Diagnostik von Pockenviren

1Ausbildungsmaterial des Robert Koch-Instituts

06/01/2004

Bund-Länder-AG„Szenarien

bioterroristischer Anschläge und Abwehrmaßnahmen“

Gliederung

• Einleitung• klinisches Bild• Eingruppierung des Erregers der Pocken• Diagnostik und Differentialdiagnostik

– Elektronenmikroskopie– Nachweis von Nukleinsäuren– Erregeranzucht

• Probenahme und Versand• Diagnostik aus Patientenmaterial und aus

Umweltproben• Liste der Laboratorien zur Pockendiagnostik

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Pocken

• Erreger: Variola-Virus• Inkubationszeit 12 bis 14 Tage (7 - 19 Tage)• Hohe Viruskonzentrationen in Vesikeln

und Krusten• Übertragung über Tröpfchen, hohe

Viruskonzentration in Saliva• Letalitätsrate ca. 30 % (Variola major)

bzw. ca. 1 % (Variola minor)

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Pocken als Biowaffe

1754/67 Briten „schenkten“ Indianern in Nordamerika Pockenvirus-verseuchte Decken

> 50% der Mitglieder der betroffenen Stämme starben

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Tag 3 Tag 5 Tag 7

Pocken - klinisches Bild

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Klassifizierung von Chondropockenviren

(Pockenviren der Vertebraten)

Orthopoxviren Variola, Vaccinia, Affenpocken, Kuhpocken, Kamelpocken

Avipoxviren Geflügelpocken, KanarienpockenCapripoxviren Ziegenpocken, Schafspocken, Lumpy Skin

DiseaseLeporipoxvirus MyxomatoseParapoxvirus Orf, PseudokuhpockenSuipoxvirus SchweinepockenMolluscipoxvirus Molluscum contagiosumYatapoxvirus Tanapocken, Yabapocken

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Orthopockenviren

Virus Infektionen bei Wirtsbereich Variola Mensch

engVaccinia Büffel, Kuh, Mensch, Schwein, breit Kaninchen, natürlicher Wirt?Affenpocken Menschenaffen, Affen, Mensch breit natürlicher Wirt: Eichhörnchen (?)Kuhpocken Karnivoren, Kuh, Mensch, Ratte breit natürlicher Wirt: Gerbils, Nagetiere (?)Kamelpocken Kamel engEctromelia Mäuse, natürlicher Wirt (Wühlmäuse?) engWaschbärpocken Waschbär (racoon) breit?Wühlmauspocken Wühlmäuse (vole) eng Uasin-Gisha-Pocken Pferd, natürlicher Wirt? mittel Taterapocken Tatera kempi (Gerbilart) eng

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Übersicht über die Laboruntersuchungen

• Elektronenmikroskopie– orientierende Schnelldiagnostik (ca. 30 min.)– Unterscheidung zwischen Herpesviren, Para- und

Orthopockenviren

• Nachweis von Nukleinsäuren/Sequenzierung– Unterscheidung zwischen verschiedenen

Orthopockenviren (innerhalb von 24 h)

• Virusanzucht– Nachweis der Vermehrungfähigkeit

(Asservierung für weitergehende Untersuchungen)

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Herpesvirus Orthopockenvirus Parapockenvirus

EM-Differenzierung von Pockenviren und Herpesviren

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Quelle Fotos: RKI, H. Gelderblom

EM-DifferenzierungVerschiedene Aspekte der Orthopockenviren

(OPV)

OPV: mit Virushülle OPV: M-Form OPV: M-Form+C-Form

Quelle Fotos: RKI, H. Gelderblom

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Elektronenmikroskopie

• Fixierung des Probenmaterials (z.B. mit 4 % Formaldehyd in 0,05 M HEPES-Puffer pH 7,0 oder PBS)

• Außen-Dekontamination des Fixier-Röhrchens(z.B. mit 10 % Formaldehyd oder 2,5 % Natrium-Hypochlorid oder 2 % Peressigsäure)

• Negativkontrastierung(stabile, stark adhäsive Trägernetze; als Kontrastmittel parallel Phosphorwolframsäure und Uranylazetat oder Ammoniummolybdat)

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ElektronenmikroskopieAufarbeitung von Proben für den Versand

Quelle: RKIQuelle Fotos: RKI

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• Probenahme durch den verantwortlichen Arzt (1, 2)

• Pockenbläschen mit Schere, Pinzette o.ä. öffnen (1) bzw. Schorf mit Pinzette entnehmen (2)

• Vesikelprobe auf Objektträger, direkt oder mit Tuberkulin-spritze (1)

• Lufttrocknen (1, 2)

• Inaktivierung (1, 2)

• bruchsicherer Container (1, 2)

• Sterile Umverpackung (1, 2)

1 Versand von Vesikelflüssigkeit

2 Versand von Vesikeln / Schorf

ElektronenmikroskopieAufarbeitung von Proben für den Versand - Grid-

Methode

• EM-Trägernetz mit dunklen „Ober“- Seite für 2-3 sec auf die Bläschenflüssigkeit abdrücken, pro Läsion 2-3 Grids

• Lufttrocknen in der Pinzette

• Inaktivierung mit 4% Formaldehyd in PBS oder HEPES-Puffer

• Versand:- beschriftetes Röhrchen- sterile Umverpackung

Quelle Fotos: RKI

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Nachweis von Nukleinsäuren

• Inaktivierung des Probenmaterials(z.B. mit Lysispuffer 25-50 % Guanidiniumchlorid)

• Außen-Dekontamination des Fixier-Röhrchens(z.B. mit 10 % Formaldehyd oder 2,5 % Natrium-Hypochlorid oder 2 % Peressigsäure)

• Probenaufbereitung/Isolierung der DNA(Protease, AL-Puffer)

• Nachweis von Nukleinsäuren– Consensus PCR (Vertreter der Orthopoxviridae OPV)– Differenzierung des Variola-Virus von anderen OPV

(Sequenzierung z. B. crmB-Gen, ATI-Gen, HA-Gen oder validierte Varila-spezifische PCR )

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Erregeranzucht

• Nur aus nicht-inaktiviertem Probenmaterial• Nur in Laboratorien der Sicherheitsstufe 4

(BSL4)

• Eine Differenzierung erfolgt nach Präparation der Virus-DNA über PCR mit Sequenzierung und phylogenetischer Analyse

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Gewinnung klinischer Proben

Zusammenfassung der Möglichkeiten zur Probenahme:EM: 1) getrockneter Abstrich auf Objektträger, fixiert mit 4 % FA

2) Spritze: Spritzen-Inhalt in Röhrchen mit wenig 4% FA3) Spritze: Übertragung in ein Röhrchen, fixiert mit 4 % FA4) Direkter Abklatsch (Grid) fixiert mit 4 % Formaldehyd

PCR: Aliquot in Reaktionsröhrchen (in einer Glove-Box)

Benötigtes Material zur Probenahme:• Schutzausrüstung• Pinzette, Schere, Spritze, Objektträger, Grid (je nach Technik)• Versandröhrchen (z.B. Einfrierröhrchen)• Stoßsichere, auslaufsichere Umverpackung (mit Beipackzettel)Zur Fixierung/Desinfektion :• 4 % Formaldehyd in PBS oder HEPES-Puffer (EM)• Lysispuffer AL, Puregene Kit, o. ä. (PCR)• Desinfektionsmittel zur Außendekontamination

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Gewinnung von Umweltproben (1)

• Probenahme durch Einsatzkräfte (z.B. Feuerwehr)• Sicherstellung, dass kein explosiver Stoff / kein

chemischer Kampfstoff enthalten ist• Risikoanalyse:

– Fall 1: geschlossenes Behältnis– Fall 2: geöffnetes Behältnis (a) Feststoff, (b) Pulver, (c) Flüssigkeit– Fall 3: Freisetzung

• Schutzkleidung anlegen• Probenahme• Außendesinfektion des Probenahmegefäßes• Stoßfeste Umverpackung• Beschriftung der Umverpackung

(Fundort, Datum, Uhrzeit)17

Gewinnung von Umweltproben (2)

• Schwarzbereich: durch Probe kontaminierter Bereich– Schutzanzug mit positivem Druck– Raum verschließen – Desinfektion der Oberflächen (Entscheidung, ob und wann )

• Graubereich: Übergangsbereich (Schleuse)– Außendesinfektion des Probenahmegefäßes– weitere Verpackung des Probenmaterials– Desinfektion der Schutzanzüge etc.

• Weißbereich: nicht-kontaminierter Bereich– Betreten nur nach Desinfektion der Schutzkleidung– Nur steril verpackte Probe

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Probentransport

• Schnellstmöglicher Probentransport zum Labor (Wenn anderweitig nicht sichergestellt, muss der Transport per

Polizeistreife oder Hubschrauber erfolgen.) • Information des Ansprechpartners im Labor• Verpackung der Probe laut Sicherheitsbestimmungen und

Anforderungen an die Diagnostik• Lückenloses Probennahme- und Transportprotokoll

(inklusive Personen, Probenzustand und Zeiten)

• Persönliche Übergabe durch vorab bestimmten Kurier (Übergabeprotokoll wird momentan erstellt)

• Sofortige Bestätigung des Probeneingangs durch das Labor an den behandelnden Arzt oder zuständigen Amtsarzt

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z.B. Pulver, Erdprobe,

Wasser, Abklatsch etc.

UmweltprobeKlinische Probe

z.B. Rachenabstrich; Blut;Vesikelinhalt; Krusten

Pockenvirusdiagnostik

1. Fixierung für EM

2. Inaktivierung für PCR

3. Asservierung für Anzucht

Negativkontrastierung(Differentialdiagnose zu VZV)Orthopockenviren

Anzucht in Zellkultur

Differenzierung mit PCRSequenzierung

PCR

Orthopocken- undVariola-spezifischePrimer bzw. Sonden

Probenasservierung

Vorbereitung von drei Probengefäßen: Die Schritte 1–3 werden bei klinischen Proben direkt bei der Abnahme von Patienten und bei „Umweltproben“ in einer Glove Box durchgeführt. Eine Anzucht von Pockenerregern ist nur in BSL-4-Laboratorien möglich. Nach Fixierung bzw. nach Inaktivierung können die Proben unter BSL-1/-2-Bedingungen weiter bearbeitet werden

.

Untersuchung im EM

Klinische Probe: Verdacht

Umweltprobe: Verdacht

Klinische Probe: bestätigt

Umweltprobe: begründeter Verdacht Umweltprobe: bestätigt

positiv beide positiv beide positiv

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Verdacht auf Pockenviruserkrankung:

Elektronenmikroskopischer Nachweis eines Orthopockenvirus aus klinischer Probe

Bewertungskriterien für Untersuchungen auf humane

Pockenviren in klinischem Material (1)

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Bewertungskriterien für Untersuchungen auf humane

Pockenviren in klinischem Material (2)

Bestätigt positiv:Positive Orthopockenvirus-/Variola-PCR aus klinischem Material und Bestätigung mit validierten molekularen Methoden (validierte PCR, Sequenzierung)

oderElektronenmikroskopischer Nachweis eines Orthopockenvirus aus klinischem Material und Bestätigung mit validierten molekularen Methoden (PCR, Sequenzierung)

(Anzucht von Pockenviren aus klinischem Material und Bestätigung von Variola mit validierten molekularen Methoden (PCR, Sequenzierung))

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Bewertungskriterien für Untersuchungen auf humane

Pockenviren in “Umwelt”proben

Verdacht:Elektronenmikroskopischer Nachweis eines Orthopockenvirus aus

einer Umweltprobe begründeter Verdacht:PCR positiv für Orthopockenviren bzw. für Variola; Differenzierung der Viren mit validierten molekularen Methoden (PCR,

Sequenzierung, Stammbaumanalyse) Bestätigung:Anzucht von Pockenviren zum Nachweis der Vermehrungs-fähigkeit in Zellkultur und Bestätigung von angezüchtetem Variolavirus mit validierten molekularen Methoden (PCR,

Sequenzierung, Stammbaumanalyse) 23

Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin BSL 4Prof. Dr. H. SchmitzDr. Stephan Günther20359 Hamburg

Institut für Virologie der Universität Marburg BSL 4Prof. Dr. Hans-Dieter KlenkDr. Jan ter Meulen / Dr. Stephan Becker35037 Marburg

Robert Koch-Institut BSL 3Konsiliarlaboratorium für EM-ErregerdiagnostikDr. Hans R.GelderblomRetrovirologie, Prof. Dr. Georg Pauli13353 Berlin

Niedersächsisches Landesgesundheitsamt BSL 3Dr. Matthias PulzDr. Masyar Monazahian30449 Hannover

Institut für Medizinische Virologie BSL 3Prof. Dr. H. W. DoerrProf. Dr. Holger Rabenauder Johann Wolfgang Goethe-Universität60596 Frankfurt/Main

Sanitätsakademie der Bundeswehr BSL 3Dr. Hermann MeyerDr. FinkeInstitut für Mikrobiologie80937 München

Bayerisches Landesamt für Gesundheit undLebensmittelsicherheit Oberschleißheim BSL 3Dr. Gerbermann85764 Oberschleißheim

Institut für Medizinische BSL 3Prof. Dr. Hans WolfProf. Dr. Wolfgang JilgMikrobiologie und Hygiene93053 Regensburg

Vorschlag für Laboratorien zur Pockendiagnostik

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Diagnostische EM-Laboratorien mit überprüfter Expertise*

25* Expertise geprüft von der DVV

Institution Abteilung PLZ OrtLUA Sachsen Standort Dresden 1099 DresdenIZW-Friedrichsfelde Elektronenmikroskopie 10315 BerlinBBGes-ILAT Institut für Lebensmittel, Arzneimittel 10557 BerlinFU Berlin, UKBF Inst. für Infektionsmed., Abt. Virologie 12203 BerlinBgVV FG 306 12277 BerlinRobert-Koch Institut ZBS 4, Bildgebende Verfahren 13353 BerlinLVL Brandenburg Laborbereich Potsdam 14469 PotsdamLVL Brandenburg Laborbereich 15236 Frankfurt/O.BFAV Insel Riems 17493 Greifswald-Insel RiemsBernhard-Nocht-Institut Elektronenmikroskopie 20359 HamburgUniversitätsklinikum Kiel Inst. f. Med. Mikrobiologie u. Virologie 24105 KielWehrwissenschaftliches Institut für Schutztechnologien, Virologie 29633 MunsterMedizinische Hochschule Hannover, Institut für Virologie 30625 HannoverUni Bielefeld Zentrum für Ultrastrukturelle Diagnostik 33615 BielefeldUniversität Marburg Institut für Virologie 35037 MarburgJustus-Liebig-Uni Gießen Institut f. Virologie, FB10, VetMed 35392 GießenJustus-Liebig-Uni Gießen Inst.f.Hyg. u. Infektionskrankh. d. Tiere 35392 GießenDt. Primatenzentrum GmbH Abt. Tiermedizin u. Primatenhaltung 37077 GöttingenLUA Sachsen-Anhalt Standort Stendal 39576 StendalUniv.-klinikum Münster Institut f. Medizinische Mikrobiologie 48151 MünsterUniversität Bonn Inst. f. Med. Mikrobiologie u. Immunol. 53105 BonnZentrales Institut des Sanitätsdienstes d. Bundeswehr, Elektronenm. 56070 KoblenzLUA, FB Tiermedizin Inst.f. Tierseuchendiagnostik 56073 KoblenzStaatl. Veterinäruntersuchungsamt, Diagnostik/ Virologie 59821 ArnsbergUniversität Frankfurt/ Main Institut f. Medizinische Virologie 60596 Frankfurt/M.Paul-Ehrlich Institut Abteilung 3/3 63225 LangenUniklinikum Institut für Anatomie und Zellbioologie 66421 Homburg / SaarBundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten, Inst. für Immunologie 72076 TübingenLudwig-Maximilians-Univ. Institut f. Medizinische Mikrobiologie 80539 MünchenBayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 85764 OberschleißheimUni-Klinikum Regensburg Zentrales EM-Labor, Pathologie 93042 Regensburg