Nhóm 4:

Nguyễn Thị Thị Thanh Tuyền

Uông Quang Nhật

Trần Thị Hồng Tím

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 1

ĐỊNH LƯỢNG AMINO ACID BẰNG NINHYDRIN

I. NGUYÊN TẮC

Nguyên tắc

Dưới tác dụng của ninhydrin, acid amin oxi hoá bị giảm bớt một nguyên

tử C, nó trở thành dạng aldehyde rồi đến ammoniac và carbonic, acid

amin.Như vậy các acid amin có khối lượng phân tử nhỏ hơn và amoniac

tạo thành sẽ oxi hoá ninhydrin tạo nên phức hợp có màu xanh tím,

cường độ màu tương ứng với giá trị nitơ amin của acid amin.

Phản ứng của acid amin với ninhydrin là cơ sở để định lượng các hợp

chất theo phương pháp khí kế bằng cách tính số lượng CO2 hoặc NH3

bay ra, còn phương pháp so màu lại đo cường độ màu, nó phụ thuộc

nồng độ phức hợp của ninhydrin với NH3.

Phản ứng màu ninhydrin cũng xảy ra với acid amin mạch bên của

peptide và protein cũng như với muối amoni, glucozamin và

ammoniac.Để định lượng chính xác acid amin, dung dịch nghiên cứu

phải không có hợp chất trên.

Phản ứng của acid amin với ninhydrin được sử dụng nhiều để định tính

và định lượng acid amin, đặc biệt là phương pháp sắc ký trên giấy và

sắc ký trên cột nhựa trao đổi lớn nhờ máy phân tích acid amin tự động

do Spackman, Stein và Moose đề xướng. Phản ứng này rất nhạy, có thể

cho phép ta xác định được các acid amin có nồng độ rất nhỏ (vài

microgam).

II. THỰC HÀNH

II.1Hóa chất

Dung dịch mẫu chứa acid amin có khoảng 3-5mg nitơ trong 1ml

Dung dịch ninhydrin: hoà tan 2g ninhydrin trong 50ml dung dịch etanol

50%.

Dung dịch đệm citrate 0,4M; pH = 5.

Dung dịch etanol 50%.

Dung dịch chuẩn leucin

II.2Dụng cụ thí nghiệm

Bình định mức 10ml.

Pipet 1ml, 5ml.

ống nghiệm 10ml

Nồi ủ.

Máy so màu

II.3Cách tiến hành

Lấy 0,1ml dung dịch nước mắm cho vào bình định mức 100ml,thêm nước

cất vào cho đến 100ml ta được dung dịch acid amin cần định lượng.

Lấy 1ml dung dịch acid amin đã pha loãng ở trên cho vào ống nghiệm.

Cho thêm 1,5ml dung dịch đệm citrate 0,4M và 2ml dung dịch ninhydrin.

Lắc đều ống nghiệm và đặt vào nồi ủ nhiệt đun sôi 30 phút.

Lấy ống nghiệm trong nồi ủ nhiệt ra và đổ vào bình định mức 10ml.Cho

thêm etanol 50% đến 10ml.

Đo giá trị hấp thu OD ở 570nm. Chỉnh máy về với ống kiểm tra, ống đó

có đủ các hóa chất như ống ban đầu nhưng thay dd acid amin bằng nước

cất cùng thể tích.

Giá trị hấp thụ nhận được tương ứng với độ hấp thụ của dung dịch chuẩn

leucin đã biết nồng độ (cường độ màu trong phản ứng ninhydrin tương

ứng với cường độ màu trong dung dịch chuẩn leucin).

Đường chuẩn leucin:

Lấy 5 ống nghiệm, đặt lên giá.Và lần lượt cho vào từng ống nghiệm:

Ống Dung dịch leucin (mg)

1 20

2 40

3 60

4 80

5 100

Làm phản ứng với các hóa chất trên và đo độ hấp thụ

III. KẾT QUẢ

Thời gian khảo sát : 10 phút

Ống Mẫu Nước Dung dịch leucin

1 2 3 4 5

Màu sắc ++++ + ++ +++ +++++ ++++++ +++++++

∆OD 0,112 0 0,033 0,075 0,143 0,177 0,209

0 20 40 60 80 100 1200

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

f(x) = 0.00220714285714286 x − 0.00419047619047618R² = 0.987133352585977

Đường chuẩn

Đường chuẩnLinear (Đường chuẩn)

Nồng độ leucin ( µg)

∆OD

IV. BIỆN LUẬN KẾT QUẢ

- Các axit amin khi phản ứng với ninhydrin sẽ bị dezamin hóa, oxy hóa và

decacboxy hóa tạo NH3, CO2, và aldehyt tương ứng.

- Phản ứng ninhydrin là phản ứng màu, dùng để định tính và định lượng axit

amin, imino axit và amin. Khi đun nóng ninhydrin trong môi trường kiềm

với chất có nhóm chức amin bậc 1 sẽ thu được sản phẩm có màu tím xanh

có maximum hấp thụ ở 570 nm. Mật độ quang của sản phẩm thu được

tuyến tính phụ thuộc vào số lượng nhóm amin tự do. Dựa vào tính chất này

người ta có thể định tính được axit amin.

- Đối với đường chuẩn: theo thứ tự ống, nồng độ dung dịch leucin tăng dần,

lượng phức hợp sinh ra từ phản ứng cũng tăng nên màu xanh tím cũng đậm

dần theo thứ tự ống, lượng ∆OD cũng tăng dần.Ống nước chỉ có màu vàng

của ninhydrin, không có màu xanh vì trong ống không có acid amin để tạo

ra phức màu xanh tím.

- Mẫu: được pha loãng với lượng thích hợp nên thuộc đường chuẩn

y = 0.0022x – 0.0042 với ∆OD = 0.112 → C =53µg

V. PHẦN MỞ RỘNG

Phương pháp sắc kí giấy

Là một phương pháp sắc kí dùng giấy hấp thụ để phân tách một lượng nhỏ

vật chất lỏng mang (chất hoà tan) và lấy ra khi vạch chất hoà tan tiến gần

đầu kia của một băng giấy. Có thể dùng sắc kí hai chiều nếu dùng giấy

vuông và hai chất hoà tan khác nhau. Giấy được rút ra khỏi chất lỏng mang

thứ nhất, quay một góc vuông và nhúng vào chất lỏng thứ hai. Ta sẽ có

“bản đồ” hai chiều của các thành phần giọt thử. Sự giống nhau, khác nhau

có thể tìm thấy bằng cách đo giá trị Rf (độ chuyển động tương đối)

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân bố giữa hai pha dung

môi: dung môi cố định và dung môi di động. Dung môi cố định thường là

nước giữ ở giấy sắc ký ( trong điều kiện bão hòa hơi nước, giấy có thể giữ

15-20% nước tính theo trọng lượng giấy). Dung môi di động thường là một

dung môi hữa cơ bão hòa nước di chuyển trên tờ giấy theo mao dẫn kéo

theo các chất trong dung dịch. Tốc độ di chuyển của từng chất không giống

nhau và mỗi chất được đặc trưng bởi một trị số nhất định được gọi là Rf.

Có nhiều sắc ký giấy khác nhau đó là sắc ký một chiều đi xuống, sắc ký

võng nằm ngang và sắc ký hai chiều..Loại giấy thường dùng là Whatman số

1 và Shleicher-Schull 2044 a và b, dung môi gồm các chất như 4 Butanol: 1

Acetic acid: 5 nước (dùng cho chiều thứ nhất: 3 phenol: 1 nước (dùng cho

chiếu thứ 2).

Trong đó: 

- a là khoảng cách dịch chuyển của chất phân tích

- b là khoảng cách dịch chuyển của dung môi

Sắc ký lớp mỏng

Nguyên tắc của phương pháp này dực trên lý thuyết của sắc ký giấy, nghĩa

là cũng dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha: chất hấp phụ được trán

rộng trên một phiến kính tạo thành một lớp mỏng và pha di động là dung

môi thích hợp. Dung môi di chuyển làm dịch chuyển các chất trong mẫu

thử. Các chất hấp phụ thường dùng là Silicagel, alumin

acid,Sephadex,v.v… được kết hợp với thạch cao (gypse) để dán vào phiến

kính

Sắc ký khí

Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng tính chất khó bay hơi của các

acid amin nên có thể sử dụng chương trình nhiệt để chuyển chúng thành các

dẫn xuất ( thường là N-acetyl-amin). Cho tác dụng acid amin với cồn

amylic và HBr khan, sau đó cho tác dụng hỗn hợp này với anhydric acetic.

Cột thường dùng là loại Chromosorb W (60-80 mesh) có một lớp

polyetylenglyco 1% (cobowax 1564 hoặc 6000). Chương trình nhiệt giữa

1250 C và 1550 C, tốc độ chảy 60-240 ml/phút.

Phương pháp Sorensen

Các amino acide có thể phản ứng với formol trung tính để tạo thành dẫn

xuất metylenic.Kết quả là nhóm amin mất tính chất cơ bản của nó ,ngược

lại nhóm cacboxyl trong amino acide tồn tại dạng metylen tự do có thể

chuẩn độ với NaOH .

Phương pháp được ứng dụng trong trường hợp nhóm cacboxyl và nhóm

amin tự do bằng nhau.

Nguyên tắc các phản ứng màu khác của protein:

Phản ứng xantoproteic: đặc trưng với các axit amin vòng thơm. Các gốc

amino acid Tyr,Trp,Phe trong protein tác dụng với HNO3 đặc tạo thành

màu vàng và sau khi thêm kiềm sẽ chuyển thành da cam

Phản ứng ninhydrin: đặc trưng với các - axit amin.

Phản ứng Pholia: đặc trưng với các axit amin chứa lưu huỳnh

Phản ứng Millon : phát hiện Tyrosin. gốc Tyr tác dụng với thủy ngân

nitrate trong HNO3 đặc tạo thành kết tủa màu nâu đất

Phản ứng Folin: phát hiện Tyrosin, Tryptophan.

Phản ứng Sakaguchi: phát hiện Arginin. Gốc Arg tác dụng với dung dịch

kiềm của α-naphtol và hypobromite cho màu đỏ anh đào