra ganso OP nomeada como IBV/Anser anser/Brazil/Jundia-SP/2016/ganso OP ● destacada

em vermelho. Análise filogenética inferida utilizando o método de máxima verossimilhança e bootstrap de 1000 réplicas, baseado no modelo de Tamura-nei. A árvore com maior probabilidade de log (-4797.8585) é mostrada. A porcentagem de árvores nas quais as amostras se agrupam é mostrada ao lado dos ramos. As árvores iniciais para a pesquisa heurística foram obtidas automaticamente aplicando algoritmos Neighbor-Joining e BioNJ a uma matriz de distâncias emparelhadas estimadas usando a abordagem de Máxima Probabilidade Composta (MCL) e selecionando a topologia com o valor de verossimilhança logaritmica superior. A análise envolveu 20 sequências de nucleotideos. Houve um total de 873 posições no conjunto final de dados. As análises foram feitas utilizando o MEGA7.

A análise filogenética da amostra Ganso OP (Figura 7B) foi realizada

utilizando 873 nt do fragmento entre a posição de 21.476nt a 22.349nt

correspondente ao gene S2 do VBI (ZHANG et al., 2010). Esta amostra

apresentou identidade de 100% na região do gene S2 com a sequência 23/2013

(BRANDAO et al., 2016).

6 DISCUSSÃO

O VBI é conhecido como um vírus de rápida dispersão e que acomete

rapidamente aves que não foram imunizadas (DE WITT; COOK; VAN DER,

2010). Este vírus apresenta uma grande gama de estirpes geneticamente

distintas, o que torna o seu controle desafiador (CAVANAGH, 2007).

De acordo com a literatura, o teste de RRT-PCR para o gene UTR de IBV

é um teste extremamente sensível e especifico para a detecção do VBI e pode

ser utilizado como uma rápida ferramenta para detecção e diferenciação de

outros patógenos respiratórios possivelmente envolvidos em surtos (CALLISON

et al., 2006). Nossos resultados demonstram um grande número de amostras

positivas para o VBI no teste de RRT-PCR em amostras de diversas origens

como centros de triagem, zoológicos e criatórios comerciais, o que nos mostra

que o vírus continua circulando. No entanto, a detecção pelo RT-PCR não foi

possível, mesmo após consecutivas passagens em ovos embrionados,

46

provavelmente devido à baixa carga viral presente nestas amostras. A dinâmica

de excreção viral em aves silvestres demonstra que a frequência de eliminação

dos vírus pode variar entre diferentes as diferentes espécies, recentemente um

estudo realizado com Influenza Aviária de Baixa Patogenicidade (LPAI) indica

que a eliminação dos vírus ocorre de maneira variável. Interessantemente,

também foi observado que a amostra H7N3 apresentava baixa infectividade,

talvez pela baixa adaptação aos ovos embrionados e permissividade do

hospedeiro frente a amostra (COSTA et al., 2011).

Durante muitos anos acreditou-se que o único hospedeiro do VBI fosse o

Gallus gallus, no entanto, diversos trabalhos têm detectado a presença destes

vírus em aves silvestres de vida livre e de cativeiro (CAVANAGH et al., 2002).

Nas últimas décadas os coronavírus aviários foram detectados em aves de

diversas ordens como Anseriformes, Charadriiformes, Galliformes,

Columbiformes, Passeriformes, Pelacaniformes, Ciconiiformes e Pssitaciformes

(JONASSEN et al., 2005; CULVER; BRITTON; CAVANAGH, 2008; HUGHES et

al., 2009; MURADRASOLI et al., 2009; DOMANSKA-BLICHARZ et al., 2010;

FELIPPE et al., 2010; TARNAGDA et al., 2011). Nossos resultados

demonstraram amostras positivas oriundas de quatro ordens, Anseriformes,

Psittaciformes, Strigiformes e Falconiformes, e um total de 8 espécies diferentes.

Nossos resultados reiteram a circulação de coronavírus aviários em aves

silvestres.

A presença do VBI foi detectada principalmente em suabes

orofaringeanos, o que demonstra que o vírus foi detectado principalmente na

cavidade oral destas aves. A replicação do VBI ocorre principalmente em células

epiteliais do trato respiratório superior, inicialmente nas células ciliadas da

traqueia, e por este motivo, as partículas virais podem ser encontradas com

maior facilidade em amostras em amostras coletadas do trato respiratório

(DHINAKAR; JONES, 1997). Outro fator que pode ter influenciado na dificuldade

de detecção e isolamento do VBI em amostras de suabes cloacais pode estar

relacionada ao fato de que amostras cloacais podem apresentar uma grande

quantidade de fatores de inibição de PCR, e que a quantidade e tipo de inibidor

encontrado em amostras de aves silvestres pode variar de acordo com a dieta,

habitat e localização geográfica (DAS et al., 2009).

47

O comércio ilegal de aves silvestres não apresenta risco somente no

âmbito de conservação das espécies, mas também um risco de disseminação

de diversos patógenos, que podem resultar em surtos de enfermidades que

geram grandes perdas econômicas ou doenças com potencial zoonótico

(KARESH et al., 2005). A amostra proveniente de um exemplar da espécie

Amazona aestiva, positiva para o teste de RRT-PCR para VBI, foi coletada de

uma ave apreendida por fiscais da polícia ambiental em um local onde outras

aves estavam armazenadas e seriam posteriormente comercializadas no

mercado ilegal. Nossos achados corroboram com o fato de que o comércio ilegal

de aves se tornou um potencial meio de disseminação de patógenos. Vale

ressaltar que o comércio ilegal de animais silvestres mundial cresceu muito nos

últimos anos e é considerado o segundo maior mercado ilegal, que movimenta

quantias entre 5-20 bilhões de dólares anualmente, ficando atrás apenas do

mercado ilegal de drogas (WYLER; SHEIKH, 2008).

Interessantemente, amostras coletadas de aves comercializadas como

aves ornamentais também foram positivas para o VBI. A amostra CA11T,

apresentou alta identidade com amostras reconhecidas como potenciais

receptoras de recombinações adquiridas horizontalmente, neste estudo também

foi demonstrado que as recombinações ocorrem por todo genoma do VBI (THOR

et al., 2011). Esta amostra também apresentou alta identidade com uma amostra

isolada de aves de produção na Índia (KIRUBAHARAN et al., 2015) o que levanta

a questão sobre como a imunização com vacinas atenuadas é realizada

atualmente, uma vez que claramente, estirpes vacinais recombinadas com

amostras de campo estão circulando em aves silvestres e de produção.

A amostra Ganso OP, apresentou alta identidade com isolados de aves

de produção (BRANDAO et al., 2016), embora não haja informações sobre a

vacinação desta aves. O gene S2 é conservado nos coronavírus, principalmente

quando comparado com o gene S1, onde estão localizadas as três regiões

hipervariáveis (CAVANAGH et al., 1992; KANT, 1992). Em ambas amostras

sequenciadas, não houve cobertura da subunidade S1 do gene S, sendo esta a

principal região utilizada para a caracterização dos VBI (VALASTRO et al., 2016).

Possivelmente por este motivo observou-se baixa diversidade quando

comparada a outras amostras.

48

O sequenciamento NGS, se mostrou uma ótima ferramenta para o

sequenciamento de amostras, mesmo que com baixa carga viral, uma vez que,

foi possível sequenciar alguns fragmentos do VBI de amostras positivas no RRT-

PCR, mas que não eram detectadas no RT-PCR. Atualmente o NGS tem aberto

novos horizontes para o sequenciamento de material genético, no entanto, seu

alto custo é um fator limitante para alguns laboratórios (RADFORD et al., 2012).

Com a aplicação do sequenciamento de alto desempenho também

conseguimos detectar a presença de mais de um vírus nestas amostras. A

detecção de mais de um vírus em amostras de aves silvestres foi descrita

anteriormente em Anseriformes, no qual algumas aves apresentaram co-

infecção com dois ou até três vírus com os vírus da doença de Newcastle, vírus

da bronquite infecciosa e/ou vírus da influenza aviária (WILLE et al., 2015). Estas

co-infecções podem afetar a dinâmica de replicação destes vírus, assim como a

resposta imune gerada pelo hospedeiro frente a infecção com vírus com

características distintas (FRANCA et al., 2014).

49

7 CONCLUSÕES

O presente estudo demonstrou a presença do VBI em aves silvestres de

cativeiro por meio da detecção molecular com RRT-PCR. As amostras

detectadas pelo RRT-PCR possuíam baixa carga viral e mesmo após

consecutivas passagens não foi possível realizar o sequenciamento sanger. As

amostras sequenciadas pelo método de alto desempenho apresentaram alta

similaridade com outras amostras de VBI depositadas no Genbank. A análise

filogenética do gene RdRp de uma das amostras demonstrou uma alta

identidade com a amostra vacinal, em uma ave que não foi imunizada, o que

levanta a hipótese de que eventos de spillover de estirpes vacinais ocorrem e

podem estar relacionados com a disseminação do VBI. A amostra Ganso OP

apresentou alta identidade com uma amostra detectada em uma ave de

produção, o que demonstra que estirpes vacinais utilizadas na imunização

destas aves circulam em aves silvestres e de produção de subsistência. Ambas

amostras apresentaram co-infecção com os vírus da doença de Newcastle

(NDV) e vírus da bronquite infecciosa (VBI). O sequenciamento de alto

desempenho (NGS) demonstrou ser uma ótima ferramenta para detecção de

mais de um vírus em uma amostra. Novos estudos deverão ser realizados afim

do sequenciamento completo do gene S1 destas amostras para a caracterização

do genótipo envolvido.

50

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