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Aus der Plastisch- und Handchirurgischen Klinik
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. R.E. Horch
Die antiapoptotische und antiinflammatorische Wirku ng von
Insulin und Propranolol in LPS-stimulierten THP-1
Makrophagen
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Thomas Hrach
aus
Ansbach
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Univ ersität
Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler
Referent: Prof. Dr. med. R. E. Horch
Koreferent: Priv.-Doz. Dr. med. J. Schmidt
Tag der mündlichen Prüfung: 18. Mai 2011
Diese Arbeit widme ich in großer Liebe
meinen Eltern, meiner Schwester Barbara und meiner Freundin Jana.
Ich bin unendlich froh und dankbar, dass es euch gibt.
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung 1
2. Einleitung 5
3. Material und Methoden 12
3.1 Zellkultur 12
3.2 Stimulation der Zellen 12
3.3 Trypanblaufärbung 14
3.4 Zellproliferationsassay 14
3.5 Apoptose 14
3.5.1 TUNEL Färbung 14
3.5.2 JC-1 Färbung 15
3.6 Zytokinspiegelbestimmung 16
3.6.1 Interleukin-1β ELISA 16
3.6.2 Tumornekrosefaktor α ELISA 16
3.7 Statistische Auswertung 17
4. Ergebnisse 18
4.1 Zellvitalität 18
4.1.1 Reduktion der Zellvitalität von THP-1 Zellen durch Lipopoly-
saccharid 18
4.1.2 Einfluss von Insulin auf die Zellvitalität in LPS-stimulierten
THP-1 Zellen 19
4.1.3 Einfluss von Propranolol auf die Zellvitalität in LPS-stimulierten
THP-1 Zellen 22
4.2 Zellaktivität 25
4.2.1 Einfluss von Lipopolysaccharid auf die Zellaktivität von THP-1
Zellen 25
4.2.2 Einfluss von Insulin auf die Zellaktivität in LPS-stimulierten
THP-1 Zellen 25
4.2.3 Einfluss von Propranolol auf die Zellaktivität in LPS-stimulierten
THP-1 Zellen 27
4.3 Apoptose 29
4.3.1 JC-1 Färbung 29
4.3.1.1 Induktion von Apoptose in THP-1 Zellen durch Lipopolysaccharid 29
4.3.1.2 Einfluss von Insulin auf den apoptotischen Effekt von LPS in
THP-1 Zellen 31
4.3.1.3 Einfluss von Propranolol auf den apoptotischen Effekt von LPS
in THP-1 Zellen 35
4.3.1.4 Einfluss des NF-κB Signalwegs auf die Apoptose in
LPS-stimulierten THP-1 Zellen 38
4.3.1.4.1 Einfluss des NF-κB Signalwegs auf die Reduktion der
LPS-induzierten Apoptose durch Insulin 39
4.3.1.4.2 Einfluss des NF-κB Signalwegs auf die Reduktion der
LPS-induzierten Apoptose durch Propranolol 40
4.3.1.5 Einfluss des PI3-K Signalwegs auf die Apoptoseinduktion in
LPS-stimulierten THP-1 Zellen 41
4.3.2 TUNEL Färbung 43
4.3.2.1 Induktion von Apoptose in THP-1 Zellen durch Lipopolysaccharid 43
4.3.2.2 Einfluss von Insulin auf den apoptotischen Effekt von LPS in
THP-1 Zellen 45
4.3.2.3 Einfluss von Propranolol auf den apoptotischen Effekt von LPS in
THP-1 Zellen 48
4.4 Inflammation 51
4.4.1 Interleukin-1β 51
4.4.1.1 Einfluss von Lipopolysaccharid auf die IL-1β Expression in
THP-1 Zellen 51
4.4.1.2 Einfluss von Insulin auf die IL-1β Expression in LPS-stimulierten
THP-1 Zellen 52
4.4.1.3 Einfluss von Propranolol auf die IL-1β Expression in
LPS-stimulierten THP-1 Zellen 53
4.4.2 Tumornekrosefaktor α 54
4.4.2.1 Einfluss von Lipopolysaccharid auf die TNFα Expression in
THP-1 Zellen 54
4.4.2.2 Einfluss von Insulin auf die TNFα Expression in LPS-stimulierten
THP-1 Zellen 55
4.4.2.3 Einfluss von Propranolol auf die TNFα Expression in
LPS-stimulierten THP-1 Zellen 56
5. Diskussion 57
5.1 Einfluss von Lipopolysaccharid auf die Makrophagenkultur 58
5.2 Einfluss von Insulin auf LPS-stimulierte Makrophagen 58
5.3 Einfluss von Propranolol auf LPS-stimulierte Makrophagen 60
5.4 Rolle des NF-κB Signalwegs für die antiapoptotische Wirkung von
Insulin und Propranolol 61
5.5 Rolle des PI3-K Signalwegs für die antiapoptotische Wirkung von
Insulin 63
6. Ausblick 65
7. Literaturverzeichnis 66
8. Abkürzungsverzeichnis 74
9. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen 76
10. Anhang 76
11. Danksagung 90
12. Lebenslauf 91
- 1 -
1. Zusammenfassung
1A.1 Einleitung
Die Therapie septischer Patienten stellt für den Kliniker nach wie vor eine
Herausforderung dar. Neben der kausalen Therapie mit Antibiotika gibt es viel-
versprechende Ansätze mit verschiedenen Anabolika, wie Insulin und β-Blockern,
die sich in der klinischen Erprobung befinden. Über die Wirkmechanismen dieser
anabolen Substanzen auf das Immunsystem auf zellulärer und molekularer Ebene
ist bisher noch wenig bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Effekte von
Insulin und Propranolol auf das Zellüberleben, die Zellaktivität, die Apoptose und die
proinflammatorische Antwort in humanen Makrophagen zu bestimmen, die mit
Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert wurden.
1A.2 Material und Methoden
Humane Makrophagen (THP-1) wurden mit LPS stimuliert und anschließend mit
Insulin oder Propranolol behandelt. Zudem wurde eine Negativkontrolle unter
alleiniger Gabe von Kulturmedium durchgeführt. Die Zellvitalität wurde anhand der
Trypanblaufärbung ermittelt. Um die Zellaktivität zu ermitteln, wurde der
Zellproliferationsassay (MTS) verwendet. Die Apoptoserate wurde mittels JC-1
Färbung sowie der TUNEL Färbung detektiert. Um festzustellen, ob die Effekte des
Insulins über den PI3-K Signalweg vermittelt werden, wurde der PI3-K Inhibitor
Wortmannin verwendet. Da bei der Apoptose auch der NF-κB Signalweg eine
zentrale Rolle spielt, wurde der NF-κB Blocker TPCK verwendet, um die Effekte von
Insulin und Propranolol auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Die TNFα und
IL-1β Konzentrationen wurden in den Zellkulturüberständen gemessen, um die
Effekte von Insulin und Propranolol auf die Expression proinflammatorischer
Zytokine zu untersuchen.
1A.3 Ergebnisse
Die wichtigsten Ergebnisse werden im Folgenden zusammengefasst:
1. LPS reduzierte die Zellvitalität in THP-1 Zellen dosisabhängig. Dieser Effekt
konnte durch Gabe von Insulin oder Propranolol aufgehoben werden. Ideal
erscheinen hier Dosen von 5U/ml Insulin bzw. 10µM Propranolol.
2. LPS reduzierte die Zellaktivität dosisabhängig. Die Behandlung der LPS
stimulierten THP-1 Zellen mit Insulin bzw. Propranolol zeigte keine relevante
Änderung der Zellaktivität.
- 2 -
3. LPS induzierte dosisabhängig Apoptose in THP-1 Zellen. Insulin und
Propranolol wirkten in Kombination mit LPS antiapoptotisch. Unter
Verwendung des PI3-K Inhibitors Wortmannin konnte in der vorliegenden
Arbeit eine Vermittlung der zytoprotektiven und antiapoptotischen Effekte
von Insulin über den PI3-K Signalweg nachgewiesen werden. Für die
Wirkungen von Propranolol scheint der NF-κB Signalweg mitverantwortlich
zu sein. Dies konnte mit Hilfe des NF-κB Inhibitors TPCK nachgewiesen
werden.
4. LPS erhöhte die Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine IL-1β und
TNFα in THP-1 Zellen. Die Ausschüttung von IL-1β in endotoxämischen
THP-1 Zellen konnte durch die Gabe von Insulin zu Beginn der Inflammation
signifikant gemindert werden. Die Gabe von Propranolol zeigte auf die IL-1β
Sekretion keinen signifikanten antiinflammatorischen Effekt. Die
Ausschüttung von TNFα in endotoxämischen THP-1 Zellen konnte durch die
Applikation von Insulin signifikant gemindert werden. Die Ausschüttung von
TNFα konnte in der späten Inflammationsreaktion durch Applikation von
Propranolol signifikant gemindert werden.
1A.4 Praktische Schlussfolgerung
Die hier erarbeiteten Ergebnisse bieten insbesondere hinsichtlich der
antiapoptotischen und zytoprotektiven Wirkungsmechanismen von Insulin und
Propranolol einen erheblichen Erkenntnisgewinn. Es besteht allerdings noch
erheblicher Forschungsbedarf, um diese Effekte vollständig zu verstehen. Inwiefern
sich diese Erkenntnisse auf den klinischen Alltag und insbesondere auf die Therapie
septischer Patienten übertragen lässt, muss anhand weiterer klinischer Studien
belegt werden.
- 3 -
1B.1 Introduction
Insulin decreases the incidence of sepsis and improves mortality of critically ill
patients. In endotoxemic as well as in thermally injured rats, insulin attenuates
the systemic inflammatory response by decreasing the proinflammatory and
increasing the antiinflammatory cascade. The aim of the present study was to
determine the effects of insulin and propranolol on cell survival, cell activity,
apoptosis, and proinflammatory response in a human macrophage-like cell line
(THP-1 cells) stressed with lipopolysaccharide (LPS).
1B.2 Materials and methods
Human macrophages were stressed with LPS and received either saline, insulin
or propranolol. Cell viability was analyzed by MTS, apoptosis was detected using
JC-1 and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling-
staining. To elucidate on the insulin signaling pathway, wortmannin was used as
a phosphatidylinositol-3-kinase inhibitor. To elucidate on the propranolol
signaling pathway N-p-tosyl-L-phenylalaninchloromethylketon was used as a
NF-κB inhibitor. Tumor necrosis factor (TNF) and interleukin-1beta (IL-1β) were
measured to determine the effect of insulin and propranolol on proinflammatory
cytokine expression.
1B.3 Results
The main results are displayed in the following:
1. LPS reduced the overall cell viability in THP-1 macrophage cell line. This
effect could be completely abolished by the addition of insulin or propranolol.
Ideal seemed to be the use of doses of 5U/ml insulin respectively 10µM
propranolol.
2. LPS reduced the cell activity in a dose-dependent-manner. The treatment of
endotoxemic THP-1 macrophages showed no effect on cell activity, when
doses of 5U/ml insulin respectively 10µM propranolol were administered.
3. LPS induced apoptosis in THP-1 macrophages. Insulin and propranolol
blocked these proapoptotic effects. Ideal seemed to be the use of doses of
5U/ml insulin respectively 10µM propranolol. Using the PI3-K inhibitor
wortmannin we could show that the cytoprotective and antiapoptotic effects
of insulin were partly mediated through the PI3-K signaling pathway.
Considering the effects of propranolol, the NF-κB signaling pathway might
play a crucial role. This could be demonstrated using the NF-κB inhibitor
TPCK.
- 4 -
4. LPS increased the expression of the proinflammatory cytokines IL-1β and
TNFα in the cell culture supernatants after 4, 8, 12, 24 hours. The addition of
insulin at early time points (4, 8 hrs) significantly attenuated the expression
of IL-1β. The addition of propranolol did not show any significant
antiinflammatory effect on the IL-1β expression. The release of TNFα in
endotoxemic THP-1 macrophages was significantly decreased by 15U/ml
insulin. The release of TNFα could be significantly decreased by the addition
of 1 or 10µM propranolol especially at later time points (12, 24 hrs).
1B.4 Conclusions
The acquired results indicate that insulin and propranolol exert antiapoptotic
effects and reduce the expression of proinflammatory cytokines in endotoxemic
human macrophages.
The antiapoptotic effects are mediated via the phospatidylinositol-3-kinase-
pathway and the NF-κB pathway.
- 5 -
2. Einleitung
Die Sepsis stellt die systemische Reaktion des Körpers auf eine Infektion dar.
Hierbei gibt es meist einen Sepsisherd, der die Symptome verursacht. Dieser kann
seinen Ursprung in den verschiedensten Organsystemen haben. Am häufigsten ist
jedoch die Urosepsis, das heißt, dass hier der Infektionsfokus im Urogenitalsystem
zu suchen ist.29,57 Von dort aus streuen die Mikroorganismen, meist Bakterien, in
seltenen Fällen auch Viren, Pilze oder Parasiten und gelangen somit in den
Blutkreislauf. Das Immunsystem antwortet darauf mit einer proinflammatorischen
Reaktion und schüttet Zytokine aus, die diese positive Immunantwort unterhalten.58
Für die Proinflammation sind hier unter anderem Tumornekrosefaktor (TNF) alpha
und Interleukin (IL-) 1 verantwortlich.3,14,42,52 Beide Polypeptide werden zu Beginn
der septischen Kaskade sezerniert. Das proinflammatorische Zytokin TNF alpha,
ebenfalls unter dem Namen Kachexin bekannt, wird von Monozyten und
Makrophagen produziert und in die Blutbahn abgegeben. Es ist dort z. B. in der
Lage neutrophile Granulozyten zu stimulieren. Außerdem führt TNF alpha zu einem
Verschluss tumorversorgender Blutgefässe, was zu einer Nekrose der Tumorzellen
führen kann. IL-1, auch endogenes Pyrogen genannt, existiert in zwei molekularen
Unterformen, IL-1 alpha und IL-1 beta.29 Beide haben annähernd die gleiche
proinflammatorische Potenz. Sie sind u. a. in der Lage die Synthese von „Akute-
Phase-Proteinen“ in den Hepatozyten zu stimulieren, wirken auf polymorphkernige
Zellen wie Leukozyten chemotaktisch und stimulieren die Freisetzung dieser Zellen
aus dem Blut und Knochenmark.
Es können aber auch nichtinfektiöse Ursachen, wie zum Beispiel ein schweres
Trauma oder eine Pankreatitis, ein der Sepsis klinisch ähnliches Bild hervorrufen.
Dies wird als SIRS (systemic inflammatory response syndrome) bezeichnet.21,57
Gelingt es dem Körper nicht, die proinflammatorische Immunreaktion mittels
gegenregulatorischer Mechanismen, der so genannten Antiinflammation,
einzudämmen, kommt es zur Hyperinflammation. Dies kann dann zum Vollbild der
Sepsis führen, dem so genannten Septischen Schock. Von einem septischen
Schock spricht man, wenn durch die Sepsis ein Blutdruckabfall um mindestens
40mmHg hervorgerufen wird, der auch durch adäquate Volumensubstitution nicht
mehr zu beheben ist. Dies führt in der Folge zu Mikrozirkulationsstörungen und
somit auch zu einer Perfusionseinschränkung der Organe. Die Organdysfunktion,
die zum Beispiel durch eine Laktatazidose oder eine Oligurie in Erscheinung tritt,
kann bei Fortschreiten der Erkrankung in einem Multiorganversagen resultieren.
- 6 -
Sind hierbei mehr als zwei Organe betroffen, beträgt die Letalität nahezu hundert
Prozent.36
Um klinisch die Diagnose einer Sepsis zu sichern, müssen mindestens zwei der
folgenden Kriterien erfüllt sein: Hypo- beziehungsweise Hyperthermie (>28°C bzw.
<36°C), Tachykardie (>90 Schläge pro Minute), Brady pnoe (<20 Atemzüge pro
Minute), zusätzlich kann eine Leukozytose oder Leukopenie bestehen. Blutkulturen
sind diagnostisch wegweisend und auch zur Verlaufskontrolle sehr gut geeignet.
Nach der Abnahme der Blutkulturen muss umgehend eine antibiotische Therapie
eingeleitet werden. 36,57
In den letzten Jahren hat die Inzidenz der Sepsis trotz modernster antibiotischer
Therapie und maximaler intensivstationärer Betreuung stetig zugenommen. Allein in
Deutschland beläuft sich die Zahl septischer Patienten auf geschätzte 44000 bis
95000 Fälle pro Jahr. Damit geht auch ein sehr hoher finanzieller Aufwand einher.
Nach Schätzungen belaufen sich die Kosten pro Patient im Mittel auf 23297 Euro.21
Die steigende Anzahl der Sepsisfälle kann zum Teil mit dem steigenden
Durchschnittsalter der Bevölkerung erklärt werden. Bei älteren, oft auch
bettlägerigen Menschen führt ein geschwächtes Immunsystem meist zu schwer
verlaufenden Erkrankungen wie zum Beispiel Pneumonien mit septischem Verlauf.
Ein besonders wichtiger Faktor ist die zunehmende Zahl an invasiven
diagnostischen und therapeutischen Maßnahmen. Dadurch erhöht sich die
Keimbelastung des Organismus drastisch. Besonders multiresistente Erreger stellen
hier ein Problem dar. Zudem finden immunsuppressive Therapieformen eine immer
weitere Verbreitung. Dies kann unter anderem mit den wachsenden Möglichkeiten in
der Transplantationschriurgie und der damit verbundenen Immunsuppression erklärt
werden. Immunsuppression hat aber auch in der Therapie von
Autoimmunerkrankungen einen hohen Stellenwert.
Da unterschiedliche Ursachen einen septischen Zustand hervorrufen können, erhält
man ein heterogenes Patientengut. Kann ein Sepsisherd infektiösen Ursprungs
gefunden werden und der verantwortliche Keim in der Blutkultur verifiziert werden,
wird dieser gezielt antibiotisch therapiert und der Sepsisherd falls möglich saniert.
Dies steht als kausale Therapieoption an erster Stelle. Außerdem kann eine
zeitweilige Unterstützung der Vitalfunktionen mittels Beatmung und
Kreislaufstabilisation bei Verschlechterung des klinischen Erscheinungsbildes
notwendig werden. Bei Anzeichen von Organdysfunktion wie steigenden
Nierenretentionsparametern bei Nierenversagen oder steigendem
Blutglukosespiegel bei einer Dysfunktion des Pankreas, wird versucht, die Funktion
der Organe durch Hämofiltration und Insulintherapie zu ersetzen. Inzwischen haben
- 7 -
sich diese supportiven Maßnahmen wie frühe hämodynamische Unterstützung,
niedriges Atemvolumen und intensive Insulinbehandlung durch klinische Studien
etabliert.57
Die Behandlung der Hyperglykämie gehört seit Jahren zur etablierten klinischen
Therapie der Sepsis. Hyperglykämien kommen bei kritisch Kranken sehr häufig vor,
auch wenn noch kein manifester Diabetes mellitus vorbestand.22 Dies kann zum Teil
auf einen Funktionsausfall des endokrinen Pankreas zurückgeführt werden. Daher
ist es oft notwendig Insulin zu substituieren, um Blutzuckerspitzen abzufangen.48 In
den letzten Jahren hat sich jedoch zunehmend die intensivierte Insulintherapie im
Rahmen der Sepsisbehandlung etabliert. Dies geht auf eine klinische Studie von
G. Van den Berghe und Koautoren zurück.62 Sie konnten in einer prospektiven,
randomisierten, kontrollierten Studie zeigen, dass eine intensivierte Insulintherapie,
die den Blutglukosespiegel mittels Insulinperfusortherapie unter 110mg/dl hält, die
Morbidität und Mortalität kritisch Kranker auf einer chirurgischen Intensivstation
signifikant verbesserte. Sie bezogen insgesamt 1548 Patienten in ihre Studie mit ein
und verglichen die intensivierte Insulintherapie mit der konventionellen
Insulintherapie, bei der eine Insulingabe nur bei einem Blutglukosespiegel von über
215mg/dl indiziert ist und dann zwischen 180 und 200mg/dl eingestellt wird.
Während des Aufenthalts auf der Intensivstation zeigte sich eine deutlich
verminderte Mortalität bei Patienten im intensivierten Therapiearm von 4,6 Prozent
gegenüber 8,0 Prozent bei konventioneller Therapie (p<0,04). Am deutlichsten
wurde dieser Effekt bei Patienten, die länger als fünf Tage intensivtherapeutisch
behandelt wurden: 10,6 Prozent Mortalität bei intensivierter Insulintherapie
verglichen mit 20,2 Prozent bei konventionellem Therapieschema (p=0,005).62 In
weiteren Studien konnten diese Erfolg versprechenden Ergebnisse allerdings nur
zum Teil reproduziert werden.59-61,63 Zwar konnte kein Unterschied zwischen den
Patienten mit intensivierter und herkömmlicher Insulintherapie bezogen auf die
Mortalität während des Krankenhausaufenthalt gesehen werden, aber die Morbidität
wurde weiterhin signifikant reduziert. Dies zeigte sich vor allem in einer Prävention
von Nierenschäden, verkürzter Beatmungspflichtigkeit, und verkürztem
Intensivstations- bzw. Krankenhausaufenthalt.61 Diese Ergebnisse wurden auch
durch tierexperimentelle Studien an Ratten gestützt.38,42 D. Klein et al. untersuchten
die hepatische Funktion und Morphologie nach schwerem Trauma sowie die
Alteration der hepatischen inflammatorischen Signalkaskade im
Verbrennungsmodell an Ratten. Hierbei wurde den Versuchstieren eine 30-
prozentige transdermale Verbrennung appliziert, welche die Tiere in einen
septischen Zustand versetzt. Den Versuchstieren wurden nach Applikation der
- 8 -
Verbrennung 5IU/kg Insulin oder NaCl-Lösung als Kontrolle verabreicht. Dies hielt
den Blutzuckerspiegel bei den mit Insulin behandelten Versuchstieren um 120mg/dl.
Bei den Kontrolltieren variierte der Blutglukosespiegel zwischen 150 und 170mg/dl.
Sie legten mit ihrer Arbeit eine zytoprotektive Wirkung des Insulins nahe und
konnten eine Abmilderung der inflammatorischen Reaktion nachweisen, die durch
eine Verminderung der proinflammatorischen und eine Verstärkung der
antiinflammatorischen Kaskade vermittelt wurde. Dadurch wurden die hepatische
Morphologie und damit auch die Leberfunktion verbessert. Dies könnte für die
Organfunktion kritisch Kranker und damit für deren Überleben entscheidend sein.42
Zum Teil kann dies durch die Wirkung des Insulins als anaboles Hormon erklärt
werden. Im Fettgewebe und im Skelettmuskel wird die Glukoseaufnahme über den
Glukosetransporter GLUT4, sowie die Glykolyse gesteigert.48 Im Skelettmuskel wird
zudem die Glykogenbiosynthese gefördert. Im Fettgewebe wird die
Fettsäurebiosynthese gefördert, wohingegen die Lipolyse gehemmt wird. In der
Leber wird die Glukoneogenese gehemmt, die Glykolyse und Glykogensynthese
hingegen wird stimuliert. Somit findet eine effiziente Speicherung des
Substratangebotes in Form von Glykogen und Triacylglycerinen statt. Außerdem
werden die Proteinbiosynthese und das Zellwachstum angeregt. Es zeigt sich also
eine Förderung des anabolen und eine Hemmung des katabolen Stoffwechsels.
Einige Studien legen nahe, dass der Schlüssel zur Verbesserung der
Überlebensraten nicht in der Insulinapplikation zu suchen ist, sondern schreiben
dies der strikten Euglykämie zu.26,27 Andererseits gibt es auch Hinweise für eine
direkte antiinflammatorische Wirkung des Insulins.4,17,40 Ob jedoch die Verbesserung
der Morbidität kritisch Kranker durch die strikte Einstellung des Blutzuckers oder
durch eine direkte antiinflammatorische Wirkung des Insulins erreicht werden, ist
nach wie vor ungeklärt. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit die
Wirkmechanismen von Insulin auf zellulärer Ebene näher untersucht.
Insbesondere die Vermittlung der Insulinwirkung über die PI3-K Signalkaskade
stand hier im Mittelpunkt. Eine Studie von Iida und Kollegen35 legte eine
antiapoptotische Wirkung von Insulin über den PI3-K Signalweg nahe. Sie konnten
bei durch Nährmediumsentzug ausgehungerten Makrophagen eine antiapoptotische
Wirkung von Insulin nachweisen.
β-Blocker stellen neben Insulin ein weiteres Medikament mit anabolem Potential
dar. Dies könnte ebenfalls in der klinischen Therapie der Sepsis von Bedeutung
sein.31-34,41 M. Kawakami und Kollegen41 verwendeten ebenfalls das
Verbrennungsmodell an Mäusen, um den Einfluss von Katecholaminen auf die
Sezernierung proinflammatorischer Zytokine zu untersuchen. Die Verbrennung
- 9 -
führte zu erhöhten Epinephrinspiegeln, welche die Ausschüttung
proinflammatorischer Zytokine stimulierte. Durch Propranolol konnte diese
proinflammatorische Reaktion unterdrückt werden. Die Forschungsgruppe um Haart
und Herndon33 führte eine Studie an 25 Kindern mit Verbrennungen von mehr als
40 Prozent der Körperoberfläche durch. Ausgehend von der Tatsache, dass
schwere Verbrennungen den Energieumsatz sowie den katabolen Muskelabbau
steigern, postulierten sie einen positiven Effekt durch die Blockade der
β-adrenergen Stimulation. Dies werde über eine Katecholamin induzierte
hypermetabolische Reaktion vermittelt. Die β-Blockade mittels Propranolol zeigte
sich in einer gesenkten Herzfrequenz und einem verminderten Grundumsatz
gegenüber der Kontrollgruppe. Die Nettomuskelproteinbalance konnte in der
Propranololgruppe um 82 Prozent gesteigert werden. In einer weiteren klinischen
Studie konnte in der Propranololgruppe eine Hochregulation der Gene gesehen
werden, die in den Muskelaufbau involviert sind (z.B.: Dynein).32 In dieser Studie
konnte weiterhin gezeigt werden, dass ein Schlüsselenzym für die Glukoneogenese
(Fructose-1,6-bisphosphatase) und die Insulinresistenz heruntergeregelt ist.
Außerdem wurde das Zinkfingerprotein-145 (A20) herunterreguliert, das in die
negative Feedbackschleife der NF-κB Aktivierung zur Regulation des
Apoptosevorgangs involviert ist.
In der Pathogenese der Sepsis spielt Apoptose eine bedeutende Rolle. Da
Apoptose durch die genetische Ausstattung der Zelle selbst reguliert und ausgelöst
wird, wird die Apoptose auch programmierter Zelltod genannt. Zuallererst
kondensiert das Zytoplasma der Zelle, wobei der Zellkern durch die Aktivierung
endogener Endonukleasen und spezifischer Proteasen verschiedenen
Veränderungen unterliegt. Die Mitochondrien bleiben dabei jedoch intakt. Chromatin
verklumpt entlang der Kernmembran und der Zellkern schrumpft. Man spricht von
Karyopyknose. Nun löst sich die betroffene Zelle aus dem Zellverband und
fragmentiert in mehrere Teile, Apoptosekörperchen genannt, die von einer intakten
Zellmembran umschlossen werden. Im Gegensatz dazu steht die Nekrose, der
provozierte Zelltod. Sie ist durch eine initiale Zellschwellung gekennzeichnet, die
zuerst noch reversibel ist. Die Zellschwellung wird durch eine erhöhte Permeabilität
der Zellmembran für Ionen hervorgerufen. Durch die osmotische Lyse der Zelle
rupturiert die Zellmembran. Die Apoptose jedoch kommt auch physiologisch beim
normalen Zellumsatz vor und spielt auch in der Embryogenese eine entscheidende
Rolle.8,10,20,24
In der vorliegenden Arbeit sollte das inflammatorische Geschehen auf zellulärer und
molekularer Ebene unter dem Einfluss von Insulin und Propranolol untersucht
- 10 -
werden. Dazu wurde die Monozytenzellinie THP-1 ausgewählt, die Zellen wurden zu
Makrophagen ausdifferenziert. Makrophagen spielen eine entscheidende Rolle für
das angeborene Immunsystem und die Fähigkeit des Organismus, auf pathogene
Noxen wie Bakterien, Viren oder Pilze angemessen zu reagieren. Sie gehören als
Polymorphkernige zu den antigenpräsentierenden Zellen, so genannten APCs und
können pro- und antiinflammatorische Zytokine sezernieren. Zudem stehen sie am
Anfang der septischen Kaskade, noch vor der B-Zell-vermittelten humoralen,
spezifischen Immunreaktion. Zunächst wurde die Sekretion proinflammatorischer
Zytokine nach Stimulation mit Lipopolysaccharid untersucht. LPS ist ein integraler
Bestandteil der Zellwände von gramnegativen Bakterien, ist aber auch in
grampositiven Bakterien enthalten. Makrophagen reagieren auf eine Stimulation mit
LPS mit der Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine. Des Weiteren wurden
sowohl Versuche zur Apoptoserate bei inflammatorischen Makrophagen als auch zu
den Wirkungen von Insulin und Propranolol auf die Apoptoseinduktion durchgeführt.
Abschließend wurden die beteiligten intrazellulären Signalwege untersucht, über die
sowohl Insulin als auch Propranolol ihre Wirkung in der Zelle entfalten. Hierzu
wurden folgende Hypothesen aufgestellt:
1. Hypothesen zur Zellvitalität
1.1 LPS reduziert dosisabhängig die Zellvitalität in THP-1 Makrophagen
1.2 Insulin erhöht die Zellvitalität in LPS-stimulierten THP-1 Makrophagen
1.3 Propranolol erhöht die Zellvitalität in LPS-stimulierten THP-1 Makrophagen
2. Hypothesen zur Zellaktivität
2.1 LPS reduziert dosisabhängig die Zellaktivität in THP-1 Makrophagen
2.2 Insulin erhöht die Zellaktivität in LPS-stimulierten THP-1 Makrophagen
2.3 Propranolol erhöht die Zellaktivität in LPS-stimulierten THP-1 Makrophagen
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3. Hypothesen zur Apoptose
3.1 LPS induziert Apoptose in THP-1 Makrophagen
3.2 Insulin reduziert dosisabhängig die LPS-induzierte Apoptose in THP-1
Makrophagen und wirkt über den PI3-K Signalweg antiapoptotisch
3.3 Propranolol reduziert dosisabhängig die LPS-induzierte Apoptose in THP-1
Makrophagen und wirkt über den NF-κB Signalweg antiapoptotisch
4. Hypothesen zum Inflammationsgeschehen
4.1 LPS erhöht die Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine in THP-1
Makrophagen
4.2 Insulin wirkt in THP-1 Makrophagen antiinflammatorisch
4.3 Propranolol wirkt in THP-1 Makrophagen antiinflammatorisch
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3. Material und Methoden
3.1 Zellkultur
Die Monozytenzelllinie THP-1 Humansuspensionszellen (human acute monocytic
leukemia, ATCC, USA, Cat.-No.: TIB-202) wurde in 175cm2 Zellkulturflaschen
(Corning, Deutschland, Cat.-No.: 431080) in RPMI 1640 Zellkulturmedium mit
GlutaMAX (Gibco, GB, Cat.-No.: 61870-010) kultiviert, das mit 1%
Penicillin/Streptomycin (10.000U / 10.0000µg/ml) (Biochrom, Deutschland, Cat.-No.:
A2213) und 10% FBS (Fetal Bovine Serum) (Biochrom, Deutschland, Cat.-No.:
S0115) versetzt wurde, um optimales Wachstum zu gewährleisten. Die Zellen
wurden im Brutschrank bei 37°C in einer angefeuchte ten Atmosphäre kultiviert, die
5% CO2 enthielt. Alle drei bis fünf Tage wurde das Zellkulturmedium erneuert. Nach
mindestens drei Tagen Zellwachstum wurden die Zellen abzentrifugiert (5min,
900rpm, RT), mittels Trypanblaufärbung (Biochrom, Deutschland, Cat.-No.: L6323)
in einer Neubauer-Zählkammer gezählt und anschließend in Zellkulturplatten
ausgesät. Je nach Versuchsdesign wurden hierfür 6-well Platten (BD Falcon,
Deutschland, Cat.-No.: 353046) mit 1,5x106/2ml Zellen, 96-well Platten (BD Falcon,
Deutschland, Cat.-No.: 353918) mit 8x104/100µl oder Culture slides (BD Falcon,
Deutschland, Cat.-No.: 354118). mit 1,1x105/500µl Zellen je well verwendet. Um die
THP-1 Monozyten zu Makrophagen auszudifferenzieren, wurden sie über Nacht mit
PMA (phorbol 12-myrisate 13-acetate) (Sigma, USA, Cat.-No.: P1585) inkubiert, das
in einer Endkonzentration von 5x10-5g/ml vorlag. Die ausdifferenzierten
Makrophagen adhärierten an den Boden der wells, während die undifferenzierten
Monozyten in Suspension blieben und durch Waschen mit PBS (Phospate buffered
saline, pH 7,4) aus der Zellkultur entfernt wurden. Anschließend wurden die Zellen
über Nacht mit serumfreiem Medium kultiviert, um den Zellzyklus der einzelnen
Zellen auf die G0-Phase zu synchronisieren.
3.2 Stimulation der Zellen
Die Zellen wurden entweder in serumfreiem Medium als Negativkontrolle oder mit
aufsteigenden Dosen (100ng/ml, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 und 100µg/ml)
Lipopolysaccharid (LPS E. coli 0111:B4, Sigma, Cat.-No.: L 2654, L4391, L 3516, L
4641, L 6529, L 7770, L 6143 und L 7895) inkubiert, um die optimale LPS –
Dosierung herauszufinden.
- 13 -
Um die Effekte von Insulin (Insuman rapid Optiset, Aventis, Deutschland) auf das
Zellüberleben, die Induktion von Apoptose, sowie die Ausschüttung
proinflammatorischer Zytokine zu untersuchen, wurden die Zellen alleinig mit LPS
stimuliert oder in Kombination mit Insulin in verschiedenen Dosierungen (1, 5, 10,
15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 und 50 U/ml) über 24 Stunden inkubiert. Insulin wurde
hierbei 30 Minuten nach der Stimulation mit LPS appliziert. Um festzustellen, ob die
Effekte des Insulins über den Phosphatidylinsoitol-3-Kinase (PI3K) Signalweg
vermittelt werden, wurde der PI3K Inhibitor Wortmannin (Sigma, Deutschland,
Cat.-No.: W 1628-1MG) verwendet. Die Zellen wurden in Culture slides kultiviert und
wie oben beschrieben mit 10µg/ml LPS und 5U/ml Insulin behandelt. Wortmannin
wurde in verschiedenen Konzentrationen zugegeben (1, 10, 50, 100, 200nM). Als
Kontrollgruppen dienten Zellen, die mit Wortmannin allein oder mit LPS und
Wortmannin behandelt wurden. Da im Apoptosesignalweg unter anderem auch der
Nukleäre Transkriptionsfaktor (NF) - κB eine Rolle spielt, wurde der Einfluss von
Insulin auf den NF-κB Signalweg mittels des NF-κB Blockers N-p-Tosyl-L-
Phenylalaninchloromethylketon (TPCK, Sigma, Deutschland, Cat.-No.:
T 4376-100MG) untersucht. Hierzu wurden die Zellen in Culture slides kultiviert und
wie oben beschrieben mit 10µg/ml LPS und 5U/ml Insulin behandelt. TPCK wurde in
verschiedenen Konzentrationen zugegeben (1, 10, 50, 100, 200µM). Als
Negativkontrollen dienten Zellen, die mit TPCK allein oder einer Kombination aus
LPS und TPCK behandelt wurden. Es wurden Negativkontrollen sowohl mit
serumfreien Medium als auch mit Insulin ohne LPS durchgeführt.
Um die Effekte von Propranolol (Dociton, Astra Zeneca, Deutschland) auf das
Zellüberleben, die Induktion von Apoptose, sowie die Ausschüttung
proinflammatorischer Zytokine zu untersuchen, wurden die Zellen alleinig mit LPS
stimuliert oder in Kombination mit Propranolol in verschiedenen Dosierungen (0,1; 1;
10; 100; 500 und 1000µmol/ml) über 24 Stunden inkubiert. Propranolol wurde
hierbei 30 Minuten nach der Stimulation mit LPS appliziert. Da im
Apoptosesignalweg unter anderem auch der Nukleäre Transkriptionsfaktor (NF) - κB
eine Rolle spielt, wurde der Einfluss von Propranolol auf den NF-κB Signalweg
mittels des NF-κB – Blockers N-p-Tosyl-L-Phenylalaninchloromethylketon (TPCK,
Sigma, Deutschland, Cat.-No.: T 4376-100MG) untersucht. Hierzu wurden die
Zellen in Culture slides kultiviert und wie oben beschrieben mit 10µg/ml LPS und
10µM Propranolol therapiert. TPCK wurde in verschiedenen Konzentrationen
zugegeben (1, 10, 50, 100, 200µM).
- 14 -
Als Negativkontrollen dienten Zellen, die mit TPCK allein oder einer Kombination
aus LPS und TPCK behandelt wurden. Es wurden ebenfalls Negativkontrollen mit
serumfreien Medium und nur mit Propranolol ohne LPS durchgeführt.
3.3 Trypanblaufärbung
24 Stunden nach der Stimulation der Zellen mit LPS wurden die Zellüberstände
abpipettiert. Die Zellen wurden mit zwei bis drei Tropfen Trypanblau (0,5%ig in
physiologischer Kochsalzlösung, Biochrom) je well gefärbt, so dass der Boden des
wells mit Färbelösung bedeckt war, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern.
Nach fünf Minuten Einwirkzeit wurden unter Durchlichtmikroskopie im
Zellkulturmikroskop (Leica DMRBE, Deutschland) bei 100x Vergrößerung je zwei
Gesichtsfelder ausgezählt und eine Lebend-Tot-Ratio erstellt. Als eindeutig tote
Zellen wurden diejenigen gezählt, die lila bis dunkelblau gefärbt, deren Zellkern
fragmentiert und deren Zellmembran sich aufgelöst hatte.
3.4 Zellproliferationsassay
Um die Zellaktivität zu ermitteln, wurde der CellTiter 96 Aqueous non-radioactive
cell proliferation assay (Promega, USA, Cat.-No.: G5421) verwendet. Nachdem die
Zellen wie oben beschrieben mit serumfreien Medium beziehungsweise mit LPS
allein oder in Kombination mit Insulin oder Propranolol inkubiert wurden, wurde 24
Stunden nach der Stimulation mit LPS die Umwandlung der Tetrazolimverbindung
(3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-
tetrazolium, inner salt, MTS) in wasserlösliches Fromazan durch metabolisch aktive
Zellen gemessen. Die Absorption des Fromazans bei 490nm verhält sich zu der
Zahl der lebenden Zellen direkt proportional. Das Ansetzen des
Zellproliferationsassays geschah nach Angaben des Herstellers. Für die Messung
der Fromazan-Absorption wurde ein ELISA Reader (Tecan Sunrise, Österreich) bei
490nm verwendet. Die Experimente wurden in je zwei Tripletts (n=6) aus einer
Zellpassage durchgeführt.
- 15 -
3.5 Apoptose
3.5.1 TUNEL Färbung
Die TUNEL Färbung (In situ Cell Death Detection Kit, TMR red, Roche,
Deutschland, Cat.-No.: 2156792) ist spezifisch für die Detektion von Apoptose.
TUNEL steht für terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end
labeling. Während des Apoptosevorgangs entstehen durch die DNAse nicht nur
doppelsträngige niedermolekulare DNA Fragmente (Mono- und Oligonukleosomen),
sondern auch Einzelstrangbrüche in DNA-Abschnitten mit hohem Molekulargewicht.
Diese sogenannten Nicks sind apoptosespezifisch. An diese 3‘(OH)- Enden können
sich nun durch die terminale Transferase mit Fluoreszenzfarbstoff gelabelte
Nucleotide anlagern.24,25 Daher leuchten apoptotische Zellen unter Fluoreszenz
hellrot, nicht apoptotische Zellen zeigen keine Fluoreszenz. Vor dem Färben wurden
die Zellen in Culture slides kultiviert und dann mit Medium als Kontrollgruppe, mit
LPS, Insulin oder Propranolol allein, oder mit einer Kombination aus LPS und Insulin
beziehungsweise Propranolol behandelt. Die Färbung erfolgte nach Angaben des
Herstellers. Im Anschluß erfolgte die sofortige Auswertung am
Fluoreszenzmikroskop (Leica Fluvert FU, Deutschland) bei 400x Vergrößerung. Es
wurden je zwei Gesichtsfelder unter Durchlicht (Gesamtzellzahl) und unter roter
Fluoreszenz bei 590nm (apoptotische Zellen) ausgezählt und der Prozentsatz
apoptotischer Zellen ermittelt.
3.5.2 JC-1 Färbung
Zusätzlich zur TUNEL Färbung wurde die JC-1 Färbung (JC-1 Mitochondrial
Potential Sensors) verwendet. Sie beruht auf dem Prinzip der Änderung des
Membranpotentials der Mitochondrien, wenn die Zellen beginnen, sich apoptotisch
zu verändern. Der Verlust des mitochondrialen Membranpotentials steht daher am
Anfang des Apoptosezyklus und ist somit ein sehr frühes Zeichen von Apoptose.
Die Mitochondrien nehmen den kationischen JC-1 Farbstoff (5,5‘,6,6‘-tetrachloro-
1,1‘,3,3‘-tetraethylbenzimidazolylcarbocyamine iodide, JC-1, CBIC(3), MoBiTec,
Deutschland, Cat.-No.: T-3168) auf. Unter Fluoreszenz zeigen dann lebende Zellen
ein grünes Cytosol und rote Aggregate an den mitochondrialen Membranen.
Apoptotischen Zellen fehlen diese Aggregate.50,55 Die Zellen wurden ebenfalls in
Culture slides kultiviert und dann mit Medium als Kontrollgruppe, mit LPS, Insulin
oder Propranolol allein, oder mit einer Kombination aus LPS und Insulin
beziehungsweise Propranolol behandelt. 24 Stunden nach der Stimulation mit LPS
- 16 -
wurde zunächst einmal mit PBS gewaschen und anschließend die JC-1
Färbelösung, 10µg/ml in phenolrotfreiem RPMI gelöst, objektträgerdeckend
aufgetragen. Dann wurden die Zellen 10 Minuten in einer feuchten Kammer bei
37°C im Brutschrank in der Färbelösung inkubiert. D anach wurde dreimal mit PBS
gewaschen, der Objektträger in Glycerol eingebettet und mit einem Deckgläschen
abgedeckt. Anschließend erfolgte umgehend die Auswertung am
Fluoreszenzmikroskop (Leica Fluvert FU, Deutschland) bei 400x Vergrößerung. Es
wurden jeweils zwei Gesichtsfelder in zwei verschiedenen Wellenlängen ausgezählt.
Unter grüner Fluoreszenz (520nm) wurde die Gesamtzellzahl ermittelt, unter roter
Fluoreszenz (590nm) die Anzahl nicht apoptotischer Zellen. Daraus wurde dann der
Prozentsatz apoptotischer Zellen berechnet.
3.6 Zytokinspiegelbestimmung
4,8,12 und 24 Stunden nach der Stimulation der Zellen mit LPS wurden die
Zellüberstände gewonnen, bei 4°C und 900rpm fünf Mi nuten lang abzentrifugiert,
um mögliche Zellrückstände zu entfernen, aliquotiert und bei -20°C eingefroren.
3.6.1 Interleukin 1 ββββ ELISA
Das proinflammatorische Zytokin Interleukin (IL)-1, auch endogenes Pyrogen
genannt, existiert in zwei molekularen Unterformen, IL-1 alpha und IL-1 beta. Die
Zytokinspiegel von IL-1β in den Zellkulturüberständen wurden nun quantitativ mittels
human IL-1β ELISA (Bender MedSystems, USA, Cat.-No.: BMS224/2TEN) nach
dem sandwich-enzyme-immunoassay Prinzip bestimmt. Das Ansetzen der ELISA
geschah nach Angaben des Herstellers. Hierbei ist vor allem zu beachten, dass die
Standards sowie die Proben während des Ansetzens der ELISA ständig bei 2 – 8°C
gelagert wurden. Die Zellkulturüberstände wurden wie oben beschrieben gewonnen.
Alle Assays wurden in Doppelbestimmung durchgeführt.
Die Absorption wurde unverzüglich am ELISA Reader (Tecan Sunrise, Österreich)
bei einer Wellenlänge von 450nm gegen die Referenzwellenlänge von 629nm
gemessen. Mittels Computer Software (Tecan Reader PC Package magellan
version 3.0) wurde eine Standardkurve erstellt und die IL-1β Konzentrationen der
Proben berechnet und in pg/ml angegeben. Bei jedem ELISA wurde zudem eine
Positivkontrolle durchgeführt.
- 17 -
3.6.2 Tumornekrosefaktor αααα ELISA
Tumornekrosefaktorα (TNFα), ebenfalls unter dem Namen Kachektin bekannt, ist
ein weiteres proinflammatorisches Zytokin. Es wird spezifisch nur von Monozyten
und Makrophagen sezerniert und ist sowohl in der Lage, entscheidend die
Immunantwort zu modulieren als auch als potentes Pyrogen zu fungieren. Die
Zytokinspiegel von TNFα wurden durch den human TNFα ELISA Kit (Bender
MedSystems, USA, Cat.-No.: BMS223/3TENCE) ermittelt. Da ungebundenes TNFα
bei Raumtemperatur zerfällt, wurden die Zellkulturüberstände aliquotiert und bei
jeder neuen Bestimmung einer Probe ein neues Aliquot aufgetaut. Daher ist es von
besonderer Wichtigkeit, dass die Standards sowie die Proben während des
Ansetzens der ELISA ständig bei 2–8°C auf Eis gelag ert werden, um die
ursprüngliche Konzentration von TNFα zu erhalten. Das Ansetzen der ELISA
geschah nach Angaben des Herstellers. Die Zellkulturüberstände wurden wie oben
beschrieben gewonnen. Alle Assays wurden in Doppelbestimmung durchgeführt.
Die Absorption wurde unverzüglich am ELISA Reader bei einer Wellenlänge von
450nm gegen die Referenzwellenlänge von 629nm gemessen. Mittels Computer
Software wurde eine Standardkurve erstellt und die TNF-α Konzentrationen der
Proben berechnet und in pg/ml angegeben. Bei jedem ELISA wurde eine
Positivkontrolle mitgeführt.
3.7 Statistische Auswertung
Die Daten wurden für die verschiedenen Therapieoptionen und Kontrollen gemittelt
und die Standardabweichung sowie der mittlere statistische Fehler berechnet.
Anschließend wurden die Daten einem Student´schen t-Test für ungepaarte
Datensätze unterzogen. Als statistisch signifikant wurde ein p<0,05 angesehen, ein
p<0,01 wurde als statistisch hochsignifikant angesehen.
- 18 -
4. Ergebnisse
4.1 Zellvitalität
Die Zellvitalität wurde 24 Stunden nach der Stimulation der Makrophagen mit LPS
durch Färbung mit Trypanblau ermittelt.
4.1.1 Reduktion der Zellvitalität von THP-1 Zellen durch Lipopolysaccharid
Wir führten zunächst eine Dosisfindungsstudie durch, in der die Makrophagen mit
aufsteigenden Dosen von LPS (5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90µg/ml) stimuliert
wurden. Ab 5µg/ml zeigte sich ein signifikanter Anstieg avitaler Zellen (Abb. 1).
Dieser stieg gegenüber der Kontrolle mit durchschnittlich 7,87±3,59% bis 80µg/ml
LPS stetig an. Bei 80µg/ml LPS betrug der Anteil avitaler Zellen 63,51±8,10%. Ab
60µg/ml zeigte sich erstmals ein hochsignifikanter Zuwachs an avitalen Zellen.
Somit konnte ein dosisabhängiger zytotoxischer Effekt von LPS auf die
Makrophagenkultur beobachtet werden.
0
20
40
60
80
100
Kontrolle 5 10 20 30 40 50 60 70 80 90
LPS-Konzentration [µg/ml]
% a
vita
ler
Zel
len
**
**
*
****
** **
Abb. 1: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen in der Trypanblaufärbung 24h nach der Stimulation mit aufsteigenden LPS – Konzentrationen (n=3) im Vergleich zur Kontrolle (*p<0,05; **p<0,01).
- 19 -
4.1.2 Einfluss von Insulin auf die Zellvitalität in LPS-stimulierten THP-1
Zellen
Als Negativkontrollen wurden zunächst Trypanblaufärbungen an Zellen
durchgeführt, die mit Insulin alleine behandelt wurden (Tab. 1). Hier zeigte sich bei
der Zellbehandlung mit 1, 5, 10 und 15U/ml Insulin keine signifikante Veränderung
des Anteils avitaler Zellen gegenüber der Kontrolle. Erst bei der Applikation von 20
und 25U/ml Insulin konnte ein hochsignifikanter Anstieg des Anteils avitaler Zellen
beobachtet werden (p<0,01). Daher wurden diese Dosierungen nicht mehr in den
weiteren Experimenten verwendet.
Behandlung der THP-1 Zellen % avitaler Zellen
Kontrolle 6,00±5,8310µg LPS 28,54±7,391U/ml Insulin 10,29±6,895U/ml Insulin 12,61±5,7210U/ml Insulin 10,50±7,4915U/ml Insulin 10,32±6,6320U/ml Insulin 51,31±10,5225U/ml Insulin 85,27±8,36
Tab.1: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Applikation von Insulin [U/ml] (n=4) verglichen mit der Kontrollgruppe ohne Behandlung (Negativkontrolle).
Nach Stimulation mit 5µg/ml LPS betrug der Anteil avitaler Zellen 24,42±2,32%.
Durch Behandlung mit Insulin konnte bei allen verwendeten Insulinkonzentrationen
ein hochsignifikanter Rückgang (p<0,01) des Zellsterbens beobachtet werden
(Abb. 2).
Bei 10µg/ml LPS betrug der Prozentsatz avitaler Zellen 44,53±0,15% (Abb. 3). Auch
hier zeigte sich ein hochsignifikanter Abfall der Anzahl avitaler Zellen (p<0,01) bei
allen Insulinkonzentrationen.
Die Stimulation der Makrophagen mit 20µg/ml LPS lieferte ein ähnliches Ergebnis
(Anhang Abb.41). Zunächst betrug der Anteil avitaler Zellen durch die alleinige
Stimulation mit LPS 37,76±2,49%. Durch Therapie mit 1U/ml Insulin konnte ein
hochsignifikanter Rückgang (p<0,01) auf 11,3±0,30% erreicht werden. Bei 5, 10 und
15U/m war der Rückgang avitaler Zellen geringer als bei der Behandlung der Zellen
mit 1U/ml, der Abfall war allerdings immer noch signifikant (p<0,05).
Diese Ergebnisse bestätigten sich auch bei 30µg/ml LPS (Anhang Abb. 42). Hier
betrug der Anteil avitaler Zellen 60,67±6,18%. Durch den Einsatz von Insulin konnte
die Zahl avitaler Zellen bei allen Konzentrationen nahezu halbiert werden. Bei 1, 10
und 15U/ml war die Verminderung der Anzahl avitaler Zellen signifikant (p<0,05),
bei 5U/ml hochsignifikant (p<0,01).
- 20 -
0
20
40
60
80
100
Kontrolle 5µg LPS +1UInsulin
+5UInsulin
+10UInsulin
+15UInsulin
Zellbehandlung
% a
vita
ler
Zel
len
** ** ****
Abb. 2: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 5µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Insulin [U/ml] (n=3) verglichen mit 5µg/ml LPS (**p<0,01), Kontrolle = ohne Behandlung.
0
20
40
60
80
100
Kontrolle 10µg LPS +1UInsulin
+5UInsulin
+10UInsulin
+15UInsulin
Zellbehandlung
% a
vita
ler
Zel
len
**** ** **
Abb. 3: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Insulin [U/ml] (n=3) verglichen mit 10µg/ml LPS (**p<0,01).
- 21 -
Anders stellte sich der Verlauf der Therapie bei der Stimulation der Makrophagen
mit 40µg/ml LPS dar (Anhang Abb. 43). Bei 40µg/ml LPS betrug die Anzahl avitaler
Zellen 79,12±3,40%. Mit 1 beziehungsweise 5U/ml Insulin konnte noch ein leichter
Rückgang an toten Zellen erreicht werden, dieser war allerdings nicht mehr
signifikant. Durch die Applikation von 10 beziehungsweise 15U/ml stieg die Zahl
avitaler Zellen über die Rate der Positivkontrolle mit 40µg/ml LPS auf 83,14±3,95%
beziehungsweise 84,39±1,26% an.
Bei 50µg/ml LPS betrug der Anteil avitaler Zellen 91,57±1,20% (Anhang Abb. 44)
Durch diese hohe Rate an avitalen Zellen, konnte bei der Therapie mit 1, 5 und
10U/ml Insulin ein hochsignifikanter Abfall des Anteils avitaler Zellen erzielt werden
(p<0,01), bei 15U/ml war ein signifikanter Rückgang zu verzeichnen.
Somit konnte bei Stimulation der Zellen mit 5 bis 30µg/ml LPS durch die
Behandlung mit 1 bis 15U/ml Insulin ein deutlicher Rückgang des Anteils avitaler
Zellen erreicht werden.
- 22 -
4.1.3 Einfluss von Propranolol auf die Zellvitalitä t in LPS-stimulierten THP-1
Zellen
Als Negativkontrollen wurden zunächst Trypanblaufärbungen an Zellen
durchgeführt, die mit Propranolol alleine behandelt wurden (Tab. 2). Hier zeigte sich
bei einer Zellbehandlung mit 1, 10 und 100µM Propranolol keine signifikante
Veränderung des Anteils avitaler Zellen gegenüber der Kontrolle. Erst bei der
Applikation von 500µM Propranolol konnte ein hochsignifikanter Anstieg des Anteils
avitaler Zellen beobachtet werden (p<0,01). Daher wurde diese Dosierung nicht für
die weiteren Experimente verwendet.
Behandlung der THP-1 Zellen % avitaler Zellen
Kontrolle 6,00±5,8310µg LPS 28,54±7,390,1µM Propranolol 6,00±5,001µM Propranolol 7,71±4,6310µM Propranolol 9,34±6,33100µM Propranolol 12,46±5,14500µM Propranolol 100,00±0,00
Tab. 2: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Applikation von Propranolol [µM] (n=3) verglichen mit der Kontrollgruppe ohne Behandlung. Die Kombination von 10µg/ml LPS mit 1 und 10µM Propranolol führte zu einem
hochsignifikanten Absinken der Zahl avitaler Zellen auf 2,77±1,07% bzw.
4,68±1,27%. Die Behandlung mit Propranolol nach Stimulation mit 5µg/ml LPS
zeigte bei hohen Dosen (100µM) nahezu keinen Rückgang des Anteils avitaler
Zellen (Abb. 4).
Bei Stimulation der Zellen mit 10µg/ml LPS zeigte sich nach Gabe von 1µM
Propranolol ein hochsignifikantes Absinken der Zahl avitaler Zellen auf 7,63±0,99%
(Abb. 5, p<0,01). Ein ähnlicher Effekt konnte für die Behandlung der Zellen mit 10
und 100µM Propranolol nachgewiesen werden. Bei beiden Dosierungen war ein
hochsignifikanter Abfall der Zahl avitaler Zellen auf 8,02±1,10% bzw. 19,35±0,68%
zu verzeichnen (p<0,01).
Bei 20µg/ml LPS wurde der Effekt noch deutlicher sichtbar (Anhang Abb. 45). Im
Vergleich zum Stimulationswert von 20µg/ml LPS mit 37,76±2,49% fiel der
Prozentsatz avitaler Zellen bei allen Propranololdosierungen auf Werte unter 9%
(1µM: 3,87±0,81%, 10µM: 4,05±2,17%, 100µM: 8,43±2,73%). Daher war bei allen
getesteten Propranololdosierungen ein hochsignifikanter Rückgang des Anteils
avitaler Zellen zu verzeichnen (p<0,01).
- 23 -
0
20
40
60
80
100
Kontrolle 5µg LPS +1µMPropranolol
+10µMPropranolol
+100µMPropranolol
Zellbehandlung
% a
vita
ler
Zel
len
** ** **
Abb. 4: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 5µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Propranolol [µM] (n=3) verglichen mit 5µg/ml LPS (**p<0,01).
0
20
40
60
80
100
Kontrolle 10µg LPS +1µMPropranolol
+10µMPropranolol
+100µMPropranolol
Zellbehandlung
% a
vita
ler
Zel
len
**
** **
**
Abb. 5: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Propranolol [µM] (n=3) verglichen mit 10µg/ml LPS (**p<0,01).
- 24 -
Für 30µg/ml LPS konnte ebenfalls ein deutliches Absinken der Rate avitaler Zellen
durch die Propranololgabe erreicht werden (Anhang Abb. 46) Im Vergleich zur
Stimulation mit 30µg/ml LPS mit einem Anteil von 60,67±6,18% avitaler Zellen war
ein hochsignifikanter Rückgang des Anteils avitaler Zellen (<22%) bei allen
Dosierungen zu beobachten (p<0,01). Dieser Trend konnte auch für höhere LPS-
Dosierungen gezeigt werden (Anhang Abb. 47, 48).
Somit ergab sich bei allen verwendeten LPS-Dosierungen bei Behandlung der
Zellen mit 1 bis 100µM Propranolol ein signifikanter Rückgang des Anteils avitaler
Zellen. Bei geringen LPS-Dosierungen war der Behandlungserfolg mit der höchsten
Propranololdosierung mit 100µM am wenigsten ausgeprägt.
- 25 -
4.2 Zellaktivität
Die Zellaktivität wurde 24 Stunden nach der Stimulation mit LPS mit dem
Zellproliferationsassay gemessen. Die optische Dichte (OD) ist direkt proportional
zur Zahl lebender Zellen.
4.2.1 Einfluss von LPS auf die Zellaktivität von T HP-1 Zellen
Eine Stimulation der Makrophagen mit 1, 5, 10, 20 und 30µg/ml LPS zeigte keine
signifikante Veränderung der Zellaktivität verglichen mit der Kontrollpopulation ohne
LPS mit 2,326±0,016 (Abb. 6). Ab einer Stimulation mit 40µg/ml LPS zeigte sich ein
hochsignifikanter Abfall der Zellaktivität (p<0,01). Bei 100µg/ml LPS betrug die
Zellaktivität 0,789±0,036. Somit zeigt sich eine dosisabhängige Reduktion der
Zellaktivität durch LPS in der Makrophagenkultur.
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
Kontrolle 1 5 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
LPS-Konzentration [µg/m l]
OD
**
****
** ****
**
Abb. 6: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit aufsteigenden LPS – Konzentrationen (n=6) im Vergleich zur Kontrolle (**p<0,01).
4.2.2 Einfluss von Insulin auf die Zellaktivität in LPS-stimulierten THP-1
Zellen
Verglichen mit der Stimulation der Makrophagen mit 10 µg/ml LPS
(OD 2,583±0,044) zeigte sich keine signifikante Veränderung der Zellaktivität bei
Behandlung mit 1 und 5U/ml Insulin (Abb. 7).
Ab der Zugabe von 10U/ml Insulin konnte eine hochsignifikante Verringerung der
Zellaktivität gezeigt werden. Die OD betrug 0,825±0,112 bei Zugabe von 25U/ml
Insulin (p<0,01).
Sehr ähnlich verhielt sich die Zellaktivität bei der Stimulation mit 20 und 30µg/ml
LPS (Abb. 8). Hier zeigte sich ein hochsignifikanter Abfall der Zellaktivität gegenüber
der Stimulation mit LPS bei einer Applikation von 20 und 25U/ml Insulin (p<0,01).
- 26 -
Die Stimulation mit 30, 40 und 50µg/ml LPS zeigte ein ähnliches Bild (Anhang
Abb. 49 - 51).
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
Kontrolle 10µgLPS
+1UInsulin
+5UInsulin
+10UInsulin
+15UInsulin
+20UInsulin
+25UInsulin
Zellbehandlung
OD
**
**
****
Abb. 7: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=6) im Vergleich zu 10µg/ml LPS (**p<0,01).
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
Kontrolle 20µgLPS
+1UInsulin
+5UInsulin
+10UInsulin
+15UInsulin
+20UInsulin
+25UInsulin
Zellbehandlung
OD
*
**
**
Abb. 8: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 20µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=6) im Vergleich zu 20µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01). Somit konnte bei allen verwendeten LPS-Dosierungen (10, 20, 30, 40 und 50µg/ml
LPS) ein hochsignifikanter Abfall der Zellaktivität für die Gabe von 20 und 25U/ml
Insulin beobachtet werden. Daher wurden diese hohen Insulindosierungen nicht für
weiterführende Experimente verwendet.
- 27 -
4.2.3 Einfluss von Propranolol auf die Zellaktivitä t in LPS-stimulierten THP-1
Zellen
Bei Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS betrug die Zellaktivität
2,583±0,044 (Abb. 9). Bis zur Applikation von 100µM Propranolol zeigte sich keine
signifikante Veränderung der Zellaktivität. Erst bei einer Applikation von 500µM
Propranolol konnte ein deutlicher hochsignifikanter Abfall in der Zellaktivität auf
0,239±0,006 (p<0,01) festgestellt werden.
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
Kontrolle 10µg LPS +0,1µMPropranolol
+1µMPropranolol
+10µMPropranolol
+100µMPropranolol
+500µMPropranolol
Zellbehandlung
OD
**
Abb. 9: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=6) im Vergleich zu 10µg/ml LPS (**p<0,01).
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
Kontrolle 20µg LPS +0,1µMPropranolol
+1µMPropranolol
+10µMPropranolol
+100µMPropranolol
+500µMPropranolol
Zellbehandlung
OD
**
Abb. 10: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 20µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=6) im Vergleich zu 20µg/ml LPS (**p<0,01). Bei Stimulation mit 20µg/ml LPS und der entsprechenden Zugabe von Propranolol
zeigte sich ein nahezu identisches Bild wie schon bei 10µg/ml LPS. Bei Stimulation
mit 20µg/ml LPS betrug die Zellaktivität 2,222±0,043 (Abb. 10). Bis zur Applikation
von 100µM Propranolol zeigte sich keine signifikante Veränderung der Zellaktivität.
Bei Zugabe von 500µM Propranolol konnte ein hochsignifikanter Rückgang der
Zellaktivität auf 0,309±0,003 beobachtet werden (p<0,01).
- 28 -
Die Stimulation mit 30, 40 und 50µg/ml LPS zeigte ein ähnliches Bild (Anhang
Abb. 52-54).
Somit konnte bei allen verwendeten LPS-Dosierungen (10, 20, 30, 40 und 50µg/ml
LPS) ein hochsignifikanter Abfall der Zellaktivität für die Gabe von 500µM
Propranolol beobachtet werden. Daher wurde diese hohe Propranololdosierung
nicht für weiterführende Experimente verwendet.
- 29 -
4.3 Apoptose
4.3.1 JC-1 Färbung
Die Apoptoserate wurde 24 Stunden nach Stimulation der Makrophagen mit LPS
mittels JC-1 Färbung ermittelt.
4.3.1.1 Induktion von Apoptose in THP-1 Zellen durc h Lipopolysaccharid
Gegenüber der Kontrollpopulation mit einer Apoptoserate von 4,23±0,48% konnte
bei Stimulation der Makrophagen mit aufsteigenden Dosen von LPS eine stetige
Erhöhung des Prozentsatzes apoptotischer Zellen beobachtet werden (Abb. 11, 12).
Bei Stimulation mit 5µg/ml LPS zeigte sich erstmals eine signifikante Erhöhung der
Apoptoserate auf 17,46±3,30% gegenüber der Kontrolle ohne LPS (p<0,05). Ab
10µg/ml LPS wurde die Steigerung des prozentualen Anteils apoptotischer Zellen
hochsignifikant (p<0,01). Bei Stimulation mit 20µg/ml LPS deutete sich nochmals ein
Anstieg der Apoptoserate auf 67,82±5,29% an. Eine Behandlung mit 30, 40 und
50µg/ml LPS führte zu einer Apoptoserate von 72,49±2,35%; 76,61±1,51% und
88,70±4,79%. Insgesamt zeigte sich ein dosisabhängiger Anstieg der Zahl
apoptotischer Zellen durch die Stimulation mit aufsteigenden Dosen von LPS.
0
25
50
75
100
Kontrolle 1 5 10 20 30 40 50
LPS-Konzentration [µg/ml]
% a
popt
otis
cher
Zel
len
*
******
**
**
Abb. 11: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit aufsteigenden LPS – Konzentrationen (n=5) im Vergleich zur Kontrolle (*p<0,05; **p<0,01).
- 30 -
. Abb. 12: Repräsentative mikroskopische Aufnahme von THP-1 Makrophagen (400x) nach JC-1 Färbung. Nahezu alle unbehandelten Zellen (Kontrollgruppe) zeigen eine punktierte grüne (A) bzw. rote (A’) Fluoreszenz als Zeichen für eine polarisierte Mitochondrienmembran (=nicht apoptotische Zellen); Ca. ein Drittel der mit 10µ/ml LPS behandelten Zellen zeigen nur eine diffuse grüne (B) bzw. rote (B’) Fluoreszenz ohne Punktierung (apoptotische Zellen), bei Stimulation mit 30µg/ml LPS sind ca. drei Viertel apoptotische Zellen zu sehen (C) und (C’), bei Stimuation mit 50µg/ml zeigen nahezu alle Zellen die diffuse grüne (D) bzw. rote (D’) Fluoreszenz ohne Punktierung, die für apoptotische Zellen charakteristisch ist (weißer Pfeil markiert Apoptosekörperchen).
- 31 -
4.3.1.2 Einfluss von Insulin auf den apoptotischen Effekt von LPS in THP-1
Zellen
Um negative Effekte der Behandlung mit Insulin allein auf die LPS-stimulierten
Zellen auszuschließen, führten wir zuerst eine Negativkontrolle mit Insulin in
aufsteigenden Konzentrationen durch (Tab. 3, Anhang Abb. 55). Es wurden keine
statistisch relevanten Änderungen der Apoptoserate verglichen mit der
Kontrollpopulation beobachtet.
Behandlung der THP-1 Zellen % apoptotischer ZellenKontrolle 7,88±2,0910µg LPS 36,43±0,511U/ml Insulin 7,75±1,105U/ml Insulin 5,18±1,3110U/ml Insulin 7,61±2,5615U/ml Insulin 11,17±0,54
Tab. 3: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (JC-1 Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen mit Insulin [U/ml] (n=4).
Durch die Stimulation der Makrophagen mit 5µg/ml LPS erhöhte sich die Zahl
apoptotischer Zellen von 7,81±1,94% bei der Kontrolle auf 23,19±1,71%
(Abb. 13, 14). Durch Behandlung mit niedrigen Dosen Insulin (1 und 5U/ml) konnte
der Prozentsatz apoptotischer Makrophagen wieder auf das Niveau der
Kontrollpopulation gesenkt werden (1U/ml Insulin: 8,50±1,24% bzw. 5U/ml Insulin:
7,59±1,37%). Dies stellt gegenüber der Positivkontrolle mit LPS eine
hochsignifikante Absenkung der Apoptoserate dar (p<0,01). Die Therapie mit
höheren Dosen Insulin (10 und 15U/ml) erhöhte die Apoptoserate gegenüber der
Kontrolle geringfügig auf 12,85±1,19% beziehungsweise 11,10±2,77%. Verglichen
mit der Stimulation mit LPS war ein hochsignifikanter Rückgang der Apoptoserate
zu verzeichnen (p<0,01).
Bei Stimulation mit 10µg/ml LPS betrug die Zahl apoptotischer Zellen 36,01±1,22%
(Abb. 15). Hier senkte die Therapie mit allen verwendeten Dosierungen an Insulin
die Apoptoserate nahezu um die Hälfte verglichen zur Stimulation mit 10µg/ml LPS
(1U/ml Insulin: 20,13±3,42%; 5U/ml Insulin: 17,90±0,62%; 10U/ml Insulin:
18,44±2,84% bzw. 15U/ml Insulin: 19,76±2,94%). Dieser Abfall der Apoptoserate
war für alle Dosen Insulin hochsignifikant (p<0,01).
- 32 -
Abb. 13: Repräsentative mikroskopische Aufnahme von THP-1 Makrophagen (400x) nach JC-1 Färbung. Ca. ein Viertel der mit 5µ/ml LPS behandelten Zellen zeigen eine diffuse grüne (A) bzw. rote (A’) Fluoreszenz ohne Punktierung (=apoptotische Zellen; mit weißem Pfeil markiert). Im Gegensatz dazu zeigen nicht apoptotische Zellen eine punktierte grüne bzw. rote Fluoreszenz, welche die polarisierte Mitochondrialmembran repräsentiert. Wurden die mit LPS-stimulierten Zellen mit 1U/ml Insulin behandelt, reduziert sich der Anteil apoptotischer Zellen um mehr als die Hälfte (B bzw. B’). Nach Stimulation der Makrophagen mit 20 µg/ml LPS betrug die Apoptoserate
71,05±1,63% (Anhang Abb. 56). Hier konnte eine Behandlung mit niedrigen
Dosierungen an Insulin (1 und 5U/ml) die Apoptoserate signifikant auf Werte von
60,06±4,22% beziehungswiese 61,39±4,13% senken (p<0,05). Der Rückgang der
Apoptoserate war jedoch nicht so deutlich wie bei 5 und 10µg/ml LPS (p<0,05).
Behandlung mit hohen Dosen (10 und 15 U/ml) Insulin steigerte sogar die
Apoptoserate mit 86,20±5,44% beziehungsweise 81,35±2,72% signifikant über das
Niveau von 20µg/ml LPS (p<0,05).
- 33 -
0,00
10,00
20,00
30,00
Kontrolle 5µg LPS +1U Insulin +5U Insulin +10UInsulin
+15UInsulin
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
**
****
**
Abb. 14: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 5µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=4) im Vergleich zu 5µg/ml LPS (**p<0,01).
0,00
25,00
50,00
75,00
Kontrolle 10µg LPS +1U Insulin +5U Insulin +10UInsulin
+15UInsulin
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
******
**
Abb. 15: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=4) im Vergleich zu 10µg/ml LPS (**p<0,01).
- 34 -
Ein ähnliches Bild zeigte sich bei Stimulation der Zellen mit 30 µg/ml LPS (Anhang
Abb. 57). Hier betrug die Apoptoserate bei Stimulation mit 30µg/ml LPS
82,37±2,21%. Durch die Therapie mit 1U/ml Insulin konnte noch eine signifikante
Verringerung der Apoptoserate auf 73,35±2,31% erreicht werden (p<0,05). Bei
Applikation von 5 und 10U/ml Insulin kehrte sie auf das Niveau der Stimulation mit
30 µg/ml LPS zurück und erhöhte sich bei einer Behandlung mit 15U/ml Insulin
signifikant auf 95,07±4,27% (p<0,05).
Bei Stimulation der Makrophagen mit 40 µg/ml LPS betrug die Anzahl apoptotischer
Zellen 93,96±0,50% (Anhang, Abb. 58). Die Therapie mit 1 U/ml Insulin erbrachte
einen signifikanten Rückgang der Apoptoserate auf 89,54±1,84% (p<0,05) und fiel
damit wesentlich geringer aus als bei den vorherigen Dosierungen von LPS. Danach
stieg der Prozentsatz apoptotischer Zellen jedoch kontinuierlich an. Bei der
Behandlung mit hohen Dosen Insulin von 10 und 15U/ml zeigte sich im Vergleich
zur Stimulation mit 40 µg/ml LPS eine signifikante Erhöhung der Apoptoserate auf
98,25±1,75% beziehungsweise 100,00±0,00% (p<0,05).
Somit konnte vor allem in den Stimulationsgruppen mit 5 und 10µg/ml LPS bei allen
verwendeten Insulindosierungen (1, 5, 10 und 15U/ml) ein hochsignifikanter
Rückgang der Apoptoserate beobachtet werden (p<0,01). Bei höheren LPS-
Dosierungen konnten nur noch kleine Insulindosen, vor allem 1U/ml, einen
signifikanten Rückgang der Apoptoserate erreichen. Hohe Insulindosierungen
erhöhten die Apoptoserate noch über das Niveau der LPS-Stimulation.
- 35 -
4.3.1.3 Einfluss von Propranolol auf den apoptotisc hen Effekt von LPS
in THP-1 Zellen
Um negative Effekte der Behandlung mit Propranolol allein auf die LPS-stimulierten
Zellen auszuschließen, führten wir zuerst eine Negativkontrolle mit Propranolol
allein in aufsteigenden Konzentrationen durch (Tab. 4, Anhang Abb. 55). Es wurden
keine statistisch relevanten Änderungen der Apoptoserate für die Zellbehandlung
mit Propranolol verglichen mit der Kontrollpopulation beobachtet.
Behandlung der THP-1 Zellen % apoptotischer ZellenKontrolle 7,88±2,0910µg LPS 36,43±0,511µM Propranolol 5,83±3,1010µM Propranolol 3,07±0,69
Tab. 4: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (JC-1 Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen mit nur Propranolol [µM] verglichen mit der Kontrolle ohne LPS (n=4).
Für die Stimulation der Makrophagen mit 5µg/ml LPS ließ sich für die Behandlung
der Zellen mit Propranolol ein deutlicher antiapoptotischer Effekt nachweisen
(Abb. 16, 17). Bei Stimulation mit 5µg/ml LPS betrug die Apoptoserate 23,19±1,71%
verglichen mit der Kontrollpopulation ohne LPS mit 7,81±1,49%. Sowohl bei der
Therapiegruppe mit 1, als auch mit 10µM Propranolol wurde die Apoptoserate auf
7,34±1,49% beziehungsweise 3,53±0,86% gesenkt. Dieser hochsignifikante
Rückgang der Apoptoserate lag sogar noch unter der Apoptoserate der
Kontrollpopulation ohne LPS (p<0,01).
Auf etwas höherem Apoptoseniveau konnten wir dies auch für die Stimulation mit
10µg/ml LPS zeigen (Abb. 18). Bei Stimulation mit 10µg/ml LPS betrug die
Apoptoserate 36,01±1,22%. Bei Therapie mit 1 und 10 µM Propranolol sank die
Apoptoserate hochsignifikant auf 10,26±2,22% beziehungsweise 4,70±1,30%
(p<0,01). Somit hatte die Zahl apoptotischer Zellen bei 10 µM Propranolol wieder
das Niveau der Kontrollgruppe erreicht.
Bei Stimulation mit 20 µg/ml LPS betrug die Apoptoserate 71,05±1,63% (Anhang
Abb. 60). Nach anschließender Therapie mit Propranolol konnte sowohl bei
Therapie mit 1µM Propranolol ein signifikanter (p<0,05), als auch bei Therapie mit
10µM Propranolol ein hochsignifikanter Abfall der Apoptoserate auf 58,16±1,12%
beziehungsweise 60,95±2,54% beobachtet werden (p<0,01).
Bei Stimulation mit 30µg/ml LPS betrug der Anteil apoptotischer Zellen
82,37±2,21% (Anhang Abb. 61). So fiel zwar der Prozentsatz apoptotischer Zellen
durch die Behandlung mit 1µM Propranolol auf 78,58±2,49%. Dies wurde aber erst
bei 10µM Propranolol mit einer Apoptoserate von 74,71±1,69% signifikant (p<0,05).
- 36 -
Abb. 16: Repräsentative mikroskopische Aufnahme von THP-1 Makrophagen (400x) nach JC-1 Färbung. Ca. ein Viertel der mit 5µ/ml LPS behandelten Zellen zeigen eine diffuse grüne (A) bzw. rote (A’) Fluoreszenz ohne Punktierung (=apoptotische Zellen; mit weißem Pfeil markiert). Im Gegensatz dazu zeigen nicht apoptotische Zellen eine punktierte grüne bzw. rote Fluoreszenz, welche die polarisierte Mitochondrialmembran repräsentiert. Wurden die mit LPS-stimulierten Zellen mit 10µM Propranolol behandelt, betrug der Anteil apoptotischer Zellen 3,5% (B bzw. B’). Bei einer Stimulation der Makrophagen mit 40µg/ml LPS und nachfolgender
Applikation von Propranolol zeigte sich keine Änderungen der Apoptoserate im
Vergleich zur alleinigen LPS-Gabe (Anhang Abb. 62).
Somit konnte vor allem in den Stimulationsgruppen mit 5 und 10µg/ml LPS bei allen
verwendeten Propranololdosierungen (1 und 10µM) ein hochsignifikanter Rückgang
der Apoptoserate beobachtet werden (p<0,01). Bei höheren LPS-Dosierungen
konnte bei einer hohen Propranololdosierung von 10µM ein signifikanter Rückgang
der Apoptoserate erreicht werden (p<0,05).
- 37 -
0,00
10,00
20,00
30,00
Kontrolle 5µg LPS +1µM Propranolol +10µMPropranolol
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
**
**
Abb. 17: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 5µg/ml LPS und der entsprechenden Therapieoption mit Propranolol [µM] (n=4) im Vergleich zu 5µg/ml LPS (**p<0,01).
0,00
25,00
50,00
75,00
Kontrolle 10µg LPS +1µM Propranolol +10µMPropranolol
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
**
**
Abb. 18: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färubng) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=4) im Vergleich zu 10µg/ml LPS (**p<0,01).
- 38 -
4.3.1.4 Einfluss des NF- κB Signalwegs auf die Apoptose in LPS-stimulierten THP-1 Zellen
Um zu untersuchen, ob der NF-κB Signalweg für die LPS-induzierte Apoptose von
Bedeutung ist, wurde der nicht selektive Serinproteaseinhibitor TPCK eingesetzt,
der in Makrophagen eine Blockade des Apoptoseinduktors NF-κB herbeiführt.
Zunächst wurden einige Kontrollversuche durchgeführt, um die Effekte von TPCK
allein und in Kombination mit LPS auf die Makrophagenpopulation nach JC-1
Färbung zu untersuchen (Anhang Abb. 64). Zur Dosisfindung wurde dann ein
Titrationsversuch mit aufsteigenden TPCK-Konzentrationen (1, 10, 50µM)
durchgeführt (Tab. 5). Die Apotoserate wurde anhand der JC-1 Färbung ermittelt.
Bei 1µM TPCK konnte keine signifikante Veränderung der Apoptoserate im
Vergleich zur Kontrolle ohne LPS festgestellt werden. Bei höheren Dosierungen (10,
50µM TPCK) zeigte sich ein signifikant höherer Anteil an apoptotischen Zellen im
Vergleich zur Kontrollgruppe ohne LPS (p<0,01). Daher wurden diese hohen
Dosierungen nicht für weitergehende Versuchsreihen verwendet.
Behandlung der THP-1 Zellen % apoptotischer ZellenKontrolle 2,85±0,6710µg/ml LPS 32,06±0,641µM TPCK 3,06±0,2910µM TPCK 35,82±3,9450µM TPCK 100,00±0,00
Tab. 5: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (JC-1 Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen nur mit TPCK [µM] (n=3). Bei Stimulation der Zellen mit 10 µg/ml LPS betrug der Anteil apoptotischer Zellen
32,06±0,64% (Anhang Abb. 64). Die zusätzliche Gabe von 1µM TPCK führte zu
einem hochsignifikanten Rückgang der Apoptose auf 13,22±0,21% (p<0,01). Somit
konnte der Serinproteaseinhibitor TPCK über den NF-κB Signalweg in einer
Dosierung von 1µM die LPS-vermittelte Apoptose deutlich reduzieren.
- 39 -
4.3.1.4.1 Einfluss des NF- κB Signalwegs auf die Reduktion der LPS-
induzierten Apoptose durch Insulin
Im nächsten Versuchsabschnitt wurden die Zellen mit 10 µg/ml LPS stimuliert und
anschließend 5U/ml Insulin hinzugegeben (Abb. 19). Zusätzlich zum Insulin wurde
TPCK hinzugegeben, um zu untersuchen, ob der NF-κB Signalweg an der
insulinvermittelten Apoptosereduktion beteiligt ist. Bei Stimulation der Zellen mit
10µg/ml LPS betrug der Anteil apoptotischer Zellen 22,04±1,51%. Die Behandlung
mit 5U/ml Insulin führte zu einem Rückgang der Apoptoserate auf 11,19±0,92%.
Nach der zusätzlichen Applikation von 1µM TPCK konnte eine Steigerung der
Apoptoserate auf das Niveau der Stimulation mit LPS beobachtet werden (5U/ml
Insulin + 1µM TPCK: 25,95±0,54%). Dieser Rückgang der Apoptoserate war im
Vergleich zur Therapie mit 5U/ml Insulin hochsignifikant (p<0,01).
0
25
50
Kontrolle 10µg LPS +5U Insulin +5U Insulin+1µM TPCK
% a
popt
otis
cher
Zel
len
**
Abb. 19: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Therapieoption mit 5U/ml Insulin, sowie der Applikation von TPCK [µM] (n=3) im Vergleich zur Therapie mit 5U/ml Insulin (**p<0,01).
- 40 -
4.3.1.4.2 Einfluss des NF- κB Signalwegs auf die Reduktion der LPS-
induzierten Apoptose durch Propranolol
In diesem Versuchsabschnitt wurden die Zellen mit 10 µg/ml LPS stimuliert und
anschließend 10µM Propranolol hinzugegeben (Abb. 20). Zusätzlich zum
Propranolol wurde TPCK hinzugegeben, um zu untersuchen, ob der NF-κB
Signalweg an der propranololvermittelten Apoptosereduktion beteiligt ist. Die
Apoptoserate wurde mittels JC-1 Färbung ermittelt. Bei Stimulation der Zellen mit
10µg/ml LPS betrug die Apoptoserate 31,25±1,11% (Abb. 20). Die Behandlung mit
10µM Propranolol verringerte die Apoptoserate auf 7,60±0,42%. Bei gleichzeitiger
Applikation von 1µM TPCK zeigte sich ebenso eine hochsignifikante Steigerung der
Apoptoserate verglichen mit der Therapie mit 10µM Propranolol (p<0,01). Jedoch
kehrte die Zahl apoptotischer Zellen mit 20,31±1,37% nicht vollständig auf den
Stimulationswert von 10µg/ml LPS zurück.
0
25
50
Kontrolle 10µg/ml LPS +10µMPropranolol
+10µMPropranolol+1µM TPCK
% a
popt
otis
cher
Zel
len
**
Abb. 20: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Therapieoption mit 10µM Propranolol sowie der Applikation von TPCK [µM] (n=3) im Vergleich zur Therapie mit 10µM Propranolol (**p<0,01).
- 41 -
4.3.1.5 Einfluss des PI3-K Signalwegs auf die Apopt oseinduktion in LPS-
stimulierten THP-1 Zellen
Um zu untersuchen, ob der PI3-K Signalweg für die zytoprotektive Wirkung von
Insulin in LPS-stimulierten Makrophagen bedeutsam ist, wurde der selektive PI3-K
Inhibitor Wortmannin eingesetzt. Zunächst wurden einige Kontrollversuche
durchgeführt, um die Effekte von Wortmannin allein und in Kombination mit LPS auf
die Makrophagenpopulation zu untersuchen. Die Apoptoserate wurde mittels JC-1
Färbung ermittelt (Anhang Abb. 65). Zur Dosisfindung wurde dann ein
Titrationsversuch mit aufsteigenden Wortmannin-Konzentrationen (1, 10, 50, 100,
200nM) durchgeführt (Tab. 6). Hier zeigte sich, dass Wortmannin in allen
verwendeten Dosierungen keine signifikante Änderung der Apoptoserate bewirkte,
wenn es allein oder in Kombination mit LPS appliziert wurde. Bei Applikation von
Wortmannin allein bewegte sich die Apoptoserate auf dem Niveau der
Kontrollgruppe ohne LPS, bei Kombination von LPS mit Wortmannin auf dem
Niveau der Positivkontrolle mit LPS.
Behandlung der THP-1 Zellen % apoptotischer ZellenKontrolle 1,05±0,5410µ/ml LPS 26,79±1,22LPS + 1nM Wortmannin 27,73±1,11LPS + 10nM Wortmannin 24,84±1,29LPS + 50nM Wortmannin 27,87±0,90LPS + 100nM Wortmannin 26,93±1,31LPS + 200nM Wortmannin 27,28±0,481nM Wortmannin 2,65±1,3410nM Wortmannin 1,86±1,2250nM Wortmannin 2,15±0,42100nM Wortmannin 1,19±1,19200nM Wortmannin 0,94±0,47
Tab. 5: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (JC-1 Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen mit nur Wortmannin [nM] sowie LPS kombiniert mit Wortmannin (n=3). Bei Stimulation der Zellen mit 10µg/ml LPS betrug der Anteil apoptotischer Zellen
26,45±0,55%. Die Behandlung mit 5U/ml Insulin verringerte die Zahl apoptotischer
Zellen auf 13,06±1,99%. Durch die zusätzliche Applikation von 1nM Wortmannin
wurde die Apoptoserate wieder auf das Niveau der Stimulation mit LPS erhöht
(Abb. 21). Dieser Anstieg war hochsignifikant (p<0,01). Dies konnte auch bei den
anderen verwendeten Dosierungen beobachtet werden (Anhang Abb. 66).
- 42 -
0
25
50
Kontrolle 10µg LPS +5U Insulin +5U Insulin +1nMWortmannin
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
**
Abb. 21: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit 5U/ml Insulin, sowie der Applikation von aufsteigenden Dosen Wortmannin [nM] (n=3) im Vergleich zur Therapie mit 5U/ml Insulin (**p<0,01).
- 43 -
4.3.2 TUNEL Färbung
Die Apoptoserate wurde 24 Stunden nach der Stimulation der Makrophagen mit
LPS mittels TUNEL Färbung ermittelt, um die Ergebnisse der JC-1 Färbungen zu
verifizieren.
4.3.2.1 Induktion von Apoptose in THP-1 Zellen durc h Lipopolysaccharid
Gegenüber der Kontrollpopulation mit einer Apoptoserate von 8,24±1,09% konnte
bei Stimulation der Makrophagen mit aufsteigenden Dosen von LPS eine stetige
Erhöhung des Prozentsatzes apoptotischer Zellen beobachtet werden (Abb. 22, 23).
Bei Stimulation mit 1µg/ml LPS zeigte sich erstmals eine signifikante Erhöhung der
Apoptoserate auf 12,89±1,96% gegenüber der Kontrolle ohne LPS (p<0,05). Ab
5µg/ml LPS (16,34±1,91%) wurde die Steigerung der Apoptoserate hochsignifikant
(p<0,01). Insgesamt zeigte sich ein dosisabhängiger Anstieg der Zahl apoptotischer
Zellen durch die Stimulation mit aufsteigenden Dosen von LPS.
0
25
50
75
100
Kontrolle 1 5 10 20 30 40 50
LPS-Konzentration [µg/ml]
% a
popt
otis
cher
Zel
len
*
**
**
**
**
**
**
Abb. 22: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (TUNEL Färbung) 24h nach der Stimulation mit aufsteigenden LPS – Konzentrationen (n=4) im Vergleich zur Kontrolle (*p<0,05; **p<0,01).
- 44 -
Abb. 23: Repräsentative mikroskopische Aufnahme von THP-1 Makrophagen (400x) nach TUNEL Färbung. In der Durchlichtaufnahme zeigt sich die Gesamtzellzahl (A-D). Apoptotische Zellen zeigen eine rote Fluoreszenz (typische apoptotische Zelle mit weißem Pfeil markiert). Nicht apoptotische Zellen zeigen keine Fluoreszenz. Die unbehandelten Zellen (Kontrollgruppe) zeigen nahezu keine apoptotischen Zellen (A’). Nach Stimulation der Zellen mit 10µg/ml LPS steigt der Anteil apoptotischer Zellen auf ca. ein Drittel (B’), nach Stimulation mit 30µg/ml sind ca. drei Viertel der Zellen apoptotisch (C’), bei Stimulation der Zellen mit 50µg/ml LPS steigt die Apoptoserate auf ca. 85% (D’).
- 45 -
4.3.2.2 Einfluss von Insulin auf den apoptotischen Effekt von LPS in THP-1
Zellen
Um negative Effekte der Behandlung mit Insulin allein auf die LPS-stimulierten
Zellen auszuschließen, führten wir zuerst eine Negativkontrolle mit nur Insulin in
aufsteigenden Konzentrationen durch (Tab. 6, Anhang Abb. 67). Es wurden keine
statistisch relevanten Änderungen der Apoptoserate für die verwendeten
Insulindosierungen verglichen mit der Kontrollpopulation beobachtet.
Behandlung der THP-1 Zellen % apoptotischer ZellenKontrolle 7,24±2,1410µg LPS 28,98±0,211U Insulin 5,38±0,235U Insulin 5,96±0,5810U Insulin 9,37±1,4615U Insulin 10,72±0,48
Tab. 6: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (TUNEL-Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen mit nur Insulin [U/ml] verglichen mit der Kontrolle ohne LPS (n=3).
Durch die Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS erhöhte sich die Zahl
apoptotischer Zellen von 7,24±2,14% bei der Kontrolle auf 36,52±1,13%
(Abb. 24, 25). Durch die Gabe niedriger Dosen Insulin (1 und 5U/ml) konnte der
Prozentsatz apoptotischer Makrophagen wieder auf das Niveau der
Kontrollpopulation gesenkt werden (1U/ml Insulin: 12,03±2,33% bzw. 5U/ml Insulin:
9,30±0,56%). Dies stellt gegenüber der Positivkontrolle mit LPS eine
hochsignifikante Absenkung der Apoptoserate dar (p<0,01). Die Gabe von höheren
Dosen Insulin (10 und 15U/ml) erhöhte die Apoptoserate gegenüber der Kontrolle
geringfügig auf 14,63±1,45% beziehungsweise 13,92±2,78%. Verglichen mit der
Stimulation mit LPS war ein hochsignifikanter Rückgang der Apoptoserate zu
verzeichnen (p<0,01).
Bei der Stimulation der Zellen mit 50µg/ml LPS betrug die Apoptoserate
84,35±0,65% (Abb. 26, 27). Durch die Gabe von Insulin konnte bei allen
verwendeten Dosierungen (1, 5, 10 und 15U/ml) eine hochsignifikante Absenkung
der Apoptoserate verglichen mit der Stimulation mit 50µg/ml LPS erreicht werden
(p<0,01). Innerhalb der Insulinbehandlung zeigte sich eine leicht ansteigende
Tendenz der Apoptoserate (1U/ml Insulin: 43,11±3,48%; 5U/ml Insulin:
50,35±1,55%; 10U/ml Insulin: 59,45±2,11% bzw. 15U/ml Insulin: 69,03±1,47%).
- 46 -
0
25
50
Kontrolle 10µg LPS +1UInsulin
+5UInsulin
+10UInsulin
+15UInsulin
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
*
****
**
Abb. 24: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (TUNEL Färbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=3) im Vergleich zu 10µg/ml LPS (**p<0,01).
Abb. 25: Repräsentative mikroskopische Aufnahme von THP-1 Makrophagen (400x) nach TUNEL Färbung. In der Durchlichtaufnahme zeigt sich die Gesamtzellzahl (A-B). Apoptotische Zellen zeigen eine rote Fluoreszenz (typische apoptotische Zelle mit weißem Pfeil markiert). Nicht apoptotische Zellen zeigen keine Fluoreszenz. Nach Stimulation der Zellen mit 10µg/ml LPS zeigen ca. 35% der Zellen Zeichen von Apoptose (A’), nach Behandlung der mit LPS stimulierten Zellen mit 5U/ml Insulin betrug der Anteil apoptotischer Zellen ca. 10% (B’).
- 47 -
0
25
50
75
100
Kontrolle 50µg LPS +1UInsulin
+5UInsulin
+10UInsulin
+15UInsulin
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
**
**
**
**
Abb. 26: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (TUNEL Färbung) 24h nach der Stimulation mit 50µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=3) im Vergleich zu 50µg/ml LPS (**p<0,01).
Abb. 27: Repräsentative mikroskopische Aufnahme von THP-1 Makrophagen (400x) nach TUNEL Färbung. In der Durchlichtaufnahme zeigt sich die Gesamtzellzahl (A-B). Apoptotische Zellen zeigen eine rote Fluoreszenz (typische apoptotische Zelle mit weißem Pfeil markiert). Nicht apoptotische Zellen zeigen keine Fluoreszenz. Nach Stimulation der Zellen mit 50µg/ml LPS zeigen ca. 85% der Zellen Zeichen von Apoptose (A’), nach Behandlung der mit LPS stimulierten Zellen mit 5U/ml Insulin betrug der Anteil apoptotischer Zellen ca. 50% (B’).
- 48 -
4.3.2.3 Einfluss von Propranolol auf den apoptotisc hen Effekt von LPS in
THP-1 Zellen
Um negative Effekte der Behandlung mit Propranolol allein auf die LPS-stimulierten
Zellen auszuschließen, führten wir zuerst eine Negativkontrolle mit nur Propranolol
in aufsteigenden Konzentrationen durch (Tab. 7, Anhang Abb. 67). Die
Apoptoserate wurde nach der TUNEL Färbung ermittelt. Es wurden keine statistisch
relevanten Änderungen der Apoptoserate für die Gabe von Propranolol verglichen
mit der Kontrollpopulation beobachtet.
Behandlung der THP-1 Zellen % apoptotischer ZellenKontrolle 7,24±2,1410µg LPS 28,98±0,211µM Propranolol 5,23±0,7910µM Propranolol 3,46±0,56
Tab. 7: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (TUNEL Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen mit nur Propranolol [µM] verglichen mit der Kontrolle ohne LPS (n=3).
Unter dem Einsatz von Propranolol konnte die Zahl apoptotischer Zellen von
36,52±1,13% bei Stimulation mit 10µg/ml LPS deutlich auf 12,66±0,28% bei
Applikation von 1µM Propranolol gesenkt werden (Abb. 28, 29). Im Falle der
Behandlung mit 10µM Propranolol konnte die Apoptoserate auf das Niveau der
Kontrollgruppe verringert werden (8,40±0,44%). In beiden Fällen war dieser
Rückgang der Apoptoserate hochsignifikant (p<0,01).
Die Behandlung mit Propranolol bei einer Stimulation der Makrophagen mit 50µg/ml
LPS erbrachte ähnliche Ergebnisse (Abb. 30, 31). Bei Stimulation mit 50µg/ml LPS
betrug die Apoptoserate 84,35±0,49%. Die Behandlung mit Propranolol reduzierte
die Apoptoserate deutlich (1µM Propranolol: 53,57±2,15%, 10µM Propranolol:
45,16±6,43%). Bei beiden Dosierungen war der Rückgang der Apoptoserate
hochsignifikant (p<0,01). So konnte durch die Gabe von 10µM Propranolol nahezu
eine Halbierung der Apoptoserate im Vergleich zur Stimulation mit 50µg/ml LPS
erreicht werden.
- 49 -
0
25
50
Kontrolle 10µg LPS +1µMPropranolol
+10µMPropranolol
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
****
Abb. 28: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (TUNEL Färbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=3) im Vergleich zu 10µg/ml LPS (**p<0,01).
Abb. 29: Repräsentative mikroskopische Aufnahme von THP-1 Makrophagen (400x) nach TUNEL Färbung. In der Durchlichtaufnahme zeigt sich die Gesamtzellzahl (A-B). Apoptotische Zellen zeigen eine rote Fluoreszenz (typische apoptotische Zelle mit weißem Pfeil markiert). Nicht apoptotische Zellen zeigen keine Fluoreszenz. Nach Stimulation der Zellen mit 10µg/ml LPS zeigen ca. 35% der Zellen Zeichen von Apoptose (A’), nach Behandlung der mit LPS stimulierten Zellen mit 1µM Propranolol betrug der Anteil apoptotischer Zellen ca. 10% (B’).
- 50 -
0
25
50
75
100
Kontrolle 50µg LPS +1µMPropranolol
+10µMPropranolol
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
****
Abb. 30: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (TUNEL Färbung) 24h nach der Stimulation mit 50µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=3) im Vergleich zu 50µg/ml LPS (**p<0,01).
Abb. 31: Repräsentative mikroskopische Aufnahme von THP-1 Makrophagen (400x) nach TUNEL Färbung. In der Durchlichtaufnahme zeigt sich die Gesamtzellzahl (A-B). Apoptotische Zellen zeigen eine rote Fluoreszenz (typische apoptotische Zelle mit weißem Pfeil markiert). Nicht apoptotische Zellen zeigen keine Fluoreszenz. Nach Stimulation der Zellen mit 50µg/ml LPS zeigen ca. 85% der Zellen Zeichen von Apoptose (A’), nach Behandlung der mit LPS stimulierten Zellen mit 1µM Propranolol betrug der Anteil apoptotischer Zellen ca. 50% (B’).
- 51 -
4.4 Inflammation
4.4.1 Interleukin-1 β
Die Konzentration von IL-1β im Zellkulturüberstand wurden 4, 8, 12 und 24 Stunden
nach der Stimulation der Zellen mit LPS mittels ELISA bestimmt.
4.4.1.1 Einfluss von Lipopolysaccharid auf die IL-1 β Expression in THP-1
Zellen
4 Stunden nach der Stimulation mit 1µg/ml LPS betrug die IL-1β Expression
3107±92pg/ml (Abb. 32). Verglichen mit der Kontrollpopulation mit 18±7pg/ml war
die Erhöhung der IL-1β Expression statistisch hochsignifikant (p<0,01). Nach 8
Stunden erhöhte sich die IL-1β Expression bei Stimulation der Zellen nochmals auf
3743±389pg/ml verglichen mit der Kontrolle mit 78±25pg/ml. Nach 12 und
24 Stunden wurde eine ähnliche IL-1β Expression gemessen. Zu allen gemessenen
Zeitpunkten (4, 8, 12 und 24h) war die Erhöhung der IL-1β Expression bei
Stimulation der Zellen mit 1µg/ml LPS verglichen mit der Kontrolle hochsignifikant
(p<0,01).
0
1000
2000
3000
4000
5000
4h 8h 12h 24h
Therapiedauer
IL-1
ß [p
g/m
l]
Kontrolle 1 µg/ml LPS
**
******
Abb. 32: IL-1β Expression [pg/ml] 4, 8, 12 und 24h nach der Stimulation mit 1µg/ml LPS im Vergleich zur Kontrolle ohne LPS (**p<0,01).
- 52 -
4.4.1.2 Einfluss von Insulin auf die IL-1 β Expression in LPS-stimulierten
THP-1 Zellen
Die Spiegel des proinflammatorischen Zytokins IL-1β waren bei Stimulation mit
1µg/ml LPS im Vergleich zur Kontrollpopulation zu allen gemessenen Zeitpunkten
um mehr als das 35-fache erhöht (Abb. 33). Hierbei stieg im zeitlichen Verlauf die
IL-1β Expression bei Stimulation mit 1µg/ml LPS in 8 Stunden von 3107±92pg/ml
auf 3743±389pg/ml. Bei 12 und 24 Stunden wurde eine ähnliche IL-1β Expression
gemessen. Für die Zellbehandlung mit 1U/ml Insulin konnte im gesamten zeitlichen
Verlauf keine signifikante Senkung der Zytokinexpression erreicht werden. Nach
4 Stunden Behandlungsdauer mit höheren Dosen Insulin (5 bis 15 U/ml) fiel die
IL-1β Expression signifikant auf Werte unter 2096±411pg/ml ab. Im Fall von 5 und
15U/ml zeigte sich eine hochsignifikante Absenkung (p<0,01). Diese Absenkung
wurde auf einem etwas höheren Niveau auch bei 8 Stunden Behandlungsdauer
beibehalten (p<0,05). Nach 12 und 24 Stunden konnte zwar noch eine Verringerung
der IL-1β Expression erzielt werden, diese war jedoch nicht mehr statistisch
signifikant.
0
1000
2000
3000
4000
5000
4h 8h 12h 24h
Therapiedauer
IL-1
ß [p
g/m
l]
Kontrolle 1 µg/ml LPS + 1 U/ml Insulin + 5 U/ml Insulin + 10 U/ml Insulin + 15 U/ml Insulin
***
** *
**
Abb. 33: IL-1β Expression [pg/ml] 4, 8, 12 und 24h nach der Stimulation mit 1µg/ml LPS und der entsprechenden Therapieoption mit Insulin [U/ml] im Vergleich zur Stimulation mit 1µg/ml LPS (*p<0,05, **p<0,01).
- 53 -
4.4.1.3 Einfluss von Propranolol auf die IL-1 β Expression in LPS-stimulierten
THP-1 Zellen
Die IL-1β Expression stieg nach Stimulation mit 1µg/ml LPS zu allen Zeitpunkten im
Vergleich zur Kontrollpopulation stark an (Abb. 34). Obwohl für niedrige
Propranololkonzentrationen bis 10µM gegenüber der Stimulation mit 1µg/ml LPS zu
allen Zeitpunkten eine leichte Senkung der Zytokinexpression erreicht wurde, war
diese nicht signifikant. Bei Applikation von 100µM Propranolol stiegen die IL-1β
Spiegel weit über das Niveau der Stimulation mit 1µg/ml LPS auf Spitzenwerte bis
zu 10103±3591pg/ml nach 12 Stunden Therapiedauer an, um nach 24 Stunden
wieder auf 5685±2579pg/ml abzufallen.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
4h 8h 12h 24h
Therapiedauer
IL-1
ß [p
g/m
l]
Kontrolle1 µg/ml LPS + 0,1 µM Propranolol + 1 µM Propranolol + 10 µM Propranolol + 100 µM Propranolol
Abb. 34: IL-1β Expression [pg/ml] 4, 8, 12 und 24h nach der Stimulation mit 1µg/ml LPS und der entsprechenden Therapieoption mit Propranolol [µM] im Vergleich zur Stimulation mit 1µg/ml LPS (n.s. = nicht signifikant).
- 54 -
4.4.2 Tumornekrosefaktor α
Die Konzentration von TNFα im Zellkulturüberstand wurde 4, 8, 12 und 24 Stunden
nach der Stimulation der Zellen mit LPS mittels ELISA bestimmt.
4.4.2.1 Einfluss von LPS auf die TNF α Expression in THP-1 Zellen
4 Stunden nach der Stimulation mit 1µg/ml LPS betrug die TNFα Expression
7147±944pg/ml (Abb. 35). Verglichen mit der Kontrollpopulation mit 27±16pg/ml war
die Erhöhung der TNFα Expression statistisch hochsignifikant (p<0,01). Nach
8 Stunden erhöhte sich die TNFα Expression bei Stimulation der Zellen auf
13959±3200pg/ml verglichen mit der Kontrolle mit 45±24pg/ml. Nach 12 Stunden
stieg die TNFα Expression nochmals leicht auf 14889±3472pg/ml bei Stimulation mit
1µg/ml LPS verglichen mit der Kontrolle mit 136±50pg/ml. Nach 24 Stunden
erreichte die TNFα Expression eine Endkonzentration von 19288±3563pg/ml
verglichen mit der Kontrolle mit 230±51pg/ml.
0
10000
20000
30000
4h 8h 12h 24h
Therapiedauer
TN
F a
lpha
[pg/
ml]
Kontrolle 1 µg/ml LPS
**
****
**
Abb. 35: TNFα Expression [pg/ml] 4, 8, 12 und 24h nach der Stimulation mit 1µg/ml LPS im Vergleich zur Kontrolle ohne LPS (**p<0,01).
- 55 -
4.4.2.2 Einfluss von Insulin auf die TNF α Expression in LPS-stimulierten
THP-1 Zellen
Im Vergleich zur Negativkontrolle ohne LPS waren bei Stimulation der Zellen mit
1µg/ml LPS die Spiegel des proinflammatorischen Zytokins TNFα anfangs um mehr
als das 3000-fache von durchschnittlich 27±16pg/ml auf 7147±944pg/ml erhöht
(Abb. 36). Sie stiegen im Verlauf von 24 Stunden stetig bis auf einen Endwert von
19288±3563pg/ml an. Unter der Insulintherapie fiel auf, dass nur für 15U/ml ein
signifikanter Abfall von TNFα erreicht wurde (8h: p<0,05; 4, 12, 24h: p<0,01). Für 1
bis 10U/ml ergaben sich Werte auf dem Niveau von LPS oder noch über diesem
Niveau.
0
10000
20000
30000
40000
4h 8h 12h 24h
Therapiedauer
TN
F a
lpha
[pg/
ml]
Kontrolle 1 µg/ml LPS+ 1 U/ml Insulin + 5 U/ml Insulin+ 10 U/ml Insulin + 15 U/ml Insulin
*** **
**
Abb. 36: TNFα Expression [pg/ml] 4, 8, 12 und 24h nach der Stimulation mit 1µg/ml LPS und der entsprechenden Therapieoption mit Insulin [U/ml] im Vergleich zur Stimulation mit 1µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).
- 56 -
4.4.2.3 Einfluss von Propranolol auf die TNF α Expression in LPS-stimulierten
THP-1 Zellen
Bei der Zellbehandlung mit Propranolol konnte schon für 100µM bei der Messung
nach 4 Stunden ein signifikanter Rückgang der TNFα Konzentration im Vergleich
zur Stimulation mit 1 µg/ml LPS auf 2658±699pg/ml erreicht werden (p<0,05).
Dieser Abfall blieb auch bis zum Ende der Behandlungsdauer erhalten, stieg jedoch
im zeitlichen Verlauf leicht auf einen Endwert von 5194±1489pg/ml TNFα an und
wurde ab einer Dauer von 8 Stunden hochsignifikant (p<0,01; Abb. 37). Bei 1µM
Propranololapplikation begann der Abfall nach 8 Stunden Behandlungsdauer auf
eine TNFα Konzentration von 12559±2720pg/ml, bei 10µM nach 12 Stunden auf
einen Wert von 16191±2825pg/ml. Nach 24 Stunden Behandlungsdauer war bei
allen verwendeten Propranololkonzentrationen eine signifikante Suppression der
TNFα Spiegel auf Werte unter 16086±4561pg/ml messbar.
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
4h 8h 12h 24h
Therapiedauer
TN
F a
lpha
[pg/
ml]
Kontrolle 1 µg/ml LPS
+ 0,1 µM Propranolol + 1 µM Propranolol
+ 10 µM Propranolol + 100 µM Propranolol
*** *
****
* *
*
***
Abb. 37: TNFα Expression [pg/ml] 4, 8, 12 und 24h nach der Stimulation mit 1µg/ml LPS und der entsprechenden Therapieoption mit Propranolol [µM] im Vergleich zur Stimulation mit 1µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).
- 57 -
5. Diskussion
Die Therapie einer Sepsis und eines systemic inflammatory response syndrome
(SIRS) gestaltet sich nach wie vor äußerst schwierig. Für eine optimale Therapie
gibt es verschiedene Ansätze. Neben der konservativen antibiotischen Therapie,
sowie den supportiven und lebenserhaltenden Maßnahmen befinden sich ebenfalls
immunmodulatorische Therapien der Sepsis in der klinischen Erprobung.57 Sie
fristen bis jetzt ein Nischendasein und sind in ihrer mortalitätssenkenden Wirkung
umstritten. Es gibt jedoch auch Verfahren, für die eine mortalitätssenkende Wirkung
anhand klinischer Studien nachgewiesen ist. Hierzu zählt die intensivierte
Insulinbehandlung, die von der Arbeitsgruppe um Van den Berghe entwickelt
wurde.59-63 Die mortalitätssenkenden Wirkungen des Insulin sind jedoch auf
zellulärer Ebene noch nicht vollständig geklärt. Makrophagen spielen eine zentrale
Rolle in der zellulär vermittelten Immunität. Sie nehmen aber auch auf die humorale
Immunität Einfluss (Abb. 38). Zudem stehen Makrophagen am Anfang der
Sepsiskaskade. Dies bedeutet, dass sie in die Sepsiskaskade noch vor Beginn der
durch B-Zellen vermittelten humoralen Immunantwort eingreifen.
Abb. 38: Ablauf der Sepsiskaskade.
Systemische inflammatorische
Reaktion
Hyper -metabolismus
Proteinabbau (Katabolie)
Multiorgan -versagen
Infektion (Bakteriämie)
LPS (Endotoxin)
AAAkkk ttt iii vvv iii eeerrruuunnnggg vvvooonnn MMMaaakkkrrroooppphhhaaagggeeennn
Ausschüttung proinflammatorischer
Zytokine
Endothel -dysfunktion
Gerinnungs -störungen
- 58 -
5.1 Einfluss von Lipopolysaccharid auf die Makropha genkultur
LPS stimuliert Makrophagen dosisabhängig und wirkt hierbei über den LPS-
Rezeptorkomplex, der sich aus CD 14 Toll-like receptor 4 (TLR4) und dem myeoloid
differentiation protein-2 (MD-2) zusammensetzt.23 Wie in der Literatur beschrieben
erhöht LPS die Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine, wie IL-1, IL-6 oder
TNFα und ruft dabei einen sepsisähnlichen Zustand hervor.9 Dies konnten wir
anhand der Stimulationsversuche bestätigen. Zudem wird für LPS eine Apoptose
induzierende Wirkung postuliert.5,13 Aliprantis und Kollegen konnten in einer Studie
mit THP-1 Makrophagen zeigen, dass bakterielle Lipoproteine über den Toll-like
Receptor-2 Apoptose auslösen.5 Für die Makrophagenlinie RAW 264.7 konnte
durch Castrillo et alteri eine Apoptoseinduktion durch LPS nachgewiesen werden.13
Diese apoptoseinduzierende Wirkung konnte im THP-1 Modell ebenfalls sowohl
anhand der TUNEL als auch mit Hilfe der JC-1 Färbung nachvollzogen werden.
5.2 Einfluss von Insulin auf LPS-stimulierte Makrop hagen
Für Insulin wird in der Literatur eine zytoprotektive und antiapoptotische Wirkung
beschrieben.1,35,37-40,42 Es konnte bereits von verschiedenen Arbeitsgruppen gezeigt
werden, dass Insulin in der Lage ist, den Zelltod in Oligodendrozyten, epithelialen
Zellen oder Karzinomzelllinien zu verhindern.10,49,66 Im Verbrennungsmodell konnten
diese Insulineffekte von der Arbeitsgruppe um Jeschke bestätigt werden, indem sie
nachwiesen, dass Insulin in endotoxämischen Ratten einen Leberschaden
abwenden und die Leberfunktion aufrechterhalten konnte.40,42 Die Proliferation der
Hepatozyten konnte zusammen mit der Konzentration von Bcl-2, einem pro-
mitogenen Signalprotein gesteigert werden. Des Weiteren konnte Insulin die
Apoptose in Hepatozyten verringern. Dies spiegelte sich in einer verringerten
Konzentration der proapoptotischen Signalproteine Caspase-3 und -9 wider. Somit
zeigte sich eine deutliche Verbesserung der Lebermorphologie.42 Außerdem wurde
die hepatische Proteinsynthese durch Gabe von Insulin gesteigert. Die Produktion
von Albumin war erhöht, während niedrigere Spiegel von CRP gemessen wurden.
Die Freisetzung der Leberenzyme AST und ALT als Indikatoren für einen
Leberschaden wurde signifikant durch Insulin verringert.40 Iida und Kollegen konnten
im Zellmodell mit THP-1 Makrophagen Apoptose induzieren, indem sie den Zellen
Serum als Nährmittel entzogen und sie damit „aushungerten“.35 Mittels eines DNA-
Fragmentationsassays wurde die Apoptoserate bestimmt. Wurden diese Zellen mit
Insulin behandelt, verringerte sich die Apoptoserate signifikant. Zudem war die DNA
der THP-1 Makrophagen weniger fragmentiert. Diese zytoprotektiven und
antiapoptotischen Insulineffekte zeigten sich auch im vorliegenden
- 59 -
LPS-Zellstimulationsmodell mit THP-1 Makrophagen für niedrige Insulindosierungen
(1 bis 15U/ml). Durch Insulingabe konnte in LPS-stimulierten Zellen die Zellviabilität
signifikant gesteigert werden. Die Gabe von Insulin führte des Weiteren zu einer
Senkung der Apoptoserate in LPS-stimulierten Makrophagen. Folglich konnte für
niedrige Dosen Insulin in der mit LPS-stimulierten THP-1 Zelllinie eine eindeutige
Zytoprotektion und antiapoptotische Wirkung aufgezeigt werden.
Weiterhin konnte in LPS-stimulierten Makrophagen zusätzlich zu den
antiapoptotischen und zytoprotektiven Insulineffekten auch ein antiinflammatorischer
Effekt durch die Gabe von Insulin nachgewiesen werden. Dies zeigte sich in einer
verringerten Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine TNFα und IL-1β in
LPS stimulierten THP-1 Zellen nach einer Behandlung mit Insulin. Der
antiinflammatorische Effekt des Insulin war jedoch weit geringer ausgeprägt als er in
einem Verbrennungsmodell in Ratten von Dagmar Klein und Kollegen gezeigt
werden konnte.42 In ihrem Modell wurden Ratten mittels eines
Verbrennungstraumas in einen endotoxämischen Zustand versetzt. Nach
24 Stunden zeigte sich bereits eine signifikante Erhöhung der hepatischen IL-1β
mRNA Expression in der reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-
PCR). Diese erhöhte sich noch in den nachfolgenden sieben Tagen. Insulin
verringerte die Expression von IL-1β mRNA. Für die Expression der hepatischen
TNF mRNA konnte ebenfalls eine ähnliche Kinetik nachgewiesen werden. Auf
Proteinebene konnte diese antiinflammatorische Wirkung von Insulin im
Rattenmodell bestätigt werden. Diese Ergebnisse konnten von der Gruppe um
Jeschke auch im Verbrennungsmodell bestätigt werden. Insulin verminderte in
ihrem Verbrennungsmodell die systemische inflammatorische Reaktion und zeigte
somit antiinflammatorische Wirkung.37-39 In einer Studie an endotoxämischen Ratten
wurden die Serumelektrolytwerte sowie die Blutglukosespiegel der Ratten der
Kontrollgruppe sowie im Therapiearm mit Insulin untersucht. Hier zeigten sich keine
signifikanten Unterschiede38. Daher postulierten sie, dass diese Effekte eher nicht
durch eine indirekte Insulinwirkung mittels Modulation des Glukose- oder
Elektrolytmetabolimus vermittelt, sondern durch direkte antiinflammatorische
Mechanismen des Insulins induziert wurden.
- 60 -
5.3 Einfluss von Propranolol auf LPS-stimulierte Ma krophagen
Bis dato gibt es noch keinen eindeutigen Beleg für eine zytoprotektive oder
antiapoptotische Wirkung von Propranolol. Es existieren jedoch klinische Studien,
die eine positiven anabolen Einfluss von Propranolol auf den Metabolismus nach
einem schweren Verbrennungstrauma nahe legen.31-34 Die Arbeitsgruppe um
Herndon konnte beispielsweise in einer klinischen Studie an Kindern mit akuten
Verbrennungen zeigen, dass die Herzfrequenz und der Ruheenergieumsatz durch
die β-Blockade verringert wurden und die Nettomuskelproteinbalance gesteigert
werden konnte.33 In einer weiteren klinischen Studie an Verbrennungsopfern
konnten sie einen positiven Langzeiteffekt von Propranolol darlegen. Wurde die
Propranololdosierung so titriert, dass die Herzfrequenz um 20 Prozent verringert
wurde, konnte eine Senkung der Herzlast sowie eine fettige Degeneration der Leber
verhindert werden.34 Über die genauen Wirkmechanismen auf zellulärer Ebene ist
jedoch noch wenig bekannt. Für die Therapie mit Propranolol konnten wir eine
signifikante Erhöhung der Zellviabilität in LPS-stimulierten Makrophagen
nachweisen. Dieser zytoprotektive Effekt könnte mit der antiinflammatorischen
Wirkung von Propranolol erklärt werden.
Bei Stimulation der Zellen mit LPS und anschließender Therapie mit Propranolol
konnte ein signifikanter Rückgang der Expression des proinflammatorischen
Zytokins TNFα beobachtet werden. Für die Sekretion von IL-1β ließen sich keine
statistisch relevanten Änderungen der Zytokinexpression bei der Gabe von
Propranolol feststellen. Dies bestätigt auch die Ergebnisse einer tierexperimentellen
Studie von Kawakami und Kollegen.41 Sie konnten in einem Verbrennungsmodell an
Mäusen einen erhöhten Plasmaspiegel von Adrenalin nachweisen. Eine
transdermale Verbrennung von 20 Prozent der gesamten Hautoberfläche der Mäuse
führte zu einem Anstieg der IL-1α Konzentration. IL-1α stellt ebenso wie IL-1β eine
Isoform der Interleukin 1 – Familie dar. Dies konnte durch eine Vorbehandlung mit
Propranolol nicht verhindert werden. Anders verhielt es sich bei dem ebenfalls
proinflammatorisch wirkenden Zytokin IL-6. Nach Applikation einer 20-prozentigen
Verbrennung erhöhte sich die Expression von IL-6. Eine Vorbehandlung mit
Propranolol reduzierte diesen Effekt.44
In der JC-1 Färbung beobachteten wir bei Stimulation mit LPS nach Therapie mit
niedrigen Propranololdosierungen einen hochsignifikanten Rückgang der
Apoptoserate. Zum Teil ging dieser antiapoptotische Effekt sogar so weit, dass die
Apoptoserate unter das Niveau der Kontrolle gesenkt werden konnte. Diese
Ergebnisse bestätigten sich auch in der TUNEL Färbung. Infolgedessen konnte bei
- 61 -
Stimulation mit LPS ein zytoprotektiver, antiapoptotischer und antiinflammatorischer
Effekt des nicht selektiven β-Blockers Propranolol nachgewiesen werden.
5.4 Rolle des NF- κB Signalwegs für die antiapoptotische Wirkung von
Insulin und Propranolol
Nuclear transcription factor κB (NF-κB) spielt sowohl bei der Stimulation der
Makrophagen mit LPS als auch beim Apoptosevorgang eine entscheidende
Rolle.1,13,18 Aida und Schröder konnten in einem LPS-Stimulationsmodell an der
J774.1A Makrophagenzelllinie zeigen, dass an der LPS-vermittelten Zytotoxizität
NF-κB als Signalprotein beteiligt ist.1 Der Serinprotease – Inhibitor N-α-tosyl-L-
phenylalanin-chloromethyl-ketone (TPCK) ist in der Lage, NF-κB indirekt zu
blockieren, indem es die Iκ-Bα Protease inhibiert. Das Protein IκBα hält in
unstimulierten, nicht apoptotischen Zellen NF-κB im Zytoplasma und verhindert eine
Transduktion in den Kern. Proinflammatorische Mediatoren wie TNFα oder LPS
vermitteln über Ihre Bindung an Zelloberflächenrezeptoren eine Dissoziation des
IκBα vom NF-κB Komplex. Dies führt zu einer Phosphorylierung und proteolytischen
Degradation des Inhibitors IκBα durch die IκBα Protease (vgl. Abb. 39). 10µM TPCK
konnten in Ihrem Zellmodell die Zytotoxizität im MTS-assay von 1µg/ml LPS
komplett aufheben.1 In unseren Versuchsreihen war TPCK in der Lage, den
zytoprotektiven Effekt von 5U/ml Insulin nach Stimulation der Makrophagen mit
10µg/ml LPS gänzlich aufzuheben. Nach Stimulation der Zellen mit LPS zeigte sich
eine erhöhte Apoptoserate in der JC-1 Färbung. Nach Behandlung der Zellen mit
Insulin konnte ein antiapoptotischer Effekt nachgewiesen werden. Die Inhibition des
antiapoptotischen Effekts von Insulin durch TPCK zeigte sich darin, dass nach
Zugabe von 1µM TPCK zur Behandlung mit 5U/ml Insulin die Apoptoserate wieder
auf das Niveau der Stimulation der Zellen mit 10µg/ml LPS anstieg. In unserem
Zellmodell reichte daher schon eine geringere Menge TPCK aus, um die
zytoprotektiven und anitapoptotischen Effekte von Insulin aufzuheben. Dandona und
Kollegen postulierten ebenfalls einen antiinflammatorischen Effekt des Insulins, der
in monozytären Zellen unter anderem durch den NF-κB Signalweg vermittelt
wurde.18 In einer klinischen Studie an adipösen Patienten wurde einer
Insulintherapie (2,0 - 2,5 IU/h in 5%-iger Glukoselösung intravenös) eine alleinige
Applikation von 5-prozentiger Glukoselösung gegenübergestellt. Es zeigte sich ein
signifikanter Abfall der NF-κB Konzentration in den Monozyten im
Insulintherapiearm. Zudem konnte ein Absinken der freien Sauerstoffradikale (ROS)
beobachtet werden, welche ebenfalls proinflammatorische Effekte vermitteln.18 Die
Arbeitsgruppe um Dandona assoziierte in einer weiteren klinischen Studie an
- 62 -
Myokardinfarktpatienten damit auch einen möglichen antiatherogenen
Langzeiteffekt des Insulins.17 Ein ähnlicher antiapoptotischer Effekt konnte in
unserem Zellversuchsmodell bei der Propranololtherapie beobachtet werden. Bis
dato gibt es noch keine Studien zur Rolle des NF-κB Signalwegs bei der
antiapoptotischen Wirkung von Propranolol. Der antiapoptotische Effekt von 10µM
Propranolol in der JC-1 Färbung konnte jedoch nicht komplett aufgehoben werden.
Dennoch wurde die Zytoprotektion von Propranolol stark reduziert. Wurde TPCK
zusammen mit LPS verabreicht, kam es in der Makrophagenpopulation zu einem
signifikanten Rückgang der Apoptoserate im Vergleich zur Kontrolle. Hieraus kann
man schlussfolgern, dass LPS über den NF-κB Signalweg apoptotisch wirkt. Auch
Insulin und Propranolol wirken über den NF-κB Signalweg antiapoptotisch. Dies
bedeutet, dass NF-κB in unserem Zellmodell sowohl proapoptotische als auch
antiapoptotische Effekte vermittelt. Aus diesen Ergebnissen kann man somit
schließen, dass sowohl die Wirkung von LPS als auch die zytoprotektiven und
antiapoptotischen Wirkungen von Insulin und Propranolol in THP-1 Makrophagen
unter anderem über den NF-κB Signalweg vermittelt werden.
Abb. 39: Die NF-κB Signalkaskade und deren Inhibition durch TPCK.
NF-κB: Nuclear transcription factor κB TPCK: Serinprotease – Inhibitor N- α-tosyl-L-phenylalanin-chloromethyl-ketone
Iκ-Bα-Protease
NF-κB
NF-κB Komplex
Iκ-Bα
Transkription
TPCK
LPS
- 63 -
5.5 Rolle des PI3-K Signalwegs für die antiapoptoti sche Wirkung von Insulin
Über die Insulinsignalkette ist in der Literatur schon einiges bekannt.23 Insulin bindet
an die zelloberflächenständigen Insulinrezeptoren, wodurch nun Insulin-Rezeptor-
Substrat 1 (IRS-1) an den Rezeptor binden kann. IRS-1 wird dann durch die
Posphatidylinositol-3-Kinase (PI3-K) zu IRS-1-P phosphoryliert. IRS-1-P vermittelt
nun verschiedene Effekte, zum Beispiel die Translokation des Glukosetransporter
GLUT4 aus dem Zytosol in die Zellmembran (vgl. Abb. 39). Zudem vermittelt
IRS-1-P verschiedene metabolische Effekte von Insulin.23 Die PI3-Ks gehören zu
einer Familie von Signaltransduktionsenzymen, die für die Regulierung von
Zellproliferation und Zellüberleben mitverantwortlich sind. Sie scheinen eine große
Rolle während der Inflammation und Sepsis zu spielen.64 Eine von Williams und
Kollegen durchgeführte Tierstudie legt nahe, dass eine erhöhte PI3-K Expression
das Zellüberleben begünstigt.65 Im CLP Mausmodell fanden die Autoren heraus,
dass eine teilweise Inhibition des PI3-K Signalwegs durch Wortmannin und
LY294002 das Überleben der Mäuse minderte. Wortmannin inhibiert spezifisch die
PI3-K und unterbricht damit die Signalkaskade. In unserer Versuchsanordnung
konnte Wortmannin die Zytoprotektion von Insulin vollständig aufheben. Die
Inhibition des antiapoptotischen Effekts von Insulin zeigte sich darin, dass nach
Zugabe von Wortmannin in Dosen von 1 bis 200nM zur Behandlung mit 5U/ml
Insulin die Apoptoserate wieder auf das Niveau der Stimulation der Makrophagen
mit 10µg/ml LPS anstieg. Zusätzlich führten wir einige Kontrollversuchsreihen durch,
um negative Effekte von Wortmannin auf die Zellkultur auszuschließen. Weder bei
der Kultur mit LPS und Wortmannin noch bei der Kontrollgruppe mit Wortmannin
allein, zeigten sich statistisch relevante Veränderungen der Apoptoserate verglichen
mit der Kontrollpopulation mit beziehungsweise ohne LPS-Stimulation. Aus diesen
Daten lässt sich ableiten, dass die Zytoprotektion und der antiapoptotische Effekt
von Insulin unter anderem über den PI3-K Signalweg vermittelt werden. Dies
bestätigte auch eine Studie von Iida und Kollegen, in der die Autoren einen
antiapoptotischen Effekt von Insulin in durch Serum- und somit Nährmittelentzug
ausgehungerten Makrophagen nachweisen konnten.35 Sie assoziierten den
zytoprotektiven Effekt von Insulin mit einer erhöhten mRNA Expression und
Proteinproduktion des antiapoptotischen Bcl-XL Gens. Zudem bestimmten sie die
PI3-K Aktivität, indem sie die Aktivität von radioaktiv markiertem Phosphatidylinositol
bestimmten, das mit 32P gelabeltem ATP phosphoryliert wurde. Insulin stimulierte
die PI3-K Aktivität deutlich und konnte mittels Wortmannin aufgehoben werden.
Allerdings muss man in Betracht ziehen, dass Wortmannin auch teilweise den MAP-
Kinase Signalweg blockiert und dass somit einige der zytoprotektiven und
- 64 -
antiapoptotischen Effekte des Insulins auch über den MAP-K Signalweg vermittelt
werden könnten (Abb. 40).
Abb. 40: PI3-K Signalkaskade und dessen Wirkung am Insulinrezeptor.
Die hier erarbeiteten Ergebnisse bieten insbesondere hinsichtlich der zellulären
antiapoptotischen und zytoprotektiven Wirkungsmechanismen von Insulin und
Propranolol einen erheblichen Erkenntnisgewinn. Es besteht allerdings noch
erheblicher Forschungsbedarf, um diese Effekte vollständig zu verstehen. Inwiefern
sich diese Erkenntnisse auf den klinischen Alltag und insbesondere auf die Therapie
septischer Patienten übertragen lässt, muss anhand weiterer klinischer Studien
belegt werden.
GLUT4 Insulinrezeptor
IRS-1
PI3K GLUT4
IRS-1-P
PI3K
MAP-K
Mitogenes Signal
Andere Signalvermittler
Transkription
PI3K: Phosphatidylinositol -3-Kinase GLUT4: Glukosetransportprotein 4 IRS-1: Insulin-Rezeptor-Substrate 1 MAP-K: mitogen-acivated-protein-kinase
Wortmannin
- 65 -
6. Ausblick
In der vorliegenden Arbeit wurden die antiapoptotischen und antiinflammatorischen
Effekte von Insulin und Propranolol auf LPS-stimulierte THP-1 Zellen untersucht.
Wir wählten hierfür Makrophagen, da sie eine zentrale Rolle im Abwehrgeschehen
im menschlichen Körper übernehmen und oft den ersten Kontakt zu einem
pathogenen Agens herstellen. Jedoch sind die Möglichkeiten in der Zellkultur
beschränkt und lassen sich selten eins zu eins auf den Menschen übertragen, der
ein wesentlich komplexeres Gefüge an Interaktionen darstellt, als man es in-vitro
nachstellen könnte. Hierzu gab es auch schon tierexperimentelle Ansätze, wie zum
Beispiel das Verbrennungsmodell oder das Endotoxämiemodell an Ratten oder
Mäusen. Ebenfalls denkbar wäre das „second hit“ Modell. Daher wäre der nächste
logische Schritt die Ergebnisse der Insulin- und Propranololstudien anhand
klinischer Studien bei septischen Patienten zu überprüfen. Es gibt bereits einige viel
versprechende klinische Versuche hierzu. Die Gruppe um Van den Berghe
postuliert eine Blutzuckereinstellung für kritisch Kranke unter 110mg/dl durch eine
intensivierte Insulintherapie, wodurch sich die Mortalität erheblich senken ließe.59-63
Propranolol solle laut der Forschungsgruppe um Herndon in der Lage sein, durch
eine Senkung der Herzfrequenz um 20 Prozent, die katabole Stoffwechsellage bei
Verbrennungspatienten umzukehren, sowie die Nettoskelettmuskelmasse positiv zu
beeinflussen.31-34 Aber all diese Studien untersuchten nur ein sehr beschränktes
Patientengut und sind in ihrer Aussagekraft folglich eingeschränkt. In wie weit sich
diese Ergebnisse auf septische Patienten übertragen ließen, müsste anhand einer
groß angelegten Multicenterstudie geprüft werden. Hier besteht noch erheblicher
Forschungsbedarf. Auch eine Kombination von Insulin und Propranolol wäre
denkbar. In wiefern sich die antinflammatorischen und antiapoptotischen Effekte
potenzieren würden oder synergetisch wirkten, ist nicht abzusehen. Es bleibt aber
für die Zukunft zu hoffen, dass sich die positiven antiapoptotischen und
antiinflammatorischen Eigenschaften von Insulin und Propranolol im klinischen
Alltag bestätigen und dadurch die Mortalität bei Sepsispatienten gesenkt werden
kann. Es gibt auch erste Ansätze, selektivere PI3-K Inhibitoren, die nur die δ-
Isoform des Enzyms inhibieren, als Therapieoption bei inflammatorischen wie auch
autoimmunen Erkrankungen einzusetzen.64 In wie weit sich diese neuen
Therapieansätze im klinischen Alltag etablieren können, ist noch offen.
- 66 -
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Cornerstone 5: 56 - 63 (2003)
60. Van den Berghe G. H., Role of intravenous insulin therapy in critically ill
patients, Endocr Pract 10: 17 -20 (2004)
- 73 -
61. Van den Berghe G., Wilmer A., Hermans G., Meersseman W., Wouters P. J.,
Milants I., Van Wijngaerden E., Bobbaers H., Bouillon R., Intensive insulin
therapy in the medical ICU, N Eng J Med 354: 449 - 461 (2006)
62. Van den Berghe G., MD, PhD, Wouters P., MSc, Weekers F., MD, Verwaest
C., MD, Bruyninckx F., MD, Schetz M., MD, PhD, Vlasselaers D., MD,
Ferdinande P., MD, PhD, Lauwers P., MD, Bouillion R., MD, PhD, Intensive
insulin therapy in critically ill patients, N Engl J Med 345: 1359 – 1367 (2001)
63. Van den Berghe G., Wouters P. J., Bouillon R., Weekers F., Verwaest C.,
Schetz M., Viasselaers D., Ferdinande P., Lauwers P., Outcome benefit of
intensive insulin therapy in the critically ill: Insulin dose versus glycemic
control, Crit Care Med 31: 359 - 366 (2003)
64. Ward S., Sotsios Y., Dowden J., Bruce I., Finan P., Therapeutic potential of
phosphoinositositide 3-kinase inhibitors, Chem Biol 10: 207 - 213 (2003)
65. Williams D. L., Li C., Ha T., Ozment-Skelton T., Kalbfleisch J. H., Brooks L.,
Breuel K., Schweitzer J. B., Modulation of the phosphatiside 3-kinase
pathway alters innate resistance to polymicrobial sepsis, J Immunol 172: 449
- 456 (2004)
66. Wu X., Fan Z., Masui H., Rosen N., Mendelsohn J., Apoptosis induced by an
anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody in a human
colorectal carcinoma cell line and its delay by insulin, J Clin Invest 95: 1897 -
1905 (1995)
67. Yano M., Hasegawa G., Ishii M., Yamasaki M., Fukui M., Nakamura N.,
Yoshikawa T., Short-term exposure of high glucose concentration induces
generation of reactive oxygen species in endothelial cells: implication for the
oxidative stress associated with postprandial hyperglycemia, Redox Rep 9:
111 - 116 (2004)
- 74 -
8. Abkürzungsverzeichnis
α alpha
β beta
κ kappa
% Prozent
°C Grad Celsius
µg/ml Mikrogramm pro Milliliter
µl Mikroliter
µM Mikromolar
Abb. Abbildung
ALT Alanin-Aminotransferase
APC anigen presenting cells
AST Aspartat-Aminotransferase
ATP Adenosintriphosphat
Bcl B-cell lymphoma
ca. circa
Cat.-No. Katalognummer
CRP C-reaktives Protein
CO2 Kohlendioxid
DNA Deoxyribonucleic acid
E. coli Escherichia coli
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
et al. et alteri
FBS fetal bovine serum
GLUT Glukosetransporter
h hora
IL-1β Interleukin-1 beta
IU/kg International Units pro Kilogramm
IRS-1 Insulin-Rezeptor-Substrat 1
JC-1 5,5‘,6,6‘-tetrachloro-1,1‘,3,3‘-teraethylbenzimidazolyl-
carbocyamine iodide
LPS Lipopolysaccharid
MAP-Kinase mitogen-activated-protein-kinase
MD-2 myeoloid differentiation protein-2
mg/dl Milligramm pro Deziliter
- 75 -
min Minute
ml Milliliter
mmHg Millimeter Quecksilbersäule
mRNA messenger ribonucleic acid
MTS (3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-
phenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium
nM Nanomolar
NF-κB nuclear factor kappa B
nm Nanometer
n Numerus
RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction
ROS reactive oxygen species
OD optische Dichte
p Irrtumswahrscheinlichkeit
P Phosphat
PBS phosphate buffered saline
PMA phorbol 12-myrisate 13-acetate
pg/ml Picogramm pro Milliliter
pH Potentia hydrogenii
PI3-K Phosphatidylinositol3-Kinase
rpm rounds per minute
RPMI Roswell Park Memorial Institute
RT Raumtemperatur
SIRS systemic inflammatory response syndrome
Tab. Tabelle
THP-1 Human acute monocytic leukemia cell line
TLR4 Toll-like receptor 4
TNFα Tumornekrosefaktor alpha
TPCK N-p-Tosyl-L-Phenylalaninchloromethylketon
TUNEL terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP
nick end labeling
U Units
U/ml Units pro Milliliter
USA United States of America
vgl. vergleiche
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
- 76 -
9. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen
Publikation:
Leffler M, Hrach T, Stuerzl M, Horch RE, Herndon DN, Jeschke MG: Insulin
Attenuates Apoptosis and Exerts Anti-Inflammatory Effects in Endotoxemic Human
Macrophages, J Surg Res 2007
- 77 -
10. Anhang
0
20
40
60
80
100
Kontrolle 20µg LPS +1U Insulin +5U Insulin +10UInsulin
+15UInsulin
Zellbehandlung
% a
vita
ler
Zel
len
**
* * *
Abb. 41: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 20µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Insulin [U/ml] (n=3) verglichen mit 20µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).
0
20
40
60
80
100
Kontrolle 30µg LPS +1U Insulin +5U Insulin +10UInsulin
+15UInsulin
Zellbehandlung
% a
vita
ler
Zel
len
* *** *
Abb. 42: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 30µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Insulin [U/ml] (n=3) verglichen mit 30µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).
- 78 -
0
20
40
60
80
100
Kontrolle 40µg LPS +1U Insulin +5U Insulin +10UInsulin
+15UInsulin
Zellbehandlung
% a
vita
ler
Zel
len
Abb. 43: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 40µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Insulin [U/ml] (n=3) verglichen mit 40µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).
0
20
40
60
80
100
Kontrolle 50µg LPS +1U Insulin +5U Insulin +10UInsulin
+15UInsulin
Zellbehandlung
% a
vita
ler
Zel
len
*
**
**** **
Abb. 44: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 40µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Insulin [U/ml] (n=3) verglichen mit 50µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).
- 79 -
0
20
40
60
80
100
Kontrolle 20µg LPS +1µMPropranolol
+10µMPropranolol
+100µMPropranolol
Zellbehandlung
% a
vita
ler
Zel
len
**** **
**
Abb. 45: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 20µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Propranolol [µM] (n=3) verglichen mit 20µg/ml LPS (**p<0,01).
0
20
40
60
80
100
Kontrolle 30µg LPS +1µMPropranolol
+10µMPropranolol
+100µMPropranolol
Zellbehandlung
% a
vita
ler
Zel
len
** ** **
Abb. 46: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 30µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Propranolol [µM] (n=3) verglichen mit 30µg/ml LPS (**p<0,01).
- 80 -
0
20
40
60
80
100
Kontrolle 40µg LPS +1µMPropranolol
+10µMPropranolol
+100µMPropranolol
Zellbehandlung
% a
vita
ler
Zel
len
**
** **
Abb. 47: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 40µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Propranolol [µM] (n=3) verglichen mit 40µg/ml LPS (**p<0,01).
0
20
40
60
80
100
Kontrolle 50µg LPS +1µMPropranolol
+10µMPropranolol
+100µMPropranolol
Zellbehandlung
% a
vita
ler
Zel
len **
** **
Abb. 48: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 50µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Propranolol [µM] (n=3) verglichen mit 50µg/ml LPS (**p<0,01).
- 81 -
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
Kontrolle 30µg LPS +1UInsulin
+5UInsulin
+10UInsulin
+15UInsulin
+20UInsulin
+25UInsulin
Zellbehandlung
OD
**
**
***
Abb. 49: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 30µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=6) im Vergleich zu 30µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
Kontrolle 40µgLPS
+1UInsulin
+5U Insulin
+10U Insulin
+15U Insulin
+20U Insulin
+25U Insulin
Zellbehandlung
OD
*
**
**
Abb. 50: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 40µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=6) im Vergleich zu 40µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
Kontrolle 50µgLPS
+1UInsulin
+5U Insulin
+10UInsulin
+15UInsulin
+20UInsulin
+25UInsulin
Zellbehandlung
OD
**
**
Abb. 51: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 50µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=6) im Vergleich zu 50µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).
- 82 -
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
Kontrolle 30µg LPS +0,1µMPropranolol
+1µMPropranolol
+10µMPropranolol
+100µMPropranolol
+500µMPropranolol
Zellbehandlung
OD
*
**
Abb. 52: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 30µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=6) im Vergleich zu 30µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
Kontrolle 40µg LPS +0,1µMPropranolol
+1µMPropranolol
+10µMPropranolol
+100µMPropranolol
+500µMPropranolol
Zellbehandlung
OD
**
Abb. 53: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 40µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=6) im Vergleich zu 40µg/ml LPS (**p<0,01).
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
Kontrolle 50µg LPS +0,1µMPropranolol
+1µMPropranolol
+10µMPropranolol
+100µMPropranolol
+500µMPropranolol
Zellbehandlung
OD
*
**
Abb. 54: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 50µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=6) im Vergleich zu 50µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).
- 83 -
0
10
20
30
40
Kontrolle 10µg LPS 1U Insulin 5U Insulin 10U Insulin 15U Insulin 1µMPropranolol
10µMPropranolol
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
*
Abb. 55: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (JC-1 Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen mit nur Insulin [U/ml] und Propranolol [µM] (*p<0,05, n=4).
0,0
25,0
50,0
75,0
100,0
Kontrolle 20µg LPS +1UInsulin
+5UInsulin
+10UInsulin
+15UInsulin
Therapieoption
% a
popt
otis
cher
Zel
len
* *
* *
Abb. 56: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 20µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=3) im Vergleich zu 20µg/ml LPS (*p<0,05).
- 84 -
0,00
25,00
50,00
75,00
100,00
Kontrolle 30µg LPS +1UInsulin
+5UInsulin
+10UInsulin
+15UInsulin
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len *
*
Abb. 57: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 30µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=3) im Vergleich zu 30µg/ml LPS (*p<0,05).
0,0
25,0
50,0
75,0
100,0
Kontrolle 40µg LPS +1UInsulin
+5UInsulin
+10UInsulin
+15UInsulin
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
** *
Abb. 58: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 40µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=3) im Vergleich zu 40µg/ml LPS (*p<0,05).
- 85 -
0
25
50
75
100
Kontrolle 50µg LPS +1UInsulin
+5UInsulin
+10UInsulin
+15UInsulin
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
Abb. 59: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 50µg/ml LPS und der entsprechenden Therapieoption mit Insulin [U/ml] (n=3) im Vergleich zu 50µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).
0,0
25,0
50,0
75,0
100,0
Kontrolle 20µg LPS +1µMPropranolol
+10µMPropranolol
Therapieoption
% a
popt
otis
cher
Zel
len
* **
Abb. 60: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 20µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=3) im Vergleich zu 20µg/ml LPS (*p<0,05, **p<0,01).
- 86 -
0,00
25,00
50,00
75,00
100,00
Kontrolle 30µg LPS +1µMPropranolol
+10µMPropranolol
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len *
Abb. 61: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 30µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=3) im Vergleich zu 30µg/ml LPS (*p<0,05).
0,0
25,0
50,0
75,0
100,0
Kontrolle 40µg LPS +1µMPropranolol
+10µMPropranolol
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
Abb. 62: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 40µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=3) im Vergleich zu 40µg/ml LPS.
- 87 -
0
25
50
75
100
Kontrolle 50µg LPS +1µMPropranolol
+10µMPropranolol
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
Abb. 63: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 50µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=3) im Vergleich zu 50µg/ml LPS.
Zellbehandlung
0
25
50
Kontrolle 10µg/ml LPS LPS + 1µMTPCK
1µM TPCK
% a
popt
otis
cher
Zel
len
**
Abb. 64: Apoptose in Makrophagen (JC-1 Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Behandlung mit LPS und TPCK [µM] und nur TPCK [µM] (n=3); (**p<0,01).
- 88 -
0
25
50
Kontrolle 10µg/ml LPS LPS + 1nMWortmannin
1nM Wortmannin
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
Abb. 65: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (JC-1 Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen mit LPS und Wortmannin [nM] und nur Wortmannin [nM] (n=3).
0
25
50
Kontrolle 10µg LPS +5U Insulin +5U Insulin+1nM
Wortmannin
+5U Insulin+10nM
Wortmannin
+5U Insulin+50nM
Wortmannin
+5U Insulin+100nM
Wortmannin
+5U Insulin+200nM
Wortmannin
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
****
******
Abb. 66: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit 5U/ml Insulin, sowie der Applikation von aufsteigenden Dosen Wortmannin [nM] (n=3) im Vergleich zur Behandlung mit 5U/ml Insulin (**p<0,01).
- 89 -
0
25
50
Kontrolle 10µg LPS 1U Insulin 5U Insulin 10U Insulin 15U Insulin 1µMPropranolol
10µMPropranolol
Zellbehandlung
% a
popt
otis
cher
Zel
len
Abb. 67: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (TUNEL Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen mit nur Insulin [U/ml] und Propranolol [µM] verglichen mit der Kontrolle ohne LPS (n=3).
- 90 -
11. Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde in der Plastisch- und Handchirurgischen Klinik der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg unter der Leitung von Herrn
Prof. Dr. med. R. E. Horch (Direktor) angefertigt.
Für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und die großzügige finanzielle
Unterstützung möchte ich mich ganz herzlich bei Prof. Dr. med. R. E. Horch
bedanken.
Für die Vergabe des Themas, die konstruktive Betreuung und Unterstützung sowie
die aus zahlreichen Diskussionen hervorgegangenen Anregungen bedanke ich mich
sehr herzlich bei Dr. med. Mareike Leffler.
Mein besonderer Dank gilt Frau Simone Beck, MTA für die hervorragende
technische und sehr freundschaftliche Zusammenarbeit, ohne die das Gelingen
dieser Arbeit nicht möglich gewesen wäre.
Im Übrigen möchte ich allen Kolleginnen und Kollegen der Arbeitsgruppe des
Zellbiologischen Labors und des klinischen Genanalyselabors danken, die mir
jederzeit mit ihrer Hilfe unterstützend zur Seite standen.
- 91 -
12. Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name: Thomas, Herbert H r a c h
Wohnort: Bergstraße 12
91623 Sachsen b. Ansbach
Tel.: 09827 / 6750
Geboren: 18.03.1981 in Ansbach
Staatsangehörigkeit: deutsch
Familienstand: ledig
Eltern: Hermann Hrach, Bundesbahnhauptsekretär a.D.
Inge Hrach, Steuerfachgehilfin
Schulbildung:
09/1987 - 07/1991: Rusam - Volksschule Sachsen
09/1991 - 06/2000: Platen - Gymnasium Ansbach
Abschluss: Abitur (Note: gut)
Wehrdienst:
07/2000 - 04/2001: JaBoG 32, Lagerlechfeld
Hochschulbildung:
04/2001 - 07/2007: Friedrich - Alexander - Universität Erlangen
03/2003: Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung
(Note: befriedigend)
06/2007: Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung
(Note: befriedigend)
Praktische Erfahrungen:
09/2003: Famulatur: Innere Medizin, Gemeinschaftspraxis für
Hämatologie und internistische Onkologie /
Nephrologie, Dres. M. Hahn, S. Müller, K. Bittner,
Ansbach
- 92 -
09/2004: Famulatur: Chirurgie, Chirurgische Klinik mit Poliklinik
der Friedrich - Alexander - Universität, Abteilung für
Plastische und Handchirurgie,
Prof. Dr. med. R. E. Horch, Erlangen
07/2004 - 08/2004: Famulatur: Chirurgie, Klinikum Ansbach,
Unfallchirurgie, Priv.-Doz. Dr. med. V. Hendrich
09/2005 - 10/2005: Famulatur: Innere Medizin: Internistische
Hausarztpraxis, Dr. med C. Ott, Lichtenau
02/2006 - 06/2006: 1. Tertial des Praktischen Jahres: Frauenheilkunde
und Geburtshilfe, Universitäts-Frauenklinik, Erlangen
06/2006 - 10/2006: 2. Tertial des Praktischen Jahres: Klinikum Neumarkt,
Chirurgische Klinik, Neumarkt i.d.OPf.
10/2006 - 01/2007: 3. Tertial des Praktischen Jahres: Klinikum Neumarkt,
Medizinische Klinik II, Neumarkt i.d.OPf.
Seit 09/2007 Tätigkeit als Assistenzarzt der Abteilung Innere
Medizin der Kreisklinik Weißenburg
Publikation:
Leffler M, Hrach T, Stuerzl M, Horch RE, Herndon DN, Jeschke MG: Insulin
Attenuates Apoptosis and Exerts Anti-Inflammatory Effects in Endotoxemic Human
Macrophages, J Surg Res 2007
Weißenburg, den 15. Mai 2011 ____________________
Thomas Hrach