DIPARTIMENTO DI FARMACOLOGIA PRECLINICA E CLINICA PROGETTO

Monitoraggio della terapia enzimatica sostitutiva (ERT) nella malattia di

Anderson-Fabry

RESPONSABILE SCIENTIFICO: Prof. Gloriano Moneti COLLABORATORI: F. Boscaro, G. La Marca, G. Bartolucci, G. Pieraccini.

E’ stato messo a punto un metodo per il dosaggio dei livelli plasmatici ed urinari di

globotriaosylceramide (Gb3) in pazienti colpiti dalla malattia di Anderson-Fabry.

L’analisi prevede l’uso della tecnica Flow Injection Analysis-Electrospray

Ionization-Tandem Mass Spectrometry (FIA-ESI-MS/MS). Essendo il metodo molto

sensibile, la preparazione dei campioni di plasma ed urine è molto rapida, infatti i

campioni sono solo diluiti 50 volte ed iniettati. La quantificazione degli analiti

avviene in uno strumento a triplo quadrupolo (QqQ), con la modalità Multiple

Reaction Monitoring (MRM). Sono stati presi in considerazione i seguenti

parametri: la linearità della risposta degli standard di calibrazione, la precisione

delle analisi, l’accuratezza e il limite di rivelazione del metodo. La procedura

proposta permette una rapido ed accurato dosaggio della globotriaosylceramide in

campioni biologici. I dati ottenuti da volontari sani e da pazienti colpiti dalla malattia

di Anderson-Fabry suggeriscono un ruolo potenziale di questa tecnica per

monitorare l’efficacia della terapia sostitutiva con enzima prodotto da DNA

ricombinante (ERT).

DIPARTIMENTO DI FARMACOLOGIA PRECLINICA E CLINICA

DIPARTIMENTO DI FARMACOLOGIA DIPARTIMENTO DI FARMACOLOGIA PRECLINICA E CLINICAPRECLINICA E CLINICA

TITOLO DEL PROGETTO:

RESPONSABILE SCIENTIFICO: Prof. Gloriano Moneti

COLLABORATORI: F. Boscaro, F. Luceri, G. la Marca, G.Bartolucci e G. Pieraccini.

Monitoraggio della terapia enzimatica sostitutiva (ERT) nella malattia di Anderson-FabryMonitoraggio della terapia enzimatica sostitutiva (ERT) nella malattia di Anderson-Fabry

Ospedale di Ospedale di CareggiCareggi, Firenze, FirenzeUnitUnitàà di Citogenetica e Geneticadi Citogenetica e GeneticaDr. F. Dr. F. TorricelliTorricelli

UniversitUniversitàà di Firenzedi FirenzeCISMCISMProf. G. MonetiProf. G. Moneti

Ospedale di Ospedale di CareggiCareggi, Firenze, FirenzeUnitUnitàà di Neuropsichiatriadi NeuropsichiatriaDr. M.R. ScordoDr. M.R. Scordo

Ospedale di Ospedale di CareggiCareggi, Firenze, FirenzeUnitUnitàà di Cardiologiadi CardiologiaDr. M. Dr. M. CiaccheriCiaccheri

UniversitUniversitàà di Firenzedi FirenzeDipartimento di NeurologiaDipartimento di NeurologiaDr. W. BorsiniDr. W. Borsini

UniversitUniversitàà di Firenzedi FirenzeDipartimento di OftalmologiaDipartimento di OftalmologiaDr. A. SodiDr. A. Sodi

Ospedale di Ospedale di CareggiCareggi, Firenze, FirenzeUnitUnitàà di di NefrologiaNefrologia (Coordinatore)(Coordinatore)Dr. F. Dr. F. MartinelliMartinelli

Centro di riferimento della Toscana per la malattia di

Anderson-Fabry

Centro di riferimento della Centro di riferimento della Toscana per la malattia di Toscana per la malattia di

AndersonAnderson--FabryFabry

©© Blackwell Science Ltd.Blackwell Science Ltd.

William Anderson (1842–1900)William Anderson (1842–1900) Johannes Fabry (1860–1930)Johannes Fabry (1860–1930)

Malattia di ANDERSON - FABRYMalattia di ANDERSON Malattia di ANDERSON -- FABRYFABRY

EREDITARIETA’EREDITARIETA’

x y xx*

x x x y xx* x*y

x*y x x

xx* x y xx* x y

incidenza stimata:incidenza stimata:1 : 40,000 maschi1 : 40,000 maschi

In Italia:In Italia:500 : 20 M maschi500 : 20 M maschi

Human Globotriaosylceramide (Gb3)Human Globotriaosylceramide (Gb3)OOH

OHHO O

CH2OH

OH2CH

HO OH

O OH2CH

HO OH

O

O O

CH

2CH CH

NH

C

O

2CH( )

)(CH214-24 3

CH

OH

CH CH 12 3CH

α–Galactosidase A

• L’ assenza o la ridotta attività dell’enzima è responsabile di un difetto metabolico che si manifesta nella sindrome di Anderson-Fabry

• la mancata idrolisi del legame α galactosidico comporta un accumulo di Gb3 prevalentemente nei fluidi biologici e nelle cellule endotelialidei vasi sanguigni

• questo accumulo puo’ manifestarsi anche dopo molto tempo con patologie a danno di vari organi

gangli e celluleperineurali del SNA

cellule epitelialidella cornea e del rene

cellule del tessutoconnettivo, miocardicoe reticoloendoteliale

fluidi biologicicellule muscolari lisce del sistema

cardiovascolare -renale

lisosomi dell’endotelio vascolare

Malattia di Malattia di AndersonAnderson--FabryFabry

Angiocheratoma Opacità della cornea

FIA-ESI-TOF (MARINER)

FIA-ESI-TOF (MARINER)

Mass (m/z)1126.0 1137.4 1148.8 1160.2 1171.6 1183.0

50

100%

Inte

nsity

OOH

OHHO O

CH2OH

OH2CH

HO OH

O OH2CH

HO OH

O

O O2CH CH

NH

C

O

2CH( )

2 )(CH

CH

OH

CH CH 12 3CH

R

1156.77081166.5732

1130.7537

1154.7546

1128.7435

1158.7747

R=22:1

R=22:0

R=24:2

R=24:1 R=24:0C55H80N11O17

1172.75931174.7758

ISIS

Measured m/z Calculate m/z Error (ppm) DBE Formula1128,74351 1128,73804 4,84793 5,5 C58H107NO18Na1130,75378 1130,75369 0,08136 4,5 C58H109NO18Na1154,75466 1154,75369 0,84173 6,5 C60H109NO18Na1156,77084 1156,76934 1,29837 5,5 C60H111NO18Na1158,77476 1158,78499 -8,82670 4,5 C60H113NO18Na1172,75931 1172,76425 -4,21461 5,5 C60H111NO19Na1174,77583 1174,77991 -3,46688 4,5 C60H113NO19Na

LCLC--ESIESI--MS/MSMS/MS

HPLCElectrospray

Interface

Triple QuadrupoleMS/MS

Q1 Q2 Q3Autosampler

Flow Injection Analysis(FIA)

HPL

C C o

lum

n

4 6 8 10 12

5 10 15 20 25 30 35

Time, min

HPLCPlasma

FIA - Plasmacalibration curve

Time, min

1 Sample

15 Samples2.5 µg/mL

5 µg/mL

10 µg/mL

20 µg/mL

0 µg/mL

C16:0

C18:0

C20:0C22:1C24:2

C22:0C24:1

C24:0

MRM

1158.7 996.71156.7 994.71154.7 992.71130.7 968.71128.71102.71074.71046.7

966.7940.7912.7884.7

C24:0

C16:0

C24:1C24:2C22:0C22:1C20:0C18:0

980µL ofAcetone : MeOH : H2O

45 : 45 : 10 v/v

20 µL of plasma

+980µL of

Acetone : MeOH : H2O45 : 45 : 10 v/v

20 µL of urine

+

PLASMAPLASMA

Proteine Precipitation

and centrifugation10.000 g x 5 min

800 µL liquid phase

800 µL liquid phase

FIAFIA--ESIESI--MS/MSMS/MS( PE SCIEX API 365 )

0.2 µL Inj. 0.2 µL Inj.

1:50 Dilution 1:50 Dilution

URINEURINE

4 6 8 10 12 Time, min

1000

2000

3000

4000

Inte

nsity

, cps

4 6 8 10 12 Time, min

1000

2000

3000

Inte

nsity

, cps 2 weeks therapy

Basal

C16:0

C18:0C20:0C22:1C24:2

C22:0C24:1

C24:0

Plasma

UrineBasal

2 weeks therapy

Gb3 in AFD male biological fluidsGb3 in AFD male biological fluids

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

Gb3

(µg/

mL)

0 0 0 0 2 4 8 12 16 20 25 28 30 32 34 38 40 42 46 50Weeks

Plasma Gb3: AFD Male (V.A.) TKT

0,02,04,0

6,08,0

10,012,0

14,016,018,0

Gb3

(mg/

24h)

0 0 0 2 4 8 12 16 20 25 28 30 32 34 36 38 40 42 46 50

Weeks

Urine Gb3: AFD Male (V.A.) TKT

0,0

2,04,06,08,0

10,0

12,0

14,016,018,0

Gb3

(mg/

24h)

0 1 4 8 12 24 28 32 36 40 48 60 84 100

weeks

Urine Gb3: AFD Female (C.G.) TKT

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

Gb3

ug/

mL

0 1 4 8 12 24 28 32 36 40 48 60 84Weeks

Plasma Gb3: AFD Female (C.G.) TKT

ERT follow upERT follow up

3,00

8,00

13,00

18,00

23,00Gb3 Plasma (µg/mL)Gb3 Plasma (µg/mL)

Basa

le4

Mes

e

Basa

le

5 M

ese

7 m

ese

6,5

mes

e6

mes

e

9 m

ese

1 M

ese

1 Se

ttim

ana

2 M

ese

3 M

ese

.

♂Fa

bry

♀Ca

rrier

♂F a

bry

♂Fa

bry

♂Fa

b ry

♂Fa

b ry

♀Ca

rrier

♀Ca

rrier

♀Ca

rrier

♀Ca

rrier

♀Ca

rrier

♀Ca

rrier

Gb3 Urine (nmoli/g Creatinine)Gb3 Urine (nmoli/g Creatinine)

0,00

4,00

8,00

12,00

16,00

20,00

1 M

ese

9 M

ese

Basa

le

Basa

le 4 M

ese

7 M

ese

6,5

Mes

e

1 Se

ttim

ana

2 M

ese

3 M

ese

♂Fa

bry

♀Ca

rrier

♂F a

bry

♀Ca

rrier

♀Ca

rrier

♀Ca

rrier

♀Ca

rrier

♀Ca

rrier

♂Fa

bry

♀Ca

rrier

♀Ca

rrier

♀Ca

rrier

♂Fa

b ry

♂Fa

b ry