Determinação de diversos compostos em bebidas por cromatografia de alta

eficiência (HPLC)

Simões, Filipa; Moreira, Filipe; Lobo, Gerson

Licenciatura em Bioquímica, Bioquímica Experimental I, Turma nº2, Grupo nº4,

DQB/FCUL, Campo Grande Ed. C8, 1749-016 Lisboa)

ResumoCom este trabalho experimental pretendeu-se identificar a presença de

diversos compostos (benzoato de sódio, sacarina e cafeína) em três amostras de

bebidas, nomeadamente chá, café e coca-cola. Para isso, recorreu-se à técnica de

cromatografia de alta eficiência, também conhecida por HPLC, sendo também

possível, recorrendo ao método do padrão externo, a determinação do teor em

cafeína.

A partir da cromatografia utilizada detectou-se a presença de sacarina e

cafeína na coca-cola; de cafeína no chá e de cafeína na amostra de café. A única

amostra padrão que não foi possível identificar por comparação dos tempos de

retenção foi o benzoato de sódio.

Quanto à determinação da concentração de cafeína em cada uma das amostras

analisadas, recorreu-se à análise quantitativa, que teve em conta as diferentes

diluições a diferentes concentrações. Construiu-se assim uma curva de calibração da

área do pico em função da concentração dessas soluções - método do padrão

externo. Método este usado para calcular o teor de cafeína em cada bebida. Verificou-

se pois que a ordem pela qual a bebida que apresenta o maior teor em cafeína é o

café (0,29 mg/mL), seguida da coca-cola (0,146 mg/mL) e finalmente do chá (0,813

mg/mL), obtendo-se valores ligeiramente inferiores aos tabelados, possivelmente

devido às diferenças intrínsecas às diferentes marcas de cada produto analisado.

Introdução

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) consiste numa fase móvel

(normalmente constituída por uma mistura de solventes) que transportam a amostra

em análise através de uma coluna cromatográfica, a interacção entre os analitos em

estudo e a coluna determinam a forma como a separação dos vários analitos ocorre.

Depois de feita a separação a fase móvel conduz os analitos ate um detector que é

1

normalmente UV/Vis embora detectores diferentes como os de índice de refracção

possam ser utilizados.

Existem vários factores que influenciam a análise por HPLC, no entanto os

mais importantes são a composição da fase móvel e o tipo de coluna (factores como a

temperatura, fluxo e modo gradiente ou isocrático, são utilizados na fase de

optimização de método cromatográfico).

As primeiras colunas cromatográficas eram constituídas por partícula de sílica

que podiam ou não ser revestidas por diferentes compostos para lhe conferirem

diferentes capacidades separativas. Hoje em dia estas colunas são ainda as mais

utilizadas, no entanto já existem no mercado colunas de base polimérica e que são

utilizadas em gamas de pH mais extremas onde não é possível utilizar sílica.

As colunas podem classificar-se em dois grupos: as de fase reversa (C8, C18),

falando-se em cromatografia de fase reversa, e as colunas de fase normal (sílica,

NH2), falamos então de cromatografia de fase normal.

As colunas de fase reversa utilizam-se para separar compostos neutros e a

fase da coluna é hidrofóbica. Solventes como o acetonitrilo, o metanol e as soluções

tampão são usadas como fase móvel.

As colunas de fase normal utilizam-se para amostras em que o analito é

hidrofóbico sendo a fase estacionária polar e usando para a fase móvel solventes

como o n-hexano, n-heptano ou isopropanol.

Os dois principais mecanismos de separação desta técnica são a interacção

composto-coluna e a velocidade a que esta interacção ocorre.

Em fase reversa a interacção ocorre entre os grupos funcionais que revestem a

fase estacionária da coluna (normalmente grupos octilsilano – C8 e octadecilsileno –

C18).

A velocidade a que este mecanismo ocorre tem a ver com a composição da

fase móvel. Fases móveis com grande quantidade de meio aquoso produzem

cromatogramas com tempos de retenção mais elevados. Se aumentarmos a

concentração de solvente orgânico reduz-se o tempo de análise. Factores como o pH

da fase móvel poderão também ter que ser considerados para alguma separação

cromatográfica.

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Em fase normal quando se esta em presença de colunas polares e eluentes

apolares os mecanismos que se estabelecem para a separação cromatográfica

baseiam-se na capacidade de se estabelecerem mecanismos de adsorção.

A tabela seguinte mostra por que razão compostos como a acetona, DMF e

DMSO não são utilizados em fases móveis. Os seus cutoff situam-se numa zona de

máximo de absorvência de um grande número de compostos. Já a agua e o

acetonitrilo, com máximo a 200 e 190 respectivamente, situam-se numa zona do

espectro onde um número muito reduzido de substâncias possui absorvência.

Tabela 1- Absorvância dos solventes

Solvente UV (nm) Cutoff @ 1AU

Ácido acético 230

Acetona 330

Acetonitrilo (ACN) 190

Dimetilformamida (DMF) 268

Dimetilsulfóxido (DMSO) 268

Dioxano 215

Etanol (EtOH) 210

Metanol (MeOH) 205

N-propanol 210

Iso-Propanol (IPA) 210

Tetrahidrofurano (THF) 215

Agua (H2O) 210

3

Parte experimental

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Pesou-se 1 mg de sacarina, de aspartame e de benzoato de sódio para balões de 5 mL e aferiu-se com eluente

Pesou-se 25 mg de cafeína para um balão de 100 mL e afereiu-se

com a fase móvel

Peprarou-se 5 padrões de cafeína diluindo 1,5,10 e 20 mL em balões de 25 mL.

Aferiu-se com o eluente

Mediu-se 1 mL de café para um balão de 50 mL e aferiu-se com o

eluente

Usou-se um saco de chá em 500 mL de

água fervente. Mediu-se 4 mL para um balão de 20 mL e aferiu-se

com o eluente

Mediu-se entre 10 a 15 mL de pepsi para um gobelet e usou-se o

ultra-sons para desgaseificar a bebida

Após a desgazeificação mediu-se 8 mL para um

balão de 20 mL e aferiu-se com o eluente

Filtraram-se as amostras sob pressão

com um filtro de membrana

Tratamento de dados

Tempos de Retenção

Tabela 2: Tempos de retenção das amostras padrão

Amostras Padrão Diluição Tempo de Retenção (min)

Benzoato de Sódio - 15,88

Sacarina - 4,12

Cafeína 1 1/25 11,60

Cafeína 2 2/25 11,78

Cafeína 3 5/25 11,75

Cafeína 4 10/25 11,75

Cafeína 5 20/25 11,67

Como se prepararam várias amostras padrão de cafeína, torna-se necessário

calcular o valor médio do tr deste padrão, sendo ele dado por:

t rmédio=15×∑i=1

5

ci=15× (11,60+11,78+11,75+11,75+11,67 )=1

5×58,55=11,71≈12min

É possível identificar os compostos anteriormente enunciados na tabela nas

amostras estudadas (café, coca-cola e chá) por comparação dos tempos de retenção

lidos a partir dos cromatogramas.

No caso da coca-cola, verificou-se que ao maior pico do cromatograma

corresponde um tr (tempo de retenção) de 11,92 min. Por comparação com a tabela 1

conclui-se que a coca-cola é constituída por cafeína. No cromatograma desta bebida é

possível observar um pico menor, com um tr = 4,44 min. Assim, do mesmo modo se

conclui que a sacarina é outro componente da coca-cola.

Para o chá apenas se detectou um pico evidente, com um t r de 11,63 min. Isto

significa que este chá tem cafeína na sua composição, o que é de esperar dado que o

chá usado foi chá preto.

Por fim, no cromatograma da amostra de café são visíveis diferentes picos,

destacando-se um maior ao qual está associado um tr de 11,62 min. Os restantes

picos não têm valores de tempos de retenção que possam ser comparados com a

tabela 1.

5

Note-se que de todos os padrões preparados o benzoato de sódio foi o único

que não foi detectado nas amostras de chá, coca-cola e café, uma vez que nenhum

dos picos presentes nos respectivos cromatogramas tinha a ele associado um valor de

tr igual ou semelhante a 15,88 min.

Observando todos os cromatogramas, presentes em Anexo conclui-se acerca

da sua resolução. Os cromatogramas têm uma boa resolução quando têm uma boa

selectividade e um alargamento de banda pequeno.

Neste caso em particular, verifica-se que todos eles têm um alargamento de

banda pequeno e, no geral, uma boa selectividade. Para o cromatograma da amostra

do café pode ser considerado que a selectividade é relativamente pior, já que os picos

estão próximos, no entanto são perceptíveis, o que permite concluir que se trata de um

cromatograma com uma boa resolução.

Por comparação dos valores de tr de cada constituinte das amostras com o valor

de tr obtido para a cafeína padrão, pode-se aferir que todas as amostras possuem

cafeína na sua constituição, correspondendo esta apenas ao último pico de cada

amostra – tabela 3.

Tabela 3 : Tempos de retenção (tr) e áreas dos picos correspondentes à identificação da cafeína

nos cromatogramas das amostras preparadas a partir de diversas bebidas (chá, café e coca-cola).

Bebid

a

tr/

min

Ápico/

mm2

tr (padrão

de

cafeína)/mi

n

Composto

identificad

o

Café11,6

2

5000000

0

11,72

Cafeína

Chá11,6

38271500 Cafeína

Coca-

Cola

11,9

2

2119700

0Cafeína

Tendo em conta a tabela 3 , observa-se que os tempos de retenção não

coincidem totalmente, podendo esta discrepância dever-se ao erro inerente ao

aparelho de medição.

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Utilizando o método do padrão externo, foi possível determinar a concentração

de cafeína em cada uma das amostras. Construiu-se para tal uma curva de calibração

por regressão linear, através do método dos mínimos quadrados, a partir da

representação gráfica da área dos picos em função da correspondente concentração

de cafeína.

Sabendo que para a solução mãe se diluiram 25,5 mg de cafeína em 100 mL de

eluente, calculou-se a concentração de cafeína presente em cada solução diluída de

padrão de cafeína:

C=mV

C=25,5100

=0,255mg /mL

Sabendo que para a primeira solução se dilui 1mL (Vi) de solução mãe de

cafeína em 25mL (Vf) é possível determinar a concentração da solução preparada.

C iV i=C f V f⇔C f=C iV i

V f⇔C f=

0,255×125

=0,01mg /mL

Procedendo-se de forma análoga para as restantes diluições efectuadas, as

concentrações calculadas são apresentadas na tabela 4.

Tabela 4- concentração das soluções obtidas por diluição da solução mãe de cafeína (0,25mg/mL), e respectivos tempos de retenção (tr) e área do pico.

Diluição V solução mãe[Cafeína] (mg/mL)

TrÁrea do

pico1 1 0,01 11,6 4216100

2 2 0,0211,7

89733400

3 5 0,0511,7

521891000

4 10 0,111,7

527070000

5 15 0,211,6

737968000

De modo a determinar a concentração de cafeína nos 3 compostos analisados

por HPLC, aplicou-se o método do padrão externo, relacionando-se graficamente

(gráfico I) as áreas de cada pico com as concentrações de cafeína conhecidas (tabela

4). Obtém-se pois a curva de calibração representada na figura 1.

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0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.250

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

30000000

35000000

40000000f(x) = 164395232.172471 x + 7681662.35489221R² = 0.891996452303613

Series2Linear (Series2)

[Cafeína] (mg/mL)

Área

do

pico

UA

Figura 1-Curva de calibração referente ao método do padrão externo, obtida por regressão linear atravéss a partir da represCurva de calibrado do padrão externo, obtida porntação gráfica dos resultados

da tabela

Neste caso, confirma-se a existência de linearidade entre as grandezas em

estudo pois o R2 obtido é 0,892 (valor próximo de 1, correspondente às correlações

perfeitas).

Utilizando os valores das áreas dos picos de cafeína de cada amostra,

determinou-se a concentração (x), substituindo-se y pelas áreas obtidas nos

cromatogramas.

y=2×108 x+8×106

⇔x= y−8×106

2×108

No caso da amostra de chá substituímos o valor de y e obtém-se:

C=8271500−8×106

2×108=0,0814mg /mL

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Tabela 5- concentração de cafeína de cada uma das amostras estudadas, em função das respectivas áreas de pico e tempos de retenção.

Amostra [cafeina]/(mg/mL)

café 0,2100

cha 0,0014

coca-cola 0,0660

Como as amostras são preparadas através de diluições é necessário recalcular a

concentração de cafeína nas bebidas em estudo.

Sabendo que

⇔c inicial=c final×V finalV inicial

c inicial×V inicial=c final×V final⇔

E sabendo também que, por exemplo, para o chá foram utilizados 4 mL num

volume final de 20 mL, tiramos que:

c i=0,0014×20

4=0,007mg /mL

Sabendo que esta concentração está contida numa solulção de 500mL,

multiplica-se este volume com a respectiva concentração, para calcular a massa total

de cafeína presente em solução.

mcafeína=0,007×500=3,5mg≈ 0,0035g

Tendo uma massa inicial de 1,5g, torna-se, então, possível calcular o teor real

de cafeína presente no equivalente a uma saqueta de chá.

% teorcafeína=mcafeínamchá

(¿ )% teor cafeína=0,00351,5

=0,2%

Efectuando os mesmos cálculos para as restantes amostras, obtemos o quadro

seguinte.

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Tabela 6 – Concentrações originais de cafeína nas amostras

Amostra[Cafeína]

(mg/mL)

Volume final da

solução (mL)

Volume inicial da

amostra (mL)

[Cafeína] Inicial

(mg/mL)

Teor cafeína

(mgcafeína/gamostra)

Chá 0,0014 20 10 0,007 2,33mg/g=0,2%

Coca-Cola 0,0660 20 8 0,165 0,17mg/g=1,7%

Café 0,2100 50 1 10,5 52,42mg/g=5,2%

Pela observação da tabela 6, verificamos que é o café a bebida que contem

uma maior concentração de cafeína.

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Conclusão

Este trabalho teve como objectivo principal a identificação da presença de

cafeína em amostras tais como café, chá e coca-cola, bem como o seu teor nestas

bebidas.

Após o seu estudo por HPLC, foi realizada uma análisa dos cromatograma

obtidos. Por comparaçao dos tempos de retenção de cada pico obtido com o tempo de

retenção obtido para o padrão de cafeína, verifica-se a existência de um pico a que

corresponde um tr característico da cafeína em todas as amostras, confirmando assim

a sua presença em cada uma das bebidas. Para a sacarina verifica-se a existência de

um pico na coca-cola e para o benzoato de sódio não se verifica qualquer pico nas

três amostras.

Em seguida recorreu-se ao método do padrão externo para determinar o teor de

cafeína de cada amostra de bebida. Para tal, construiu-se uma curva de calibração a

partir da representação gráfica das áreas dos picos em função da concentração de

cafeína (mg/mL). Assim, tendo por base a equação da recta obtida, conhecendo-se as

áreas correspondentes ao pico da cafeína, assim como as diluições efectuadas na

preparação de cada amostra, concluiu-se que a bebida mais concentrada em cafeína

é o café (10,5), seguida da coca-cola (0,165) e finalmente o chá (0,007).

Relativamente ao teor de cafeína presente em cada amostra, verificou-se que o

café apresenta a maior percentagem de cafeína em mgcafeína/gamostra (5,2%).

Apesar de os resultados obtidos serem ligeiramente diferentes dos teóricos,

subestimando a concentração de cafeína, possivelmente por estes valores

dependerem da marca e do modelo do produto testado (podendo se assim explicar a

diferença mais significativa do valor obtido para o chá), foi possível determinar a

ordem relativa esperada de concentração em cafeína das bebidas.

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Bibliografia

Reversed phase HPLC application guide, Macherey-Nagel

Braga Morais, Zilda; Métodos cromatográficos, licenciatura em análises clinicas

e de saúde pública, Escola Superior de Saúde Egas Moniz, 2008-2009

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Anexos

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Figura 1- Cromatograma coca-cola e chá

Figura 2- Cromatografia da sacarina e da cafeína padrão 1

Figura 3- Cromatogramas da cafeína padrão 2 e 3

Figura 4- cromatogramas da cafeína padrão 4 e 5

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