Contenido 1INTRODUCCIN.1 2FUNDAMENTOS TERICOS.2 3MATERIALES Y
MTODOS13 3.1TAMAO MXIMO DE CRISTAL DE LISOZIMA POR GOTA Y F, FACTOR
DE XITO, AMBOS A 20 Y 21C.18 3.2ESTUDIO DE LA METAESTABILIDAD DE LA
LISOZIMA (20C).18 4RESULTADOS Y DISCUSIN.19 4.1TAMAO MXIMO DE
CRISTAL DE LISOZIMA POR GOTA Y EL FACTOR DE XITO A 20 Y 21C. MTODO
DE HANGING DROP (HDM).19 4.2ESTUDIO DE LA METAESTABILIDAD DE LA
LISOZIMA, 20C.23 5CONCLUSIONES.26 6BIBLIOGRAFA Y REFERENCIAS.27
Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de Cristales de Protena
FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/091 1Introduccin.
Lairradiacinconultrasonidoshademostradoseruneficientemtodopara
conseguir nucleacin heterognea en la cristalizacin de lisozima de
clara de huevo.Se han analizado y ajustado las condiciones de
irradiacin, de modo que estas no
resultasenperjudiciales,daandoloscristalesoinclusoesparciendolasgotasdelas
placasdecristalizacin.Estosdaossonproducidosacausadelacavitacin,causada
porlairradiacinultrasnica(ondasacsticas),yelaumentodetemperaturadela
muestra que esta pueda implicar.
Concortosperiodosdeirradiacinseguidosdeunmayorintervaloensu
ausenciayunligeroaislamientoenelequipo,desaparecicualquiertipodedao
observable en las gotas.Los experimentos realizados usando los
mtodos de hanging drop y microbatch
a20y21C,demostraronclaramentequeelusodeultrasonidospromuevela
nucleacin.Habiendoobtenidocristalesenunmayorrangodecondiciones,se
comprobqueelefectoproducidocorrespondealadisminucindelazonade
metaestabilidad.
Alastemperaturasestudiadas,eltamaodeloscristalesenausenciade
irradiacin result ser mayor que en su presencia. Este efecto no
parececontribuir a la mejora de la calidad de los cristales, pero
son necesarios ms conocimientos, por lo que se realizarn estudios
futuros al respecto. Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de
Cristales de Protena FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/092
2Fundamentos Tericos.
Lacomplejidaddelosprocesosbiolgicossebasaenlasimplicidaddelos
comportamientos de las unidades que los
constituyen.Lasprotenassonmacromolculasorgnicasconstituidasprincipalmentepor
carbono,hidrgeno,oxgenoynitrgeno,aunquefrecuentementecontienenazufre,
fsforoeinclusoalgunosmetalescomohierro,magnesioocobre.Todascoincidenen
su estructura qumica central, diferencindose por su estructura
primaria, lo que definir sus diferentes funciones en el organismo
(estructurales, metablicas o reguladoras).
Estasmacromolculassoncadenasdeaminocidosqueseplieganadquiriendo
unaestructuratridimensional.Suestudiodetalladoserfundamentalparaconocery
comprenderbienelfuncionamientodelasmismas,pudiendoasdesarrollarfrmacos,
materialesoterapias,ademsdeacelerarconsiderablementelosprocesosyreducirlos
costes de forma relevante [1].
Lacristalizacindegrandesmolculasbiolgicasesunproblemadegran
dificultad que se aborda utilizando desde las teoras clsicas de
crecimiento cristalino hasta las ltimas tecnologas de investigacin
espacial. Su importancia reside en que es
elpasoineludibleparadesvelarlaestructurantimayparacomprenderel
funcionamientodeestasmolculas,protagonistasindudablesdelacienciadelsiglo
XXI. Juan Manuel Garca Ruz & Fermn Otlora Muoz [2].
Existeninmensosejemplosdesarrolladossiguiendoestastcnicas,delosms
conocidos es el caso de los frmacos contra el VIH, los inhibidores
de la
transcriptasa-reversa-proteasa[3].OtroejemplopodraserelImatinib,frmacoaltamenteselectivo
con tirosina-quinasa, causante de la leucemia mieloide crnica (CML)
[4].EnelcasodelVIH,trasconocerlaestructuradelaproteasaimplicada(1989),
losinvestigadoresempezaronadesarrollarmolculasmsymspequeasconefecto
inhibidordelaenzimaycorrigiendotodosloserroresanteriormentecometidos.En
1995fueaprobadoporlaFoodandDrugAdministration(FDA)deEE.UUelprimer
inhibidordelatranscriptasa-reversa-proteasa,elsaquinavir(Hoffmann-LaRoche),
seguidoen1996porelritonavir(LaboratoriosAbbott)yelindinavir(Merck).Esto
implicaunprocesodemenosde8aos,cuandolonormalserade12a15aosy Efecto
de Ultrasonidos en la Produccin de Cristales de Protena FEUP-IBMC
Proyecto Fin de Carrera 2008/093
millonesdedlaresinvertidos.(Desarmedeunvirusmortal:lasproteasasysus
inhibidores [5]. Figura 1. Proteasa causante del VIH. Molcula
simtrica con el ncleo activoen el centro y dos partes iguales a los
lados [6].
Latcnicamsusadaparadeterminarestructurastridimensionalesesla
cristalografaporrayosX,aunquemstardecomenztambinaserusadala
espectroscopa de RMN, que se aplic por primera vez, con este uso,
en la dcada de los
80.FueKurtWthrich,qumicosuizo,quincomenzelestudioestructuralde
biomolculasconestatcnica.Recibi,pordichotrabajo,elpremioNobelenelao
2002. LahistoriadelosrayosXcomienzaen1895,consudescubrimientopor
WilhelmConradRntgen,primerPremioNobeldeFsica(1901).Sonnecesarios
algunosaoshastaqueMaxVonLauedescubreelfenmenodeladifraccin
(comenzando con l la cristalografa y el primer diagrama de
difraccin), Premio Nobel de Fsica en 1914. El hallazgo de Max von
Laue no pas desapercibido, al menos para
losbritnicosWilliamHenryBraggysuhijoWilliamLawrenceBragg,quienesen
1915 compartieron el Premio Nobel de Fsica al demostrar la utilidad
del fenmeno que haba descubierto von Laue, para obtener la
estructura interna de los cristales. A lo largo
delosaos40,DavidHarker,qumicoEstadounidense,secentrenlaresolucindel
problema de las fases (debido a la diferentes direcciones y ngulos
de difraccin) con la
aplicacindelafuncindePattersonyconsupropiotrabajo,desarrolladoen
colaboracin con John S. Kasper, los mtodos directos.Con un lugar
prominente en la
CienciadelsigloXX,JohnD.Bernaldemostrque,encondicionesadecuadas,un
Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de Cristales de Protena
FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/094
cristaldeprotenapodamantenersucristalinidadalexponerloalosrayosX,yfueel
motor de grandes estudios cristalogrficos posteriores.Rosalind
Franklin obtuvo losprimeros diagramas de fibra del ADN, pero muri
prematuramentealos37aosyenrelacinconestadesafortunadahistoria,Maurice
Wilkins,JamesWatsonyFrancisCrickrecibieronelPremioNobeldeFisiologao
Medicina en 1962 por el descubrimiento de la estructura de la doble
hlice del ADN [7] y
[8].ElanlisisconcristalografaderayosXsloserposiblesilamuestrase
encuentraenformademonocristal,loquesuponeunagrandesventajafrenteala
posibilidaddetrabajarcondisoluciones,comosucedeconlaRMN.Adems,la
cristalografa de rayos X provoca cierta inestabilidad en la
muestra, sin llegar esta a ser
destructivaysolucionndosedichosproblemasconelusodecondicionescriognicas
[9].A continuacin, se muestra la cantidad de estructuras estudiadas
por cada una de las tcnicas de citadas anteriormente (Figura 2). En
ellas, se observa el trabajo realizado hasta la actualidad, siendo
posible establecer una comparacin entre ambas.
ComosemuestraenlaFigura2asehallegadoyahastaunnmerode50.000
estructurasanalizadasmediantecristalografaporrayos-X,frentea8.000,estudiadas
por RMN (Figura 2b). Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de
Cristales de Protena FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/095
Figura 2. Nmero de estructuras estudiadas por rayos X (a) y por RMN
(b) desde 1993 hasta la actualidad. En ambas figuras es posible
observar los datos anuales (azul), como los acumulados a lo largo
de los aos representados (rojo). (Protein Data Bank, www.pdb.org)
(a) (b) Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de Cristales de
Protena FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/096
Hayquevencermuchosobstculosexperimentalesantesdequelaestructura
tridimensionaldeunaprotenaseadeterminadapordifraccinderayosX.Primerola
molcula debe ser cristalizadayelcristal debe ser singularyde
impecable calidad. Se entiende como cristal, la repeticin de la
celda unidad de tomos, iones o molculas en
tresdimensiones,porloquedeberntenerunacorrectaorganizacindedichasceldas
adems de un cierto tamao
[10].Porotraparteestelfenmenodelacristalizacinens.Prcticamenteseha
consideradounarte(tcnicadeensayo-error)hastanohacedemasiadotiempo.Hoy
en da hay quien sigue considerndola as, o quien trabaja para
transformarla en ciencia
[2].Thefirstreliesonempiricaltechniquesthatarebasedmainlyontrialand
error, and what is perceived to be the art of crystallisation. The
second approach is
aimedatgaininganunderstandingofthefundamentalprinciplesthatgovern
crystallizationChayen NE [11]. Para entender los principios bsicos
de la cristalizacin es fundamental estudiar
detalladamenteeldiagramadefases,necesitandotenerclarosconceptoscomo
solubilidad y sobresaturacin, entre otros.
Lasolubilidadeslaconcentracinmximadeunsolutoenequilibrioparaun
determinadoconjuntodecondiciones(pH,temperatura,fuerzainica).Cuandola
concentracin de soluto sobrepasa dicho lmite, se dar la
sobresaturacin,. El diagrama de fases mostrar el comportamiento de
una solucin de protena, su estado ms estable, segn las diferentes
condiciones y parmetros ajustables usados. El parmetro ajustable ms
habitual es la concentracin de agente precipitante, pero puede ser
la temperatura, el pH o la concentracin aditiva. Conociendo el
diagrama de fases se
podrnescogerdirectamentelosrangosdeintersdesdeeliniciodelaexperiencia,
evitandoasgrancantidaddeexperimentosdeensayo-errorenlabsquedadelas
mejores condiciones de cristalizacin (Figura 3) [11]. Efecto de
Ultrasonidos en la Produccin de Cristales de Protena FEUP-IBMC
Proyecto Fin de Carrera 2008/097 Figura 3. Diagrama de fases de
cristalizacin de protena, donde habitualmente se asume como
parmetro ajustable la concentracin de agente precipitante. La curva
de solubilidad separa la zona de subsaturacin de la de
metaestabilidad, por lo que todo el proceso girar en torno a ella.
Tambin se observa la curva de supersaturacin separando la zona de
nucleacin de la zona metaestable, razn por la que tendr gran
importancia [11].
Soncuatrolosprincipalesmtodosdecristalizacinposibles,diferencindose
porloscaminosqueseguirnenelproceso(curvasi,ii,iii,ivdelaFigura3)de
obtencin de cristales estables. Segnel objetivo o la experienciaa
realizar, habr que escoger uno de ellos. Los ms usados por su
simplicidad y resultados, suelen ser los de
difusindevapor,aunquetienengranimportanciatambinlosdemicrobatch,
contradifusin y dilisis [11]. En los mtodos de difusin de vapor
(Figura 3, curva ii), hanging drop y sitting
drop(gotacolganteysentada)lagotasecomponedeprotena,agenteprecipitantey
disolucin tampn (estas dos ltimas suelen ira la par por encontrarse
formando parte
delreservatorio).Habrevaporacindelassustanciasvoltiles(aguaosolvente
orgnico)hastaqueseequilibrelapresindevaporentrelagotayelreservatorio
(Figuras 4 y 5) [12]. Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de
Cristales de Protena FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/098
Figura 4. Modelo esquemtico de la tcnica de hanging drop usado para
la derivacin de la cintica de evaporacin terica [13].
Normalmenteelusodeagentesprecipitantesdisminuyelasolubilidaddela
protenaenladisolucin.Cuandoocurraexactamentelocontrarioyseproduzcaun
aumentodelasolubilidad,sercuandoseuselatcnicademicrodilisis(Figura3,
curvaiii).Elprincipiobsicodelacristalizacinpormicrodilisissebasaenla
permeabilidad de la membrana (Figura 5c). Esta dejar pasar pequeas
molculas como
ionesoaditivos,peronoalaprotena.Lacinticadelequilibriodependerdela
concentracindelagenteprecipitante(tantodentrocomofueradelamembrana),dela
temperatura, de la geometra del sistema o/y del cut-off [14].
Figura 5. Esquema de los mtodos hasta ahora citados de
cristalizacin de protenas [14].
Enmicrobatch(Figura3,curvai)seusaunaconcentracindeagente
precipitante tan alta que la supersaturacin es prcticamente
instantnea en el momento
delapreparacindelagota.Esposibleobtenerbuenoscristalescercadelazonade
Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de Cristales de Protena
FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/099
metaestabilidad.Silasupersaturacinfueramuyalta,tendranquedisolversepartede
lospequeoscristalesodelprecipitadoparaqueaumentasensutamaolosdems
cristales existentes (efecto de Ostwald ripening) [12] y
[15].Elsistemamicrobatchhabitualseefectacubriendoconparafina,asseforma
unsistemacerradoquenopermitirlaevaporacindelagota(Figura6).Existeun
mtodomodificadodemicrobatchdondeseusasiliconaenvezdeparafina,ouna
mezcladeambas,estopermitirlaevaporacindelaguadelamuestra,concentrando
los reactivos de la gota [16] y [17]. Figura 6. Gota sumergida en
aceite inerte segn el mtodo de microbatch [15].
Otraformadeconseguirmicrobatchseraseguirelprocedimientodelatcnica
de hanging drop, pero ajustando las concentraciones del
precipitante entre la gotay su
reservatorio,forzandoaselequilibrioyevitandocualquierindiciodetransferenciade
masa [13]. El principal inconveniente de microbatch es que es
relativamente difcil cambiar las condiciones de uso de una misma
protena [12].
Paraelmtodoporcontradifusin(Figura3,curvaiv),latcnicasebasaenla
contradifusindelcompuestoquesequierecristalizarydesuagenteprecipitante,es
decirelcompuestoutilizadoparadisminuirlasolubilidaddelcompuestoacristalizar.
Su implementacin necesita por tanto de dos recipientes, en uno de
ellos se coloca una
solucindelcompuestoacristalizaryenelotrounasolucindelagenteprecipitante.
Ambos recipientes se conectan a travs de un tercero que se rellena
con un lquido que
nointerfieraenlareaccindeprecipitacin,porejemploelsolventeutilizadopara
prepararlassoluciones.Eltrucoenestatcnicaconsisteenescogerunascondiciones
iniciales que mantenganel sistema lejos del equilibrio, es decir
justo al contrario de lo que habitualmente se hace en los
experimentos de cristalizacin. Si conectamos ambos
recipientes,lasdossolucionesempezarnadifundirunacontralaotra.Debemos
asegurarqueunadelasdos(concretamenteladelagenteprecipitante)avancems
rpido de tal forma que invada a la otra [18].Efecto de Ultrasonidos
en la Produccin de Cristales de Protena FEUP-IBMC Proyecto Fin de
Carrera 2008/0910
Paracualquierprocesodecrecimientocristalinolacinticadeformacinde
ncleoscristalinosestables(nucleacinprimaria)tendrgranimportancia.Ser
imprescindiblequelabarreraenergticaseavencidaparaquesedelanucleacin,
superando un radio crtico al que se correspondern los ncleos
estables (Figuras 7 y 8). Figura 7. Energa necesaria para la
formacin del cristal en funcin de su radio crtico [18]. Figura 8.
Variaciones en la barrera de la energa de activacin en funcin de la
supersaturacin
[18].Traslanucleacincomenzarelprocesodecrecimientocristalino,esdecir,el
procesodeordenacindetomos,ionesomolculasparaformarlaredcristalina.La
posicin ms favorable para dicho crecimiento ser la del rincn, por
lo que tendern a esta la mayor parte de unidades del sistema. Por
el motivo anteriormente descrito, el crecimiento cristalino seguir
un modelo
quecontengaelmayornmeroposibledeposicionesderincn,elmodelode
crecimientoenespiral(Figura9),graciasalasdislocacioneshelicoidalesquesevan
autogenerando [19]. Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de
Cristales de Protena FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/0911
Figura 9. Crecimiento cristalino en espiral [20].
Algunasteorasafirmanqueesteprocesoesespontneoylavelocidadde
crecimiento dependiente del radio de curvatura de la espiral
[21].Otras defienden que el
procesoesenergticamenteactivadoylavelocidaddecrecimientoindependientedel
radio de curvatura de la espiral, siendo esta V una vez alcanzado
el tamao crtico [22].
JugandoalTetrissepuedecomprobarlaimportanciadelarelacin
"velocidaddetransporte"/"cinticadesuperficie"("velocidaddecaidadefichas"/
"periciadeljugador")enlacalidaddelcristalresultante.JuanManuel
Garca Ruz [23].
Elexperimentodecristalizacinidealseraquelenelquelasmolculas lleguen
a la superficie del cristal con velocidad igual o menor a la de su
reorganizacin en la superficie. Juan Manuel Garca Ruz [2].
Conelobjetivodeconoceryestudiarlosfundamentosbsicosdela
cristalizacin de protenas se proseguir con la bsqueda de nuevos
mtodos racionales
queayudenadestapartodossusmisterios,acercndolacadavezmsaunacienciay
dejando atrs el arte que supona este proceso. El control de la
nucleacin sera un paso determinativo enesteavanceyde ah que se
emprendiera con gran esfuerzo, desde 1998, la bsqueda del nucleante
universal,
aquelqueconsigainducirdeformaeficienteycontroladalanucleacinheterognea
[11].Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de Cristales de Protena
FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/0912
Hansidoestudiadoscomonucleantesheterogneosleos,superficies
modificadas,camposmagnticos,presin,seedingyultrasonidosentreotros[24,25].
Hastaelmomentoelxitodeestosmtodoshasidolimitado,perosecontina
investigandoymejorandodichastcnicas,comoeselcasodelusodematerialescon
mesoporos que albergan molculas de protena [11].
Losultrasonidosconsiguenactuarcomonucleantesheterogneosdebidoal
fenmenodelacavitacinultrasnica[26],[27],[28]y[29].Duranteesteprocesose
producenburbujasdeaireconcondicionesdetemperaturaypresinmuyelevadas,lo
quefavorecelanucleacinporreducirconsiderablementeelradiocrticodelncleo
parainducirlanucleacin[30].Otraformadeveresteefectoseraconsiderarla
superficie de las burbujas de la cavitacin como centros de
nucleacin [26] y [31]. Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de
Cristales de Protena FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/0913
3Materiales y Mtodos
Lastcnicasdecristalizacinusadaspararealizarlasexperienciashansido
hanging drop (vapor diffusion) y una modificacin de la habitual
tcnica de microbatch.Una vez preparadas, las placas se sumergen en
dos baos de agua a temperatura
constante,unodeellosconultrasonidosyelotrosin,loquepermitircompararlos
resultados de ambas condiciones.
Losmaterialesusadosseresumenenplacasdecristalizacindehangingdrop
(juntoatodoelmaterialsecundarionecesarioparalapreparacindeestas,vase
lminas de vidrio (cubres), vaselina) y las soluciones reactivas:
Disolucin tampn de Acetato sdico, pH 4.7. Disolucin precipitante,
NaCl. Disolucin de protena, lisozima
Esimprescindibleparaunacorrectacomprensin,tantodelosmtodos
realizados como de los resultados, definir el factor de xito (f):
El factor dexitorepresenta la fraccin entre las gotas en las que se
formaron cristales con respecto al total, analizadas en cada
condicin. Como su nombre indica, es el porcentaje de xito de
obtencin de cristales en las gotas de una misma condicin.
Ladisolucintampnsepreparaconcidoacticoglacial(100%)yacetato
sdicotrihidratado(M=136,08).TeniendoencuentaqueelpHbuscadoes4.7se
procede de la siguiente manera: M (A-) = 136.08 M (HA) = 60.05 (HA)
= 1.05 Kg/ l 0.871 =
Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de Cristales de Protena
FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/0914 Se quiere una [HA] de
0.2 M y un volumen de 0.5 litros, por lo que el volumen de cido y
la masa de base a usar sern: VHA = 5.719 mlyMA- = 13.608 g A
continuacin se preparan ambas soluciones en volmenes de 250 ml cada
una (matrazaforado).Trasesto,semezclarnenun
vasodeprecipitadosde500mlconla ayuda de un pH-metro (as como
agitadores magnticos que aseguren la homogeneidad de la mezcla) y
se filtrar al vaco usando un filtro de celulosa de 0.2m.
Paralapreparacindeunvolumende250mldedisolucinprecipitantede
NaClal10%sernnecesarios25gdelasal.Estasolucinseprepararenunmatraz
aforado, siendo el acetato sdico (disolucin tampn) el disolvente
usado.
Porltimosepreparalasolucinproteica(estaserpreparadaparacadauso).
Enunvolumende0.5 mldeacetatosdico,omenor,segnlanecesidad,sediluirla
cantidadqueconvengadelisozima,conlaayudadeunagitadorycentrifugandounos
10 minutos. La concentracin usada para los ensayos de medida del
tamao mximo por gota y el factor de xito (vase apartado 3), ser de
50 mg/ml. En los casos del estudio de la metaestabilidad se usaron
diferentes concentraciones. Tras la preparacin de las disoluciones
se procede con las placas. Como ya se ha indicado, las placas
usadas han sido de hanging drop en todos los ensayos.A continuacin
(Figura 10) se muestra un esquema de la planta de una placa y se
explicar el procedimiento a seguir con las mismas. Figura 10.
Planta de una placa de hanging drop El primer paso para preparar
una placa de cristalizacin de este tipo ser decidir
laorganizacinenelladelasdiferentescondicionesaestudiar(diferentes
concentraciones de la solucin precipitante o de la
proteica).Acontinuacinsepreparanlasdisolucionesparalosreservatoriosconlas
concentraciones que se crean convenientes de agente precipitante y
de solucin tampn. Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de
Cristales de Protena FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/0915
Esnecesarioaplicarvaselinaenelcontornodecadaunodeloshuecos
cilndricosparaconseguirunbuenaislamientoyquesloexistaevaporacinentrela
gota y el reservatorio.
Elvolumenelegidocomoreservatorioserde1ml,delquesepipetearla
cantidad necesaria paralas gotas. Tras esto, se preparan las gotas
sobre los cubres (lminas de vidrio siliconizado de 22 mm, Hampton).
El volumen de la gota apropiado en estos casos es entre 6 y 10 l y
se usar una proporcin de 1:1 (protena/solucin del reservatorio) en
todas ellas. Para todos los ensayos (vapor difusion y microbatch)
se formaran gotas de 8 l. El procedimiento normal (Figura 121) es
pipetear 4 l (o la cantidad que segn
elcasosehayadecidido)delreservatorioydepositarlossobreelcubre.Pipeteando
nuevamente de la solucin de protena e incrustando esto sobre la
gota ya formada (sin llegar a introducir la punta de la pipeta
dentro de la gota, siendo lo correcto que ambas
gotasseadhieranporelcontactoyaquelainterfaseeselpuntoclavedeesta
transferenciademateria)evitandoposiblesperturbacionescomoburbujasdeaireoel
contacto de los dedos con el cubre, se consigue la gota donde se
dar la cristalizacin.Girando el cubre 180 Cy adherindolo con la
vaselina anteriormente colocada
encadahuecoseconsigueunodelosveinticuatrosistemascerradosquellevacada
placa (Figura 112). Figura 11. Esquema de preparacin de una placa
del mtodo de vapor diffusion, hanging drop [14]. Efecto de
Ultrasonidos en la Produccin de Cristales de Protena FEUP-IBMC
Proyecto Fin de Carrera 2008/0916 Figura 112. Sistema cerrado
propio de la tcnica de hanging drop (vapor difusion) dentro de la
placa de cristalizacin [14]. En los ensayos destinados al anlisis
del factor de xito y a la medida del tamao
mximodecristalporgota(vaseapartado3),sepreparancuatroconcentracionesde
reservatoriodiferentes,unaporcadafiladelaplaca,conintencindeobservarlos
efectos de la variacin de la concentracin de solucin precipitante.
El experimento fue realizado a dos temperaturas diferentes: 20 y
21C (Tabla 1). Tabla 1. Diferentes concentraciones de NaCl
preparadas para cada temperatura en presencia y ausencia de
ultrasonidos por HDM Concentracin de la disolucin de NaCl (%) 20C
Con ultrasonidos22,5345,566,57 Sin ultrasonidos3,544,555,566,57 21C
Con ultrasonidos4,555,566,578,59 Sin ultrasonidos55,566,577,58,59
Enlasexperienciascorrespondientesalestudiodelametaestabilidadinteresa
que no exista evaporacin alguna (microbatch). En vez de recurrir al
mtodo habitual de microbatch se decide usar una placa de hanging
drop y ajustar todas las concentraciones
delprecipitanteforzandoaselequilibrioentrelagotaysureservatorio,evitando
cualquier indicio de transferencia de masa.
EnlaTabla2semuestranlasconcentracionesusadasenelexperimento
realizado a latemperatura de 20C. Efecto de Ultrasonidos en la
Produccin de Cristales de Protena FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera
2008/0917 Tabla 2. Diferentes condiciones usadas en las placas de
microbatch.
Unavezpreparadaslasplacas,sesumergenensusrespectivosbaos,
encontrndose estos estabilizados a una temperatura fija.
Elbaodeultrasonidosestconectadoaunprogramade96horasdeduracin
durante las que se irradian 3 segundos de cada 3 minutos.
Semuestraacontinuacinelmontajeexperimentalutilizadodurantela
experimentacin: Figura 123. Montaje experimental con dos baos de
ultrasonidos (Elmasonic S 30 H) y uno sin conectados en
serie-paralelo mediante una bomba de acuario, para garantizar la
estabilidad de la temperatura en ambos tanques. Una vez obtenidos
los cristales de protena han de revisarse peridicamente para
comprobarquesucrecimientohallegadoallmite,siendoposibleprocederconlas
[Lisozima] (mg/ml) Concentracin de la disolucin de NaCl (%)
551,522,536 301,522,53,56 2022,5356 122,533,556 83,5567- Efecto de
Ultrasonidos en la Produccin de Cristales de Protena FEUP-IBMC
Proyecto Fin de Carrera 2008/0918 mediciones oportunas. Mediante la
comparacin de fotografas con un programa grafico se decide cuando
el crecimiento deja de ser apreciable. El procedimiento a seguir en
las dos experiencias difiere considerablemente, por lo que se
decide explicar los mtodos por separado. 3.1Tamao mximo de cristal
de lisozima por gota y f, factor de xito, ambos a 20 y 21C. La
tcnica elegida para realizar esta experiencia es la de hanging
drop, debido a la simplicidad del mtodo y adecuacin al objetivo
buscado. Unavezseobservaqueelcrecimientodeloscristalessehadetenido
aparentemente,lasplacassonretiradasdesusrespectivosbaosysesacanfotografas
conunadeterminadaamplitud.Estasfotografassontratadasconelprogramagrfico
Photoshop, con el que es posible medir 2 dimensiones del cristal.
Deestaformasedeterminaelcristaldetamaomximodecadagotayse
registraenunatabladedatos,ascomoelfactordexito(f)paracadacondicin
estudiada. 3.2Estudio de la metaestabilidad de la lisozima (20C).
Debidoalintersenelconocimientodelasconcentracionesdeagente
precipitanteyprotenatantoenlagotacomoenelreservatoriosedecidiusarun
mtodo modificado del habitual
microbatch.Alcanzadoelpuntofinaldecrecimientodeloscristalesdelisozima,lasplacas
son retiradas de los baos y observadas. Se sacan fotografas con una
misma amplitud, y
estasacompaarnalosresultadosnumricos(vaseFigura17),facilitandola
comprensin con un aporte ms visual. Efecto de Ultrasonidos en la
Produccin de Cristales de Protena FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera
2008/0919 4Resultados y Discusin. 4.1Tamao mximo de cristal de
lisozima por gota y el factor de xito a 20 y 21C. Mtodo de hanging
drop (HDM). Esta experiencia se realiz a 20 y a 21C con el fin de
observar la relevancia de la temperatura en este tipo de ensayos.
Para comprobar si el uso de los ultrasonidos podra desestabilizar
la temperatura
delosbaosporrecalentamiento,setomaronfotografastrmicasdeunaplacade
cristalizacinsometidaadiferentesperiodosdeirradiacin.Esposibleobservarenla
Figura13(a)queirradiandoduranteunminutolaplacadecristalizacinnosevi
afectada.LaFigura13(b)muestralasalteracionesdetemperaturaproducidaspor
periodosdeirradiacinde10minutos.Secomprob,quecon3segundosdecada3
minutos la influencia del recalentamiento era irrelevante. Figura
134. Termogramas de una placa de cristalizacin sometida a
ultrasonidos durante 1minuto (a) y tras 10 minutos de irradiacin
(b).(a) (b) Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de Cristales de
Protena FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/0920
Losdatosfueronanalizadosyesposibleconcluirqueungradocentgrado
influye significativamente en los resultados obtenidos, as como
cualquier inestabilidad en esta u oscilaciones de la misma.Tanto a
20como a 21C, se observa la misma diferenciaconysin la presencia de
irradiacin. Claramente se aprecia como a concentraciones de NaCl ms
bajas fueron obtenidos valores de f mayores con el uso de
ultrasonidos (Figura 145).Es obvio que la irradiacin ultrasnica
consigueuna nucleacin ms precoz,en un mayor rango de condiciones de
concentracin de NaCl, comparando con el caso sin irradiacin (Figura
145). Encuantoalasdiferentestemperaturas,factordepesoenloqueaestas
experienciasserefiere,esalamenordeellasalaqueseobtienenucleacina
concentracionesdeNaClmsbajas.A20Ctambinseobservauncomportamiento
menosprogresivo,puesencuantosedalanucleacinenunagota,estasucede
prcticamente en el total de las gotas de dicha condicin (Figura
145). (a) Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de Cristales de
Protena FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/0921 Figura 145.
Fraccin de gotas por condicin que presentan cristales de protena
usando HDM en presencia y ausencia de ultrasonidos. Fueron
analizadas entre 5 y 6 gotas por condicin. a) 20 C. b) 21 C.
Parapoderanalizarlosresultadosdeltamaomximoporgotasecalculauna
mediadelostamaosmximosporcondicin(concentracindeNaCl),ytrasestose
representanconjuntamentelosobtenidosconlapresenciadeultrasonidosylos
obtenidos sin irradiacin para facilitar la comparacin (Figura 156).
(b) Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de Cristales de Protena
FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/0922 Figura 156. Media de
los tamaos mximos por gota ( L ) en cada concentracin de NaCl.
Fueron analizadas entre 5 y 6 gotas por condicin. a) 20 C. b) 21 C.
(a) (b) Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de Cristales de
Protena FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/0923
Seobservaelmismoefecto,anteriormentemencionado,conrespectoala
influencia de la temperatura en la aparicin de nucleacin. Referente
a los ultrasonidos,
estosaceleranelprocesoyconsiguenquelanucleacinsucedaaconcentracionesms
bajas, si se compara con los ensayos sin irradiacin, comprendiendo
un mayor rango de condiciones para las que es posible obtener
cristales de protena (Figura 156).
Elnicoefectoclaro,observableconrespectoaltamaodeloscristales,esel
menor tamao obtenido con la presencia de ultrasonidos (a elevadas
concentraciones ya que a las ms bajas no es efectiva la nucleacin
en ausencia de irradiacin). Respecto a
latendenciaporconcentracindelagenteprecipitante,loesperadoseraunaumento
hastaciertovalorde[NaCl],ypasadoeste,unadisminucinporelefectodel
precipitado.Avaloresaltosde[NaCl]sedaranunagrancantidaddecristalesde
tamao pequeo, incluso con la presencia de precipitado. Es posible
ver que no es esta la tendencia que muestran las figuras anteriores
(Figura 156). 4.2Estudio de la metaestabilidad de la lisozima, 20C.
Con una aproximacin de los valores mnimos de [NaCl] a los que se
produce la aparicin de cristales de lisozima para concentraciones
de 55, 30, 20, 12 y 8 mg/ml, es posible calcular la curva de
metaestabilidad.Linealizandolosdatosobtenidosseobtienelagrficamostradaacontinuacin
(Figura167),dondeesposibleverquelosajustessonrealmentebuenos,tantoparael
casocon,comoparaeldesinultrasonidos.Losdatosdelacurvadesolubilidad
proceden de la bibliografa [32], siguiendo el ajuste realizado
porMartins et al. [13]. Las ecuaciones de las rectas que se
muestran en la Figura 167 estn linealizadas bajo la expresin: Los
coeficientes A y B adoptan los siguientes valores numricos (Tabla
3): Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de Cristales de Protena
FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/0924 Tabla 3. Valores de los
coeficientes A y B en la linealizacin de las tres curvas
representadas en la Figura 167. Curvas linealizadasAB Metaestable
(sin ultrasonidos) Metaestable (con ultrasonidos) Solubilidad [32]
Figura 167.Linealizacin de la curva de solubilidad procedente de la
bibliografa y de las curvas de metaestabilidad experimentales, 20
C. Parallevaracaboestasexperienciasseusaelmtododemicrobatch,una
modificacindeestatcnica,vaseelapartado3,tantolaobtenidabajolosefectosde
losultrasonidoscomoensuausencia,serposiblecomparardeunaformamsvisual
ambos resultados. Para esto se recurre tambin a la curva de
solubilidad para 20C y pH
4.7delabibliografaanteriormentemencionada([32]y[13])ysemuestranenel
diagramadefasesfotografasdeloscristalesobtenidosenlasdiferenteszonas,
acompaando a los datos numricos.Efecto de Ultrasonidos en la
Produccin de Cristales de Protena FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera
2008/0925 Figura 178. Diagrama de fases de la lisozima, 20 C y pH
4.7, en el que se observa la curva de solubilidad y las de
metaestabilidad correspondientes a la presencia (a) y ausencia (b)
de irradiacin con ultrasonidos, acompaadas de imgenes de los
propios resultados obtenidos en las diferentes zonas del diagrama.
(a) (b) Efecto de Ultrasonidos en la Produccin de Cristales de
Protena FEUP-IBMC Proyecto Fin de Carrera 2008/0926 Es obvio que la
amplitud de la zona metaestable (MSZW) decrece con el uso de
irradiacin. Como se muestra en la Figura 18, la zona de
metaestabilidad para los datos
de[Lisozima]=20mg/mlesprcticamentelamitad(entrminosdeamplitud)conel
uso de ultrasonidos. En todos los casos los cristales han crecido
en un tiempo inferior a una semana.
Tantolanucleacincomoelcrecimientoseveninfluenciadospordiversasvariables
como la temperatura, el pH, cualquier impureza depositada en el
cubre, incluso huellas dactilares, polvo,etc. Tambin es importante
el volumen de lagota que se escoja, este comprende variables como
el rea de contacto, el ngulo de contacto, etc.
Paratodaslasexperienciasfueronusadosvolmenesdegotade8l.Sin
embargo,sloenlasexperienciasdelclculodelazonametaestableseobservaron
daos por causa de los ultrasonidos (gotas ligeramente esparcidas).
Esto se explica por la ausencia de evaporacin en el mtodo usado
(microbatch modified). Con un volumen de gota menor se hubiera
reducido tal efecto. 5Conclusiones.
Lairradiacinconultrasonidosconsiguemayorprecocidadenlanucleacin
abarcandorangosdecondicionesmsamplios,comobajasconcentracionesdelagente
precipitante. Este efecto tiene gran importancia, pues podra ser
visto como un mtodo
alternativoalseeding,oinclusouncomplementoaeste,lograndoconestomejores
resultados,deformacmoda,sencillaynosuponiendoelevadoscostesnide
equipamiento ni de manutencin.Los ultrasonidos parecen disminuir el
tamao de los cristales de
protena.Elporcentajedegotasconcristales(porcondicin)alcanzasumximoms
rpidamenteaconcentracionesdeNaClmsbajasenpresenciadeultrasonidosqueen
su ausencia. Por esto, lairradiacin ultrasnica asegura mejores
resultados en cuanto a lo que el factor de xito se refiere. Por
otra parte, est el efecto observado en las experiencias de
determinacin de
lascurvasdemetaestabilidad.Losultrasonidosconsiguenquelacurvade
metaestabilidad sea ms baja, por lo que la amplitud de la zona
metaestable ser menor yaparecerncristalesen mayor diversidad
decondiciones. Este efectoes ms acusado cuanto menores son las
concentraciones del agente precipitante. Efecto de Ultrasonidos en
la Produccin de Cristales de Protena FEUP-IBMC Proyecto Fin de
Carrera 2008/0927 6Bibliografa y Referencias.
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