Farmacologia preclinica

7/27/2019 Farmacologia preclinica

1/70

Farmacologia preclinica

Riferimenti: Dr. Sabata Pierno

Prof. Diana Conte


2/70

Test preclinici

Valutazione del principio attivo prima del test sulluomo (clinici)

Colture cellulari

Test di farmaci su cellulenormali o cellule in cui

viene indotta una

mutazione

Organismi interi

Test in vivo su modellianimali di patologie e

animali sani

Valutazione tossicitValutazione tossicit

Acuta

Subcronica

Cronica

Riproduttiva

Cancerogenesi

Studi in vitroStudi in vitro Studi in vivoStudi in vivo


3/70


4/70


5/70


6/70


7/70

Studi in vitro

propriet farmacologiche

screening iniziale di tossicit

metabolismo


8/70

Test di tossicit

Valutazione del rischio potenziale nelluomoderivante dallesposizione ad un farmaco


9/70


10/70


11/70


12/70

es. di test in vivo:inibizione

Misura della durata del sonno da esobarbitale(farmaco rapidamente disattivato dalle monoossigenasiepatiche)

Gli inibitori di questo sistema prolungheranno dunque laloro azione

es. somministrazione cloramfenicolo a topi 1 ora primadella somministrazione con pentobarbitale prolunga il

sonno in maniera dose-dipendente


13/70

Test di neurotossicit

Su nuovi farmaci e agenti chimici

Uso di modelli animali: in genere roditori

Vengono valutati parametri neurocomportamentalicome perdita di memoria, deficit somatosensoriali,disfunzioni motorie e anche laspetto fisico,reattivit, forza muscolare

Supporto dei test in vitro


14/70

Meccanismi di tossicit acuta

I canali ionici che facilitano la trasmissione dellimpulso nervoso

sono sensibili a perturbazioni causate da varie sostanze tossiche e farmaci.

(Gli inibitori del trasporto ionico sono indicati in parentesi)


15/70

Test in vivo: tossicit acuta

Stabilire effetti tossici da singola dose:Si costruisce una curva dose risposta con almeno 5 animali per sessoEffetto quantale (tutto o nulla)

Fine: Standardizzare dosidefinire meccanismiattribuire eventuale tossicit dorganoletalit

determinazione requisiti sicurezza imballi


16/70

Fattori responsabili della variazione della DL50Fattori responsabili della variazione della DL50

Specie

Razza etGenerePesoStato di saluteStato nutrizionaleContenuto intestinaleVia di somministrazioneStabulazioneTemperatura

OrarioStagioneErrore umano


17/70

Saggio di irritazione oculareSaggio di irritazione oculare

Per valutare lirritazione dovuta a composti applicatitopicamente nellocchio

Variazione del test di DraizeAnimale da esperimento pi adatto: coniglio

Il test consiste nellapplicare il materiale da valutare nel sacco

congiuntivale nellocchio. Laltro occhio funge da controllo.Dopo 1, 2, 3 giorni va esaminato laspetto della cornea (opacit), iride

(aspetto e reazione alla luce), congiuntiva (arrossamento ed effetto suivasi), palpebre (eventuale gonfiore).

La colorazione alla fluoresceina pu migliorare lesame visuale perch ilcolorante pu essere pi facilmente assorbito dai tessuti danneggiati,

che diventano fluorescenti quando locchio viene illuminato

Nuove direttive: numero di animali minimo richiesto ridotto da 6 a 3.Il pH va controllato con attenzione


18/70

Test per irritazione cutaneaTest per irritazione cutaneaapplicazione topica di sostanze chimiche

Irritazione primariaIl composto da studiare viene applicato su unarea rasata di 5 cm2 sul dorso di

conigli albini. Dopo 24 ore larea viene osservata valutando arrossamenti,lesioni, edemi ecc.

Sensibilizzazione cutanea

Valutazione reazioni allergiche. Ricerca di anticorpi. Animali usati: cavie

Fase di induzione: trattamento ogni 3 giorni per 2 settimane. Poi trattamentotopico di 24 ore simile al test di irritazione cutanea. Segue osservazione

severit lesioni su numero animali


19/70

Sicurezza farmacologica

Test per lo sviluppo di nuovi farmaciIdentificare gli organi bersaglio(SNC, sistema cardio-vascolare, sistema polmonare)

Identificare gli effetti indesiderati

Possibili effetti tossicologici

Identificare il meccanismo che porta agli effettiindesiderati


20/70

Studi di tossicit generale

Acuta: singola somministrazione;

A breve termine (dosi ripetute): 14-28 giorni;

Prolungata (10-25% della vita dellanimale, subcronica): 3-6 mesi(nel ratto)

Cronica (>50% della vita): 1-2 anni nel ratto (in genere studi di

cancerogenesi)


21/70

gli studi acuti rappresentano lesposizione dovuta adincidenti o a sovradosaggi accidentali o volontari.

gli studi subcronici rappresentano lesposizione (a livellipi bassi di quelli dovuti ad incidenti) frequente a sostanzedi uso professionale (es. solventi) o domestico (es.

detergenti), ad additivi alimentari, farmacie inquinantiambientali;

gli studi cronici rappresentano lesposizione giornaliera,

per tutta la vita, ad additivi alimentari, residui di pesticidinel cibo e nellacqua ecc.

Rapporto con lesposizione delluomo


22/70

Tipi di tossicit

Tossicit funzionale: alterazioni delle funzioni diun sistema (nervoso, cardiovascolare,endocrino) danno dorgano.

Citotossicit: alterazione irreversibile di proteine(enzimi, canali ionici ecc.) o membrane (lipidi);disregolazione del metabolismo necrosi,apoptosi tossicit tissutale e dorgano osistema (fegato, rene, SNC ecc.).

Genotossicit: alterazione del DNAmutazioni,

alterazioni cromosomiche cancerogenesi,malattie congenite.

Reazioni allergiche: allergeni, apteni,modificatori degli antigeni cellulari risposta

immunitaria.


23/70

Predittivit degli studi animali di 221 effetti tossici di 150 farmacinelluomo.


24/70

TossicitTossicit

subcronicasubcronica

Provocata da somministazione ripetuta (es. orale 28-90 gg)

Essenziale per stabilire i regimi di dose

Determinazione NOELNOEL (No-observed effect level)

3 livelli di dosedose; Via di somministrazione con la dieta

N animalianimali (roditori) = 10-20 (maschi e femmine) per ogni livello di dose

La specie scelta dovrebbe essere quella con maggiore similarit farmacocinetica e

metabolica con luomo (il pi comune roditore il ratto il pi comune non roditore il

cane)

Perridurre la variabilitridurre la variabilit si usano ceppi di roditori consanguinei

Gli animali devono essere posti in quarantenaquarantena prima di essere ammessi nellarea di

sperimentazione

Regolare ispezione da parte del veterinario


25/70

Valutazione della reversibilitValutazione della reversibilit

Cibo normale per 21-28 giorni

Osservazione dei vari parametri


26/70

Lista dei parametri da valutare

Dati in vita

Aspetto. Mortalit e morbilit. Pelle, pelo, eventuale presenza di massepalpabili, lesioni esterneOcchi. Esame della cornea e della retinaConsumo di cibo. settimanalmentePeso corporeo. SettimanalmenteAnomalie comportamentaliFrequenza respiratoriaECGEEG

Ematologia. Prima e dopo il test. Emoglobina, eritrociti, leucociti, piastrine,parametri di coagulazioneEmatochimica. Elettroliti, glucosio, lipidi, sieroproteine, transaminasi efosfatasi.Analisi delle urine. pH, densit, proteine, bilirubinaAnalisi delle feci. Sangue occulto, agenti tossici, metaboliti


27/70

Test terminali

Se vengono riscontrate lesioni vieneesaminato anche il gruppo a dose pibassa

Istologia

I tessuti elencati, o evantuali masse, vengono inclusi sezionati ecolorati per la microscopia ottica. Inclusione in paraffina,

colorazione con ematossilina-eosina

Necropsia

I tessuti sono rimossi pesati edesaminati per evidenziare

grosse lesioni, masse, ecc.vengono poi fissati in formalinatamponata per il successivoesame istologico


28/70

Identificazione dei cancerogeni

Cancro: crescita incontrollata di cellule anormalicon possibile invasione dei tessuti lontani

Lanalisi epidemiologica ha rivelato lapresenza di un accumulo di mutazioni di

geni critici durante lo sviluppo del cancro

Alterazione processo direplicazione/riparazione DNA

danno ossidativo DNA

danni DNA causati da cancerogeni ambientali


29/70

Spesso un clone cellulare necessita di decenni peraccumulare molteplici mutazioni critiche da consentire losviluppo di un cancro evidenziabile clinicamente

Alcuni geni: proto-oncogeni sono presenti nelle cellulenormali e regolano la crescita cellulare.

Tali geni sono frequentemente mutati nel cancro

Durante la cancerogenesi i geni soppressori ditumore (oncosoppressori) possono subire

mutazioni e perdere attivit

Alcuni proto-oncogeni e oncosoppressori alterano la

capacit della cellula di andare incontro ad apoptosi


30/70

Agenti terapeutici come potenziali cancerogeni

Agenti alchilantiCiclofosfamide

Ormoni

Fenacetina

Metronidazolo

Cimetidina


31/70

Saggio di riferimento Gold standardCondotto x 2 anni sui roditori

Limiti:

Differenze tra specieUtilizzo di alte dosiBreve ciclo vitale roditoriNumerosit del campioneNecessit di estrapolazione alluomoCosti elevati

Test preliminaridi mutagenicit o tossicit genetica


32/70

Saggi di genotossicit / mutagenesi a breve terminesono stati sviluppati utilizzando batteri, lieviti,

Drosophila, cellule umane o murine

Valutazione della presenza di mutazioni puntiformi,mutazioni frame-shift, danni cromosomici e

trasformazioni cellulari

Mutagenicit era sinonimo di cancerogenicit neiroditori solo nel 60% dei casi (meccanismiepigenetici?)


33/70

Saggio di Tennant (Science, 1987)73 sostanze chimiche

gi testate come cancerogene nel saggio sui roditorisono state analizzate su 4 saggi a breve termine:

1.Saggio di mutagenesi sulla Salmonella (test di

Ames)2.Saggio del linfoma di topo3.Formazione di aberrazioni cromosomiche4.Scambio di cromatidi fratelli in cellule ovariche di

criceto


34/70

Tossicologia

genetica

DNAemutazioni


35/70

MutazioniVariazioni stabili del materiale

genetico trasmesse allaprogenie


36/70

Mutazioni spontanee

provocate da fattori chimiciendogeni e da errori nei processi

che si attuano sul materiale

genetico

Mutazioniindotte

prodotte dall'azione diparticolari agenti fisici

o chimici


37/70

Mutazionicromosomiche

Alterazione della strutturadel cromosoma

Es. sindrome del cri du chat(microencefalia, difficoltintellettive)

delezione braccio cortocromosoma 5

M t i i i h


38/70

Mutazioni genomiche

riguardano il numero di cromosomi

Aneuploidie = Aggiunta o perdita di cromosomi

le forme di aneuploidia pi frequenti sono la mancanza di un cromosomada una coppia (monosomia) o la presenza di un cromosoma in pi in unacoppia (trisomia) . Pi raro il caso di perdita di una coppia intera(nullisomia).

Es. trisomia del cromosoma 21 (ridotto sviluppo fisico e mentale,suscettibilit a malattie dellapparato respiratorio) frequenza 1/700nati

La sindrome di Turner invece un esempio di monosomia; gli individuinati con questa anomalia possiedono un solo cromosoma sessuale, quellofemminile X.


39/70

Mutazioni geniche

Sostituzioni o stopSostituzioni o stop

Es. anemia falciforme emoglobina S mutanteAT in TA

Valina al posto di ac. glutammico

Delezione o inserzione di 1 o pi basi

Scivolamento nella lettura(mutazioni frameshift)


40/70

Dominanti o recessive

a seconda se si esprimano o meno nelle cellule diploidi allo stato eterozigote

T t di A


41/70

Test di Ames

Stabilisce la capacit della sostanza in esame di indurremutazioni in un ceppo di Salmonella che porta una mutazioneper un enzima della via biosintetica dellistidina

Forte correlazione tra mutagenicit e cancerogenicit

Lagente chimico se mutageno potr determinare unamutazione (reversione) del gene compromesso permettendo

cos al batterio di risintetizzare laminoacido essenziale.

Test di Ames


42/70

es d esLa sensibilit dei ceppi pu essere aumentata da mutazioni ulteriori

Esistono ceppi ricombinanti per gli enzimi del metabolismo

2007 J.F. DESAPHY

Coltura di Salmonellaistidina-dipendenti (medium + istidina)

Miscela S9

Enz fegato ratto

Potenziale mutageno

coltura su

Agar privo di

istidina

incubazione

2 giorni 37Cmutageno

non-mutageno

Il mutageno pu casualmente revertire il fenotipo deficientedeterminando la comparsa di cloni in grado di sintetizzare istidina


43/70

Tossicit cronica

DurataDurata: generalmente 1 anno o pi

Animali utilizzatiAnimali utilizzati: ratti e caniStudi di cancerogenesi: ratti e topi

Fine dello studioFine dello studio: Definizione dei margini di sicurezza

I parametri da valutareparametri da valutare sono gli stessi usati per gli studisubcronici


44/70

I test di cancerogenesiI test di cancerogenesihanno requisiti in comune con i test subcronici e cronici

Lagente chimico da testare pu essere somministrato nel cibo,acqua da bere, applicazione dermica, sondino, inalazioneLa somministrazione va effettuata a cominciare dopo losvezzamento

La dose pi alta utilizzata la MTD (max dose tollerata)Principale parametro determinato: incidenza tumorale misurataattraverso esami istologici

Necessario un gran numero di animali a causa della possibilit dicomparsa spontanea di tumori (50 o pi ratti o topi per sesso e pergruppo di trattamento)

Necropsia ad uno stadio intermedio (es. 12 mesi) e alla fine del test

T d


45/70

Test di teratogenesi

tossicologia della riproduzione

Interferenza con la capacit riproduttiva

Possibilit di introdurre malformazioni congenite

Negli adulti (trattamento precedente laccoppiamento e

nelle femmine fino alla lattazione)

Negli animali in gravidanza durante il periodo diorganogenesi


46/70

Calcolo delle perdite pre- e post- impianto

(riassorbimento precoce e tardivo e morte fetale)

25 maschi vengono trattati per 70 gg che precedonolaccoppiamento e 25 femmine per 14 gg prima

dellaccoppiamento

3 livelli di DOSE3 livelli di DOSE (nel cibo, acqua da bere, con sondino)La dose alta viene scelta per causare una tossicit non

eccessiva nella madre (es. tale da indurre decremento di pesocorporeo del 10% o effetti su organi bersaglio)

Basse dosi nel range dei no-effect level

Il trattamentotrattamento viene continuato per tutta la gravidanza (21 gg)e fino allo svezzamento (ancora 21 gg)

La duratadurata scelta sulla base dei tempi critici di ovulazione e

spermatogenesi

Procedura sperimentale


47/70

Dopo la nascita i piccoli vengono contati, pesati ed esaminati perevidenziare eventuali anormalitLe nidiate sono raggruppate in numero costante (8-10) dopo 4

giorni

Allo svezzamento i cuccioli vengono sacrificati e su di essi eseguitaautopsia per valutare eventuali anormalit interne

Negli studi multigenerazionali vengono salvati 25 animali per sesso

e per gruppo per produrre le successive generazioni

Il trattamento continua per tutto il test, che pu essere condottoper due tre generazioni

Procedura sperimentale


48/70

Per valutare effetti da parte materna o paterna possibile trattare solo un genitore e incrociarlo con

un soggetto del sesso opposto non trattato

Analogamente possibile distinguere tra gli effetti

mediati dallutero o dovuti alla lattazione (scambiandoi neonati delle femmine trattate con quelli dellefemmine non trattate e viceversa)


49/70

Es.AntitumoraliAntiepilettici

CortisoniciAnticoagulanti orali

Effetti della Talidomide


50/70

Effetti della Talidomide

Venduto negli anni 50-60 come sedativo, anti-nausea e ipnotico, rivolto in particolarmodo alle donne in gravidanza. Prodotto in forma di racemo, fu ritirato dal commercio

(1961) in seguito alla scoperta della teratogenicit dovuta ad uno dei suoi enantiomeri,

resa tristemente evidente dalla nascita di migliaia di bambini che presentavano amelia

(assenza degli arti) o vari gradi di focomelia (riduzione delle ossa lunghe degli arti),

generalmente a carico degli arti superiori che quelli inferiori, e quasi sempre bilaterale.

dopo 3 anni di prove su

animali non gravidi

e su donne inallattamento

Effetti collaterali non

gravi

La specie umana risultata essere sensibile

alla dose di 1 mg/kg.

Inibitore

dellangiogenesi

T t i t i d


51/70

Teratogenesi: parametri da osservare

Indice della fertilit: n di gravidanze rispetto al n diaccoppiamenti

N dei nati vivi rispetto al n natiPerdite pre-impianto: n corpi lutei rispetto al n dei siti di

impiantoPerdite post-impianto: n dei siti di riassorbimento nellutero

rispetto al n dei siti di impiantoDurata della gestazione

Effetti sul sistema riproduttivoDimensioni e condizioni della nidiata, morfologia dei cuccioli

alla nascita, genereSopravvivenza dei cuccioli

Aumento in peso e in prestazioniTempi di comparsa dei punti di riferimento dello sviluppo:apertura occhi, eruzione dei denti, apertura vagina,separazione prepuzio nei maschi

Anormalit morfologiche


52/70

Affinch un agente venga etichettato

TeratogenoTeratogenoOccorre un significativo incremento

dellincidenza di anormalit strutturali efunzionali sfavorevoli nella prole in seguito allasua somministrazione alle femmine nel corso

della gravidanza o direttamente allorganismoche si sta sviluppando

Gli studi di teratologia vengono condotti su due specie


53/70

Gli studi di teratologia vengono condotti su due specie(roditori come il ratto e non roditori come il coniglio,

cane, primati)

Deve essere utilizzato un sufficiente numero di

femmine in modo che vi siano almeno 20 femminegravide per ogni gruppo di dose.

Tempo di somministrazione tale da esporre le madri nel

periodo di organogenesi (6-15 gg per ratti e topi, 6-18 gg per conigli)

La sostanza viene soministrata direttamente con unsondino endogastrico (come richiesto da EPA) x un

calcolo pi preciso della quantit3 livelli di dose (dose pi elevata non pi del 10%

mortalit nelle madri)


54/70


55/70


56/70


57/70

Colture cellulari

Test possibili:

Vitalit e citotossicitCancerogenesi e mutagenesi

9COLTURE MICROBICHE9COLTURE DI CELLULE ANIMALI O VEGETALI

Isolamento di cellule dal


58/70

tessuto, separazione eallestimento di colture cellulari


59/70


60/70


61/70

Transfezioni transienti e stabili


62/70

Transfezioni transienti e stabili

La trasformazione di cellule animali mediata dal DNAavviene in due fasi distinte temporalmente

1

trasfezione

Introduzione

del DNA

nella cellula

2

integrazione

incorporazione

eventuale nel

genoma


63/70

Espressione transitoria medianteEspressione transitoria mediante coco--precipitazioneprecipitazione con fosfato di calciocon fosfato di calcio

2X HEBS

pRC/CMV

CD-8 (pLEU)

CarrierCaCL2

Incubazione per 36-72h

a 37C

Dynal Beads

A B

A + B

Particelle sintetiche che

possiedeono in superficie

anticorpi per i recettori CD8

co-espressi con il gene da

studiare (gene reporter utile

per identificare le cellule in

cui avvenuta la trasfezione)

Utilizzare cellule che non esprimono

il gene da inserire

Plasmide contenente il gene

Si aggiunge il DNA alle cellule


64/70

Metodo del calcio-fosfato

Molto usato

Le cellule incorporano facilmente gli acidi nucleiciquando si presentano sotto forma di un precipitato

di complessi DNA-calcio fosfato.

Da ottimi risultati sia per transfezioni transienti

che permanenti

ESPRESSIONE ETEROLOGA DI PROTEINE


65/70

Permette di fare esprimere ad una linea cellulare la proteina che si vuole studiare

attraverso il trasferimento del gene codificante la proteina (trasfezione genica).

Cellule al 70% di confluenza

Plasmide contenente il cDNA

codificante la proteina

Incubazione

per qualche ora

Dopo 24 ore, le cellule

esprimono la proteina.

Dopo 3-4 giorni,lespressione cessa.

Trasfezione transitoriaIl gene penetra in cellu la

ma non si integra nel genoma

Incubazione con antibiotico

Solo le cellule esprimenti

il gene di resistenza sopravvivono

Gene di resistenza ad un antibiotico

Selezione clonale

Isolamento di un clone

Il clone deriva

da una cellula unica.

Sono tutte uguali

alla cellula madre,

Esprimono tutte la proteina

Trasfezione

permanenteIl gene si integrato

nel genoma della cellu la

esempio


66/70

Effetti della mexiletina sulla corrente al Na+ misurata mediante la tecnica del patch-clamp da canali WT e mutati (paralisi periodica ipercaliemica A1156T, miotonia potassio-

aggravata G1306E, paramiotonia congenita R1448C)

I canali mutati sono stati espressi transientemente in cellule tsA201 e la corrente al Na+ stata misurata 36-72 ore dopo la trasfezione

Mex, antiaritmico, blocca la corrente al sodio, voltaggio-dipendente, usata anche nelle patologiedel muscolo scheletrico (miotonie da sodio e da cloro) caratterizzate da ipereccitabilit

Il farmaco ugualmente efficace su A1156T, meno efficace su G1306E e pi efficace su R1448C


67/70

Saggi per valutare lattivit deifarmaci

attivit analgesicaantiaggregante

antiinfiammatoriaantiepiletticaantiipertensiva

broncodilatatoriaantitussivaecc.


68/70

valutazione dellefficacia delle proprietproprietanalgesicheanalgesiche di determinate sostanze(Taber 1974)

Test piastra calda (hotTest piastra calda (hot plateplate oo tailtail flickflick))nei roditorinei roditori

test sensibili ai composti oppiaceitest sensibili ai composti oppiacei

Tail flickattraverso stimolazione termica si rilevano risposte di tipo riflessoHot platesi ritiene si tratti di risposte intenzionali ovvero mediate a livello centrale

Test dellTest dellhothot plateplate


69/70

Test dellTest dell hothot plateplate

fu descritto per la prima volta da Woolfe e MacDonald, 1944 persaggiare la sensibilit al dolore di topi e ratti

Consiste nel mettere un roditore su una superficie riscaldata emisurare lintervallo di tempo (latenza) che intercorre prima che siverifichi una determinata risposta (es. leccarsi la zampa)

Il tutto per un periodo di tempo generalmente non superiore a 60 sec

la temperatura della superficie meno di 50C, temperatura che non

arreca danni alla pelle del roditore

numerosi studi sul comportamento animale si prefiggono di ridurreulteriormente tale temperatura


70/70

Il test consiste nella valutazione dei tempi di

latenza misurati nei gruppi di animali

introdotti al test

Analisi dei risultati

Test statistici

Conclusione sugli effetti dei farmaci

Documents

Farmacologia preclinica