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7/21/2019 Determinación de Clorofila
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLOING. AGROINDUSTRIAL
DETERMINACION DE CLOROFILA
INTRODUCCIÓN
La fotosíntesis es un proceso de suma importancia para la biosfera porque convierte laenergía de la radiación solar en energía química que puede ser usada por todas las
formas de vida. La fotosíntesis comprende dos reacciones globales diferenciadas. En la
primera se realiza la transducción de energía, y en la segunda la reducción y fijación del
carbono. Los pigmentos fotosintéticos son los únicos que tienen la capacidad de
absorber la energía de la luz solar y acerla disponible para el aparato fotosintético. Los
cloroplastos de las plantas superiores contienen siempre varios pigmentos, clorofila a,
clorofila b, algunas !antofilas y carotinas. "odos estos pigmentos son insolubles en agua,pero se disuelven f#cilmente en algunos solventes org#nicos. $dem#s de las clorofilas y
carotenoides, mucas plantas poseen otros pigmentos, tales como antocianos,
flavonoles, etc.
Los Pigmentos biológicos, también conocidos como pigmentos o biocromos son
sustancias producidas por microorganismos que tienen un color resultante de la
absorción selectiva de la luz. Los pigmentos biológicos incluyen pigmentos vegetales y
animales. %ucas estructuras biológicas, como la piel, ojos, plumas y cabello contienenpigmentos como la melanina en las células especializadas llamadas cromatóforos.
Los colores pigmentarios difieren del color estructural ya que los primeros son los
mismos indistintamente del #ngulo de visión mientras que el color estructural es el
resultado de la refle!ión selectiva de la luz o iridiscencia.
PIGMENTOS EN PLANTAS
La función principal de los pigmentos en las plantas es la fotosíntesis, que utiliza la
clorofila, pigmento verde junto con varios pigmentos rojos y amarillos los que ayudan a
captar la mayor cantidad de energía de luz como sea posible. &tras funciones de los
pigmentos en las plantas incluyen la atracción de los insectos a las flores que fomentan
la polinización. Los pigmentos vegetales incluyen una variedad de diferentes tipos de
moléculas, incluyendo porfirinas, carotenoides, antocianinas y betalaínas. "odos los
pigmentos biológicos absorben selectivamente ciertas longitudes de onda de la luz
mientras que reflejan otras. La luz que es absorbida puede ser utilizada por la planta
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para alimentar las reacciones químicas, mientras que las longitudes de onda reflejadas
de la luz determinan el color del pigmento que aparecer# a la vista.
LOS PRINCIPALES PIGMENTOS SON:
La clorofila es el pigmento principal en las plantas' es una clorina que absorbe
longitudes de onda amarillas y azules de la luz mientras que refleja verde. Es la
presencia y abundancia relativa de clorofila la que da a las plantas su color verde.
"odas las plantas terrestres y las algas verdes poseen dos formas de este
pigmento( clorofila a y la clorofila b. Laminarias, diatomeas, y otros organismos
fotosintéticos contienen clorofila c en lugar de b, mientras que las algas rojas sólo
poseen clorofila a. "odas las clorofilas sirven como medio principal que las
plantas utilizan para interceptar la luz con el fin de impulsar la fotosíntesis.
Los carotenoides son de color rojo, naranja o amarillo.
Las antocianinas )literalmente *flor azul*+ son pigmentos flavonoides
idrosolubles que aparecen de color rojo a azul, de acuerdo con el p.
-isponible.
Las betalaínas son pigmentos rojos o amarillos.
METODOS PARA DETERMINAR CLOROFILA
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DETERMINACIÓN CUANTITATIA DE LAS CLOROFILAS
INTRODUCCION
La fotosíntesis, consiste en la reducción de /0 atmosférico por medio de los protones
del agua obtenidos con la energía proveniente del sol. $sí la planta almacena energía
electromagnética como energía potencial en los compuestos org#nicos.
Los compuestos carbonados ricos en energía, obtenidos de esta manera, son usados
después como fuente de energía por la propia planta y por otros organismos que son
incapaces de fabricar sus propios alimentos, pero que si pueden aprovecar
la materia vegetal.
El organismo vegetal a desarrollado un sistema para capturar un fotón de luz y utilizar
la energía para elevar el nivel energético de un electrón determinado que
posteriormente regresa a su nivel basal' cuando esto sucede, el e!ceso de energía es
liberada en diferentes formas.
Los organismos fotosintéticos atrapan la luz solar formando $"1 y 2$-, que utilizancomo fuente de energía para formar lúcidos y otros componentes org#nicos a partir de
bió!ido de carbono y agua de forma simult#nea liberan o!igeno molecular. El bió!ido de
carbono formado en la respiración de los eterótrofos regresa a la atmósfera para volver
a ser utilizado por los organismos fotosintéticos. -e este modo la energía solar
proporciona la fuerza motriz para la circulación continua del bió!ido de carbono y
o!igeno molecular atmosféricos a través de la biosfera y proporciona los substratos
reducidos )combustible+.
La evolución de la vida vegetal a logrado a través de mecanismos bioquímicos, desviar
del retorno del electrón a su nivel primitivo y utilizar el e!ceso de energía para
sintetizar carboidratos. Las plantas superiores contienen también un complemento de
enzima, semejante a los de la levadura, que son capaces de convertir
la glucosa en alcool etílico y bió!ido de carbono. Esta conversión, se produce cuando
las plantas est#n privadas de o!ígeno.
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1ermanecen vivas durante periodos variables de tiempo que dependen del tipo de
planta, el grado de crecimiento. Etc.
En estas condiciones invariablemente producen bió!ido de carbono y forma alcooletílico en sus tejidos. 3n gran número de productos intermedios o fragmentos
carboidratos se producen en el proceso principal de o!idación )respiración aeróbica+
de la glucosa a bió!ido de carbono y agua, en el proceso
alternativo, fermentación alcoólica )respiración anaerobia+.
La capacidad de capturar el fotón y convertir en la energía luminosa en
energía química es propiedad e!clusiva de las plantas verdes.
Las substancias que absorben la energía radiante, que incide en la planta, es la clorofila.
3na molécula de clorofila se compone de una cabeza y una cola. La cabeza contiene
cuatro anillos de carbono nitrógeno unidos formando un anillo mayor en el centro de
este anillo ay un #tomo de magnesio y tiene un pigmento color verde
con estructuras policiclicas planas. La cola es una cadena de carbonos enlazados unidos
a la cabeza.
En todos los casos la fotosíntesis est# asociada con corpúsculos verdes aislados,
llamados cloroplastos, que est#n suspendidos en el citoplasma de la célula. Es posible
romper la célula de la oja en varias fracciones tritur#ndolas con una solución
amortiguadora.
Este tratamiento rompe los cloroplastos en fragmentos m#s peque4os llamados grana.
5e recuperan tres fracciones principales( $+ el citoplasma, una solución transparente de
color café rojizo, 6+los grana sólidos )verde+ y +las paredes celulares mezcladascon células integras.
Los granas, que son todavía capaces de llevar a cabo la fotosíntesis contienen, referido al
residuo seco apro!imadamente, el 7/8 de proteínas, 9:8 de lípidos, el ;8
de minerales y el :8 de pigmento verde llamado clorofila. Esta molécula de pigmento se
encuentra incluida en la unidad estructural fotosintética llamada cuantosoma que
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corresponde a una parte del tilacoide. Los pigmentos m#s importantes que
absorben luz en las membranas de los tilacoides son las clorotila.
$dem#s en el cloroplasto de las plantas superiores, ay otros grupos de pigmentos que
son los carotenoides y de las !antótilas. La clorofila a es de color verde debido a que
absorbe preferentemente la luz roja y azul y transmite la verde. < se distingue de la
clorofila 6 ya que esta tiene un grupo 9.
O!"ETIO
alcular la cantidad de clorofila que se encuentra en una determinada porción de
e!tracto por una determinación cuantitativa.
MATERIALES
= %ortero
= Embudo de 6ucner
= %atraz de filtración
= %atraz aforado de :/ mil
1robeta de =// ml
>aso de precipitados de 0//ml.
"ubos de ensayo
= 1ipeta de :ml.
= Embudo
1ipeta 1asteur, mecero, tripie y rejilla
Espectrofotómetro y celdas
0 -iscos de papel filtro
?radilla
= gr de ojas frescas de espinacas.
$rena
REACTIOS
$cetona al @/8 )vAv+
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METODOLOGIA
=.B oloque en el mortero = g de ojas de espinacas, sin las venas grandes, cortadas en
peque4os tama4os.
0.B$gregue arena y 7 ml de acetona al mortero, para moler el tejido y obtener una pasta
fina. $dicione 0/ml m#s de acetona.
9.B"ransfiera cuidadosamente el e!tracto resultante al embudo de 6ucner provisto de
papel filtro, y filtre al vacío.
7.B $gregue otros :/ml de acetona a la pulpa de las ojas y reanude la molienda y el
filtrado. Este segundo e!tracto agréguelo al primero. El tejido debe de quedar sinclorofila, de lo contrario repita el proceso con otros 0/ml de acetona y reúna todos los
filtrados.
:.B Lave el mortero y el embudo con :/ml de acetona que se incorporara al filtrado. En
todo el proceso no debe de usar m#s de =//ml de acetona se aconseja aforar a :/ml en
un matraz.
C.B Lea la densidad óptica )-+ a C7:. C:0.CC9 nm del e!tracto. 3sando como blanco el
acetona. $nota las densidades medidas.
DISCUSIÓN
La fotosíntesis es un proceso que transforma en carbono org#nico el gas carbónico
tomado del aire o disuelto en el agua. En el proceso interviene un pigmento,
la clo#o$il%, que es una sustancia capaz de absorber las radiaciones luminosas. Esta
captación de energía luminosa se realiza en una primera etapa en la fotosíntesis, en la
cual se produce energía química en forma de moléculas de adenosintrifosfato )$"1+ y se
desprende o!ígeno, que produce de la escisión de una molécula de agua. En una
segunda etapa, que se denomina fase obscura porque puede tener lugar en ausencia de
luz, el dió!ido de carbono se combina con una pentosa para formar glucosa a través de
una serie de reacciones químicas. La clorofila absorbe sobre todo la luz roja, violeta y
azul, y refleja la verde.
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La luz roja es la de mayor eficacia para la fotosíntesis, ya que el espectro de absorción de
la clorofila es m#s amplio en la zona del rojo. En cambio la luz verde carece
de acción sobre este proceso.
Lo anterior nos e!plica porque cuando llev#bamos la solución de clorofila a la luz del sol
esta cambiaba a un color rojo.
abe mencionar que no todas las soluciones obtenidas en la pr#ctica por los dem#s
equipos tenían la misma tonalidad de verde, esto es porque no todas las ojas de
espinacas tenían la misma frescura, esto es que entre m#s frescas se encuentren las
ojas mayor contenido de clorofila.
CONCLUSIÓN
5abemos que la clorofila es un factor importante en la fotosíntesis y que es capaz deabsorber la energía luminosa y gracias a ello puede promover la serie de reacciones que
conducen al almacenamiento de dica energía en un compuesto de alto poder calórico.
La luz roja es la de mayor eficacia para la fotosíntesis, ya que el espectro de absorción de
la clorofila es m#s amplio en la zona del rojo. En cambio la luz verde carece de
activación sobre este proceso.
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EFECTO TIEMPOS & PROCESOS DE COCCIÓN EN EL CONTENIDO DECLOROFILA DE ARIOS EGETALES
INTRODUCCION
El propósito del presente trabajo, fue evaluar la posible pérdida de este pigmento
presente naturalmente el los vegetales de oja verde por efecto de diferentes tiempos y
procesos de cocción mediante la técnica colorimétrica de ?oodDin. Los resultados
mostraron que el mayor contenido de clorofila total así como el de sus componentes y
F se presenta en la espinaca al registrarse valores de C0.;@, 7G.C@ y 0/.@9 mgAg
respectivamente. El salteado fue el proceso de cocción que mejor conserva el contenido
de clorofila en los vegetales de oja verde. ombinando tiempos y procesos, los valores
de clorofila total m#s altos se presentaron en espinaca procesada al vapor.
MATERIALES
5e adquirieron muestras de acelga, espinaca, verdolaga y berro directamente del súper
mercado, se separó la l#mina foliar libre de nervaduras de cada vegetal y se sometieron alos diferentes procesos y tiempo de cocción.
METODO
'() C*%nti$ic%ción +e clo#o$il% ,- . / tot%l %celg%s- es0in%c%s- 1e#+ol%g%s /
be##os- cocin%+os % 1%0o# % '-2 / 3 min*tos(
5e tomó una muestra de material vegetal fresco.
5e cocinó a vapor a =// H durante =, 9 y : minutos para cada tratamientorespectivamente, utilizando una estufa con control de temperatura.
$l finalizar el tiempo establecido se pasaron inmediatamente a un ba4o con agua
elada por 9/ segundos para cortar la cocción. 5e colocaron sobre papel secante para eliminar el e!ceso de líquido. 5e determinaron clorofila , F y total.
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4() An5lisis +el conteni+o +e clo#o$il% ,- . / tot%l %celg%s- es0in%c%s-
1e#+ol%g%s / be##os- cocin%+os me+i%nte s%lte%+o % '-2 / 3 min*tos(
5e tomó una muestra de material vegetal fresco. 5e cocinó mediante salteado en una planca eléctrica con control de temperatura,
durante =, 9 y : minutos a 0// H para cada tratamiento respectivamente. $l finalizar el tiempo establecido se pasaron inmediatamente a un ba4o en agua
elada por 9/ segundos para cortar la cocción. 5e colocaron sobre papel secante para eliminar el e!ceso de agua. 5e determinó clorofila , F y total.
2() Dete#min%ción +e l% c%nti+%+ +e clo#o$il% ,- . / tot%l en %celg%s-es0in%c%s- 1e#+ol%g%s / be##os- coci+os me+i%nte el 6e#1i+o % '-2 / 3
min*tos(
5e tomó una muestra de material vegetal fresco. 5e cocinó en agua irviendo durante =, 9 y : minutos para cada tratamiento
respectivamente. $l finalizar el tiempo establecido se pasaron inmediatamente a un ba4o con agua
elada por 9/ segundos para cortar la cocción. 5e colocaron sobre papel secante para eliminar el e!ceso de líquido. 5e determinaron clorofila , F y total.
7() Dete#min%ción +el conteni+o +e clo#o$il% ,- . / tot%l en %celg%s-
es0in%c%s- be##os- / 1e#+ol%g%s me+i%nte l% t8cnic% +e Goo+9in(
5e pesó por triplicado /.: g de cada una de las muestras sometidas a los
diferentes procesos de cocción y se maceraron en una solución de acetonaBagua al
@/8 vAv.
El e!tracto obtenido se pasó a través de un embudo bucner con papel filtro Iatman 2o. =.
El filtrado se aforo a =/ mL con la misma solución. 5e leyó absorbancia en un espectrofotómetro 5EJ3&K$B"32E CG/ a una
longitud de onda de C7@ y CC9 nm.
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La cuantificación de clorofila , F y total se realizó de acuerdo a las siguientes
ecuaciones.
mgg 0eso $#esco +e CLOROFILA TOTAL ; <4=(4> <A ?7@> <@(=4> <A ??2>
mgg 0eso $#esco +e CLOROFILA , ; <'4(B> <A ??2> <4(?> <A ?7@>mgg 0eso $#esco +e CLOROFILA . ; <44(> <A ?7@> ) <7(?@> <A ??2>
A; Abso#b%nci% % ?7@ / ??2 nm segn co##es0on+%(
RESULTADOS & DISCUSIÓN
La comparación múltiple de medias entre las muestras y los diferentes procesos
aplicados nos demuestra que los valores de clorofila total m#s altos se presentan en
espinaca procesada al vapor registrando C;.:@ mgAg cifra que es estadísticamente
diferente a la obtenida con los otros procesos. 1or el contrario en berro y verdolaga el
valor m#s alto se presentó con el proceso de salteado obteniéndose C0.C0 mgAg y 0@.@G
mgAg respectivamente, siendo estos contenidos diferentes estadísticamente a los valores
obtenidos en vapor y ervido, un estudio de las pérdidas de clorofila durante el
escaldado y el secado de oMra realizado por 5ivare et al. )0///+, reportó que el
método de escaldado influye m#s que la temperatura de secado en la misma. $simismo,
5cmalMo y $lzamora )0//=+ estudiaron la pérdida de color y clorofilas en el
procesamiento industrial de ojas de yerba mate encontrando que el @/8 de la pérdida
de las clorofilas tenía lugar en el ervido, mientras que con cocción seca se tenía una
pérdida menor )=/8+. El calor úmedo ace que la clorofila se pierda mayormente que
el calor seco, figura =.
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La comparación de medias para cada una de las muestras en relación al tiempo de
aplicación de los diferentes procesos nos demuestra que en acelga y verdolaga el mayor
contenido de clorofila se presenta en el control con C;.C/ mgAg y 09.@@ mgAg cifras
estadísticamente diferentes a las obtenidas en el resto de los tiempos. 1or el contrario enespinaca y berro la mayor cantidad de clorofila se presenta a los : minutos con C;.=G
mgAg en espinaca y C/.0C en berro' lo cual concuerda con el estudio realizado por
$med et al., )0//0+, en el cual concluye que el color de las espinacas, oja de mostaza y
el puré de ambas ojas, definitivamente se fue degradando durante el proceso térmico,
siendo mayormente afectado el puré. El comportamiento general de estos resultados se
presenta en la Nigura 0.
En la tabla = se presentan los resultados obtenidos al analizar la interacción de procesos
y tiempos para cada una de las muestras. -e acuerdo a estos tenemos que e!isten
diferencias estadísticamente significativas con la formación de al menos dos grupos
estadísticamente diferentes para cada conjunto de datos. En acelga con el proceso de
vapor se forman dos grupos estadísticamente diferentes siendo con el control el valor
mas alto );C.:9 mgAg+ y es el que marca estas diferencias' con el proceso de ervido se
presentan tres grupos estadísticamente por un lado el control con ;;.@C mgAg y por otra
parte los tratamientos de 9 y : minutos con :/./7 mgAg y [email protected] mgAg respectivamente.
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CONCLUSIONES
En conclusión, el mayor contenido de clorofila total así como el de sus componentes y
F se presenta en la espinaca al registrarse valores de C0.;@, 7G.C@ y 0/.@9 mgAg
respectivamente. El salteado fue el proceso de cocción que mejor conserva el contenido
de clorofila en los vegetales de oja verde. El tratamiento de : minutos de cocción,mantuvo la m#!ima concentración de clorofila, siendo ligeramente menor a la cantidad
obtenida en el control. ombinando tiempos y procesos, los valores de clorofila total
m#s altos se presentaron en espinaca procesada al vapor.
!I!LIOGRAFA
AMED- "(- AUR- A(- SIARE- U(- 4==4( olor degradation Minetics
of spinac, mustard leaves, and mi!ed puree. Oournal of Nood 5cience >ol. C;,
2o. 9, 0//0. !REINOLT- (- SCIMERLI- M(- DASHOOD- R(- !AILE&- G(-
'3. %ecanisms of loropyllin $nticarcinogenesis against $flato!in 6=(
omple! Normation Dit te arcinogen. em. es. "o!icol. =GG:, @, :/C P :=7. CERMONOS&- S(- SEGELMAN- A(- PORETS- R(- '( Effect of
dietary cloropyll derivatives on mutagenesis and tumor cell groDt. "eratogen
arcinogen %utagen. =G(9=9B 900.
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DASHOOD- R(- !REINEIT- (- !AILE&- GS(- ''(
emopreventive properties of cloropyll in inibition of aflato!in 6= )$N6=+B
-2$ binding in vivo and antimutagenic activity against $N6= and tDo
eterocyclic amines in te 5almonella mutagenicity assay.arcinogenesis'=0(G9GBG70.
GOODHIN- T(H(- 'B?( emistry and biocemistry of plant pigments. >ol. =
Q 0. $cademic 1ress Knc. 2eD <orM. 3.5.$.. ARTTIG- U(- !AILE&- G(S(- '@( emoprotection by natural cloropylls
in vivo( inibition of dibenzo )a,=+ pyreneB-2$ adducts in rainboD trout liver.
arcinogenesis. >ol. =G, no. ; pp. =909 P =90C. "IMNEJ- M(E(- JAM!RANO- M( L( & AGUILAR- M(R(- 4==7.
Estabilidad de 1igmentos en Nrutas 5ometidas a "ratamiento con Energía de%icroondas. Knformación "ecnológica. >ol. =: 2H 9, pp. C=BCC.
LAHRENCE- C(- M( CIU- CARRIE (- 4==2 . $ntiproliferative effect of
cloropyllin derived from a traditional inese medicine 6omby! mori e!creta
on uman breast cancer %NB; cells. Knternational Oournal of &ncology 09, pp.
;0G P ;9:. MATA- "(E(- JEN &U- GRA&- "(E(- HILLIAMS- D(E(- RODRGUEJ)
PROTEAU- R(- 4==7( Effects of cloropyllin on transport of dibenzo
)a,=+pyrene, 0BaminoB=BmetylBCB penylimidazoBR7,:BbSpyridine, and aflato!in6= across acoB0 cell monolayers. "o!icology =GC, pages ==;B=0:.
TCNICAS ANALTICAS !KSICAS EN FISIOLOGA EGETAL
DETERMINACIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTTICOS
La fotosíntesis, proceso que permite a los vegetales obtener la materia y la energía que
necesitan para desarrollar sus funciones vitales, se lleva a cabo gracias a la presencia en
las ojas y en los tallos jóvenes de pigmentos, capaces de captar la energía lumínica.
Entre los distintos métodos que e!isten para separar y obtener esos pigmentos se
encuentra el de la cromatografía, que es una técnica que permite la separación de las
sustancias de una mezcla y que tienen una afinidad diferente por el disolvente en que se
encuentran. -e tal manera que al introducir una tira de papel en esa mezcla el
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disolvente arrastra con distinta velocidad a los pigmentos según la solubilidad que
tengan y los separa, permitiendo identificarlos perfectamente según su color.
PIGMENTO COLOR lorofila $ e#+e %*l%+olorofila 6 e#+e %m%#illentoarotenos N%#%n%Tantofilas Am%#illo
La técnica que se describe a continuación se puede realizar sin ningún problema.
MATERIALES
ojas de espinaca o de cualquier planta cortadas en porciones. $lcool de GCU )sirve el que utilizamos para desinfectar las eridas+ 3n mortero -os filtros de café 3n embudo 3n vaso 3na pinza de la ropa
PROCEDIMIENTO
5e coloca en el mortero las ojas que se ayan elegido, se a4ade un poco de
alcool y se trituran asta que el alcool adquiera un tinte verde intenso. 5e filtra el líquido utilizando el embudo en el que se a puesto el filtro de café.
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5e recortan unas tiras de papel del otro filtro y se introducen en el vaso asta que
toquen su fondo procurando que se mantengan verticales con la ayuda de la pinza 5e esperan 9/ minutos y aparecer#n en la parte superior de la tira de papel unas
bandas de colores que se4alan a los distintos pigmentos.
OTROS MTODOS
MEDIDA DE PIGMENTOS FOTOSINTTICOS EN DUNANIELLA VIRIDIS
E!tracción de acetona a partir de precipitados y medida espectrofotométrica.
Materiales:
Espectrofotómetro
entrífuga de mesa
"ubos
$cetona
MTODO DE ETRACCIÓN & MEDIDA
=. "omar :ml de muestra y centrifugar durante :min
0. ?uardar sobrenadante para medir fosfato con método verde malaquita
9. esuspender el precipitado en 7ml de acetona para e!traer pigmentos
7. %ezclar y enrasar a :ml con 0& destilada
:. entrifugar =min
C. %edir la absorbancia del sobrenadante resultante
;. 1osibles resultados(
B;:/nm turbidez
BCC7nm m#!imo de absorción de la clorofila $
@. #lculos(
Bpara clorofila $( multiplicar resultados por factor de =/,9 )mg Aml+
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MTODO DE LICTENTALER & HEL!URN <'@2>
MATERIALES
=gr de ojas Vter dietilico risoles Witasato Espectrofotómetro 1erMin Elmer ::/ 5E de doble az 1lacas 1etri Embudo %atraz
PROCEDIMIENTO
=. En un mortero se omogeniza = gr de ojas con éter dietílico en frío.0. El omogeneizado obtenido se filtra a través de un crisol con placa filtrante nU 9
)1obel+, acoplado, mediante una junta de goma, a un embudo con filtro de vidrio
poroso nU 9 )1obel+.9. El conjunto va encajado a su vez, en un Mitasato con un tubo de ensayo sumergido
en ielo, donde se recogió el filtrado.7. 5obre la placa del primer crisol se colocó una capa de celulosa nativa en polvo de
= cm de espesor, para eliminar el agua del e!tracto.
:. $ este sistema se le conecta una corriente de nitrógeno que se adapta medianteun embudo invertido a la boca del crisol.
C. En el interior del Mitasato se realiza vacío para acelerar la filtración y evaporar el
disolvente, con lo que se arrastra el nitrógeno y se crea una atmósfera inerte que
evita la o!idación de los pigmentos.;. El omogeneizado se lava con éter dietílico asta que éste sale incoloro y,
finalmente, se enrasa a un volumen de 0: ml. -urante todo el proceso la muestra
se mantuvo en penumbra y sumergida en ielo, para evitar la destrucción de los
pigmentos fotosintéticos.
$ continuación se midió la absorbancia de la muestra a C//, C77 y CC0 nm en un
espectrofotómetro 1erMin Elmer ::/ 5E de doble az. El contenido en clorofilas se
determinó según las fórmulas(
Cl %( =/, : ! $bs )CC0+ P /,=CC! $bs )C77+
Cl b( =C, 9; ! $bs )C77+ P 9, =7 ! $bs )CC0+
Cl tot%l( =//,: ! $bs )C//+
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Los #es*lt%+os se e0#es%n en mg +e clo#o$il% g#
COMPARACIÓN DE LA ESTIMACIÓN DE LA CLOROFILA)% MEDIANTELOS MTODOS ESPECTROFOTOMTRICO & FLUOROMTRICO
RESUMEN
En cuatro ecosistemas acu#ticos de monta4a del altiplano undiboyacense, olomB bia,
se compararon mediante un an#lisis de regresión los datos de clorofilaBa obteniB dos a
partir de los métodos espectrofotométrico )fórmula tricrom#tica+ y fluorométriB co
)método de Ielscmeyer+. El an#lisis demostró que el método espectrofotométrico
sobreestimó la concentración de clorofilaBa, pero se puede utilizar con precaución en
ambientes de baja trofia. 5e alló una ecuación que permite relacionar las medidas de
clorofilaBa obtenidas con las dos metodologías.
MATERIALES & MTODOS
Las muestras se tomaron en el lago ?uatavita, olombia, )L. ?uatavita+, y en tres umeB
dales del altiplano undiboyacense, olombia, ). Llano ?rande, . 6rice4o y . 5iB
beria+, durante campa4as realizadas entre abril y agosto de 0//9 )"abla =+. El lago de?uatavita est# ubicado en el municipio de 5esquilé, presenta un di#metro de 7// m,
una profundidad m#!ima de 9/ m, es monomíctico, no tiene afluentes ni efluentes suB
perficiales, y la cuenca ace parte de una peque4a reserva forestal.
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L( F( Ll%no F( F(Ubic%ción geog#5$ic% 7H:@X:/XX
2
;9H7;X79XX
I
7H:GX0@XX 2
;7H/CX/CXX I
7H79X7/XX
2
;7H==X7/XX
I
73@Q'7Q
Q N
B23BQ'=Q
Q H M*nici0io 5esquilé "enjo 6rice4o F%c%t%ti1
5
Con+( <S cm)'> G,;
=C8
09,G
==8
=;/,C
08
?3@-?
O4 <mg l)'> C,0 0,; =,7 =-3
NF7 <mol l)'> :,G 77,7 =7;=,G 43=@-
NT <mol l)'> 00,9
8
=;7;,0
=CC8
;C90,/
= 8
2@@2-=
PRS <Rmol l)'> =,= /,0C =:,7 4B-?
Cl( % <mg m)2> =/,C @,= =:=,C '24-4
Fl*o#omet#% 7:8 =778 =0G8 '7@
Cl( % <mg m)2> =0,@ G,G 9;C,= 2?2-2
Es0ect#o$otomet#% 7 '3' 42= 4@=
T%bl% '( 3bicación geogr#fica, valores promedio y coeficiente de variación de las variables físicas, químicas y de la clorofila-a de los ecosistemas acu#ticos estudiados.
NT: nitrógeno total' &0( o!ígeno' N7: amonio disuelto' PRS: fósforo reactivo
soluble' Cl: cloro.
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RESULTADOS
La l.a presentó un promedio de 9/,= mg mB9 con el método fluorométrico y CC,0 mg
mB9 con el método espectrofotométrico. -e las 0// muestras incluidas en el an#lisis,
el ;C8 presentaron registros m#s altos con el método espectrofotométrico. Los valores
obtenidos con el método fluorométrico oscilaron entre /,C y @7:,= mg mB9 y con el
método espectrofotométrico entre /,G y 7=:@,@ mg mB9. Los datos promedio de l.a
para cada ecosistema se presentan en la tabla =. $l establecer la diferencia entre los
datos allados por espectrofotometría y fluorometría, se observaron promedios de la
diferencia m#s bajos para el . Llano ?rande )=,@ mg mB9+ y la L. ?uatavita )0,C mg mB
9+, mientras que en los otros umedales el promedio de la diferencia fue superior a
7/ mg mB9. El porcentaje de diferencia absoluta con respecto al método fluoroB métricofue de CC8 en . 5iberia, 9C8 en . 6rice4o, 0;8 en L. ?uatavita y 008 en
. Llano ?rande. $l calcular el porcentaje del número de muestras cuya medición de
clorofila por el método espectrofotométrico presenta un valor m#s alto )sobreestiB
mación+ o m#s bajo )subestimación+ que el obtenido por el método fluorométrico, se
encontró que en el =//8 de los datos espectrofotométricos de . Llano ?rande soB
brestimaron el valor de clorofila. En L. ?uatavita y . 6rice4o el porcentaje de sobreB
estimación fue apro!imadamente del ;/8, mientras en . 5iberia el porcentaje de
sobreestimación fue igual al de subestimación ):/8+.
Los modelos de regresión lineal simple )con e!cepción del modelo para . 5iberia+,
presentaron relaciones significativas con r Y /,@; )"abla 0+. Los umedales Llano
?rande y 6rice4o presentaron el r m#s alto y el valor m#s bajo se obtuvo con los daB tos
de ?uatavita. El modelo desarrollado con todos los datos presentó un r Z /,G9 )Nig. =+.
uando se e!cluyeron los datos de . 5iberia la correlación del modelo se incrementó )r
Z /,GC+ y la relación de las dos variables se describió mediante la ecuación(
arcoseno )log=/ l.aespectro.+ Z /.=99@ [ /.G=G0 ! arcoseno )log=/ l.afluorom.+
)E.=+
La -5 fue baja y no superó /,= en los modelos significativos. El valor m#s bajo se preB
sentó en el grupo de datos de la L. ?uatavita que no incluyeron las muestras del ipoB
limnio y en el modelo para el . Llano ?rande. El valor m#s alto se presentó en el
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modelo que incluyó los datos de todos los ecosistemas. La m de los modelos significaB
tivos osciló entre /,C9 y =,/7. 3na m Y = solo se presentó en el . 6rice4o )"abla
0+. "abla 0. 1rincipales par#metros obtenidos en modelos de regresión lineal simple
realizados entre la clorofilaBa estimada mediante los métodos espectrofotométrico y
fluorométrico.
G#*0o +e
+%tos
incl*i+os
Coe$iciente
+e
co##el%ción
<#>
Des1i%ció
n
est5n+%#
<DS>
Pen+ie
nte <m>
n
L( G*%t%1it% /,G//\ /,/:0 /,;:/\ '3
G*%t%1it% sin /,@;/\ /,/70 /,C9/\ '4
F( Sibe#i% /,/0/ n.s. /,0C; /,/0/ n.s. '7-
F( !#iceo /,G@/\ /,/CC =,/7/\ '7-
F( Ll%no G#%n+e /,GG/\ /,/7: /,G7/\ '2-
To+os /,G9/\ /,/G; /,@;/\ 4=
To+os sin F( =-?=V =-=3 =-'=V '@
El modelo realizado para establecer en qué concentraciones de nutrientes se cuanB
tifican con mayor e!actitud los valores de l.a estimados espectrofotométricamente
presentó un r Z /,G9 )n Z =;0' -5 Z /,=' p ] /,///=+. $l utilizar el procedimiento
gr#fico con los residuales del modelo y la concentración de nutrientes )Nig. 0+, se
estableció que la dispersión de los datos de l.a fue menor cuando el 27 ]
0///
^mol LB=, el 2" ] =7// ^mol LB= y el 15 ] 0,C ^mol LB=. Es decir, en ambientes
como la L. ?uatavita y el . Llano ?rande, los residuales no superaron dos veces la
-5 del modelo. Estas condiciones de nutrientes ocurrieron cuando la concentración de
l.a fue generalmente ] C/ mg mB9 )este criterio se cumple en todos los casos para el
. Llano ?rande y la L. ?uatavita+.
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DISCUSIÓN
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La sobreestimación de los valores de l.a por el método espectrofotométrico a sido
ampliamente documentada en la literatura )oDan, =G@G+. Los valores de sobreestiB
mación por la aplicación de la fórmula tricrom#tica presentaron diferentes amplitudes,
según la concentración de nutrientes del ecosistema. $ún así, no se puede descartar eluso de este método debido a que en los sistemas que tuvieron baja concentración de
nutrientes, la sobreestimación fue en promedio del 0;8. Este valor es bajo si se compara
con valores Y =//8 descritos por 5artory )=G@:+. Los modelos de regresión mostraron
una tendencia a tener coeficientes de correlación altos y desviaciones est#ndares bajas,
especialmente en sistemas acu#ticos con bajas concentraciones de nutrientes, como es el
caso del . Llano ?rande y de la L. ?uatavita. El an#lisis de los modelos de regresión
indicó que la tendencia de los resultados espectrofotométricos )independientemente de
la sobreestimación+ fue altamente coerente con los datos obtenidos por el método
fluorométrico para el . Llano ?rande, la L. ?uatavita y el
. 6rice4o. En concordancia con estos resultados, el an#lisis de los residuales del
modelo y los valores de nutrientes se4aló que en el . Llano ?rande y la L. ?uatavita la
estimación de l.a fue m#s adecuada. En . 6rice4o algunas de las muestras preB
sentaron valores de clorofila y nutrientes por encima del límite establecido mediante el
an#lisis de los residuales, por lo que la cuantificación por medio del método especBtrofotométrico estuvo posiblemente sesgada en algunos casos.
Los . 5iberia y 6rice4o presentaron una alta mineralización, elevadas concentraB
ciones de nutrientes y bajas concentraciones de o!ígeno debido a la acumulación de
materia org#nica )inferido a partir de la concentración de nutrientes y observaciones de
campo+. En ambientes altamente enriquecidos y productivos como el de . 5ibeB ria, la
acumulación y descomposición de materia org#nica permite el aumento de algunos
pigmentos que pueden interferir con la cuantificación de la l.a. Los feoforB bidos y feofitinas son dos productos comunes de la degradación de la l.a que, al igual que los
carotenoides, podrían interferir fuertemente con su determinación esB
pectrofotométrica )$1$, =GG@+. Estos pigmentos no fueron cuantificados en este
trabajo, y por esta razón solo es posible establecer que e!iste un factor asociado a la alta
concentración de nutrientes que interfiere con el método. 5i bien otros comB ponentes
org#nicos e inorg#nicos pueden ser también los causantes de interferir con el método
espectrofotométrico, el estudio de los pigmentos degradados merece espeB cial atención
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en futuras investigaciones para establecer el papel de tales sustancias en las
determinaciones de la l.a.
En el caso de la L. ?uatavita, la inclusión de los datos del ipolimnio en el modelo inB
crementaron la -5 debido a la mayor dispersión de los datos' no obstante, también se
incrementó la correlación entre los dos métodos porque la amplitud en la estimación de
la variable aumentó. Estos resultados sugieren que para L. ?uatavita el método especB
trofotométrico utilizado puede ser conveniente para describir los patrones verticales de
distribución de la l.a, a pesar de los valores m#s sesgados allados en el ipolimnio.
CONCLUSIONES
Los coeficientes de correlación obtenidos demostraron que los dos métodos preB sentanuna tendencia semejante con el tipo de muestras analizadas, y que el método
espectrofotométrico puede utilizarse con precaución en ecosistemas acu#ticos con baja
concentración de nutrientes. La pendiente de los modelos indica que en estos
ecosistemas el método espectrofotométrico sobreestima la clorofila con respecto al
método fluorométrico. 5in embargo, este método es útil para describir patrones espaB
ciales y temporales, ante la dificultad de utilizar en forma rutinaria metodologías m#s
e!actas pero costosas. El método espectrofotométrico puede utilizarse en sistemasacu#ticos con baja concentración de nutrientes y con concentraciones de clorofilaBa
inferiores a C/ mg mB9.
!I!LIOGRAFA
$1$, $merican 1ublic ealt $ssociation, $merican IaterDorMs, $ssociation
)$II$+, Iater 1ollution ontrol Nederation )I1N+. 5tandard %etods for
E!amination of Iater and 5eDage and IasteDater. 0/a ed. 2eD <orM' =GG@. !ANDERAS A- GONJKLEJ R- LANJA G( Limnological $spects of a igB
%ountain LaMe in %e!ico. ydrobiologia. =GG='007(=B=/. !WRER ( 1roblems in Estimation of 1eopytine. >er Knternat >erein
Limnol. =GG='07(=0:G.
DETERMINACIÓN DE CLOROFILA A & FEOPIGMENTOS RAMÓN ARELA
INTRODUCCIÓN
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La determinación de clorofila a se emplea para estimar la biomasa de los productores
primarios )fitoplancton+ que se encuentran como partículas en suspensión en el agua. El
procedimiento que se describe a continuación cuantifica la concentración de clorofila a y
feopigmentos presentes en una muestra utilizando técnicas fluorométricas. Elprocedimiento sigue los lineamientos propuestos por olmBansen et al. )=GC:+, y los
c#lculos se efectúan como se indican en Lorenzen )=GCC+. Entre las modificaciones se
encuentran el uso de metanol en vez de acetona como un disolvente de e!tracción
debido a su mayor eficiencia )olmBansen y iemann, =G;@+ y el empleo de un
sonificador )Irigt et al., =GG;+. Este método se puede aplicar en todos los rangos de
concentración de clorofila a que se encuentran en el mar. El límite de detección del
método es de /,/= ^g LB= para aguas naturales )muestra de /,: L+. Los resultados se
e!presan en ^g LB= ó mg mB9.
FUNDAMENTOS DEL MTODO
3na muestra de agua de mar se filtra a través de un filtro de fibra de vidrio sobre el cual
se retienen las partículas en suspensión. Entre estas partículas se encuentran
organismos del fitoplancton los cuales poseen pigmentos clorofílicos como clorofila a y
feopigmentos. La e!tracción de estos pigmentos de las células se efectúa usando
metanol como disolvente, y el ultrasonido )sonificación+ se usa para romper el filtro y
las células. Luego de aclarar el e!tracto por centrifugación se coloca en un fluorómetro
donde los pigmentos de las algas se e!citan con luz de longitud de onda azul, emitiendo
fluorescencia con longitud de onda roja. La fluorescencia se detecta por medio de un
fotomultiplicador. 5eguidamente, la muestra se acidifica para convertir toda la clorofila
a en feopigmentos y se mide en el fluorómetro nuevamente.
ADERTENCIAS ANALTICAS
=. La presencia de clorofila b, clorofila c yAo divinil clorofila a en la muestra pueden
acarrear error en la medición. oncentraciones elevadas de clorofila b, especialmente en
la zona del m#!imo de clorofila, interfieren en forma negativa con la clorofila a y
positiva con los feopigmentos )Wnap et al., =GG;+. Esta interferencia es importante si son
abundantes algas pertenecientes a la clase clorofíceas yAo proclorofitas.
0. El límite de detección del equipo se sobrepasa cuando el nivel de los pigmentos en los
e!tractos es muy alto. El fluorómetro siempre se mantiene en su m#!ima sensibilidad'
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por lo tanto, las mediciones tienden a subestimar concentraciones elevadas,
posiblemente por efecto de la e!tinción )_quencing`+. 1ara solventar este problema,
e!isten varias alternativas. 3na alternativa no muy recomendable es diluir la muestra lo
cual aumenta la incertidumbre del método. 5i el filtro se encuentra saturado de materialdespués de la filtración, otra opcion es cortar el filtro en fracciones m#s pequeB 4as y
realizar el an#lisis por separado a cada fracción. La alternativa m#s recomendable en
aguas muy productivas con una concentración elevada de fitoplancton es filtrar un
volumen menor de agua )0:/ mL o menos+ de manera de evitar cortar el filtro o diluir la
muestra.
9. La fluorescencia depende de la temperatura. 1or lo tanto, realizar la calibración del
equipo así como el an#lisis de muestras a una temperatura ambiental constante entre0/B0: H. El coeficiente de temperatura para la fluorescencia de la clorofila es B
/,98AH.
7. La luz intensa puede degradar con rapidez la clorofila. ealizar todo el an#lisis en un
ambiente con luz tenue.
:. "anto el material que se emplea en el an#lisis como el metanol deben permanecer
libres de residuos de #cido.
MATERIALES
Niltros de fibra de vidrio )Iatman grado ?NAN o su equivalente, /,; ^m, 0:
mm+. 3nidad de filtración y bomba de vacío. Embudos para filtros de 0: mm, 0// mL de capacidad. "ubos de centrífuga de polipropileno con tapa, de =: mL. eldas de =9Bmm específicas para el fluorómetro.
1ipetas autom#ticas monocanal con capacidad de 0// y =/// ^L. 1ipetas de : y =/ mL. Esp#tulas peque4as. ?uantes de vinilo.
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EXUIPOS
=. Nluorómetro "urner -esigns )=/B$3B//:+, con fotomultiplicador sensitivo al rojo )
=@:B@;/ nm+, l#mpara N7":Ad, filtro azul ) 97/ P :// nm 5 :BC/+ y filtro rojo ) Y
CC: nm 5 0BC7+.
0. 5onificador, Niser 5cientific modelo =//.
9. entrífuga, / B 9G// r.p.m.
7. 3nidad de filtración y bomba de vacío.
REACTIOS
=. %etanol )9 &+.
0. cido clorídrico )l, /,7@ 2+.
9. 5olución concentrada de clorofila a. 5e emplea una ampolla de solución est#ndar
comercialmente disponible de clorofila a pura )$nacystis nidulans 5igma BC=77, = mg+
libre de clorofila b. -isolver el contenido de una ampolla con cristales de clorofila a en
=: mL de metanol. Los cristales de clorofila se disuelven muy lentamente' por lo tanto,
realizar la dilución dos días antes de la calibración. 3na vez disuelta, mantener estasolución almacenada a B 0/ H.
7. 5olución de trabajo para la calibración. -iluir = mL de la solución concentrada de
clorofila a en 7G mL de metanol. La concentración de esta solución debe ser
apro!imadamente de = ^g LB=. 1ara determinar la concentración precisa, medir la
absorción a cada nanómetro entre CC/ y C;/ nm empleando un espectrofotómetro
recién calibrado y ubicar la longitud de onda con absorción m#!ima )$ma!+.
-eterminar la concentración de clorofila a en la solución aplicando la siguiente formula(
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DONDE:
Am% ; absorción m#!ima )entre CC/ B C;/ nm+. AB3=nm ; absorbancia a ;:/ nm. E ; coeficiente de absorción específica de la clorofila en metanol, ;G,@= gB= cmB=
)Oeffrey y Ielscmeyer, =GG;+. L ; longitud de la celda en cm, =/Bcm.
CAPTACIÓN DE MUESTRAS
=. aptar las muestras de agua en botellas oscuras de polietileno de = L lavando tres
veces con la muestra antes de llenar.
0. Niltrar la muestra inmediatamente a través de filtros de fibra de vidrio. $notar el volumen filtrado. El volumen a filtrar depende de la cantidad de clorofila presente en el
agua, lo cual se puede estimar a través del fluorómetro del "-. 1ara las aguas con
biomasa baja )] = mg mB9+ se filtran :// mL por duplicado. Niltrar 0:/ mL por
triplicado si la biomasa es Y = mg mB9.
9. %antener el nivel de vacío de la bomba entre 7//B :// mm g para no romper las
células.
7. $l finalizar la filtración, sacar el filtro con una pinza plana y doblarlo por la mitad o
enrollarlo con el lado que contiene las partículas acia adentro. Kntroducir el filtro en un
tubo de centrífuga debidamente identificado.
:. ongelar a B 0/ H. ealizar el an#lisis antes de un mes.
ANKLISIS DEL !LANCO
$ntes de realizar el an#lisis de clorofila a es imprescindible evaluar el funcionamiento
del fluorómetro así como la calidad analítica del metanol con un an#lisis del blanco. El
metanol debe estar libre de contaminantes o de algún otro elemento que pueda alterar
los resultados del an#lisis.
=. olocar : mL de metanol con una pipeta limpia en una celda del fluorómetro.
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0. ealizar una lectura en el fluorómetro. 3na lectura mayor de cero indica posible
contaminación del reactivo o un equipo descalibrado' por lo tanto, 2& 5E -E6E realizar
el an#lisis asta calibrar el equipo o cambiar de reactivo.
9. Es conveniente verificar la estabilidad del equipo antes del an#lisis utilizando un
est#ndar sólido suministrado por el fabricante. Este est#ndar se ajusta durante la
calibración.
ANKLISIS DE MUESTRAS
5e recomienda comenzar el an#lisis a partir de las muestras con menor concentración y
terminar con las que posean la mayor concentración )usualmente las superficiales+.
ealizar los duplicados en forma consecutiva. 3sar guantes en todo momento durante elan#lisis y atender las medidas de seguridad para el manejo del metanol.
=. 1reparación de las muestras antes del an#lisis. 5onificación.
a. 5acar los tubos de centrífuga con los filtros del congelador y descongelar a
temperatura ambiente a resguardo de la luz.
b. $gregar a cada tubo =/ mL de metanol puro sin formar burbujas. >erificar que todos
los tubos contengan la misma cantidad del líquido y que el filtro quede totalmentesumergido.
c. omper el filtro dentro del tubo con una pequeB 4a esp#tula para omogenizar la
muestra. Esto favorece la ruptura de las células del fitoplancton e incrementa la
eficiencia de e!tracción del solvente. olocar los tubos en una gradilla cubriéndolos con
papel de aluminio para protegerlos de la luz.
d. Kntroducir la punta del sonificador en el metanol sin tocar el fondo del tubo decentrífuga. La sonda debe estar lo m#s perpendicular posible y no tocar las paredes del
tubo.
e. 1render el sonificador y aumentar gradualmente la potencia asta la posición =:.
f. %antener en esta lectura por 9/ segundos, apagar el equipo y retirar la punta del
sonificador, tapar el tubo de centrífuga y guardarlo protegido de la luz.
g. Entre muestra y muestra, lavar la punta del sonificador con metanol puro y secar.
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. olocar los tubos en una gradilla y almacenar a 7 H )no congelar+ por 07 oras para
permitir que el metanol e!traiga los pigmentos. Es recomendable agitar ligeramente los
tubos tres o cuatro veces durante este periodo.
0. %edición de clorofila a y feopigmentos con el fluorómetro.
Encender el fluorómetro una ora antes de comenzar el an#lisis para permitir que
estabilice.
a. olocar los tubos en una centrifugadora por 9/ minutos a 9/// r.p.m. para clarificar
el e!tracto.
b. "ransferir los tubos a una gradilla y ordenarlos por réplicas, protegiéndolos de la luz.
c. on una pipeta, e!traer cuidadosamente : mL de metanol de la mitad superior del
líquido en el tubo, sin tocar las partículas del filtro ni producir turbulencia y
transvasarlo a la celda del fluoróB metro.
d. olocar la celda en el fluorómetro previamente calibrado, y realizar la lectura una vez
que el equipo estabilice ) @ s+. Esta lectura corresponde a la fluorescencia inicial )No+.
e. $gregar =// ^L de l /,7@ 2 y agitar levemente. Esperar tres minutos como mínimo
para que se complete la reacción.
f. olocar la celda en el fluorómetro y esperar que el equipo estabilice, realizar la lectura
de la muestra acidificada. Esta lectura corresponde a la fluorescencia acidificada )Na+.
g. Entre muestra y muestra, lavar la pipeta y las celdas del fluorómetro un mínimo de
tres veces con metanol puro.
CALI!RACIÓN DEL FLUORÓMETRO
El fluorómetro se calibra, siguiendo las instrucciones del fabricante, cada seis meses con
un est#ndar, comercialmente disponible, de clorofila a pura )$nacystis nidulans 5igma
BC=77, = mg+ libre de clorofila b. ealizar cinco diluciones con la solución de trabajo de
clorofila a para alcanzar concentraciones entre / y =9/ ^g LB= con lo cual se puede
calibrar el equipo para una escala de valores de / a =:/ ^g LB=. 3na vez finalizada la
calibración, medir el est#ndar sólido que suministra el fabricante, y utilizar esta lectura
para verificar la estabilidad del equipo en an#lisis sucesivos. 3na deriva mayor de un
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=/8 indica la necesidad de una nueva calibración. Las mismas diluciones se pueden
emplear para determinar la razón de acidificación m#!ima )+ después de la calibración.
"omar las lecturas de varias diluciones )Noma!+ y acidificar con =// ^L de l /,7@ 2.
%edir las muestras nuevamente en el fluorómetro )Nama!+. es la razón m#!ima defluorescencia, antes y después de acidificar, calculada a partir del est#ndar de clorofila a
pura usada para calibrar el fluorómetro. 1ara el metanol, varía entre 0,7 y 0,;. uando
se utiliza metanol, el valor de es m#s variable que cuando se emplea acetona. La
cantidad de #cido a4adido a la celda debe ser fijo, igual en la calibracion como para las
muestras. 3n incremento peque4o en el volumen produce valores de anómalos.
DONDE:
Fom% ; lectura antes de la acidificación.
F%m% ; fluorescencia acidificada m#!ima.
CKLCULO & EPRESIÓN DE RESULTADOS
La fórmula basada en Lorenzen )=GCC+ empleada para el c#lculo de la concentración de
clorofila a y los feopigmentos en el agua de mar es(
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e ; volumen de metanol )=/ mL+. m ; volumen de muestra filtrada. Fo ; lectura antes de la acidificación. F% ; lectura después de la acidificación.
CUANTIFICACIÓN DE CLOROFILAS
O!"ETIO & DESARROLLO DE LA PRKCTICA
El objetivo de esta parte de la pr#ctica es e!traer los de pigmentos de cloroplastos de un
material vegetal y determinar la cantidad de clorofila contenida en el mismo.
ETRACCIÓN DE PIGMENTOS:
PROTOCOLO ': Et#%cción con %ceton%
E!traer los pigmentos de cloroplastos de /.: g de ojas frescas de espinacas o de
cualquier otro material verde, con : ml de acetona al @/8, disgregando el tejido vegetal
en un mortero, de modo que los pigmentos salgan al e!terior y se disuelvan en acetona.
uando la acetona est# bien verde, el macerado se introduce en un tubo de centrífuga de
pl#stico y se centrífuga a 0/// rpm durante =/ minutos. -espués de centrifugar se
obtiene un sobrenadante verde que contiene los pigmentos. $justar el volumen final a C
ml con acetona al @/8.
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PROTOCOLO 4: Et#%cción con et%nol
E!traer los pigmentos de cloroplastos de /.: g de ojas frescas de espinacas o de
cualquier otro material verde cortando las ojas en segmentos de apro!imadamente /.:
cm que se introducen en un tubo de ensayo con C ml de etanol al @/8 de modo que los
segmentos queden bien sumergidos en el etanol. Kncubar durante 0/ minutos en un
ba4o a @/H para que las clorofilas salgan al e!terior y se disuelvan en el etanol. $l cabo
de este tiempo los segmentos deber#n quedar totalmente decolorados y el etanol queda
de color verde.
MEDIDA DE CLOROFILA:
5e toman /.: ml del sobrenadante de cada uno de los e!tractos y se diluye asta : mlcon acetona al @/8 en la e!tracción con acetona )protocolo =+ y con etanol al @/8 en la
e!tracción con etanol )protocolo 0+. -espués se mide en un espectrofotómetro a
longitudes de onda de C7: y CC9 nm.
1ara calcular las clorofilas totales aplicaremos la siguiente fórmula(
DETERMINACIÓN DE CLOROFILA EN FRUTOS DE CUATRO ARIEDADES
DE CILE <C%0sic*m s0>
RESUMEN
La importancia del cile )apsicum sp.+ es por su amplia distribución, gran diversidad
de tipos de ciles cultivados y silvestres, y los diversos usos que se le da a los frutos. Es
una fuente e!celente de colorantes naturales, vitaminas y minerales que representan
una importante materia prima en la elaboración de alimentos y en la industria. Elobjetivo del presente estudio fue cuantificar el contenido del color e!tractable, clorofila
total, y F, y carotenoides de los grupos rojos )+ y amarillonaranja )$+ en cuatro
variedades de cile )apsicum sp.+. La determinación de carotenos y clorofilas se realizó
por dos métodos de e!tracción y la determinación de color e!tractable por el método
$5"$ 0/B=. El mayor contenido de clorofila total así como el de sus componentes y F se
presentan en la muestra seca de cile cilaca después de 7 de e!tracción. La mayor
concentración de carotenoides totales y grupos carotenoides )+ y )$+ se obtuvo en lamuestra fresca de cile abanero después de una ora de e!tracción. En la variedad
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abanero en muestra fresca se presentó el mayor contenido de unidades $5"$ y en las
muestras secas el mayor contenido de estas se obtuvo en la variedad de cile cilaca.
INTRODUCCIÓN
En %é!ico, la importancia económica del cile )apsicum sp.+ es evidente por su amplia
distribución y los diversos usos que se da a los frutos. El interés por este cultivo se a
incrementado por la presencia de otros compuestos, conocidos como fitoquímicos, que
tienen un efecto benéfico sobre la salud umana )?uzm#n%aldonado y 1aredesBLópez,
=GG@+. -entro de este grupo de compuestos se encuentran los #cidos fenólicos, de los
cuales se sabe que reducen el riesgo de contraer c#ncer, problemas cardiovasculares y
otras enfermedades crónico degenerativas )-illard y ?erman, 0///+. Los frutos de
apsicum se an utilizado en forma de concentrados, oleorresinas y como especias en
colorantes alimenticios. Los frutos presentan carotenoides, como cetoBcarotenoides,
capsantina, capsorubina contribuyendo a la coloración roja del fruto )1ilip et al., =G;=+,
mientras que FBcaroteno, zea!antina, luteína y FB cripto!antina son responsables del
color amarilloBnaranja. Los pigmentos y precursores de color de frutas y ortalizas
desde el punto de vista químico, pertenecen a la familia de los terpenos, es decir est#n
formados por unidades de isopreno y su biosíntesis se produce a partir de isopentil
pirofosfato. La clorofila ayuda a la fijación del ierro en casos de anemia, la clorofila y la
clorofilina poseen actividad antimutagénica y anticarcinogénica, posee acción
antio!idante, nutre y fortalece el sistema circulatorio e intestinal, tiene actividad
desinto!icante contra metales pesados, aflato!inas, acción deodorizante )ayuda a
neutralizar el olor corporal+ )6reinolt et al. =GG:, ermonosMy et al. =GGG+. -esde el
punto de vista de la tecnología de los alimentos, el interés por clorofilas se centra en las
reacciones poscoceca que degradan a estos pigmentos, incluso los que ocurren durante
el procesamiento y almacenamiento. 1aralelamente se reconoce que la clorofila tieneefectos sobre la salud, tales como la reducción de algún tipo de tumores en animales de
laboratorio. E!isten varias clorofilas reportadas, las clorofilas y F est#n presentes en el
tejido fotosintético en una relación 9(=. Las clorofilas se emplean poco como aditivos
alimentarios, con e!cepción de algunas gomas de mascar y pastillas, junto con sales
cúpricas. En estados 3nidos se emplean como aditivos a través del uso de jugos de
vegetales. -e acuerdo con $lmeda et al. )=GG=+, el contenido total de carotenoides en el
fruto varia de acuerdo al tipo de cultivar, estado de madurez y condiciones de
crecimiento. $dem#s, la temperatura, iluminación y tiempo de secado para almacenar
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yAo elaborar subproductos pueden generar incrementos o decrementos en la
concentración de los carotenoides )?ómezBLadron y 1ardoB?onz#lez, =GGC+. Los
procesos de secado, fabricación y e!tracción de pigmentos deben estar eventualmente
resueltos para evitar pérdidas de color y conservar en forma m#s natural estospigmentos )%inguezB%osquera et al., =GG7+. orneroB%éndez et al. )0//0+, determinó
el contenido de carotenoides en el cile pimiento cv. %$=, reportando =0C/;.:@ mg.MgB=
de peso fresco. 1or otra parte $rjona et al. )0//9+, reportaron valores de =:/ y 0=7
unidades $5"$ en carotenoides de pimentón )apsicum annuum+ var. trompa de
elefante., superando el valor mínimo e!igido por la Nederal 5pecification que es de =0/
unidades, adem#s observaron que la materia prima influye en el contenido total de
carotenoides.
El conocer el contenido de pigmentos en frutos frescos y secos, es de gran importancia
ya que debido a los efectos antitumorales que se le atribuyen a los pigmentos podr#
recomendarse su consumo. 1or lo que el objetivo del presente estudio fue cuantificar el
contenido del color e!tractable, clorofila y F, y carotenoides rojos )+ y amarilloB
naranja )$+ en cuatro variedades de cile )apsicum sp.+.
METODOLOGIA (
M%te#i%l biológico / 0#oces%miento +e m*est#%s
• 5e obtuvieron 0// g de frutos frescos de cile de cada una de las variedades
)serrano, abanero, cilaca y jalape4o+ y se refrigeraron a :U por 07 oras.
1osteriormente, los frutos se desinfectaron con cloro =/8 vAv y se enjuagaron con
agua destilada, se desvenaron y se eliminó la semilla.• 3na vez eliminadas las semillas se dividieron las muestras en partes iguales, una
de las cuales se refrigeró asta su posterior uso )muestra fresca+ y la otra secolocó en papel aluminio para efectuar el secado de las muestras el cual se realizó
en un orno eléctrico durante tres días a C/o. -eterminación de color
e!tractable, carotenos y clorofilas Las muestras frescas y secas de cada una de las
variedades fueron sometidas a dos métodos de e!tracción(
MTODO DE ETRACCIÓN '(
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5e colocaron /.:g de cada muestra )fresca y seca+ por variedad en seis repeticiones, se
colocaron en vasos de precipitado de =//mL, se agregaron :/mL de acetona y se
agitaron durante 7 ' se filtró dos veces con papel Iatman 2o. 7, a la muestra se le
adicionaron otros :/mL de acetona y se agitaron nuevamente )estos pasos podr#nrepetirse asta obtener la decoloración total de la muestra+. El volumen total de acetona
fue de =//mL.
MTODO DE ETRACCIÓN 4(
5e tomaron /.:g de cada una de las muestras y se molieron en mortero evitando la
incidencia de luz, el polvo así obtenido se transfirió a un vaso de precipitado de 0//mL
y se adicionaron 7//mL de acetona y se mantuvieron en reposo durante =,
posteriormente se filtró dos veces en papel Iatman 2o. 7 y se aforó a =//mL con
acetona.
La determinación de color e!tractable se realizó por el método $5"$ 0/B= )$nónimo,
=G@C+ para lo cual se tomaron :mL de la solución final y se determinó por seis
repeticiones la absorbancia a 7C/nm en un espectrofotómetro )5pectrpotometer
6io%ate "% 9+. Vste se determinó solamente de las muestras procesadas por el
método=. $ partir de las soluciones obtenidas mediante los métodos de e!tracción = y 0,se tomaron :mL de cada una de las muestras y se realizaron lecturas de absorbancia en
el espectrofotómetro a diferentes longitudes de onda' C7@nmBCC9nm para clorofila
)?odDing, =G;C+, 7@/nmB;:/nm para carotenos totales )5tricMland Q 1arsons, =G;0'
6ritton, =G@:+, 7:/nmB:/@nm para carotenos amarillos y rojos respectivamente )NeMete
et al., =G;C' aspelBorvatovic y oricMova, =G;C+. Los resultados obtenidos fueron
analizados mediante un $n#lisis de >arianza para detectar diferencias significativas
entre las variedades, y mediante comparación múltiple de medias )"uMey+.
RESULTADOS & DISCUSION
En relación al contenido de pigmentos en frutos de cuatro variedades de cile
)apsicum annuum L.+ se encontró con base en el $n#lisis de >arianza, que e!isten
diferencias altamente significativas )1]/./=+ entre variedades y entre tratamientos, así
como en la interacción de las diferentes fuentes de variación, demostr#ndose una amplia
variabilidad. En cuanto a la clorofila el m#s alto contenido de este pigmento se presento
en las muestras secas de los frutos de la variedad cilaca independientemente del
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tiempo de e!tracción, alcanzado valores de asta @.97mgAg de muestra. 1or otra parte
en las muestras secas de cile abanero se registraron los valores mas bajo con /.9mgAg
)Nigura =+. En cuanto a los resultados obtenidos de clorofila y F se reporta que para
ambos métodos la muestra de cile cilaca )tanto muestra fresca, como seca+ presentan valores relativamente altos comparados con los dem#s variedades evaluadas. especto
al contenido de carotenoides totales en las muestras de las cuatro variedades se
encontró que la mayor concentración se presenta en las muestras frescas de los frutos de
abanero registr#ndose G9.0:gAL cuando el tiempo de e!tracción en acetona fue de =,
cuyo contenido se incrementó a ==C.G0gAL cuando el tiempo de e!tracción fue de 7.
Este comportamiento se observó también en la muestras de las variedades de cilaca y
jalape4o. -e manera general se observa un dr#stico decremento en este pigmento
cuando los frutos fueron desidratados a C/o durante ;0 )Nigura 0+. El contenido de
grupos carotenoides reporta que para ambos grupos )$ y + las muestras frescas de cile
abanero del método de e!tracción 0 )=+ registran una mayor cantidad de grupos
carotenoides en relación a las dem#s variedades estudiadas )"abla =+. 1ara el color
e!tractable, se reporta un alto índice de 9:./: unidades $5"$ para muestra fresca de
cile abanero, mientras que la muestra seca de cile cilaca da como reportado 00.7G
unidades $5"$, esta misma tendencia se observa para la muestra seca de cile serrano
dando 0.C: unidades $5"$ por encima de su contraparte fresca.
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CONCLUSIONES
El mayor contenido de clorofila total así como el de sus componentes y F se presentan
en la muestra seca de cile cilaca del primer método )7+. El contenido de carotenoides
totales y grupos carotenoides se obtuvo la mayor cantidad de la variedad cile abanero
muestra fresca del segundo método de e!tracción )=+. La variedad cile abanero en
muestra fresca presentó el mayor contenido de unidades $5"$, en cambio por parte de
la muestra seca el mayor contenido de unidades $5"$ lo obtuvieron la variedad de cile
cilaca )uso del método de e!tracción =, 7+.
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