695 298. Bd. 1965, Nr. 10 tndolyl-3-essigsaure bei der Biospthese der Mutterkornalkaloide

Beschreibung der Versuche

Zur D a r s t e l l u n g der Verb indungen vgl. l) Die Glucoside wurden in einer Konzentration von 0,001 Mol/20 ml in 3 n HCl gelost und

die Losung im Thermostaten bei 90' aufbewahrt. Nach den entsprechenden ZeiEn wurden dem Spaltansatz jeweils 3 ml entnommen, die abgekuhlt und 3mal mit je 1 ml Ather aus- geschuttelt wurden. Die optische Drehung dcr wal3rigen Losung wurde im 1-dm-Rohr bestimmt. Die Anfangsdrehung wurde in H,O (I und IV) bzw. 3 n HC1 (11, 111, V und VI) nach 5 Min. bei 20° bestimmt. Die Enddrehung wurde errechnet. Aus den gefundenen Werten der Drehung wurde der Spaltungsgrad errechnet. In Tab. 1 sind die erhaltenen Werte zusammengestellt.

Tabel le 1 Saurehydrolytische Spaltung von Phenol-, Thiophenol- und Selenophenol- P-D-glucosid (I, 11,111) sowie 4-Nitrophenol-, 4-Nitrothiophenol- und 4-Nitroselenophenol-P-~-glucosid

(IV, v, VI) Spaltungsgrad in yo nach Std.

Substanz

I I1

I11 IV V

VI

1 2

- 14 11 - - 10

Anschrift: Prof. Dr. G. Wagner, 701 Leipzig, Briiderstr. 34.

7

- 39 31

19 21

-

8

- 46 40

20 32

-

[Ph 1341

2497. E. T e u s c h e r und D. G r o g e r

Die Rolle der Indolyl-3-essigsaure bei der Biosynthese der Mutterkornalkaloide

Aus der Pharmakognostischen Abteilung des Botanischen Instituts der Universitiit Greifswald und dem Institut fur Biochemie der Pflanzen der Deutschen Akademie der Wissenschaften,

Halle/Saale

(Eingegangen am 12. Dezember 1964)

14C-Carboxylmarkierte Indolyl-3-essigsaure geht mit einer spezifischen Ein- baurate von 0,3% in die Clavinalkaloide von Claviceps purpurea ein. Dieses Ergebnis maelit es nicht unwahrscheinlich, da13 Indolyl-3-essigsaure auch als ein Praecursor der Alkaloide in Betracht kommen kann. Die geringe Einbaurate erklart jedoch nicht die Steigerung der Alkaloidbildung naeh

Zusatz von Indolyl-3-essigsiiure.

Nachdem festgestellt worden war, daB pflanzliche Streckungswuchsstoffe, be- sonders Indolyl-3-essigskure (IES), die Ausbeute a n Clavinalkaloiden bei dem

- - 696 T e u s c h e r und G r d g e r Archiv der

Pharmazie

Mutterkornstamm SD 58 in saprophytischer Kultur erheblich steigernl) 2), priiften wir, ob dieser Effekt auf einen Einbau von 1ES in das Ergolinringsystem zuriick- zufiihren ist.

Das Ergolinringsystem der Mutterkornalkaloide wird, wie Versuche mit radio- aktiv markierten Verbindungen gezeigt haben (ubersicht bei Weygand und Fl0J3), aus Tryptophan und aktivem Isopren aufgebaut. D-Tryptophan kann ebenfalls, wenn auch mit geringerer Einbaurate, als Praecursor genutzt werden4). Die Carb- oxylgruppe des Tryptophans wird eliminiert6) 6). Tryptamin und Methyltryptamin werden nicht eingebaut') *). Der Aminostickstoff des D,L-Tryptophans geht beim Einbau zu 56%, der des D-Tryptophans zu 90% verloren; der Verlust des ct-Wasser- stoffatoms betragt bei D,L-Tryptophan 5'7% und bei D-Tryptophan 98%9). Damit steht fest, daIj die Hauptmenge des L-Tryptophans, etwa 88%, ohne Verlust des Aminostickstoffs in das Alkaloid eingebaut wird, wobei wegen der Erhaltung des ct-Wasserstoffatoms Zwischenstufen wie Indolylacetamid oder Indolylaceto- nitril nicht in Betracht kommen.

Der Verlust des Aminostickstoffs und des a-Wasserstoffa,toms bei einem Teil des L-Tryptophans und beim D-Tryptophan konnte auf zweierlei Weise gedeutet wer- den :

1. Es besteht folgendes Gleichgewicht zwischen Tryptophan und Indolylbrenz- trauberisaure (IBTS) :

Alkaloid t 1,-Tryptophan f:---~- IBTS 4- ~~ n-Tryptophan -1 NH, -i H, -H,O -NH, -H, 4- H,O

+ H,O -H, - N H 3

Deuterierte IBTS wird in Slkaloide eingebautlO). Wir konnten nach Verfiitterung von L-Tryptophan IBTS papier- und diinnschichtchromatographisch sicher nach- weisen'l).

2. Neben Tryptophan kommt auch IES als Praecursor in Betracht : Alkaloid --+ L-Tryptophan +- ~s IBTS +-- __ u-Tryptophan

- -O, 1 t ? --H, . +H,O 4 [

IES + Alkaloid

1) E. Teuscher, Pharmazie 16, 570 (19ti1). 2, E. Tewrcher, Phytochemistry, 4, 341 (1966). 3, F. Weygand und H.-G. Flop, Angew. Chem. 75, 783 (1963). 4, D. ffroger, K . Mothes, Ll. Simon, H.-G. Plop und F. Il'eygand, Z. Naturforsch. I C b , 432 (1961).

6 , D. Grcjger, K. Mothes, H. Sirnon, H.-B. Flop und F. Weygand, Z. Naturforsch. 15b, 141 (1960). 7, R. M . Baxter, S. J . Kandel und A . Okany, Chem. and Ind. 1961, 1453.

O) H.-G. Flop, 27. Mothes und 11. Gunther, Z. Naturforsch. 19b, 784 (1964). 10) H. Plieninger, R. Fiacher, G. Keilich und H.-D. Orth, Liebigs Ann. Chem. 642, 214 (1961). 11) E . Teuscher, Pharmazie, im Jlruck.

D. Grdger, H.-J. Weitdt, K . Mothes und F . Weygand, Z. Naturforsch. 14b, 385 (1959).

I l . 4 . Flop und D. Grdger, 2. Natnrforsch. 186, 519 (1963).

Die Umwandlung von Tryptophan in IES beim Mutterkorn wurde erstmals von Yamno, Kishino, Yumatodani und Abelz) nachgewiesen und konnte von uns beim Stamm SD 58 bestiitigt werden. Dabei tritt IBTS als Zwischenprodukt aufll). Der Einbau der deuterierten IBTS konnte somit auch, zumindest zu einem Teil, via IES erfolgt sein. Tryptamin wird nicht in IES umgewandeltz). Durch Verfiit- terung von carboxylmarkierter IES sollte zur Kliirung dieses Problems bei- getragen werden.

Methodik Je 6 g (Frischgewicht) 6 Tage altea, submere angezogenea Mycel dea Clavinstammes

SD 68 wurden in 80 ml Phqbtpuffer pH 6,9, der 24,2 mg 14COOH-Indolyl-3-easi@ure*) (Spez. Aktivitiit 7,82 - 108 Imp/hlin/mMol) und 1,3 g NaCl enthielt, 70 SM. bei + 24" auf einem Rundschutteltisch &bier+.

Nach Versuchsende wurde daa Medium abgesaugt und ein aliquoter Teil auf Alkaloid- gehalt, IES-Gehalt und aeSemtektivitiit untemucht. Der Reat dea Mediums wurde mit Weinaiiureliisung ange&uert (pH 3,O) und 2md mit peroxidfreiem Ather extrahiert. Die wii5rige Phase wurde mit NaOH alkalisiert und 2md mit lOOml eines Chloroform-Iso- propanol-Gemischee (3: 1) ausgeachuttelt. Die organische Phaae wurde mit Na,SO, ge- trocknet und mit 60 ml lproe. Weineiiureliisung extrahiert, die weinmure Usung alkali- siert und die Alkdoide mit 3mal76 ml Methylenchlorid wieder in die organische Phaee uberfiihrt. Dee mit Na,SO, getrocknete Methylenchlorid wurde i. Vek. eingeengt und in einem aliquotan Teil die hmtakt ivi t i i t beetimmt. Die Auftrennung dea so erhaltenen Alkaloidgemisohea erfolgte auf Kiegelgel-a-Diinnschichtplatten mit dem Laufmittel Ace- ton-Athylecetat-Dimethy~~~mid (6 : 6 : 1). Elymoclavin wurde nach der Elution auf Al,O,-Diinnschichtplattan reohromatographiert. Die Alkaloide wurden mit Methylenchlorid- Methanol (8 : 2) aus der Triigersohicht eluiert. Die Aktivitiikbeatimmung erfolgte mit dem MethandurcMu 5ziihlrohr .

Ergebnisse u n d Diskussion Aus Tabelle 1 geht hervor, daS 14COOH--IES, wenn auch mit geringer spezi-

fischer Einbaurate, als Praecursor fiir die Clavinalkaloide dienen kann. Ob das ge-

Tabelle l I I

vin vin

Versuchs-

Versucha- ende

beginn

Ein- bau- rate % -

-

0,046

+) Fur die Synthese der markierten IES dankan wir Herrn Dr. R. S c W e und seinen Mitsrb.

Is) T. Yamno, K . Kiahino, 9. Yarnotodoni und M. A h , Ann. Rep. Tak. Ree. Lab. 21,83 (1962).

(Halle/Sesle).

a

samte IES-Molekiil oder nur ein Bruchstiiok davon eingebaut wird, 1aBt sich aber isunachst nicht entscheiden. Wenn auch der Einbau der IES als vollstandiges Mole kiil wahrscheinlich ist, so mu13 doch die Moglichkeit der Abspaltung der Carboxyl- gruppe und die Riickassimilation des 14C0, oder aber die Abspaltung eines Glykol- sauremolekiils in Analogie zur Umkehrung der Tryptophanbiogenese aus Indol und Serin in Betracht gezogen werden. Zur Entsclieidung dieser Frage ware der Abbau des markierten Slkaloids zur Feststellung der Lokalisation des 14C-Atoms notwendig. Die Verfiitterung von im Indolring markierter IES ist ebenfalls zur Elarung dieses Problems geeignet.

Die niedrige Einbaurate kann aus der sehr gro13en Intensitat, mit der die zu- gesetzte IES durch den Mutterkornpilz abgebaut wird, erklart werden. Wiirde der Abbau der IES durch Exoenzyme erfolgen, wie bei anderen parasitischen Pilzen beobachtet wurde13) 14), konnte die extern gegebene, markierte IES nicht gleich- rangig mit der in der Zelle gebildeten um den Einbau in das Alkaloid konkurrieren.

Wie bereits bei der Untersuchung der Biosynthese anderer Naturstoffe gefunden wurde, scheinen auch bei den Mutterkornalkaloiden Vorstufen unterschiedlicher Art in das gleiche Produkt eingehen zu konnen. Es ist in jedem Falle durch Fiitte- rungsexperimente schwer zu klaren, welche Vorstufe im Zellstoffwechsel die beste oder die einzig mogliche ist. Die Ergebnisse werden in hochstem MaBe beeinflufit durch die Permeationsgeschwindigkeit, durch bevorzugte aktive Aufnahme be- stimmter Stoffe, durch Exoenzyme oder durch Umsetzungen in der namentlich bei Pilzen und Bakterien als ein hoher organisiertes Organell anzusehenden Plasma- membran.

Uberraschenderweise wird der Abbau der IES nicht wie bei anderen Mikro- organismen oder hoheren Pflanzen durch eine Decarboxylierung eingeleitet. Obwohl bei Versuchsende keine IES mehr aufgefunden wurde, waren noch 82,5y0 der ver- fiitterten Aktivitat in dem sauer reagierenden Medium enthalten ; 91,8y0 dieser Aktivitat lassen sich mit Ather bei pH 3,O aus dem Medium extrahieren. Wird das Medium alkalisiert, so lassen sich nur 0,14y0 in den Ather iiberfiihren. Nach Auf- trennung der sauren atherischen Fraktion an Diinnschichtplatten konnte gezeigt werden, daB die gesamte Aktivitat in nur einer Verbindung enthalten ist. Diese Verbindung ist nicht identisch mit Indolyl-3-isopropionsaure oder deren Estern, die von Yamano und Mitarb.12) nach Verfiitterung von IES an Mutterkornkulturen gefunden wurden. Die Substanz konnte inzwischen als 5-Hydroxy-indolyl-3-essig- saure identifiziert werden15).

Wenn gezeigt werden konnte, da13 IES als Baustein der Clavinalkaloide in Be- tracht kominen kann, so wird durch die niedrige Einbaurate jedoch keineswegs die Steigerung der Alkaloidbildung von 3,05 mg in der Kontrolle (ohne IES-Zusatz)

13) L. Sequiera und T. A . Steeoes, Plant. Physiol. 29, 11 (1954). 14) a. Legrand, Compt. rend. EOC. biol. 151, 921 (1967). 1 5 ) Q. l’euscher und E. Teuscher, Phytochemistry, 4, 51 1 (1965).

298. Bd. 1965, Nr. 10 Reaktionen rnit 4-Omazolidonen (Teil I ) 699

auf 5,22 mg nach Zusatz von IES geklart (die Steigerung war bei diesem Versuch um das lOfache geringer als bei 3 Vorversuchen, bei denen der Wert der Kontrolle bei durchschnittlich 0,2 mg lag). Offenbar ist I E S nicht nur als Baustein, sondern auch gleichzeitig als Stimulator oder Inhibitor wirksam, der an zentralen Stoff- wechselprozessen angreift und iiber deren Beeinflussung zu einer Steigerung der Alkaloidbildung fuhrt. Dafiir spricht auch, daD andere Auxine, die nicht vom Indol- typ sind, ahnliche Wirkungen hervorrufen").

*) Herrn Prof. Dr. K. Mothes danken nir herzlich fur wertvolle Hinweise und fur die Ermog- lichung der Durchfuhrung der Arbeit.

Anschrift: Dr. E. Teusctier, Greifswald, F.-L.-Jahn-Str. 15a. [Ph 1291

2498. A. M u s t a f a , W. Aske r , M. K. H i l m y , A. S a m m o u r und M. A b d a l l a

Reaktionen mit 4-Oxazolidonen (Teil I) l) Aus den Chemischen Instituten der naturwissenschaftlichen Fakultiit der Universitiit Kairo

und der Fakultiit fur Ingenieurwissenschaften der Universitiit Ain Sham, VAR

(Eingegangen a m 22. September 1964/Januar 1965)

Der heterocyclische Ring im 2,5-Diphenyl-4-oxazolidon (Ia) konnte durch Grignardreagenzien unter Bildung von N-substituierten Mandelsiiureamid- derivaten (11) gespalten werden. Die IR-Spektren werden diskutiert. Die Reaktion von la mit Formaldehyd und Piperidin ergibt die Mannichbase 111. Die Einwirkung von Benzylarnin, Anilin und Phenylhydrazin auf I wurde

untersucht.

4-Oxazolidone sind weniger gebrauchlich als 2-0xaxolidone. Die Methoden zu ihrer Synthese wurden sorgfaltig von Staudilzger und Ruzicka2), Cornforth und Cornforth3), Davies, Ramsay und Stove4) untersucht, die chemischen Eigenschaften dieser Verbindungen scheinen aber nicht so eingehend bearbeitet worden zu sein. In dieser Arbeit ist das Verhalten des Heteroringes des 2,5-Diphenyl-4-oxazolidons (I a) gegen Grignardreagenzien untersucht worden5).

l) ubersetzt von Apotheker Wolfram Schulz, Pharniazeutisch-chemieches Institut der Univcrkitat

2, H . Staudinger und L. Ruzicka, Liebigs Ann. Che-n. 280, 282 (1911). 3, J . W . Cornforth und R. H . Cornforth, J. chem. SOC. (London) 1949, 1028. 4, W . Davaes, T . I€. R n m a y und E. R . Stove, J. chem. SOC. (London), 1849, 2633. 5 , Zum Verhalten von Heteroringen in heterocyclischen Verbindungen hei Einwirkung von

organischen D.lagnesiumverbind1iingen siehe : A. Mwtafu, II'. Asker, A . F. A . Sh,uEaby, H . E . Sobhy, A . M. Pleifel und K. Abu-Elazayem, J. Amer. chem. SOC. 82, 2029 (1960); A. Mustafa, W . Asker, A . P. A . Shalaby, A. H. Harhash und R. Doguer, Tctrahedron 20, 25 (1934); A. Mustafa, W . Asker, A . H. Harhash und A'. A . L. Kassab, Tetrahedron 19, 1577 (1963); A . Mustafa, M'. -1 sker, A . €I . Harhash, N . A . I;. Kassab nnd M. H. Elnagdi, Tetrahedron 20, ini Druck

Tubingen.