This article was downloaded by: [Universitaets und Landesbibliothek]On: 02 November 2013, At: 10:51Publisher: Taylor & FrancisInforma Ltd Registered in England and Wales Registered Number: 1072954Registered office: Mortimer House, 37-41 Mortimer Street, London W1T 3JH,UK

Analytical LettersPublication details, including instructions forauthors and subscription information:http://www.tandfonline.com/loi/lanl20

Determination de l'Acidel-Ascorbique a l'Aided'Electrodes Bacteriennes,Tissulaires et EnzymatiquesB. J. Vincké a , M. J. Devleeschouwer a & G. J.Patriarche aa Institut de Pharmacie Université Libre deBruxelles , Campus Plaine 205/6 et 205/2°Boulevard du Triomphe, B-1050, Bruxelles, BelgiumPublished online: 05 Dec 2006.

To cite this article: B. J. Vincké , M. J. Devleeschouwer & G. J. Patriarche (1985)Determination de l'Acide l-Ascorbique a l'Aide d'Electrodes Bacteriennes, Tissulaires etEnzymatiques, Analytical Letters, 18:13, 1593-1606

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ANALYTICAL LETTERS, 18(B13), 1593-1606 (1985)

DETERMINATION 1)E L'ACIDE L - A S C O R B I Q U E A L ' A I D E

D'ELECTRODES RACTERIENNES, TISSULAIRES ET ENZYMATIQUES.

KEY WORDS: bacterial, tissue and enzymic biosensors, L-ascorbic

acid in pharmaceuticals, p02 sensor.

B.J. Vinck4, M.J. Devleeschouwer", G.J. Patriarche.

Institut de Pharmacie UniversitC Libre de Bruxelles, Campus Plaine 205/6 et 205/2 '

Boulevard du Triomphe, 8-1050 Bruxelles, Belgium.

ABSTRACT

L-ascorbic acid membrane electrodes based upon the use of four

classes of biocatalysts immobilized at an oxygen electrode are eva-

luated and compared in terms of electrode properties and operating

requirements. Isolated ascorbate oxydase enzyme in soluble form and

in covalent binding matrices, peel of cucumber and living bacterial

cells of Enterobacter agglomerans strain, respectively, are employed

as biocatalytic layers. The physico-chemical factors, life times

and interferences are discussed in details. The low stability of the

soluble enzyme sensor does not allow its analytical utilization,

but the immobilized enzyme, bacterial and tissue electrodes can be

used, even in multivitamin pharmaceutical formulations. The common

linear range of those three biosensors are of 4.10 M to 7. M with a precision and a reproducibility of -+ 3 % .

-6

1593

Copyright 0 1985 by Marcel Dekker, Inc. 0003-27 19/85/18 13-1593$3.50/0

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1594 VINCKE, DEVLEESCHOUWER, AND PATRIARCtlE

INTRODUCTION

Les rbactions enzymatiques, de par leur spbcificith, ont 4td coupl6es B de nombreux systGmes de detection t e l s que la fluori-

mGtrie , I'klectrochimie 2 9 3 , les mesures enthalpimPtriques :I

l'aide de thermistances , les mesures de frkquence par quartz p ikzob lec triquc s et plus rkcemment les fibres optiques . Cependant, ce sont les mPthodes klectrochimiques qui ont rencontr;

le plus grand intbrgt dans l e domaine analytique et qui o n t permis

la dbtermination de plus de 40 substrats . Parall&lement a u x 7-9 tlectrodes L enzymes, des Clectrodes a membrane:; microbiennes

tissulaires l o ' l l ou B organelles l o ' se sont dbveloppbes.

6

L'importance de l'acide ascorbique (vitamine C ) dans le domaine

pharmaceutique et agroalimentaire a donnb lieu i de nombreuses

mkthodes de dosage de celui-ci; citons les mkthodes coulomktriques , voltamme'triques impulsionnelles diffCrentielles

lisation d'klectrodes enzymatiques

1 3

l 4 ainsi que l'uti- 15

Le but du prCsent travail est de prksenter et de comparer

quatre Clectrodes biocatalytiques ( 2 enzyme soluble ou immobilisbe,

B m6socarpe de concombre ou h cellules bact6riennes) riches en ascor-

bate oxydase et permettant de dPterminer l'acide L-ascorbique dans

des formes pharmaceutiques. La rkaction d'oxydation de la vitamine C

en prksence d'ascorbate oxydase (EC 1.10.3.3) est schkmatiske

ci-dessous:

ascorbate Acide L-ascorbique + 1 / 2 0 -) acide dkhydroascorbique

oxydase + H 2 0

Elle peut Etre suivie stoechiomCtriquement par la mesure .de la

ddpletion en oxyggne gr&e B une Clectrode 5 diffusion gazeuse d'

oxygGne. Les caractkristiques et les performances analytiques de ces

quatre biosenseurs seront examinCes en d6tails.

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DETERMINATION DE L'ACIDE L-ASCORBIQUE 1595

PARTIE EXPERIMENTALE

AEE"'"ill"ge Le dispositif de mesure comporte une blectrode B diffusion ga-

zeuse d'oxygPne (02 electrode Orion research model

la membrane de dialyse est remplacee par une membrane d e polypropy-

lgne de _+ 50 um ohtenue par pressage 2 chaud (190°C) sous pression (160 kg/cm ) pendant 1 minute de polypropylPne NovolenR BASF. La

diffCrence d'intensite de courant rbsultant de la rkduction de 1'

oxygPne 2 la cathode est convertie linbairement en potentiel et lue

s u r 1'Cchelle pX d ' u n millivoltm6trc Orion reseach digital ionanaly-

ser type 601 I. La courhe de variation de pX en fonction du temps

est tracbe h l'aide d'un enregistreur E = f(t) (Gosrtz Servogor 120)

reliC en synchronisation avec le millivoltmPtre.

97-08-00) dont

2

Les mesures sont rCalis6es s o u s agitation constante dans une

cellule thermostatis4e h 25,O _+ 0,2"C. Les coupes de tissus v6gCtaux ont 6te effectuges 2 l'aide d ' u n

microtome 2 congClation (Leitz type 1310).

RCactifs et milieux microhiologiques de croissance -----__________----___________ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Toutes les solutions sont prCparPes 5 partir d'eau hidistillke.

Tous les r6actifs utilisCs sont de qualit6 P.A. ou hiochimique.

L'ascorbdte oxydase extraite d e cucumis species est de prove-

nance Boehringer (170 U/mg).

La souche d'Enterohacter agglomerans Indole ( - ) Saccharose (-)

(Erwinia herbicola) est une souche sauvage isolPe h partir de thes

pharmaceutiques

se inclinCe H.I.A. (Difco).

l 6 . Sa culture mgre est maintenue 5 4 0 ~ sur g ~ l o -

Les milieux de croissance sont de deux types:

a) Milieu d'induction ( 0 , L % en substrat):

Extrait de levure lg, Tryptone lg, NH4Cl 2g, KH PO

Fe (<FeS04.7H20) I O m g , Mg (<MgC12) 28mg, Eau distillbe 1 L .

Cette solution est autoclav6e h 121°C pendant 15 minutes. Avant 1'

ensemencement, 0 , 2 g% d'acide L-ascorhique sont ajoutCs extempora-

nbment et la solution totale est stCrilisCe par filtration par

fraction de 100 ml.

4g, Na HP04 4g, 2 4 2 2+ 2+

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1596 VINCKE, DEVLEESCHOUWER, AND PATRIARCHE

h ) Milieu B . H . I . (Difco):

11 est utilis6 avec ou sans inducteur (0,2 % d'acidr 1,-ascorbique).

Prkparation dgs diffkrentes b l e c t g g d g s

1 ) Electrode bactkrienne:

La croissance d'Enterobacter agglomerans est cffectu&e d a n s I t .

milieu d'induction B 0,2 7, en substrat pendant 24 heures et sous

agitation orbitale (100 tours min.-') B 27°C. Cclnt millilitres sont

filtrbs sur filtre d'ac6tate de cellulose MilliporeR (HAWP 047 SO).

1.e filtre satur4 est Lavk h l'aide d e liquide ptiysiologique. Une

partie adbquate du filtre est prPlev6e et fix6e contre la membrane

de polypropylhne de l'6lectrode par le biais d'un embout amovible

de P.V.C.

L'Clectrode est conserv6e soit B 4°C dans l e tampon phosphate

0 , 1 M de pH 6,5 soit dans son milieu de culture 2 27°C SOLIS agitation.

2) Electrode tissulaire:

Lors d'un travail se rapportant aux blectrodes tissulaires.Smit

et Kechnitz l 7 avaient propos6 Cucumis sativus comme support mem-

branaire l o r s du dosage de la cystkine.

Des membranes de 500 5 600 pm sont taill6es dans le rn6socarpe

de concombre . Celles-ci peuvent Gtre conservhes durant plus de deux

semaines dans un tampon phosphate 0,1 M de pH 6,5.

La membrane tissulaire fixbe h la surface d e 1'tl.ectrode par

un filet de nylon est maintenue au moyen d'un anneau de caoutchouc.

L'klectrode e s t alors conserv6e B 4°C dans le tampon phosphate.

3) Electrodes enzymat iques :

a ) ~-gnqyme-soluble:

0 ,30 mg d'enzyme (= 51 U) sont dissous dans 50 p l de tampon

phosphate 0,l M et fix6 directement B la surface de l'6lectrode par

l'intermbdiaire d'une membrane de dialyse (cellophane 50 urn) . L'Glec-

trode est conditionnke pendant 2 heures e t stock6e dans c e &me tam-

pon.

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DETERMINATION DE L ' A C I D E L-ASCORDIQUE 1 5 9 7

b) 5 enzyme imniobilisgg-par liaisonp-c~~ya~mt~p:

Deux mkthodes d'immobilisation par liaison covalente ont PtC rkalisees: l'une par un greffage direct de l'enzyme sur un support

insoluble

selon Lubrano et Guilbault

tate de cellulose.

'8 , l'autre par corkticulation avec une prot6ine inerte l 9 sur l e m6me support insoluble d'acP-

- Type I: par greffage direct: Une membrane d'acktate de cellulo- se (membrane hydrophyle Tacussel) de 1 cm2 est imprPgnCe de 50 b 1 1

dc tampon phosphate 0 , l M de pH 6 , S O contenant 0,30 mg d'ascorbate

oxydase. La solution est Pvaporke sous vide h 4 ° C . La phase de rk-

ticulation est obtenue par adjonction d'une solution h 2,5 Z de

glutarald6hyde dans l e msme tampon. Aprks dessiccation sous vide,

la membrane est plongGe dans une solution de glycine 0 , l M durant

3 heures h 4°C et lavke B I'eau distillkc jusqu'i ce qrie l'eau de

rincage ne prksente plus d'absorption spectrale h 280 nm.

- Type 11: par cor6ticulation sur support insoluble: La membrane d'acktate de ccllulose est imprGgn6e de 14 ~1 d'une solution tampon

contenant 50 mg d'albumine d'oeuf et 2 1 , 4 mg d'enzyme par ml et de

3 p1 d'une solution b 2,5 2 dr glutaraldkhyde. La membrane est des-

sbchke B tempPrature ambinnte durant 1 h 2 henres.

Les membranes enzymatiques sont conservkes dans le tampon pen-

dant une heure avant d'Gtre fixhcs sur 1'6lectrode a u moyen d'un

filet de nylon. L'electrode est stockce 5 4°C dans le tampon.

RESULTATS ET DISCUSSION

1 ) $fluenee dg-i'activitk enzyrngyiqge.

L'influence de l'activit6 enzymatique sur l a pente et la lin6a-

ritP de r6ponse de l'klectrode a etk rkaliske pour les deux types d'

immobilisation enzymatique, sur le nombre de subcultures de la bact6-

rie et sur l'kpaisseur des coupes de mksocarpe d e concombre.

Pour l'enzyme immobiliske, la prnte maxirnale est obtenue b

partir de 10 U d'ascorbate oxydase dans la membrane, indCpendament

du type d'immobilisation.Le temps de rkponse de l'blectrode est

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1598 V I N C K E , DEVLEESCHOIJWER, AND PATRIARCl lE

indhpendant de la concentration en enzyme dans l a gamme de 10 ''1

170 U et du type d'immobilisation (type 1 ou 11).

Pour 1'Clectrode tissulaire, les activiths cnzymatiqries sont

furt variables d ' u n concombre B I'autre, comme lc, niontre la pente

maximale qui varic de 5 , 0 i h , b A p X / n N , mais le domaine d c linhariL6

r e s t e constant. Cependant, la pente maximale est constante nu s e i n

d'un &me concombre et est obtenue i partir d'une Cpaisseur de 400 pm

ILL temps de rhponse en phase stationnaire varie a u maximum d e 1,5 Z

entre d e s bpaisseurs de 400 B 1.450 um.

En ce qui conc'erne l e s hlectrodes bacthriennes, l'ascorbate

oxydase a une nctivitk tr&s variable selon les souches d'Enterobacter

agglomerans testhes, mais cette activith est tri.:; stable pour une

mcme souche et s'exprime d&s le premier ensemencement en milieu d'

induction. Seule la souche pr6sentant l e maximum d'activith a h t 6

utilis4e. 1,orsquc la bactCrie crort e n milieu B.H.I. avec ou sans

inducteur, la pente de l'klectrode diminue de pl i r s de 60 Z impli-

qunnt I n n6cessitC d'un milieu pauvre pour effectuer l'induction

enzymatique.

L'effet du pH a 6tC Gtudie sur l es 4 types d'electrodes. Pour

chacune l e pH influence peu l e domaine dc, lin6arith. Cependant, conune

lc niontre la figure 1, l'Ctude de l a pente d e rhponse en fonction (111

pH fait appara7tre deux types de courbes: celles de 1'6lectrode '-1

t ' n ~ y m e soluble e t b fragment tissulaire qui montrent une forte db-

p e n d a n c e du p H , de part et d'autre d u domaine de pH 5 , 6 0 B 6 ,hO. c t

celles correspondant aux Glectrodes bacthriennes et 5 enzymes inunobi-

lisbes mettent en kvidence une plus large gamme de pH exploitablrs

(de pH 5 ,30 b 7 , 2 0 ) . Pour les quatre blectrodes, l e m6me pH d'une

valeur de 6 , 5 0 peut Gtre utilisk avec s u c c k s .

3 ) Infl.esce-de_la_temEprature *

La figure 2 dCmontre une influence marquke de la temp4rature sur

la rCponse de l'enzyme soluble. Pour 1'6lectrode bacterienne, I ' o n

observe une stabilitP de pente entre 25 e t 35°C avec une c h u t e b ru -

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D E T E R M I N A T I O N DE L'ACIDE L - A S C O K B I O U E 1599

8 , O

6 , O

i,, 0

5 , 0 0 , 0 7 , 0 8.0 pti

Fig. 1 : Influence du pH sur la pente des diff6rentes Glectro- des: tdmpon phosphate 0 , l M - 2 5 ° C . ( 1 ) : Electrode 3 enzyme soluble; ( 2 ) : Electrode tissu- laire; ( 3 ) : Electrode h enzyme immohilisee; ( 4 ) Elec - trode bactGrienne.

tale 3 4 0 ° C . Cette diminution de pcnte 3 4 0 ° C s'accompagne bgalement

d'une altGration irrkversihle de l'enzyme, c o m e dans le cas de

l'hlectrode h enzyme soluble e t tissulaire. En c e qui concerne 1'

Glectrode tissulaire et b membrane enzymatique imobilisbe, l'influ-

ence de la tempbrature est moins marquGe. Seulc l'imrnobilisation p a r

lien covalent de I'enzyme a s s u r e une protection efficace i 4 0 ° C .

L e domaine de 1inCaritG reste constant pour les quatre blectro-

d e s j u s q u ' B 3 5 ° C . A 4 0 ° C c e l u i - c i diminuc sauf pour I'enzyme immohi-

lisGe.

4 ) Infl...rn-de-ln-for. ._iOnl9ue_du-tamEop.

Les forces ioniques croissantes du tampon augmentent la sensi-

bilitb de la rCponse aux trois blectrodes analytiquement exploitahles

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1600 V I N C K E , DEVLEESCHOUWER, A N D PATRIARCHE

F i g . 2 : I n f l u e n c e d e l a t e m p 6 r a t u r e s u r l a p c n t e d e s d i f f 6 r c n - t e s G l c c t r o d e s : tampon p h o s p h a t e O , 1 M pH 6,50. ( 1 ) : E l e c t r o d e 3 enzyme s o l u b l e ; ( 2 ) : E l e c t r o d e t i s s u - l n i r e ; ( 3 ) : E l e c t r o d e b enzyme immobilisfie; ( 4 ) : Elec - t r o d e b a c t c r i c n n e .

c o m e l e mont re l e t a b l e a u I . C e t t e G v o l u t i o n e s t s i m i l a i r e potir 1c.s

t r o i s , ninis e l l e e s t p l u s marqu6e dans l ' o r d r e : G l e c t r o d e t i s s u l a i r c > Glect rodc . cnzymat ique > b l e c t r o d e b a c t 4 r i e n n e .

Le dornainc de l i n G a r i t 6 r e s t e c o n s t a n t pour l es f o r c e s i o n i q u e s

de 0.01 3 0,1 M e t d 6 r r o i t e n s u i t e pour l c s v a l e u r s s u p f r i e u r e s .

Des tampons de 0 , l M s e r o n t c h o i s i s , c a r i l s a s s u r e n t l a r n e i l l e u r e

s e n s i b i t i t 6 pour l e domaine d e l i n P a r i t 6 l e p l u s 6 t e n d u . 11s p o s s h -

d e n t de p l u s un p o u v o i r tampon s u f f i s a n t pour l c s s o l u t i o n s aqiieuses

e t l e s fo rmes p h a r m a c e u t i q u e s de l a v i t a m i n e C .

Des p e n t e s i d e n t i q u e s s o n t o b t e n u e s dans l c , tampon a c P t a t e , c e

q u i permet son u t i l i s a t i o n d a n s l e cas d ' g c h a n t i l l o n s c o n c e n t r 6 s en

c a t i o n s m u l t i v a l e n t s t e l s que i o n s f e r r i q u e s , c u i v r i q u e s , c a l c i q u e s ,

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DETERMINATION DE L'ACIDE L-ASCORBIQUE 1601

Tableau I: Influence de la f o r c e ionique d t du tvpe de tsmpor, s u r

ld p e n t e de reponse des electrodes - pH b.50, 25°C: .

Tvpe de tampon Petite de l'elrctrode Pente de l'ilrctrode Fente de l'electrode t.c Eorce ionique bac cPrienna tissulaire enzvmatique :vpe I I

(X) ( A p x i m M ) ( A p x i d ) (ApX/mM)

Tampon phosphate

I ,(I 10, I 5

0 , 5 9 ,20

0, I d , b L

0.05 8.01

0,91 7,<8

Tampon sc6tate

0.1 8 . 5 7

8 .82

6.98

5 , b 3

5 , 0 5

3.ao

5 , 6 9 6 . 8 4

zinciques etc... et qui peuvent provoquer la pr4cipitation des

phosphates correspondants.

La stabilitC b long terme des 4lectrodes est tres variable en

fonction du type de membrane biocatalytique (tableau 11). Elle Cvolue

dans l'ordre suivant: Clectrode 2 enzyme soluble < Clectrode tissu- laire < Clectrode bactbrienne < Clectrode 2 enzyme immobilis4e.

La rCgCnCration de I'Clectrode bactCrienne b 2 7 ° C dans son mi-

lieu de croissance n'assure qu'une faible augmentation de sa stabili-

tC par rapport a la conservation dans le tampon b 4 " C , b l'encontre

des travaux antCrieurs 8,18

En ce qui concerne 1'4lectrode h enzyme soluble, son instabi-

lit4, sa faible sensibilit6 et l'allongement des temps de rCponse

rendent celle-ci peu exploitable pour la dbtermination de l'acide

ascorbique.

Les caract4ristiques analytiques des trois autres biosenseurs

sont relativement similaires, b l'exception d e la pente ClevCe de

I'Clectrode bactkrienne. Cette caractCristique peut s'expliquer par

une constante de Michaelis-Menten supGrieure (K = 23,6 mM) dans le m

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1602 V I N C K E , DEVLEESCHOUWER, AND P A T R I A R C I I E

Tableau 11: Caracteristiques d e s electrodes dans le tampon phosphate 0,l!-l,

2 5 ° C . pH 6.50 .

Type d'eleccrode Prnte Linearit6 Temps de repnnse Stabilite dn

et nombre d' (ApX/mM) exprimee 2 l'dt3t station- j o u r s elactrodes cesties en moles/L naire axprime en

mi nut e s

dlec trade 8.6 _c 0.3 i.10-6-7.10-4 2 . 5 a 3.0 10 a 1 1

( b S'C) bacterienne (8) 15 1 I b

(par regPneration)

Electrode 5.8 _+ 0 , 8 ~.10-6-1.10-3 1.5 a 2.0 5 h h

tissulaire ( 9 )

Elrctzode b 4.9 0.4 i . ~ o - ~ - - j . t ~ - ' 4,O i 5.0 ? a 3

enzyme solublr(7)

Electrode enzy- 4 , 7 : C . 2 &.10-6-9.10-4 ?,0 h 2 . 5 16 i 18 me i m o b i l i s e e

cvpe I et I1 ( 6 )

( 2 0 c a s d e l ' enzyme b a c t e r i e n n e d6montrC p a r V o l k e t L a r s r n

E n t e r o b a c t e r a e r o g e n e s p a r r a p p o r t a l ' enzyme vGg6 ta l e ( K = m

pour 1 5 . 1 mM) .

E t a n t donne que l a v i t a m i n e C p e u t Z t r e oxydee de f a c o n 3spec . i -

f i q u e p a r c e r t a i n e s enzymes, tel1C.s l e s po lypt iCnols oxydases e t l e s

cy tochromes oxydases e n p r e s e n c e de l e u r s s u b s t r a t s , l a prcgscnce

d~ L ~ ~ ~ t l t ~ ~ - c i a d t P r e c h e r c h P e pour l e s t r o i s b i o c a t a l y s e u r s . 1.a

r e c h e r c h e d e s cy tochromes oxydases a dtC e f f e c t u e e s u r d i s q u e s

r 4 a c t i f s d ' o x y d a s e t e s t R (Biombr ieux) e t les p o l y p h 6 n o l s o x y d a s e s f n

u t i l i s a n t l a L-Dopa c o m e s u b s t r a t . Ces r 6 a c t i o n s s o n t n e g a t i v e s pour

l e s d i f f e r e n t e s k l e c t r o d e s .

7 1

P a r m i l e s a u t r e s s u b s t r a t s pouvant Gtre oxyd&s p a r l ' a s c o r b a t e

oxydase t e l s que l ' a c i d e D - i s o a s c o r b i q u e , l ' a c i d e D-g lucoasco rb ique

e t l ' a c i d e r b d u c t i n i q u e d e c r i t p a r Dodds

c o r b i q u e a 4 tC Ctud iC . Come l e mont re l e t a b l e a u 111, sa rCponse .

2 2 , , s e u l l ' a c i d e D- isoas- *

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DETERMINATION DE L'ACIDE L-ASCORBIQUE 1603

varie en fonction de la biomembrane utilisbe et est plus faible pour

l'tlectrode bactCrienne.

Les ions cuivriques et ferriques, qui catalysent l'autooxyda-

tion de la vitamine C, interfgrent fortement aux tlectrodes. Les

ions ferriques diminuent la rPponse par leur effet catalytique dans

l'autooxydation de la vitamine C en solution, par contre les ions

cuivriques augmentent la r6ponse par une oxydation beaucoup plus

rapide impliquant la formation de H202 au lieu d'H 0 par la rCaction

enzymatique 2 1 . 0 n obtient en effet un maximum rapide de rPponse

qui ensuite dCcroZt progressivement. Le peroxyde d'hydroggne form6

inhibe ensuite l'activitg enzymatique de facon irr6versible. Aussi

l'action de l'ascorbate oxydase (une cuproprotPine) petit 6tre irnitte

par des ions cuivriques lies aux protPines inertes 2 1 . C'est ainsi qu'une membrane d'albumine li6e h 2.10

les me^mes conditions que la membrane de type 11, peut oxyder l'acide

ascorbique avec une rCponse relative de 30 % par rapport b celle

2

-6 M de CuS04, r6alisCe dans

obtenue par la rCaction enzymatique s u r la membrane de type I1

nant 51 U. La cinktique de rtponse sera dans ce cas plus lente,

durCe de 5 b 6 minutes. 0 n peut distinguer cette oxydation de

vitamine C par le cuivre de l a r6action enzymatique par l'inhib

de la rbponse en prCsence d'EDTA Na2. En effet, si la rCponse 2

onte-

d'une

la

t ion

1' Clectrode enzymatique est r6versiblernent diminu6e de fason constan-

te pour des concentrations de 1.10

111), la rkponse de l'klectrode cuivre-prot6ine inerte est irrCversi-

blement inhibte de 80 % en prtsence de 1.10 2 3

-5 -3 2 1.10 M en EDTA Na2 (tableau

-5 M en EDTA Na2. Gerwin et al. ont montrt que le citrate monoanion est un

inhibiteur compttitif de l'ascorbate. L'6lectrode enzymatique est la

plus sensible h la pr6sence d'acide citrique, mais cette inhibition

est parfaitement rCversible.

En ce qui concerne les sucres et alcools rentrant dans la syn-

thhse de la vitamine C (D-glucose, L-sorbose, D-sorbitol) ainsi que

d'autres sucres et le gluconate frCquernnentutilis6s c o m e excipients

des formes pharmaceutiques, seuls le glucose et le fructose interfil-

rent lCg&rement et de manihre semblable aux Clectrodes tissulaires

et enzymatiques. Par contre, un plus grand nombre de sucres interfh-

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1604 VINCKE, DEVLEESCHOUWER, AND PATRIARCHE

Tableau 111: Etude des interferences aux di€f&rentes Glectrodes i 25°C. pH 6 , 5 0 en tampon phosphate (pour les ions Fe3+ et CU" utilisa-

tion du tampon acetate).

% de reponse relative

r)e r ives Concentration Electrode Electrode Electrode a enzyme (mM) bacterienne tissulaire immobilisee

-+ 1.0 x -f 1 . 3 x + 1 , l %

Ac. L-ascorbique 3 AA

Ac. 0-rsoascorbique

AA + D-glucose

M + ac. citrique

AA + EDTA Na AA + C-fructose

AA + D-galactose

AA + lactose AA + gluconate de K

AA + Fe3+

2

AA + cu2+

0 . 3 100,O

0.3 25.2

0.3 * 30 162.5

0 .3 + 14.3 99.7

0,3 + 1,0 80.2

0.3 + 30 1 6 4 , 3

0.3 + 30 128 .2

0,3 + 30 118,4

0.2 + 30 1 0 3 , j

0.3 + 0.1 max- 2 5 4 . 5

0,3 + 0,s 76.1

100,o

79.8

lo;,$

99.0

85.8

107.5

i no ,Y

100,8

99,?

maxi 258.8

9 1 . 1

100.0

92.8

104 ,2

83,9

86, h

104.9

99.3

9 9 . 4

99.9 max- 2 7 1 . 4

86.9

Tableau IV: Dosage de la vitamine C dans des preparations vitaminees.

Quant 1 t e Electrode Electrode dgclaree bac terienne tissulaire

Electrode snzyma c ique

(mg) Trouve" Ecart CVX Trouve" Ecart CV% Trouve" Ecart CV% (mg) type (mg) type (mg) type

(mg) (mg) (mg)

A: 500 5 0 3 , 6 9,l 1,8 5 0 2 . 6 1 2 . 0 2.4 499,) 1 1 , 4 2 , 3

B: 100 103.1 2 . 7 2 . 6 103.1 2 . 9 2.8 102 .4 ?,h 2 . 5

c: 1000 1033,a 2 5 , i 2,lr 1 0 2 6 , 7 2 9 . 8 2 . 9 1020,s 12 .3 2 . 2

a Moyenne des resultats sur 5 essais.

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DETERMINATION DE L'ACIDE L-ASCORBIQUE 1605

rent au niveau de 1'Clectrode bactPrienne e n raison de leur mCtabo-

1 i sa t ion. I1 est possible d'6liminer t o u t e s ces interf4rences par La

mCthode des additions standards H l'exception du cuivre.

7) Application au dosage des formes pharmaceutiques. --------------- ------_-_____ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _-_ Le dosage de l'acide L-ascorbique a CtP r6alisP sur divers com-

primPs par la mPthode des additions standards. Les rBsultats s o n t

rapportPs dans l e tableau IV.

Comme le montre le tableau, il existe une excellente corrCla-

tion entre les rtsultats obtenus sur les diverses blectrodes.

CONCLUSIONS

L'Ctude comparative des quatre types de biocatalyseurs (enzyme

soluble, enzyme immobilisCe, tissus vdg6taux et cellules bactCriennes)

a permis de dPterminer que les conditions opPratoires optimales pour

chaque type de biocatalyseur s o n t f o r t semblables. Certaines diff4-

rences o n t C t P mises en Cvidence, en particulier en ce qui concerne

la stabilitC B long terme et les interf4rences. Seules les Plectrodes

H enzymes immobilisCes, bactPriennes et tissulaires de par leur plus

longue stabilit6 ou leur faible coGt s o n t exploitables analytiquement.

Les resultats obtenus avec celles-ci pour l e dosage des formes

pharmaceutiques s o n t en parfaite corrPlation.

REMERCIEMENTS

Nos remerciements vont au F.N.R.S. (Fonds National de la Recher-

che Scientifique) pour l'aide apportke 5 l'un d'entre nous ( G . J . P . ) .

Nos trPs sinckres remerciements von t Cgalement au Prof. M. Van Haelen pour l'aide apportbe 3 1'6laboration des coupes au microtome.

BIBLIOGRAPHIE

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1606 V I N C K E , DEVLEESCIIOUWER, A N D I 'ATRIARCHE

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Received May 20, 1985 Accepted May 31, 1985

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