Diplomka Complete[1]

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Ústav biochemie

STUDIUM FUNKCE TRANSKRIPČNÍCH REGULÁTORŮ FnrP, NNR A NarR U

BAKTERIE PARACOCCUS DENITRIFICANS

Diplomová práce

Bc. Iva Struhárová Brno, 2009

2

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením prof. RNDr.

Igora Kučery, DrSc., a Mgr. Pavla Bouchala, PhD., a že jsem uvedla veškerou použitou

literaturu a další informační zdroje.

V Brně 30. 04. 2009 ...........................................

Iva Struhárová

3

OBSAH

Seznam použitých zkratek a symbolů ................................................................................. 5

I. TEORETICKÁ ČÁST ............................................................................................... 7

1. Paracoccus denitrificans .................................................................................... 7

1. 2 Aerobní respirace ...................................................................................... 7 1. 2. 1 Terminální oxidasy ........................................................................ 8 1. 2. 1. 1 Cytochrom c oxidasa aa3 ............................................................ 9 1. 2. 1. 2 Cytochrom c oxidasa cbb3 ......................................................... 9 1. 2. 1. 3 Chinoloxidasa .......................................................................... 10

1. 3 Anaerobní dýchací řetězec ...................................................................... 11 1. 3. 1 Nitrátreduktasa ............................................................................. 11 1. 3. 2 Nitritreduktasa .............................................................................. 12 1. 3. 3 NO reduktasa ............................................................................... 13 1. 3. 4 N2O reduktasa .............................................................................. 13

1.4 Regulace aerobního dýchacího řetězce ................................................... 14 1. 4. 1 FnrP .............................................................................................. 14 1. 4. 2 NNR ............................................................................................. 16 1. 4. 3 NarR ............................................................................................. 18

2. Dvourozměrná elektroforéza ............................................................................ 19

2. 1 Příprava vzorku ....................................................................................... 19

2. 2 Isoelektrická fokusace ............................................................................. 20

2. 3 SDS-PAGE ............................................................................................. 21

2. 4 Detekce proteinů ..................................................................................... 23

2. 5 Analýza 2-D obrazu ................................................................................ 24

2. 6 Identifikace proteinů ............................................................................... 24

3. Kvantitativní real-time PCR ............................................................................. 26

3. 1 Izolace RNA ............................................................................................ 26

3. 2 Reverzní transkripce ............................................................................... 27

3. 3 PCR ......................................................................................................... 27

3. 4 Kvantitativní real-time PCR ................................................................... 28

II. CÍLE PRÁCE .......................................................................................................... 33

III. MATERIÁL A METODY ...................................................................................... 34

1. Bakteriální kmeny ............................................................................................ 34

2. Proteomová analýza ......................................................................................... 34

2. 1 Experiment na bázi 2-D elektroforézy .................................................... 34

4

2. 2 Obrazová a statistická analýza 2-D gelů ................................................. 34

2. 3 Příprava mikropreparativních gelů ......................................................... 35 2. 3. 1 Příprava vzorku ............................................................................ 35 2. 3. 2 Isoelektrická fokusace .................................................................. 35 2. 3. 3 Ekvilibrace ................................................................................... 36 2. 3. 4 SDS-PAGE .................................................................................. 36 2. 3. 5 Barvení gelů SYPRO Ruby ......................................................... 36 2. 3. 6 Analýza 2-D obrazu ..................................................................... 36 2. 3. 7 Vyřezání spotů a MS identifikace ................................................ 37

3. Měření hladin mRNA vybraných transkriptů pomocí qRT-PCR ..................... 37

3. 1 Izolace RNA ............................................................................................ 37

3. 2 Reverzní transkripce ............................................................................... 38

3. 3 Kvantitativní real-time PCR ................................................................... 39

IV. VÝSLEDKY............................................................................................................ 42

1. Proteomová analýza ......................................................................................... 42

1. 1 Proteiny ovlivněné růstovými podmínkami ............................................ 42

1. 2 Proteiny ovlivněné mutací v transkripčním regulátoru ........................... 46

1. 3 Srovnání exprese vybraných genů na úrovni proteinu a cDNA ............. 48

V. DISKUZE ................................................................................................................ 55

Pokrytí proteomu P. denitrificans ........................................................................... 55

Proteiny obsahující ve svém promotoru FNR-box .................................................. 55

Proteiny, jejichž geny se nacházejí v blízkosti genu pro transkripční faktor jiného typu .......................................................................... 57

Potvrzení operonu .................................................................................................... 59

„TonB-dependent receptors“ ................................................................................... 59

VI. SOUHRN ................................................................................................................. 61

VII. SUMMARY ............................................................................................................ 62

VIII. LITERATURA ........................................................................................................ 63

5

Seznam použitých zkratek a symbolů

2-D dvourozměrný

2-DE dvourozměrná elektroforéza

C7BzO 3-((4-heptyl)phenyl-3-

hydroxypropyl)dimethylammoniopropansulfonát

CBB Coomasie Brilliant Blue

CCD zařízení s vázanými náboji (charge-coupled device)

Cco cytochrom cbb3

Ccp cytochrom c peroxidasa

cDNA komplementární DNA (vzniklá reverzní transkripcí)

CID kolizí indukovaná disociace (collision-induced dissociation)

Ct počet cyklů nutný k vygenerování signálu (cycle threshold)

DIGE diferenční gelová elektroforéza

dNTP deoxynukleosidtrifosfát

DTE dithioerythiol

DTT dithiothreitol

ESI ionizace elektrosprejem

Fe-S klastr železosirný klastr

FNR rodina regulačních proteinů fumarát- a nitrátreduktasy

FnrP regulační protein fumarátreduktasy a nitrátreduktasy

HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie

CHAPS 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonát

IEF isoelektrická fokusace

IPG imobilizovaný pH gradient

lacZ gen pro β-galaktosidasu

m/z poměr hmotnosti a náboje

MALDI ionizace laserem za přítomnosti matrice (matrix assisted laser

desorption/ionization)

MGD molybdopteringuanosindifosfátový kofaktor

MS hmotnostní spektrometrie

6

Nap periplazmatická nitrátreduktasa

Nar respirační nitrátreduktasa

NarR regulační protein nitrátreduktasy

Nir nitritreduktasa

NNR regulační protein dusičnanu a NO

Nor NO reduktasa

Nos N2O reduktasa

PMF peptidové mapování (peptide mass fingerprinting)

Q ubichinon

Qox chinoloxidasa

qRT-PCR kvantitativní real-time PCR

SDS dodecylsulfát sodný

SDS-PAGE polyakrylamidová elektroforéza v přítomnosti dodecylsulfátu

sodného

TOF průletový analyzátor (time-of-flight)

Triton X-100 polyethylenglykol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenylether

wt divoký typ

7

I. TEORETICKÁ ČÁST

1. Paracoccus denitrificans

Paracoccus denitrificans je půdní mikroorganismus náležící mezi fakultativně

anaerobní striktně respirující bakterie s gram-negativním typem buněčné stěny.

P. denitrificans je schopen růst jak heterotrofně s celou řadou zdrojů organického

uhlíku a volné energie, tak autotrofně s využitím vodíku nebo tzv. C1 substrátů

(methylamin nebo methanol). Řetězec pro transport elektronů využívaný při aerobním

heterotrofním růstu obsahuje celou sadu proteinů s analogy v dýchacím řetězci

mitochondrií. P. denitrificans je schopen redukovat molekulární kyslík v širokém

rozmezí jeho koncentrace, což je umožněno jeho schopností syntetizovat tři terminální

oxidasy 1. Za nízké hladiny kyslíku v okolí přechází na anaerobní respiraci za využití

enzymů denitrifikační dráhy a oxidů dusíku jako alternativních akceptorů elektronů.

1. 2 Aerobní respirace

Bakterie P. denitrificans je striktně respirující organismus, což znamená, že nikdy

nefermentuje. Dýchací řetězec je velmi rozvětvený, což umožňuje růst za rozdílných

koncentrací kyslíku.

Při aerobní respiraci elektrony putují z NADH dehydrogenasy na tzv. Q-pool

(redoxní pár ubichinon/ubichinol), odkud mohou elektrony putovat jak na cytochrom bc1,

tak na chinoloxidasu ba3. Z cytochromu bc1 putují elektrony přes cytochrom c550 nebo

c520 na cytochrom c oxidasu typu aa3 nebo cbb3. Efektivita přeměny volné energie

v průběhu oxidativní fosforylace závisí na dráze přenosu elektronů.

Na produkci ATP je využíván H+-ATPasový komplex, který vyžaduje na

membráně protonový elektrochemický gradient, který vzniká translokací elektronů přes

membránu. Na každé dva elektrony, které jsou přeneseny na kyslík, jsou přes membránu

převedeny čtyři kladné náboje NADH dehydrogenasou a čtyři náboje cytochromem bc1.

Na straně cytochromu ba3 (chinoloxidasy) a cytochromu aa3 jsou přes membránu

převedeny dva náboje na dva elektrony činností protonové pumpy. Co se týče

cytochromu cbb3, stechiometrie není doposud jasná. V průběhu transportu elektronů přes

8

cytochrom ba3 je účinnost vzniku protonového gradientu nižší, než při dráze přes

cytochromu aa3, která zahrnuje komplex cytochromu bc1 2.

Obrázek č. 1: Schéma dýchacího řetězce P. denitrificans za aerobních podmínek 4

Distribuce elektronů různými drahami závisí jak na kinetických vlastnostech

komponent, které tvoří dýchací řetězec, tak na redoxním stavu Q-poolu. Cytochrom cbb3,

který má vysokou afinitu ke kyslíku, je exprimován převážně při nízkých koncentracích

kyslíku, zatímco cytochrom aa3, jež má ke kyslíku nižší afinitu, je exprimován za

atmosférické koncentrace kyslíku. Pokud vzroste stupeň redukce Q-poolu, stává se

aktivní dráha k cytochromu cbb3. Zdá se proto, že relativní úroveň exprese jednotlivých

drah může být mírně přizpůsobována vnitřním a vnějším podmínkám 2.

1. 2. 1 Terminální oxidasy

V dýchacím řetězci P. denitrificans se exprimují až 3 terminální oxidasy.

Cytochrom c oxidasy aa3 a cbb3 i chinoloxidasa náleží do skupiny Cu-hemových oxidas.

Tyto oxidasy obsahují binukleární centrum v podjednotce I, které se skládá

z vysokospinového hemu a CuB místa, kde dochází k redukci kyslíku. V podjednotce I se

nachází i druhá hemová složka. Všechny Cu-hemové oxidasy pumpují protony přes

membránu proti elektrochemickému gradientu a generují tak proton-motivní sílu.

9

Cu-hemové oxidasy se dělí na dvě skupiny dle jejich donoru elektronů

(jednoelektronový přenašeč cytochrom c a dvouelektronový přenašeč ubichinol).

Strukturně se tyto skupiny liší v podjednotce II. Cytochrom c oxidasy obsahují v této

podjednotce CuA místo u typu aa3, zatímco typ cbb3 obsahuje dvě další podjednotky

s hemem c. Chinoloxidasy postrádají v podjednotce II jakékoli kovové centrum. Zdá se,

že mechanismus redukce kyslíku je u obou typů enzymů shodný 3.

1. 2. 1. 1 Cytochrom c oxidasa aa3

Jedná se o nejlépe charakterizovanou terminální oxidasu, enzym se čtyřmi

podjednotkami.

Podjednotka I obsahuje jako prostetickou skupinu hemy a a a3, které společně

s CuB tvoří aktivní místo. Tato podjednotka je přepisována z genu ctaDII.

Geny kódující podjednotky II a III se nacházejí na operonu ctaCB-ORF1-ctaGE.

Podjednotka II (CtaC) obsahuje CuA centrum, které je vstupním místem elektronů na

holoenzym aa3, ačkoli se uvažuje i o alternativních elektronových drahách. Podjednotka

III (CtaE) je integrální membránový protein o neznámé funkci. Dva zbývající cta geny

v operonu kódují enzymy zapojené posttranslačních úprav podjednotky I.

Čtvrtá podjednotka je kódována genem ctaH. Delece tohoto genu nemá žádný

efekt na poskládání dalších tří podjednotek nebo jejich prostetických skupin, ani na jejich

aktivitu in vitro, tudíž tomuto polypeptidu nebyla přiřazena žádná role a uvažuje se, že je

to jen evoluční pozůstatek 4.

1. 2. 1. 2 Cytochrom c oxidasa cbb3

Oxidasa má tři podjednotky (CcoN, CcoO a CcoP), které jsou kódovány skupinou

genů ccoNOQP. CcoN je katalytická podjednotka I se dvěma hemy a iontem mědi. Zbylé

dvě podjednotky jsou membránově vázané cytochromy typu c s jedním, respektive

dvěma hemy.

Oxidasa cbb3 je schopna pumpovat protony. Analýzy schopnosti růstu divokých

kmenů a kmenů s dvojnásobnou mutací v oxidase ukázaly, že oxidasa cbb3 převádí

volnou energii se stejnou účinností jako oxidasa aa3, ačkoli aminokyselinové zbytky

zahrnuté do dráhy pumpovaných a chemických protonů, které jsou v cytochromu aa3 a

10

chinoloxidase bo3 konzervovány, nejsou na odpovídajících pozicích oxidasy cbb3

přítomny. Zdá se tudíž, že protonový kanál oxidasy cbb3 je složen z jiných zbytků, než u

ostatních typů 4.

1. 2. 1. 3 Chinoloxidasa

Chinoloxidasa je kódována 4 geny, které tvoří operon qoxABCD. Podjednotka I

(QoxB) nese jako redoxní aktivní skupiny hem b, hem a a jeden atom mědi. Hem a a

atom mědi představují binukleární centrum redukce kyslíku. Přítomnost pouze jediného

atomu mědi v enzymu odráží fakt, že chinoloxidasy nemají v homologu podjednotky II

binukleární CuA centrum. Hemové uspořádání ba3 je pro tuto oxidasu nezbytné pro

udržení její katalytické aktivity. Přesto se stále vyskytují rozporné studie o uspořádání

hemu chinoloxidasy založené na analýze hemu z membrán cytochrom aa3 mutantů.

Z blízké příbuznosti chinoloxidasy P. denitrificans a jejího homologu v E. coli lze

odvodit podobné prostorové uspořádání. Známkou podobnosti jejich prostorového

uspořádání je zachování jisté enzymatické aktivity (okolo 20 % jak v membránách, tak

v izolovaném komplexu v porovnání s nativní chinoloxidasou P. denitrificans) po

zaměnění genu qoxA kódujícího podjednotku II P. denitrificans za ekvivalentní gen cyoA

z chinoloxidasy bo3 E. coli. Dosud není jasné, zda chimérické chinoloxidase zůstává

schopnost translokovat přes membránu jeden proton na elektron přenesený na kyslík, jak

je tomu u původní chinoloxidasy.

Oblast qox promotoru obsahuje FNR-box. Přítomnost vazebného místa pro

transkripční regulátor z rodiny FNR signalizuje regulaci transkripce v závislosti na

hladině kyslíku nebo na změnách redoxního potenciálu, ačkoli nebyl pozorován žádný

významný pokles v expresi se syntetickým promotorem/reportérovým genem, když byly

měřeny hladiny reportéru za aerobních a anaerobních podmínek růstu. Stejná studie

překvapivě ukázala pozitivní vliv nitrátu a nitritu (přidaného do růstového média) na

expresi chinoloxidasy za aerobních podmínek 4.

11

1. 3 Anaerobní dýchací řetězec

Striktně respirující P. denitrificans využívá za anaerobních podmínek jako

akceptorů elektronů oxidy dusíku. Proces, při němž může být dusičnan (NO3-) redukován

až na molekulární dusík, se nazývá denitrifikace a je zajišťován čtyřmi enzymy.

Obrázek č. 2: Schéma denitrifikační dráhy P. denitrificans 4

Denitrifikační geny kódující proteiny pro respiraci dusičnanu (nar), dusitanu (nir),

oxidu dusnatého (nor) a oxidu dusného (nos) jsou uspořádány v klastrech. Geny nir a nor

jsou spolu úzce spojeny, obsahují 4 až 5 rozeznatelných transkripčních jednotek a nesou

strukturní informace o obou reduktasách, o zpracování kovu, syntéze kofaktorů, zrání

proteinu a regulaci. Předpokládaným operonem je genová sekvence norCBQDEF 5.

1. 3. 1 Nitrátreduktasa

Úplný denitrifikační proces vedoucí k N2 začíná komplexem, který redukuje

dusičnan. P. denitrificans má tři typy nitrátreduktas: rozpustnou asimilační a 2

disimilační - respirační (membránově vázanou) a periplazmatickou. Respirační

nitrátreduktasa je kódována operonem narKGHJI. narG kóduje velkou (α) podjednotku o

velikosti 127 kDa, která obsahuje Mo ve formě molybdopteringuanosindifosfátového

12

kofaktoru (MGD). Tento kofaktor je zároveň aktivním místem reduktasy. Malá (β)

podjednotka o velikosti 61 kDa je kódována genem narH a jako prostetickou skupinu

obsahuje železosirný klastr. Gen narI kóduje třetí (γ) podjednotku, která ukotvuje

komplex podjednotek α a β na cytoplazmatické straně membrány 5. Produkt genu narK je

nezbytný pro transport dusíkatých oxoaniontů přes cytoplazmatickou membránu 6.

Periplazmatická nitrátreduktasa je molybdopterinový protein obsahující hemové i

nehemové Fe. Skládá se ze dvou podjednotek (93 a 16 kDa), které jsou kódovány geny

napAB z genového klastru napEDABC. Jako kofaktory se zde uplatňují opět Mo a Fe-S

klastr (NapA podjednotka) a v NapB podjednotce byly nalezeny dvě vazebná místa pro

hem c. Možná funkce NapC spočívá v transportu elektronů mezi chinolem a

periplazmatickou nitrátreduktasou. Fuknce NapD a NapE nejsou známy.

Zatímco membránově vázaná nitrátreduktasa je exprimována pouze za

anaerobních podmínek, periplazmatická nitrátreduktasa je aktivní i v přítomnosti kyslíku,

je tudíž exprimována konstitutivně. Fyziologická funkce periplazmatické nitrátreduktasy

spočívá pravděpodobně v rozptýlení nadbytku redukčních ekvivalentů. Přitom může také

působit při přechodu z aerobních do anaerobních podmínek, jelikož O2 pravděpodobně

inhibuje transport dusičnanu 5.

1. 3. 2 Nitritreduktasa

Redukci dusitanu na oxid dusnatý lze považovat za klíčový krok pro denitrifikaci,

protože je při něm převáděna iontová forma dusíku na formu neiontovou 4.

K tomuto kroku jsou denitrifikačními bakteriemi využívány dva, co se týče

struktury a prostetické skupiny, naprosto odlišné enzymy. Menšinou kmenů je využíván

enzym obsahující měď. P. denitrificans náleží mezi druhou skupinu využívající

cytochrom cd1. Ten je kódován genem nirS, který je součástí klastru, jenž současně

obsahuje i geny pro biosyntézu hemu d1. Klastry nir jsou postupně spojeny s geny

kódujícími proteiny pro redukci NO.

Enzym je homodimer s podjednotkami velkými 61,2 kDa. Prostetickými

skupinami jsou hem c a hem d1, přičemž oba se nacházejí v každé z podjednotek, takže

cytochrom cd1 představuje tetrahemový protein 5.

13

Donory elektronů pro nitritreduktasu jsou cytochrom c550 a měď obsahující

pseudoazurin. Existence dvou donorů se dvěma odlišnými kovovými centry

pravděpodobně dovoluje organismu udržovat transport elektronů při proměnlivých

dostupnostech těchto mikroelementů 4.

1. 3. 3 NO reduktasa

Mezi významné chemické vlastnosti NO patří přítomnost nepárového elektronu,

reaktivita s O2 a O2▪ -, relativně dlouhý biologický poločas života a hydrofobicita, která

usnadňuje mezimembránovou a transmembránovou difúzi. V nadbytku je však NO

toxický jak pro bakterie, tak i pro houby, mikrobiální parazity, nádorové buňky a viry.

Ačkoli je metabolismus NO denitrifikujícím organismům vlastní, je tato látka toxická i

pro ně. Toxicita je způsobena především reaktivitou s proteiny obsahující přechodné

kovy a kyslík a jeho schopností tvořit adukty s aminy a thioly. Hlavním místem zásahu

do buněčných pochodů jsou hemové i nehemové Fe a měď obsahující enzymy.

NO reduktasa má dvě podjednotky (17,5 a 38 kDa), které jsou kódovány geny

norC a norB. Větší podjednotka NorB je vysoce hydrofobní cytochrom b, který obsahuje

2 hemy b a nehemové Fe, které ale není součástí Fe-S klastru. Menší podjednotka NorC

je cyrochrom c 5. Geny norCB jsou transkribovány společně se 4 dalšími geny

(norQDEF), které jsou nezbytné pro zrání NO reduktasy. Jejich konkrétní funkce ale

zatím nejsou známy.

Menší podjednotka je kotvena k membráně prostřednictvím jednoduchého

α-helixu a doména hemu c vystupuje jako rozpustný periplazmatický polypeptid. Větší

podjednotka je pomocí 12 transmembránových α-helixů ukotvena v membráně. I přes

podobnost s terminálními oxidasami, které působí jako protonové pumpy, NO reduktasa

se na vytváření protonového gradientu sama nepodílí 4.

1. 3. 4 N2O reduktasa

Konverze N2O na N2 je posledním krokem úplné denitrifikační dráhy a

představuje respiraci ve své podstatě. Do procesu redukce N2O je zapojen i komplex

cytochromu bc1. Transfer elektronů tímto cytochromem je doprovázen transportem

14

protonů přes membránu. Redukce N2O tudíž uchovává energii, i když N2O reduktasa je

rozpustný enzym.

N2O reduktasa je kódována genem nosZ a jedná se o homodimer s molekulovou

hmotností 132 kDa. Každá podjednotka obsahuje 4 atomy Cu, které tvoří 2 binukleární

centra CuA a CuZ. CuA je místem vstupu elektronů z přirozeného donoru N2O reduktasy a

CuZ je místem pro vazbu substrátu (N2O) 5.

1.4 Regulace aerobního dýchacího řetězce

Hlavními vnějšími faktory, které indukují syntézu denitrifikační dráhy, jsou nízký

tlak kyslíku a přítomnost sloučeniny dusíku. Regulační odpovědi vyvolávají i ionty kovů.

Fe, Cu a Mo mohou přímo nebo nepřímo ovlivňovat biosyntézu denitrifikačních

komponent, které závisí na těchto kovech 5. Regulace genů při přechodu z aerobního

růstu k denitrifikaci je regulována také na úrovni transkripce, a sice třemi regulačními

proteiny z rodiny FNR (regulační proteiny fumarát- a nitrátreduktasy). Jsou jimi FnrP,

NNR a NarR. Ty se po aktivaci vážou na specifické sekvence (FNR-boxy) v cílových

promotorech. Jakmile dojde k fyzickému kontaktu mezi transkripčním faktorem a σ

faktorem RNA polymerasy, rozběhne se transkripce. Specifita těchto regulátorů je určena

částečně povahou FNR-boxu a částečně sekvencí po směru transkripce za FNR-boxem 7.

1. 4. 1 FnrP

Nejvýznamnějším proteinem, který je zapojen do regulace exprese terminálních

oxidas v P. denitrificans, je regulátor transkripce FnrP. Tento protein, stejně jako jeho

analog u E. coli FNR, má čtyři důležité funkční domény:

1. N-koncová doména obsahuje tři cysteinové zbytky. Spolu se čtvrtým cysteinovým

zbytkem umístěným v centrální doméně můžou vázat klastr [4Fe-4S]

2. Sekvence zbytků v centrální doméně tvoří smyčkovou strukturu, která je v kontaktu

s RNA polymerasou.

3. FnrP obsahuje α helikální doménu obklopující Asp154, který je pravděpodobně

zapojen do procesu dimerizace.

15

4. C-konec obsahuje DNA vazebný motiv helix-otáčka-helix, který rozpoznává cílové

místo DNA s konzervativní sekvencí TTGAT-N4-ATCAA (FNR-box).

Anaerobní aktivace transkripce pomocí FnrP závisí na přítomnosti klastru [4Fe-

4S]. Při vystavení kyslíku je tento klastr rychle oxidativně destruován, proto se dá

očekávat vzrůstající aktivace FNR při klesající koncentraci kyslíku. V aktivní formě FNR

dimerizuje a silně se váže na sekvenci FNR-boxu v promotorových oblastech cílových

genů 4.

Obrázek č. 3: Model regulace aktivity FNR 8. „Neaktivní“ označuje formu FNR, která převládá

za aerobních podmínek a vykazuje sníženou aktivitu vazby na DNA. „Aktivní“ označuje formu, která

vykazuje zvýšenou aktivitu vazby na DNA a převládá za anaerobních podmínek.

FNR-box, cílové místo FnrP o palindromatické sekvenci TTGAT-N4-ATCAA, se

nachází preferenčně -41,5 nukleotidů od místa počátku transkripce pozitivně

regulovaného promotoru. Vzdálenost může být i větší, ale vyžaduje topologickou změnu

v uspořádání C-koncové domény α podjednotky RNA-polymerasy a FNR. V závislosti na

umístění tohoto boxu může FNR vystupovat jako aktivátor i jako represor transkripce 5.

FNR-box o sekvenci 5’-TTGAC-N4-ATCAA-3’, je mimo jiné přítomný

v promotoru genového klastru qoxABC (chinoloxidasa), ccoNOQP (cytochrom cbb3) a

ccp (cytochrom c peroxidasa). V qox promotoru leží FNR-box ve vazebném místě pro

RNA-polymerasu, což vysvětluje pozorovanou represi transkripce qox pomocí FnrP. Ve

skutečnosti tedy aktivní FnrP tlumí qox promotor a stimuluje promotory cco a ccp, což

vede ke snížení exprese cytochromu ba3 a ke zvýšení úrovně exprese cytochromu cbb3 a

cytochrom c peroxidasy. FNR-box se nachází také v promotoru samotného genu fnr, což

znamená, že jeho exprese je autoregulována, stejně jako v případě fnr u E. coli.

16

FnrP je blízce podobný FNR E. coli v tom, že obsahuje shodné cysteinové

uspořádání pro vazbu klastru [4Fe-4S]. U E. coli je nejdůležitějším faktorem pro

modulaci aktivity FNR koncentrace molekulárního kyslíku. Experimenty in vitro ukazují,

že klastr [4Fe-4S] je rychle ničen molekulárním kyslíkem, což vede k inaktivaci FNR.

FnrP u P. denitrificans je ale stále schopný aktivace transkripce jeho cílových genů i za

podmínek aerobního růstu. Zdá se, že za takových podmínek aktivita FnrP vzrůstá se

vzrůstajícím stupněm redukce komponent respiračního řetězce. Tato pozorování

naznačují, že klastr [4Fe-4S] FnrP vyžaduje redukci pro svou plnou aktivaci a že je méně

citlivý ke koncentraci molekulárního kyslíku než FNR u E. coli 4.

1. 4. 2 NNR

Dalším členem rodiny FNR transkripčních regulátorů je NNR, který specificky

aktivuje transkripci genových klastrů nir a nor 9 jako odpověď na respiraci dusičnanu 10.

Redukce dusitanu probíhá pouze tehdy, pokud je zajištěna další redukce NO vzájemně

závislou expresí a regulací aktivit nitrit- a NO reduktasy. NO je produkován jako signální

molekula pomocí aktivity nitritreduktasy a je pravděpodobně induktorem své vlastní

reduktasy ]. NNR je tedy jedním z proteinů, který řídí expresi NO produkujících a NO

spotřebovávajících enzymů 10.

Signálem pro expresi zprostředkovanou NNR v průběhu denitrifikace je NO 10 a

NNR je také sensorem pro O2, jelikož aktivita NNR in vivo je inhibována signálem

aerobního metabolismu 11. Na regulaci transkripce samotného nnr se nepodílí NNR ani

FnrP 10. Studie na objasnění mechanismu aktivace NO ukázaly, že odstranění aktivačního

signálu nevede k okamžité a rychlé inaktivaci NNR. Dále bylo prokázáno, že NNR je

inaktivován v důsledku přechodu na aerobní podmínky růstu, což může být vysvětleno

přímou inaktivací NNR kyslíkem nebo rychlým odstraněním aktivačního signálu

v přítomnosti kyslíku 11.

NNR obsahuje až na jednu všechny součásti homologů FNR: neobsahuje [4Fe-

4S] klastr 9. Gen nnr se nachází blízko místa, které obklopuje genové klastry nir a nor.

17

Obrázek č. 4: Genový klastr denitrifikačních genů P. denitrificans 5

Mutace v genu nnr má za následek neschopnost syntézy nitritreduktasy a exprese

NO reduktasy je snížena asi na čtvrtinu oproti nemutovanému organismu. Exprese

dalších genových klastrů (ccoNOQP, qoxABCD, narGHJI a ccp) nebyla touto mutací

ovlivněna. DNA vazebná místa pro NNR, která jsou prakticky identická s vazebnými

místy pro FnrP, byla nalezena u obou typů genových klastrů 4. V promotoru genu nirS se

však vazebná sekvence poměrně významně odlišuje (TTAACaaagGTCAA), což může

vysvětlovat to, proč je tento box specificky rozeznáván právě NNR. Naopak ale vazebné

sekvence pro NNR u norCB promotoru a pro FnrP u ccp a narK promotoru jsou velmi

podobné, což může znamenat, že existuje ještě nějaký další mechanismus zodpovědný za

specifitu NNR a FnrP k jejich promotorům 7. Navzdory vysokému stupni shodnosti však

nebyly FnrP a NNR schopny převzít navzájem své role při regulaci genů v průběhu

denitrifikace. Pravděpodobně proto, že exprese jednotlivých cílových genů vyžaduje další

transkripční faktory, které jsou určeny buď pro NNR nebo FnrP.

Související studie řady homologů FNR z různých bakterií vedly k návrhu na

rozdělení této skupiny regulátorů do tří, více či méně samostatných, kategorií, kdy každá

zahrnuje proteiny se specifickými a neměnnými aminokyselinovými zbytky uvnitř jejich

funkční skupiny. Taková specifita na výsledném kontaktním místě RNA polymerasy

může tudíž odrážet specificitu proteinů z každé kategorie pro jednotlivý σ faktor. Sigma

faktory jsou proteiny, které se reverzibilně vážou na katalyticky aktivní jádro RNA

polymerasy a jsou nutné pro iniciaci transkripce. Jelikož NNR a FnrP spadají do dvou

odlišných kategorií, může to znamenat, že dané transkripční faktory navrhované pro

NNR a FnrP jsou specifické sigma faktory 4.

18

1. 4. 3 NarR

Enzym, který katalyzuje první krok denitrifikace – redukci dusičnanu –

nitrátreduktasa, je kódován genovým klastrem narKGHJI. V protisměru od směru

transkripce se nachází gen narR, který kóduje třetí transkripční regulátor z rodiny FNR, a

sice NarR.

Gen narR je transkribován rozdílně od ostatních nar genů. Mezi dvěmi protein

kódujícími oblastmi narR a narK je rozpětí o velikosti 251 bází. Zde se nacházejí dvě

konsensuální sekvence FNR-boxů, které jsou umístěny dostatečně daleko od sebe, aby

umožňovaly vazbu FnrP, NNR a/nebo NarR, a tím případnou regulaci exprese narR a

narK.

Obrázek č. 5: Oblast narR a klastru narKGHJI 6. Oblast mezi narR a narK je zvýrazněna, dva

FNR-boxy jsou v rámečku.

NarR je nutný pro maximální expresi genů membránově vázané nitrátreduktasy

(NAR) a narK, ale nemá žádnou další regulační funkci spojenou s denitrifikací. Do

regulace NAR je pravděpodobně zapojen také FnrP, jelikož mutant fnrP- vykazuje asi jen

30 % aktivity NAR divokého kmene. Pro aktivaci genové exprese za anaerobních

podmínek vyžaduje NarR přítomnost dusičnanu a/nebo dusitanu.

Promotor narR je negativně autoregulován a je reprimován za anaerobních

podmínek, pravděpodobně pomocí FnrP. Indukce exprese strukturních genů

nitrátreduktasy pomocí NarR tedy není jen následkem úrovně exprese samotného NarR,

ale existuje nějaký biochemický signál, na který NarR odpovídá.

19

Na rozdíl od FnrP N-koncová oblast proteinu NarR neobsahuje cysteinové zbytky,

jež jsou nezbytné pro vytvoření na kyslík citlivých železosirných klastrů. NarR také

v aminokyselinové sekvenci postrádá glycin (u FnrP je to G85) klíčový pro interakci

FNR regulátorů s podjednotkou σ70 RNA polymerasy, což naznačuje, že transkripční

aktivace pomocí NarR je nezávislá na tomto specifickém kontaktu protein-protein 6.

2. Dvourozměrná elektroforéza

2-D elektroforéza je metoda, která zahrnuje isoelektrickou fokusaci (IEF)

v prvním rozměru a polyakrylamidovou elektroforézu v přítomnosti dodecylsulfátu

sodného (SDS-PAGE) v druhém rozměru. Umožňuje tak separaci komplexních směsí

proteinů dle jejich isoelektrického bodu (pI), molekulové hmotnosti (Mr), rozpustnosti a

relativního výskytu. V závislosti na velikosti gelu a použitého pH gradientu je možno

současně rozlišit až 5000 proteinů. Poskytuje také mapu intaktních proteinů, která odráží

změny v úrovni exprese proteinů, isoformách a posttranslačních modifikacích.

2. 1 Příprava vzorku

K rozrušení buněk může být použita lyze osmotická, enzymatická nebo za pomoci

detergentu, dále sonikace, French press, cyklické zmrazování a rozmrazování,

homogenizace se skleněnými kuličkami, rozemletí s (nebo bez) dusíkem nebo

homogenizátor s rotujícím ostřím. Tyto metody mohou být použity jak samostatně, tak

v kombinaci. Během přípravy vzorku je třeba odstranit nebo inaktivovat interferující

sloučeniny, jako například proteolytické enzymy, soli, lipidy, nukleové kyseliny,

polysacharidy nebo vysoce abundantní proteiny.

Pro získání vysokého rozlišení je třeba proteiny ve vzorku denaturovat, redukovat

a solubilizovat, aby se zajistilo kompletní rozrušení molekulárních interakcí a aby tím

pádem v každém spotu byl obsažen jednotlivý polypeptid. Solubilizace vzorku se provádí

obvykle v pufru, který obsahuje chaotropní sloučeniny (močovina a/nebo thiomočovina),

neionogenní a/nebo zwitteriontové detergenty (C7BzO, Triton X-100 nebo CHAPS),

redukční činidla (DTT, DTE) a dle typu vzorku i inhibitory proteas.

20

Chaotropy způsobují především přerušení vodíkových vazeb, což vede k rozbalení

proteinu a jeho denaturaci. Určitý problém spojený s použitím močoviny jako chaotropu

spočívá v tom, že ve vodných roztocích existuje v rovnováze s (iso)kyanátem amonným,

který může reagovat s α-amino skupinami N-konce a ε-amino skupinami lysinových

zbytků, čímž dochází k blokování N-konce a zavádění nábojové heterogenity. Aby se

zabránilo karbamylační reakci, je třeba nezahřívat vzorek nad 37 °C; někdy se přidává

k roztoku močoviny karbonátdehydratasa, která kyanáty odstraňuje.

Detergenty slouží k zabránění hydrofobních interakcí mezi hydrofobními

doménami proteinů, čímž se zamezí ztrátám proteinů kvůli jejich agregaci a precipitaci.

Redukce a zabránění re-oxidace disulfidických vazeb je také klíčovým krokem při

přípravě vzorku. Redukční činidla jsou nezbytná pro odstranění intra- a

intermolekulárních disulfidických vazeb, aby se dosáhlo kompletního rozbalení proteinu.

Mezi nejčastěji používaná činidla patří DTT nebo DTE 12.

2. 2 Isoelektrická fokusace

Proteiny jsou amfoterní molekuly obsahující kyselé a bazické skupiny, které jsou

protonovány a deprotonovány v závislosti na okolním pH. Po aplikaci elektrického pole

začnou proteiny migrovat k opačně nabité elektrodě, než je jejich výsledný náboj. V bodě

svého pI, kdy protein nemá žádný výsledný náboj, přestane migrovat 13. Této vlastnosti

proteinů se využívá v prvním rozměru separace – isoelektrické fokusaci.

V dnešní době se užívá imobilizovaných pH gradientů (IPG) na tzv. stripech

(proužcích). Ty jsou založeny na použití bifunkčních reagentů, sérii 10 chemicky přesně

definovaných akrylamidových derivátů s obecnou strukturou CH2=CH-CO-NH-R, kde R

obsahuje jak karboxylovou, tak amidovou skupinu. Tyto skupiny tvoří sérii pufrů

s různou hodnotou pK mezi 1 a 13. Jelikož je reaktivní konec kopolymerován

s akrylamidovou matrix, vytvoří se extrémně stabilní pH gradienty.

Existují dva způsoby nanášení vzorku na IPG stripy. V prvním případě je strip

rehydratován pufrem obsahujícím rozpuštěný vzorek (tzv. in-gel rehydration), ve druhém

případě v rehydratačním pufru vzorek rozpuštěn není a po rehydrataci stripu tak následuje

aplikace vzorku (tzv. cup-loading) 12. Existuje ještě lehká modifikace prvního způsobu

21

zvaná aktivní nanášení vzorku, kdy se v průběhu dehydratace stripu aplikuje malé napětí

(typicky 50 V). Tento postup více usnadňuje vstup proteinů s vysokou Mr 13.

Nastavení samotné fokusace je obvykle limitováno proudem 50 µA na strip, aby

nedošlo k tvorbě Joulova tepla, protože na počátku je kvůli přítomnosti solí vysoká

vodivost 12. Doba, po kterou byl vzorek vystaven napětí, se udává ve volthodinách (Vh),

což vyjadřuje velikost napětí ve voltech aplikovaného po určitý čas. Takto (rozdílnou

expozicí ve Vh) se upravují podmínky pro rozdílné vodivosti na různých stripech

způsobené jiným proteinovým složením a množství solí 14. V průběhu expozice ionty solí

migrují k elektrodám, což vede ke snížení vodivosti, a lze tak aplikovat vyšší napětí. Je

třeba také vhodně zvolit dobu fokusace. Příliš krátká doba vede k horizontálním pruhům

na výsledném gelu a je třeba se také vyhnout přehnaně dlouhým časům, což by mohlo

vést k deformovaným spotům. Velký vliv na výsledný 2-DE gel má i teplota při IEF,

jelikož pozice spotů se mohou lišit na ose pH při různých teplotách. Pro

reprodukovatelnost je tedy nezbytně nutné provádět separace za kontrolované teploty,

optimální se jeví teplota 20 °C.

Před separací ve druhém rozměru je třeba IPG stripy ekvilibrovat, aby došlo

k plné interakci mezi separovanými proteiny a SDS. Ekvilibrace probíhá ve dvou krocích.

V prvním kroku jsou pomocí DTT redukovány zafokusované proteiny, ekvilibrační

roztok také mimo jiné obsahuje 2-10% (w/v) SDS, močovinu a glycerol. Ve druhém

kroku ekvilibrační roztok obsahuje místo DTT jodoacetamid, který alkyluje

sulfohydrylové skupiny a zabraňuje jejich reoxidaci. Další funkce jodoacetamidu spočívá

v tom, že alkyluje jakékoli volné DTT, protože jinak by docházelo k jeho migraci při

SDS-PAGE a vzniku pruhů na gelu 12.

2. 3 SDS-PAGE

Druhý rozměr 2-DE separuje proteiny na základě jejich molekulových hmotností

v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS. Ten je v tomto kroku inkorporován do

komplexů s proteiny v poměru přibližně 1,4 g SDS/g proteinu. SDS tak „zamaskuje“

náboj samotných proteinů a tyto anionické komplexy vytvářejí víceméně konstantní

celkový náboj na jednotku hmotnosti. Tudíž elektroforetická mobilita takto upravených

22

proteinů závisí na molekulové hmotnosti proteinu. Při určité koncentraci polyakrylamidu

existuje přibližně lineární vztah mezi logaritmem molekulární hmotnosti a relativní

migrační vzdáleností SDS-polypeptidových komplexů.

Standardní pufrovací systém pro druhý rozměr SDS-PAGE je založen na systému

Tris-chlorid/Tris-gylcin 25. Při 2-DE není nutno, na rozdíl od klasické procedury, použít

koncentrační gel, jelikož proteiny už jsou předseparovány pomocí IEF a migrují

z jednoho gelu do druhého a nikoli z kapalné fáze do gelu. Pro speciální účely se

používají i jiné pufrovací systémy, například borátové pufry pro separaci vysoce

glykosylovaných proteinů nebo tricinový systém pro separaci malých (< 15 kDa)

proteinů.

Velikost gelu pochopitelně ovlivňuje konečné rozlišení proteinů. Obvyklé 2-DE

gely jsou 1-1,5 mm tlusté o rozměrech 20x20 cm a jsou schopny rozlišit až 1500

proteinů. Distribuce spotů na ose y gelu závisí na délce, hustotě a pH gelu v druhém

rozměru. Vhodná koncentrace akrylamidu je kolem12 %. Nižší koncentrace zhoršují

rozlišení a vyšší (15 %) ztěžují extrakci proteinů pro další studium. Pro zvýšení

koncentrace proteinů pro následnou charakterizaci (hmotnostní spektrometrie, jiná

analytická metoda) slouží tzv. preparativní gely. V prvním rozměru je aplikováno větší

množství vzorku, čímž se získá proteinová mapa obsahující větší množství proteinů 12.

Obrázek č. 6: Typický 2-D gel proteinů barvených stříbrem 13

23

2. 4 Detekce proteinů

Po 2-DE je třeba separované proteiny vizualizovat, ať už univerzálními nebo

specifickými barvicími metodami. Mezi nejdůležitější vlastností barvicích metod patří

vysoká citlivost (nízký detekční limit), vysoký lineární dynamický rozsah,

reprodukovatelnost a kompatibilita s následnými metodami identifikace proteinů, např.

MS. Žádná z barvicích metod ovšem nevyhovuje současně všem požadavkům

proteomové analýzy. V praxi se nejčastěji uplatňují metody Coomasie Brilliant Blue

(CBB), barvení stříbrem a fluorescenční barvení.

Metoda CBB se stala velmi rozšířenou díky nízké ceně, jednoduchosti a

kompatibilitě s většinou následných analýz a charakterizací proteinů. Avšak základní

limitací této metody je nedostatečná citlivost, která neumožňuje detekci proteinů

s nízkým zastoupením (limit detekce je 200-500 ng proteinu na spot). Tudíž obvykle

nelze vizualizovat více než několik set spotů, i když na počátku bylo na gel vloženo

miligramové množství. Barvení pomocí koloidní CBB je sice citlivější, ale stále

nedosahuje úrovně ostatních barvicích proteomických metod.

Barvení stříbrem je z těchto metod nejcitlivější, limit detekce je kolem 0,5 ng na

spot 14. Kvůli subjektivnímu určení konce barvení je mnohém méně reprodukovatelná než

CBB, což dělá tuto metodu méně vhodnou pro kvantitativní analýzu. Další nevýhodou je

pracnost a složitost a metoda také neumožňuje následnou analýzu pomocí MS.

Co se týče citlivosti a lineárního dynamického rozsahu, nejlepší výsledky se

dosahují u metod využívajících fluorescenční látky nebo značení proteinů radioizotopy.

Pro fluorescenční detekci proteinů existují dva hlavní přístupy – prvním z nich je

kovalentní derivatizace proteinů fluorofory před IEF. Tato metoda se nazývá DIGE

(difference gel electrophoresis) a nejznámějšími typy fluorescenčních barev jsou barvy

založené na cyaninu (Cy2, Cy3, Cy5). Druhým přístupem je barvení proteinů interkalací

fluoroforů do micel tvořených SDS po elektroforéze. Hlavním zástupcem této skupiny je

rutheniová barva SYPRO Ruby – barvení trvá jen pár hodin a probíhá jednokrokově,

čehož se využívá v automatizovaných systémech. Detekční limit je asi 1-2 ng na spot.

Výhodou fluorescenčního barvení je také kompatibilita s následnou identifikací proteinů

pomocí MS 12.

24

2. 5 Analýza 2-D obrazu

Jedním z klíčových úkolů proteomiky je identifikace rozdílné exprese mezi

kontrolním a pokusným vzorkem. K tomuto účelu je třeba počítačová analýza obrazu.

Obrázek č. 7: Schematické znázornění 2-D gelů znázorňujících různá stadia

proteomu 13. Aktivované a reprimované geny (kvantitaivní a kvalitativní změny) jsou znázorněny

šipkami.

K získání 2-D obrazu gelu existuje mnoho zařízení, jako například laserové

densitometry, CCD kamery, fluorescenční a fosforové skenery. Obdržené obrazy jsou

poté podrobeny počítačové analýze. K vyhodnocení obrazu využívá software obvykle

následující postup: a) předzpracování obrazu – oříznutí a odečtení pozadí, b) detekce a

kvantifikace spotů, c) „matching“ – automatické přiřazení zbývajících spotů, d)

normalizace – před srovnáním intenzit spotů na různých gelech jsou tyto intenzity

normalizovány (např. na celkovou intenzitu všech spotů v gelu nebo metodou tzv. local

regression model), tento krok koriguje případné chyby při pipetování vzorku a efektivitu

barvení, e) identifikace rozdílně exprimovaných spotů, f) zpracování a interpretace dat.

2. 6 Identifikace proteinů

Hlavní metodou pro identifikaci proteinů se stala hmotnostní spektrometrie,

jelikož je velmi citlivá, vyžaduje malé množství vzorku a má kapacitu na zpracování

25

velkého množství vzorků. Pro většinu proteomických studií jsou využívány dva typy MS,

a sice MALDI-TOF a ESI –MS/MS.

1. MALDI-TOF: Analyzovaný vzorek se smíchá s matricí, která obvykle obsahuje

malé molekuly s vhodným chromoforem, který je schopen absorbovat světlo specifické

vlnové délky. Směs matrice a vzorku se odpaří a vznikne tak krystalová mřížka, ve které

je peptid ze vzorku integrován. Poté je destička se vzorkem ostřelována laserem a

dochází k ionizaci a uvolnění vzorku z matrice do plynné fáze. Každá molekula peptidu

se obvykle ionizuje pomocí jednoho protonu z matrix, a tudíž výsledné peptidové ionty

nesou jeden pozitivní náboj. Takto vytvořené ionty poté směřují do TOF analyzátoru. Ten

měří čas, za který ionty dorazí z jednoho konce analyzátoru na druhý, kde dopadají na

detektor. Rychlost, kterou ionty letí analyzátorem, je přímo úměrná hodnotě jejich m/z.

2. ESI-MS/MS: Zkratka znamená tandemová MS s ionizací elektrosprejem.

Tandemová proto, že analyzátory jsou schopny vykonávat dvoustupňovou analýzu iontů.

Analyzovaný vzorek se v tomto případě nachází ve vodném roztoku, takže peptidy se

vyskytují ve formě iontů. Nejčastěji se ESI provádí při kyselém pH, kdy peptidy nesou

kladný náboj, což usnadňuje jejich fragmentaci. Vzorek se dostává do zdroje proudem

(obvykle z HPLC) a prochází jehlou, která je pod vysokým napětím. Jak proud opouští

jehlu, rozstříkne se na malé kapičky, které obsahují jak peptidové ionty, tak komponenty

mobilní fáze z HPLC, které musí být odstraněny. Vzorek pak putuje do analyzátoru.

Nejčastěji se využívá tří druhů, a sice trojnásobně kvadrupólový, iontová past a

kvadrupólový TOF. I když se tyto analyzátory liší v tom, jak pracují, vykonávají všechny

stejný typ analýzy. Ze směsi peptidových iontů vygenerovaných ESI zdrojem se vybírají

jednotlivé třídy m/z. Tento ion je poté podroben kolizí indukované disociaci (tzv.

collision-induced dissociation, CID), která nafragmentuje peptid na fragmentované ionty.

Ty jsou pak analyzovány na základě jejich m/z. Informace obsažené v tomto MS/MS

spektru umožňují odvodit peptidovou sekvenci.

Primárním nástrojem pro identifikaci proteinů je metoda peptidového mapování

(peptide mass fingerprinting, PMF), která je založena na poznatku, že sady hmotností

peptidů získaných MS analýzou proteinových štěpů (obvykle trypsinem) poskytují

charakteristický „otisk“ tohoto proteinu. Protein je pak identifikován srovnáním

experimentálního „otisku“ a teoretických peptidových hmotností generovaných in silico

26

za použití proteinových a nukleotidových databází (SWISS-PROT, NCBInr, OWL).

Tento přístup je velmi efektivní při identifikaci proteinů z biologických druhů s malým,

kompletně osekvenovaným a dobře anotovaným genomem, ale není tak spolehlivý pro

genomy, které ještě nejsou zcela sekvenovány. Dalším problémem je identifikace

proteinů, jež jsou významně posttranslačně modifikovány, jelikož peptidy generované

z těchto proteinů nemusí odpovídat nemodifikovaným proteinům v databázi. Třetí

problém představuje přítomnost více než jednoho proteinu ve spotu. V takovýchto

případech je třeba získat aminokyselinovou sekvenci 15.

3. Kvantitativní real-time PCR

3. 1 Izolace RNA

K izolaci RNA se mimo jiné používá kit RNeasy Mini

(Qiagen). Technologie, která je v kitu využita, kombinuje

selektivní vlastnosti vazby mRNA na křemennou membránku a

mikrocentrifugace. Speciální pufr s vysokým obsahem solí

umožňuje vazbu až 100 µg RNA delší než 200 bází na membránu.

Vzorek je nejprve lyzován a homogenizován v přítomnosti vysoce

denaturujícího pufru obsahujícího guanidinthiokyanát, který

okamžitě inaktivuje RNasy, aby byla zajištěna purifikace intaktní

RNA. Pro zajištění správných vazebných podmínek se přidává

ethanol. Vzorek je poté umístěn na kolonku, kde se váže celková

RNA a kontaminanty jsou efektivně odstraněny (vymyty). Eluce

RNA se provádí 30-100 µl vody.

Obrázek č. 8: Schéma izolace RNA

27

3. 2 Reverzní transkripce

Reverzní transkripce je proces katalyzovaný enzymem RNA-dependentní-DNA-

polymerasa (reverzní transktriptasa), při němž se podle RNA (templát) syntetizuje

dvouřetězcová DNA. Reverzní transkripce se využívá v genovém inženýrství, neboť s její

pomocí lze využít funkční mRNA k syntéze cDNA. Přepisu buněčných mRNA do cDNA

a jejího následného namnožení pomocí polymerasové řetězové reakce se používá při

studiu exprese genetické informace 16.

3. 3 PCR

Polymerázová řetězová reakce (PCR) představuje rychlou a nenáročnou metodu

amplifikace specifických segmentů DNA až do velikosti 6 kb. Tepelně denaturovaná

DNA (s oddělenými řetězci) je inkubována v přístroji zvaném thermocycler s DNA

polymerasou, směsí deoxynukleosidtrifosfátů (dNTP) a dvěma primery

(oligonukleotidy), jejichž sekvence je komplementární k cílové oblasti DNA určené

k amplifikaci, takže směrují DNA polymerasu k syntéze nových řetězců. Cyklické

opakování tohoto procesu, kdy každý cyklus zdvojnásobí množství přítomné DNA,

amplifikuje DNA geometrickou řadou.

V každém cyklu jsou nejprve separovány řetězce DNA tepelnou denaturací při

95 °C, poté je teplota snížena, aby mohly primery přisednout na své komplementární

sekvence na DNA, a DNA polymerasa pak zajišťuje prodlužování řetězce. Užívá se

teplotně stabilních DNA polymeras, jako například Taq DNA polymerasa (z bakterie

Thermus aquaticus) nebo Pfu DNA polymerasa (z bakterie Pyrococcus furiosus), které

jsou stabilní při 95 °C. To eliminuje nutnost přidávat čerstvý enzym po každém

denaturačním kroku. Tudíž v přítomnosti dostatečného množství primerů a dNTP je PCR

prováděna jednoduše cyklickými změnami teploty 17.

28

Obrázek č. 9: Schéma cyklu PCR 18: (1) Denaturace při 94-96°C. (2) Nasedání primerů

(annealing) při 68°C. (3) Prodlužování řetězce při 72°C (P=DNA polymerasa). (4) První cyklus je ukončen.

Dva vzniklé řetězce DNA tvoří templát pro další cyklus. Takto tím pádem dochází ke zdvojnásobení

množství DNA při každém novém cyklu.

Převzato z http://www.juliantrubin.com/encyclopedia/biochemistry/pcr.html, leden 2009.

3. 4 Kvantitativní real-time PCR

Kvantitativní real-time PCR je spolehlivá metoda pro detekci a měření produktů

generovaných v průběhu každého cyklu PCR, které jsou přímo úměrné počátečnímu

množství templátu.

Pro uskutečnění této metody je třeba mít k dispozici způsob, jak detekovat

akumulaci produktu PCR, a přístroj, který má kromě vlastností thermocycleru i schopnost

zaznamenávat výsledky každého cyklu PCR v reálném čase. Nejjednodušším způsobem

detekce akumulovaného produktu je přidání takového barviva do směsi PCR, které

fluoreskuje po navázání na dvouřetězcovou DNA. Tento přístup však má své slabiny

spočívající v tvorbě falešných signálů, pokud se barvivo naváže na chybný produkt

reakce. Vyšší specifity lze proto dosáhnout použitím sond, které se vážou pouze na

specifický produkt 18.

Nejpoužívanějšími metodami pro generování fluorescenčního signálu jsou:

29

1. Sondy TaqManTM:

Jde o oligonukleotidy značené na obou koncích (tzv. Dual-Labeled Probes). Na 5´ konci

je navázán vhodný fluorofor (reporter) s krátkou vlnovou délkou emitovaného záření, na

3´ konci pak zhášeč (quencher) s delší vlnovou délkou záření. Fluorofor s kratší vlnovou

délkou předává energii zhášeči, jenž v důsledku toho emituje záření s delší vlnovou

délkou. Původní záření fluoroforu je utlumeno. Tento stav zůstává i po nasednutí sondy.

Sonda nasedá současně s primery, a to na komplementární sekvenci vzdálenou od 3´

konce primeru. Nově vytvářený řetězec je postupně prodlužován, až dosáhne místa, kde

je navázána sonda. Nyní se uplatní proces shodný s replikací DNA in vivo. Po uvolnění

několika vodíkových můstků, jejichž prostřednictvím je navázána sonda, a přiřazení

několika nukleotidů nově tvořeného řetězce se aktivuje exonukleasová podjednotka Taq

polymerasy a oddělovaná sonda podléhá exonukleasové aktivitě tohoto enzymu. Při

rozpadu sondy se uvolněný fluorofor vymaní z vlivu zhášeče a začne emitovat

fluorescenční záření krátké vlnové délky, které je registrováno jako fluorescenční signál.

Záření zhášeče (delší vlnové délky) pochopitelně ustane. Takto je registrován každý nově

tvořený řetězec 19.

Obrázek č. 10: Schéma typické TaqMan sondy 20

2. Molekulární majáky:

Jedná se o jednořetězcové oligonukleotidové hybridizační sondy s krátkými koncovými

sekvencemi k sobě navzájem komplementárními, takže tvoří vlastně „dvouřetězcový“

kmen, jejž spojuje jednořetězcová smyčka. V ní je úsek komplementární k hledané cílové

sekvenci vyšetřované nukleové kyseliny. Protože se tyto sondy používají k fluorescenční

detekci hybridizace, je na jednom konci oligonukleotidu (např. 5´) navázán fluorofor, na

30

druhém (3´) pak zhášeč. Díky vzájemné komplementaritě koncových sekvencí

oligonukleotidu, které spolu hybridizují, jsou v klidovém stavu oba (5´ i 3´) konce tak

blízko sebe, že fluorofor i nefluoreskující zhášeč přechodně sdílejí elektrony, čímž je

fluorescence eliminována. Sonda proto nesvítí. Pokud se však ke specifickému úseku

v jednořetězcové smyčce, který je podstatně delší než vzájemně komplementární úseky

kmene sondy, přiblíží komplementární cílová struktura nukleové kyseliny, dochází

ke spontánní hybridizaci, jejíž výsledek - hybrid - je delší a stabilnější než kmen sondy,

což vede k uvolnění vazeb kmene, a oba konce sondy se od sebe vzdálí. Tím se fluorofor

vymaní z vlivu zhášeče a nic nebrání emisi záření.

Obrázek č. 11: Schéma molekulárního majáku 20

Molekulární majáky jsou díky své stabilitě ve dvou fyzikálních stavech výhodné

pro zvýšení specifity reakce. Jsou navrhovány tak, aby helix tvořený kmenem sondy byl

méně stabilní než helix vytvořený hybridizací sondy a cílové sekvence při perfektní

vazbě nukleotidů. Rozdíl v komplementaritě jednoho jediného nukleotidu, např.

v důsledku bodové mutace, má za následek zachování stability kmene sondy. Emise

fluorescenčního signálu je tedy výhradně důsledkem přísně komplementární vazby sondy

na cílovou sekvenci 19.

3. Na DNA vázající se barvivo SYBR Green I:

Při použití této metody není třeba navrhovat třetí oligonukleotid nebo hybridizační sondu.

Fluorescenční signál vzniká po excitaci světlem jen tehdy, pokud je barvivo navázáno na

DNA (interkalace do malého žlábku dvojšroubovice). Je to nejlevnější metoda, která ale

vyžaduje optimalizaci, aby například nedocházelo k tvorbě dimerů primerů, jelikož

SYBR Green I nerozlišuje reálný templát od uměle vytvořených artefaktů 20.

31

Obrázek č. 12: Schéma real-time PCR s fluorescenční barvivem SYBR Green I.

Barvivo SYBR Green I (černé kosočtverce) začíná fluoreskovat (zelené kosočtverce) po navázání na

dvouřetězcovou DNA. Tímto poskytuje přímou metodu pro kvantifikaci produktů PCR v reálném čase.

Převzato z http://home.cc.umanitoba.ca/~umbouc00/PLNT7690/presentation/SYBRGreen.html, leden 2009

Reakce PCR generuje kopie templátové DNA exponenciálním způsobem. Vlivem

inhibitorů (omezení reagencií, akumulace pyrofosfátu) nakonec PCR reakce negeneruje

kopie templátu exponenciálně („plateau“ fáze) a některé reakce tudíž vygenerují více

produktu než jiné. Z tohoto důvodu je „end-point“ kvantifikace PCR produktů velmi

nespolehlivá. Protože existuje možnost měřit produkty PCR v reálném čase (tehdy, kdy

vznikají), je možné měřit množství PCR produktu v bodě, kdy je reakce stále

v exponenciální části. Právě toto je fáze PCR rekce, kdy můžeme zpětnou extrapolací

získat informace o původním množství templátu.

Při experimentu je v exponenciální fázi určen tzv. práh signálu fluorescence, při

kterém mohou být srovnány všechny vzorky. Tento práh je funkcí fluorescence pozadí a

je snímán při úrovni, kdy signál generovaný vzorkem je výrazně vyšší než je fluorescence

pozadí. Dílčí počet cyklů PCR, které jsou potřeba k vygenerování dostatečného signálu,

jež dosáhne tento práh, je nazýván Ct (cycle threshold). Hodnoty Ct jsou přímo úměrné

množství templátu na počátku reakce a jsou základem pro výpočet hladiny exprese

mRNA 20.

32

Obrázek č. 13: Detekce produktu real-time PCR a stanovení Ct hodnoty. Osa y

představuje počet kopií genu, osa x počet cyklů amplifikace. Převzato z http://www.rt-pcr.com, leden 2009.

Existují dvě základní metody kvantifikace: relativní kvantifikace a kvantifikace

pomocí kalibrační křivky. Používanější je metoda relativní kvantifikace, kde se provádí

srovnání exprese genu zájmu ve více vzorcích s kontrolním genem. Existují metody

s korekcí nebo bez korekce efektivity amplifikace. Metoda bez korekce efektivity

amplifikace (tzv. delta-delta metoda) předpokládá stejnou teoretickou efektivitu pro

amplifikaci cílového a kontrolního genu. Hodnota Ct kontrolního genu se odečte od Ct

genu zájmu a tak se získá rozdíl ∆Ct. Hodnota ∆Ct slouží poté jako exponent čísla 2,

jelikož při každém cyklu PCR dojde ke zdvojnásobení množství produktu. Výsledný

poměr exprese se celkově dá vyjádřit touto rovnicí:

TG

TG RG

RG

Ct (kontrola vzorek)( Ct Ct ) Ct

Ct (kontrola vzorek)poměr exprese

22 2

2

∆ −∆ −∆ ∆∆

∆ −= = = ,

kde TG znamená cílový gen a RG kontrolní gen 21.

33

II. CÍLE PRÁCE

1. Charakterizovat regulační sítě, jejichž řízení je zprostředkováno transkripčními

regulátory FnrP, NNR a NarR u bakterie Paracoccus denitrificans na globální

proteomové úrovni.

2. Získané výsledky validovat na transkriptomové a genomové úrovni pomocí qRT-

PCR a analýz genomové sekvence.

3. Rozšířit webovou 2-DE proteomovou databázi P. denitrificans s využitím

kompletní sekvence genomu bakterie.

34

III. MATERIÁL A METODY

1. Bakteriální kmeny

V práci byly používány následující kmeny P. denitrificans:

Kmeny s mutací v příslušném transkripčním faktoru:

1222 divoký typ (wt)

2921 FnrP mutant (FnrP-)

7721 NNR mutant (NNR-)

11021 NarR mutant (NarR-)

2. Proteomová analýza

2. 1 Experiment na bázi 2-D elektroforézy

Bylo připraveno 36 2-D gelů z buněčných lyzátů P. denitrificans (kmeny wt, FnrP-, NNR-

a NarR-) rostlých za třech podmínek – aerobně, semiaerobně a semiaerobně

s dusičnanem, vždy v triplikátech 22. Příprava těchto gelů nebyla součástí této diplomové

práce.

2. 2 Obrazová a statistická analýza 2-D gelů

Experiment byl vyhodnocován pomocí software PDQuest 8.0 (Bio-Rad, USA). Byla

provedena detekce spotů (metoda lokálního regresního modelu), odečet pozadí,

normalizace a matching (vzájemné přiřazení spotů na jednotlivých gelech a master

gelu)22. Dále byla provedena důkladná vizuální inspekce dat. Byly vytvořeny analytické

sety, které poskytly výsledky v podobě seznamu spotů, které splňují podmínku

kvantitativní změny (zvýšení 2x, resp. snížení na polovinu) a současně podmínku

statistické významnosti (p<0,05; Studentův t-test) mezi dvěma biologickými stavy. Takto

byly finálně vyhodnoceny spoty, které mění svoji intenzitu v závislosti na růstové

podmínce či v závislosti na přítomnosti mutace v transkripčním faktoru.

35

2. 3 Příprava mikropreparativních gelů

Byly vyrobeny 4 preparativní gely, a sice ze všech kmenů P. denitrificans (wt, FnrP-,

NNR- a NarR-) pěstovaných za podmínek aerobních, semiaerobních a semiaerobních

s dusičnanem. Spoty z těchto gelů byly vybrány k MS identifikaci.

2. 3. 1 Příprava vzorku

Objem buněčného lyzátu v lyzačním pufru o složení 7 M močovina, 2 M thiomočovina,

1% (w/v) C7BzO, 40 mM Tris, 70 mM DTT, 2% (v/v) Pharmalyte 3/10, 25 mM NaF, 0,2

mM NaVO3, CompleteMini Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Německo, jedna tableta

na 10 ml lyzačního pufru) a 150 U benzonasy (Sigma-Aldrich, USA) odpovídající

400 µg bílkoviny byl smíchán se 7,5násobkem (obj.) acetonu vychlazeného na -20 °C +

0,2% (w/v) DTT, následovala inkubace 1,5 hod./ -20 °C a centrifugace

16000g/20 min./4 °C, supernatant byl odlit. Poté bylo opět přidáno 200 µl acetonu +

0,2% DTT, následovala inkubace 20 min./-20 °C a centrifugace 16000g/20min./4 °C.

Supernatant byl odlit a vzorek byl vysušen ve SpeedVacu (SPD11V, Thermo Scientific,

USA) po dobu asi 5 min. Vzorek byl nakonec resolubilizován v 350 µl rehydratačního

pufru (7 M močovina, 2 M thiomočovina, 1% (w/v) C7BzO, 40 mM Tris, 70 mM DTT

and 2% (v/v) Pharmalyte 3/10 ) inkubací za mírného třepání 75 min./ 20 °C, následovala

centrifugace 16000g/20min/15 °C.

2. 3. 2 Isoelektrická fokusace

Na elektrody fokusační vaničky (PROTEAN IEF Cell, Bio-Rad, USA) byly přiloženy

elektrodové papírky napuštěné 8 µl vody (anoda), respektive 8 µl 50 mM DTT (katoda).

Bylo naneseno 350 µl vzorku a byl přiložen strip (imobilizovaný pH gradient 3-10 NL,

18 cm, Bio-Rad, USA), který byl poté zalit 3 ml minerálního oleje. Byl spuštěn

předvolený program, vždy při 150, 300, 650, 1200 a 1500 kVh došlo k výměně

elektrodových papírků, poté se fokusace nechala probíhat přes noc, celkově bylo

aplikováno 100 kVh.

36

2. 3. 3 Ekvilibrace (uváděná množství jsou na 1 gel/strip)

IPG stripy byly ekvilibrovány ve dvou stupních vždy po 12 minutách nejprve v roztoku o

složení 50 mM TRIS/HCl pH 8,8; 6 M močovina; 2% (w/v) SDS a 30% (v/v) glycerol a

1% (w/v) DTT, poté v roztoku o stejném složení s výjimkou DTT, které bylo nahrazeno

2,5% (w/v) jodacetamidem.

2. 3. 4 SDS-PAGE

Elektroforéza byla prováděna na aparatuře PROTEAN Plus Dodeca Cell (Bio-Rad,

USA), systém podle Laemmliho 25. Na povrch předem připravených gelů (12%

akrylamid) bylo napipetováno 750 µl agarosy a ihned byl přiložen strip na povrch gelu

tak, aby mezi gelem a stripem nezůstala žádná bublina. Gely byly umístěny do

elektroforetického zařízení a do elektrodového prostoru byl nalit vnitřní/horní pufr

(0,12 M Tris; 0,96 M glycin; 17 mM SDS a 0,15 mM NaN3).

Elektroforéza běžela nejprve při napětí 50 V po dobu asi 2 hodin, poté při

100 V přes noc, dokud modrá linie nedoputovala několik milimetrů od okraje gelu.

2. 3. 5 Barvení gelů SYPRO Ruby

Gely byly fixovány v roztoku 50% ethanolu a 3% kys. octové po dobu 30 minut. Barvení

probíhalo ve vaně s 500 ml barvy, kam byly umístěny vždy 2 gely. Vany byly zakryty

hliníkovou fólií umístěny na třepačku, kde byly třepány přes noc. Poté byly gely

přeneseny do čisté vany s odbarvovacím roztokem: 10% ethanol a 7% kys. octová. Vany

byly zakryty hliníkovou fólií a umístěny na třepačku po dobu 30 minut. Gely byly

uchovávány ve vanách s 250 ml vody + 2,5 ml 1% NaN3 v ledničce.

2. 3. 6 Analýza 2-D obrazu

Gely byly naskenovány pomocí fluoroimageru Pharos FX Plus (Bio-Rad, USA) a

analyzovány pomocí software PDQuest 8.0 (Bio-Rad, USA). Všechny 4 gely byly

přidány k experimentu se 36 původními gely. Nejprve bylo odečteno pozadí a program

provedl automatickou detekci spotů. Následoval matching spotů s původními gely.

37

2. 3. 7 Vyřezání spotů a MS identifikace

Vybrané spoty byly vyřezány pomocí přístroje EXQuest spot cutter (Bio-Rad, USA) a

předány laboratoři Funkční genomiky a proteomiky, MU (doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal,

Dr.) k MS identifikaci. Proteiny byly štěpeny trypsinem; nejprve byly provedeny analýzy

MALDI-MS a MS/MS na hmotnostním spektrometru Ultraflex III (Bruker Daltonik,

Německo). U nejednoznačných výsledků a u proteinů zájmu (měnící svoji intenzitu

v závislosti na růstové podmínce či v závislosti na přítomnosti mutace v transkripčním

faktoru) byla dále provedena LC-MS/MS analýza: systém HPLC skládající se

z gradientové pumpy (Ultimate), automatického dávkovače (Famos) a přepínače kolon

(Switchos; LC Packings, Holandsko) byl on-line propojen s hmotnostním spektrometrem

HCTultra PTM Discovery System ion trap mass spectrometer (Bruker Daltonik,

Německo).

Zpracování MS a MS/MS dat bylo provedeno pomocí programu MASCOT 2.0

(MatrixScience, Velká Británie). Bylo hledáno jak proti databázi NCBI (verze 20080502

nebo pozdější), tak i proti databázi genomu P. denitrificans, verze 2006

(http://genome.ornl.nih.gov/pden).

3. Měření hladin mRNA vybraných transkriptů pomocí qRT-PCR

3. 1 Izolace RNA

Izolace RNA byla provedena pomocí kitu RNeasy Mini kit (Qiagen). Celkem bylo

provedeno 36 izolací (4 kmeny, 3 růstové podmínky, 3 biologické replikáty). 2 µl

bakteriálního peletu byly rozsuspendovány ve 100 µl TE pufru (10 mM Tris/HCl pH 8,0;

1 mM EDTA) obsahujícím 400 µg.ml-1 lysozymu. Směs byla inkubována 5 min při lab.

teplotě. Poté bylo přidáno 350 µl RLT pufru (obsahujícího 2-merkaptoethanol), řádně

promícháno, centrifugováno 14000 g/2 min a dále bylo pracováno jen se supernatantem.

K supernatantu bylo přidáno 250 µl ethanolu, promícháno pipetou. Celý obsah byl

přenesen na kolonku umístěnou ve sběrací zkumavce, cetrifugace 11500 g/15 s. Dále

bylo na kolonku pipetováno 700 µl RW1 pufru, cetrifugace 11500 g/15 s. Kolonka byla

poté umístěna do nové sběrací zkumavky, bylo přidáno dvakrát 500 µl RPE pufru, poprvé

centrifugace 11500 g/15 s, pak 11500 g/2 min. Eluce byla provedena 40 µl vody, poté

38

byla eluce opakována pomocí prvního eluátu. Případná kontaminace DNA byla

odstraněna pomocí setu RNase-Free DNase (Qiagen) přídavkem 3,4 Kunitzových

jednotek 27 DNasy (na 30 µl izolátu) a inkubací při 30 °C/30 min., poté byla DNasa

tepelně inaktivována (95 °C/10 min). Kvalita a kvantita vyizolované RNA byla určena

měřením na nanodropu (NanoPhotometerTM, Implen, Německo).

3. 2 Reverzní transkripce

Syntéza cDNA reverzní transkripcí byla provedena setem společnosti Promega. Tři

biologické replikáty byly smíchány tak, aby směs na reverzní transkripci obsahovala

stejnou výchozí hmotnost RNA, viz následující tabulka:

Tabulka I: Koncentrace vyizolované mRNA a její zpracování pro reverzní traksripci

c RNA [ng/µl]

ng RNA

80 µl reakce

c RNA [ng/µl]

ng RNA

80 µl reakce

Vzorek [µl]

Voda [µl]

Vzorek [µl]

Voda [µl]

wt A 1 108,0 350 4,3 NarR- S 2 137,0 350 3,4

wt A 2 89,2 350 5,2 NarR- S 3 246,0 350 1,9 7,5

wt A 3 141,0 350 3,3 3,1 NNR- S 1 95,2 350 4,9

FnrP-A 1 99,6 350 4,7 NNR- S 2 132,0 350 3,5

FnrP-A 2 238,0 350 2,0 NNR- S 3 156,0 350 3,0 4,6

FnrP-A 3 205,0 350 2,3 7,1 wt N 1 109,0 350 4,3

NarR-A 1 122,0 350 3,8 wt N 2 242,0 350 1,9

NarR-A 2 348,0 350 1,3 wt N 3 154,0 350 3,0 6,8

NarR-A 3 204,0 350 2,3 8,5 FnrP- N 1 47,2 350 9,9

NNR-A 1 80,0 350 5,8 FnrP- N 2 173,0 350 2,7

NNR-A 2 237,0 350 2,0 FnrP- N 3 174,0 350 2,7 0,7

NNR-A 3 308,0 350 1,5 6,7 NarR- N 1 60,4 350 7,7

wt S 1 144,0 350 3,2 NarR- N 2 174,0 350 2,7

wt S 2 185,0 350 2,5 NarR- N 3 147,0 350 3,2 2,4

wt S 3 241,0 350 1,9 8,3 NNR- N 1 174,0 350 2,7

FnrP-S 1 82,8 350 5,6 NNR- N 2 75,0 350 6,2

FnrP-S 2 135,0 350 3,5 NNR- N 3 155,0 350 3,0 4,1

FnrP-S 3 318,0 350 1,5 5,4

39

Ke každému vzorku byly přidány 4 µl směsi náhodných primerů, směs byla inkubována 5

min při 75 °C, pak zchlazena na 4 °C a přidána ke směsi, jejíž složení uvádí tabulka:

Tabulka II: Složení reakční směsi pro reverzní transkripci

objem [µl] výsledná koncentrace 22,4 voda 16 1X ImProm-IITM 5X Reaction Buffer 9,6 3 mM MgCl2 4 0,5 mM dNTP mix 4 1 U/µl Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor 4 Improm-IITM Reverse Transcriptase

Reakční směs o celkovém objemu 80 µl byla podrobena reverzní transkripci: annealing

25 °C/5 min, prodlužování prvního řetězce 42 °C/60 min a inaktivace reverzní

transkriptasy 70 °C/15 min.

3. 3 Kvantitativní real-time PCR

Kvantitativní real-time PCR byla provedena v triplikátech na přístroji 7300 Real Time

PCR System (Applied Biosystems, USA) za použití flourescenčního barviva SYBR

Green. Jednotlivá reakce obsahovala:

Tabulka III: Složení směsi pro real-time PCR

7,5 µl Power SYBR® Green PCR Master Mix 4,2 µl voda 0,9 µl F primer (5 µM) 0,9 µl R primer (5 µM) 1,5 µl cDNA

40

Tabulka IV: Použité primery

SSP Contig a číslo genu

Jméno Sekvence primerů Tm Délka

amplikonu

5710 ct74_4235

A1B9V5 Respiratory nitrate reductase beta subunit

F: 5-CGTACCCGAGGACTGGATCA-3 60 119

R: 5-CATACCAGACCATCGGCAGG-3 60

2701 ct74_4219

A1B9T9 Nitrous-oxide reductase

F: 5-AACAAGGTGCGGGTCTACATG-3 59 127

R: 5-CATGCGTCAGATCGTCGATCT-3 59

4107, 5105

ct74_3636

A1B859 OmpW family protein F: 5-AATATCGGCATCGAGGTGCT-3 58

124 R: 5-GCGCGTCAAAGTGATATTGC-3 58

1701 ct130_2487

Q51700 Nitrite reductase

F: 5-GGAAAACGACTGGGATCTGG-3 58 138

R: 5-GACATGCGGCTGATATGCAC-3 59

1311 ct73_4984

A1BC00 Transketolase, central region

F: 5-AACGACCCGGTGATCTTCCT-3 59 136

R: 5-CATAGGTGACGATGGTTGCG-3 59

1406 ct73_4983

A1BBZ9 Alpha/beta hydrolase fold

F: 5-CAAGGATCAGTCGCTGGTCAG-3 59 92

R: 5-CCAGTTCGGTCAGGAAGTCC-3 58

3203 ct73_4982

A1BBZ8 Short-chain dehydrogenase/reductase SDR

F: 5-GCAGGTCAAGCAGTTCAACG-3 62 68

R: 5-CCATGGCATTCACGTCCA-3 62

804 ct130_2610

A1B5A3 TonB-dependent receptor

F: 5-GGGAAGGTGCAGAACACCTTT-3 59 137

R: 5-CTGGTCGAGAAGTTGCGGTAA-3 59

1814 ct74_3007

A1B6E6 TonB-dependent siderophore receptor

F: 5-CCACACCGACGGCTATTATTC-3 58 131

R: 5-GGTTGTTGACATAGGCGAAGG-3 58

3211 ct130_1849

A1B352 UspA domain protein

F: 5-CAGAAGCAACTCGATTCGGC-3 60 147

R: 5-GGCCTTGTCGATGGATTCCT-3 60

8417 ct74_3407

A1B7I4 ABC transporter related

F: 5-CTGTTCCTGTTCGACGAGCC-3 59 98

R: 5-GAGGCGTTCAGATCCTGGTG-3 59

5202 ct130_2604

A1B597 SSU ribosomal protein S30P / sigma 54 modulation protein

F: 5-TATGCGGCCTTCGAACAGTG-3 61 152

R: 5-CATTCATCATCCTCGCCGG-3 61

6421 ct74_4465

Q9X7H5 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

F: 5-GCTGAAGGGCATCCTAGGCTATA-3 60 146

R: 5-ACTCGTTGTCATACCAGGTCAGG-3 60

Míra genové exprese byla určena pomocí metody relativní kvantifikace. Jako kontrolní

gen sloužila glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasa (GAPDH). Z trojice Ct analytických

replikátů byl spočten průměr a určena směrodatná odchylka. Od Ct sledovaného genu

bylo odečteno Ct GAPDH a tak byly získány hodnoty ∆Ct pro jednotlivé geny. Exprese

41

daného genu pak byla vztažena na divoký kmen za aerobních podmínek (wt A), tzn.

odečtením této hodnoty ∆Ct od hodnoty daných kmenů za všech podmínek se spočetly

tzv. ∆∆Ct hodnoty, které po výpočtu hodnoty 2-∆∆Ct vyjadřují relativní expresi daného

genu vůči wt A.

42

IV. VÝSLEDKY

1. Proteomová analýza

Bylo analyzováno 36 2-DE gelů bakterie P. denitrificans (kmeny wt, FnrP-, NNR-

a NarR- kultivované za podmínek aerobních, semiaerobních a semiaerobních

s dusičnanem, vždy v triplikátech). Z celkového počtu 737 spotů na master gelu

(počítačem vytvořený gel obsahující spoty ze všech experimentálních gelů) bylo vybráno

544 spotů, jež měly dostatečnou kvantitu a kvalitu, k identifikaci pomocí hmotnostní

spektrometrie. Podařilo se identifikovat 525 spotů, které obsahovaly celkem 640 různých

genových produktů. Výsledky identifikace budou přístupné on-line na adrese

http://web.mpiib-berlin.mpg.de/cgi-bin/pdbs/2d-page/extern/index.cgi. Jelikož se jedná o

data připravovaná k publikaci, jsou v současnosti umístěna na neveřejné části webu na

adrese http://141.14.152.84/cgi-bin/1681278/Bouchal_Paracoccus/index.cgi. Sada 297

spotů obsahovala jen jeden identifikovaný protein, a byla proto základem pro biologickou

interpretaci proteinové exprese. U 228 případů se jednalo o směs dvou a více proteinů;

tyto spoty byly proto vyřazeny z biologické interpretace.

Jelikož v průběhu času dochází ke změnám anotace osekvenovaných proteinů

v genomové databázi P. denitrificans, je třeba zmínit, že data uvedená v této práci

odpovídají anotaci genů z 15. 3. 2009. Názvy obsahují přístupová čísla do databáze

UniProt a také číslo genu, jež umožňuje vyhledávání v genomu P.denitrificans on-line

(http://genome.ornl.gov/microbial/pden a http://www.genome.jp/kegg-bin/show_organism

?org=pde).

Exprese 12 vybraných genů byla validována pomocí qRT-PCR. Jako

housekeeping gen byla použita glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasa, jejíž konstitutivní

exprese byla ověřena jak na úrovni proteinu (spot 6421), tak na úrovni mRNA.

1. 1 Proteiny ovlivněné růstovými podmínkami

Dvě níže uvedené tabulky (tabulka V a VI) obsahují spoty s jediným

identifikovaným proteinem, které vykazovaly změny při růstu za podmínek

semiaerobních a semiaerobních s dusičnanem v porovnání s růstem divokého kmene za

aerobních podmínek.

43

Tabulka V obsahuje 19 spotů se zvýšenou expresí a 2 spoty se sníženou expresí za

semiaerobních podmínek ve srovnání s aerobními u divokého kmene. Nezávisle na

přítomnosti mutace byla exprese současně a významně zvýšena u 9 spotů, u zbývajících

12 nedošlo k významné změně exprese alespoň u jednoho mutantního kmene.

Tabulka VI obsahuje 15 spotů se zvýšenou expresí a 1 spot se sníženou expresí za

semiaerobních podmínek s dusičnanem ve srovnání s aerobními u divokého kmene.

Nezávisle na přítomnosti mutace byla exprese současně zvýšena u 7 spotů, u zbývajících

9 nedošlo k významné změně exprese alespoň u jednoho mutantního kmene.

Je zřejmé, že většina proteinů (12 z 19) se zvýšenou expresí za semiaerobních

podmínek měla stejně tak zvýšenou expresi i za semiaerobních podmínek s dusičnanem.

Za povšimnutí z této skupiny proteinů stojí denitrifikační enzymy nitritreduktasa (spot

1701) a N2O reduktasa (spot 2701), dále například OmpW protein (spoty 4107 a 5105),

TonB dependent recepror (spot 0806), dehydrogenase/reductase SDR proteins (spoty

2206 and 7104) a SSU ribosomal protein S30P/sigma 54 modulation protein (spot 5202).

Hladina β-podjednotky nitrátreduktasy (spot 5710) byla s použitím uvedených kritérií

zvýšena pouze při růstu za semiaerobních podmínek s dusičnanem.

Tabulka V (následující strana): Spoty vykazující změnu v expresi při růstu za

podmínek semiaerobních v porovnání s růstem za aerobních podmínek divokého

kmene. Je také ukázána exprese dalších kmenů. Číselné hodnoty tučně znamenají

významnou statistickou změnu, kurzíva – změnu bez statistické významnosti a obyčejný

font – významnost nebyla testována.

44

wt FnrP NNR NarR všechny kmeny

SSP Contig/číslo genu Název proteinu změna násobek změny (S/A)

změna násobek změny (S/A)




501 ct130_gene_2152 A1B400 Extracellular solute-binding protein, family 1

� 2,7 � 2,8 � 2,2 � 2,2 � 2,5

806 ct130_gene_2046 A1B3P4 TonB-dependent receptor � 3,4 � 4,9 � 2,9 � 1,5 � 3,3

1106 ct130_gene_2287 A1B4D4 Membrane protein of uknown function UCP014873

� 324,2 � 820,1 � 169,8 � 548,6 � 368,4

1114 ct74_gene_3673 A1B896 Transcriptional activator, TenA family

� 3,3 � 947,0 � 650,0 � 1,7 � 4,7

1406 ct73_gene_4983 A1BBZ9 Alpha/beta hydrolase fold � 5,9 � 1,1 � 5,5 � 272,8 � 4,0 1701 ct130_gene_2487 Q51700 Nitrite reductase � 28,9 � 10,4 � 21,1 � 9,4 � 16,5

2206 ct130_gene_0206 A1AYH6 Short-chain dehydrogenase/reductase SDR

� 415,4 � 1205,0 � 258,9 � 1066,3 � 558,7

2701 ct74_gene_4219 A1B9T9 Nitrous-oxide reductase � 48,7 � 21,7 � 17,8 � 26,9 � 25,4

2808 ct130_gene_2497 A1B4Z0 Catalase-peroxidase � 2,9 � 1,4 � 1,2 � 3,8 � 2,1

3211 ct130_gene_1849 A1B352 UspA domain protein � 6,0 � 4,7 � 4,0 � 6,2 � 5,2

3802 ct130_gene_0062 A1AY35 ATPase AAA-2 domain protein

� 7,2 � 3,8 � 5,6 � 10 � 6,0


� 36,6 � 13,3 � 28,2 � 156 � 23,9

4107 ct74_gene_3636 A1B859 OmpW family protein � 9,4 � 4,3 � 7,7 � 10,6 � 8,7 5105 ct74_gene_3636 A1B859 OmpW family protein � 1297,2 � 3,7 � 1469,6 � 4187,2 � 1555,0

5202 ct130_gene_2604 A1B597 SSU ribosomal protein S30P / sigma 54 modulation protein

� 2,5 � 2,9 � 2,5 � 3,8 � 2,9

5507 ct130_gene_0686 A1AZV4 TolB, N-terminal domain protein

� 2,7 � 5,2 � 4,6 � 4,1 � 3,9

5703 ct74_gene_4030 A1B9A2 2-isopropylmalate synthase � 4,2 � 3,1 � 1,8 � 5,3 � 3,4

5706 ct130_gene_1697 A1B2Q0 Transketolase � 26,5 � 130,2 � 17,7 � 81,1 � 45,7

7104 ct130_gene_2377 A1B4M3 Short-chain dehydrogenase/reductase SDR

� 8,1 � 12,6 � 5,1 � 7,1 � 8,1

8701 ct74_gene_2871 A1B611 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase

� 2,3 � 1,4 � 1,7 � 2,4 � 1,9

1110 ct130_gene_0745 A1B013 50S ribosomal protein L10 � 0,4 � 0,5 � 0,6 � 0,4 � 0,5

1121 ct130_gene_0657 A1AZS5 Putative uncharacterized protein

� 0,1 � 0,2 � 0,1 � 0,1 � 0,1

45

Tabulka VI: Spoty vykazující změnu v expresi při růstu za podmínek semiaerobních s dusičnanem v porovnání s růstem za

aerobních podmínek divokého kmene. Je také ukázána exprese dalších kmenů. Číselné hodnoty tučně znamenají významnou

statistickou změnu, kurzíva – změnu bez statistické významnosti a obyčejný font – významnost nebyla testována.

wt FnrP NNR NarR všechny kmeny

SSP Contig/číslo genu Název proteinu změna násobek změny (N/A)

změna násobek změny (N/A)




804 ct130_gene_2610 A1B5A3 TonB-dependent receptor � 2,9 � 1,1 � 1,4 � 1,9 � 1,8

806 ct130_gene_2046 A1B3P4 TonB-dependent receptor � 18,3 � 4,0 � 1,8 � 5,6 � 7,1

1114 ct74_gene_3673 A1B896 Transcriptional activator, TenA family

� 8,5 � 3729,2 � 1026,0 � 4,6 � 11,8

1406 ct73_gene_4983 A1BBZ9 Alpha/beta hydrolase fold � 10,1 � 1,5 � 6,0 � 165,4 � 4,8

1701 ct130_gene_2487 Q51700 Nitrite reductase � 29,2 � 15,5 � 47,4 � 68,3 � 35,0

2206 ct130_gene_0206 A1AYH6 Short-chain dehydrogenase/reductase SDR

� 266,1 � 978,9 � 311,1 � 1168,3 � 508,2

2701 ct74_gene_4219 A1B9T9 Nitrous-oxide reductase � 29,3 � 85,4 � 15,4 � 28,6 � 24,7

3211 ct130_gene_1849 A1B352 UspA domain protein � 2,1 � 4,5 � 3,5 � 5,3 � 3,7


� 4,5 � 1,4 � 2,6 � 5,3 � 3,0

4107 ct74_gene_3636 A1B859 OmpW family protein � 4,9 � 3,8 � 5,8 � 9,0 � 6,2

5105 ct74_gene_3636 A1B859 OmpW family protein � 371,6 � 1,4 � 880,2 � 2220,2 � 756,0

5202 ct130_gene_2604 A1B597 SSU ribosomal protein S30P / sigma 54 modulation protein

� 2,3 � 2,6 � 2,1 � 3,0 � 2,5

5710 ct74_gene_4235 A1B9V5 Respiratory nitrate reductase beta subunit

� 5,9 � 2,1 � 24,9 � 5,6 � 5,2

7104 ct130_gene_2377 A1B4M3 Short-chain dehydrogenase/reductase SDR

� 8,2 � 10,2 � 4,2 � 5,7 � 6,9

7114 ct74_gene_3025 A1B6G4 Putative uncharacterized protein

� 22,0 � 2,6 � 44,8 � 146,7 � 7,3

8417 ct74_gene_3407 A1B7I4 ABC transporter related � 3,0 � 3,3 � 1,0 � 0,8 � 1,7

1121 ct130_gene_0657 A1AZS5 Putative uncharacterized protein

� 0,3 � 0,3 � 0,2 � 0,2 � 0,2

46

1. 2 Proteiny ovlivněné mutací v transkripčním regulátoru

Na základě statistické analýzy byly nalezeny spoty, které se lišily mezi mutantními

kmeny a divokým kmenem za jednotlivé růstové podmínky. Tyto proteiny jsou uvedeny

v tabulce VII. Za aerobních podmínek nebyl nalezen žádný takovýto protein. Za

semiaerobních podmínek vykazovaly 4 spoty snížení u FnrP- mutanta v porovnání s divokým

kmenem. Jsou to N2O reduktasa (spot 2701), UspA domain protein (spot 3211) a OmpW

family protein (spoty 4105 a 5105).

Za podmínek semiaerobních s dusičnanem je situace mnohem zajímavější. Sníženou

expresi u FnrP- mutanta oproti divokému kmeni vykazovaly 4 spoty: OmpW family protein

(spoty 4105 a 5105), β-podjednotka respirační nitrátreduktasy (spot 5710) a TonB dependent

receptor (spot 804). Sníženou expresi u mutanta NNR- vykazovaly 3 spoty: TonB dependent

receptor (spot 804), β-podjednotka respirační nitrátreduktasy (spot 5710) a ABC transporter

related protein (spoty 8417). U mutanta NarR- byla exprese snížena jen u jednoho proteinu, a

sice β-podjednotky respirační nitrátreduktasy (spot 5710). U jisté skupiny spotů došlo také ke

zvýšení exprese u mutanta NarR-. Jedná se o spoty identifikované jako Membrane protein of

uknown function UCP014873 (spot 1106), nitritreduktasa (1701), N2O reduktasa (spot 2701),

a UspA domain protein (spot 3211).

47

Tabulka VII: Spoty s jediným identifikovaným proteinem vykazující změnu v závislosti

na přítomnosti mutace v transkripčním faktoru za dané růstové podmínky. Číselné

hodnoty tučně znamenají významnou statistickou změnu, kurzíva – změnu bez statistické

významnosti a obyčejný font – významnost nebyla testována.

FnrP/wt NarR/wt NNR/wt

změna násobek změny



podmínky semiaerobní

2701 ct74_gene_4219 A1B9T9 Nitrous-oxide reductase � 0,1 1,3 1,2

3211 ct130_gene_1849 A1B352 UspA domain protein � 0,4 0,9 0,8

4107 ct74_gene_3636 A1B859 OmpW family protein � 0,1 1,0 1,1

5105 ct74_gene_3636 A1B859 OmpW family protein � 0,0 1,3 1,3

podmínky semiaerobní s dusičnanem

804 ct130_gene_2610 A1B5A3 TonB-dependent receptor � 0,4 � 0,6 � 0,5

806 ct130_gene_2046 A1B3P4 TonB-dependent receptor � 0,2 � 0,2 � 0,1

1106 ct130_gene_2287 A1B4D4 Membrane protein of uknown function UCP014873 � 1,8 � 9,3 � 6,2

1701 ct130_gene_2487 Q51700 Nitrite reductase � 1,0 � 2,0 � 1,7

2701 ct74_gene_4219 A1B9T9 Nitrous-oxide reductase � 0,9 � 2,3 � 1,8

3211 ct130_gene_1849 A1B352 UspA domain protein � 1,1 � 2,1 � 1,9

4107 ct74_gene_3636 A1B859 OmpW family protein � 0,2 � 1,7 � 1,6

5105 ct74_gene_3636 A1B859 OmpW family protein � 0,0 � 2,3 � 2,7

5710 ct74_gene_4235 A1B9V5 Respiratory nitrate reductase beta subunit � 0,2 � 0,2 � 0,2

8417 ct74_gene_3407 A1B7I4 ABC transporter related 0,3 � 0,4 � 0,6 �

48

1. 3 Srovnání exprese vybraných genů na úrovni proteinu a cDNA

Exprese vybraných proteinů byla validována pomocí qRT-PCR, tedy hladiny mRNA

(transkriptu). Níže uvedené grafy představují srovnání hladiny proteinu (graf představující

průměrnou kvantitu spotu) a hladiny transkriptu genu pro daný protein – hladinu mRNA

(graf představující poměr exprese transkriptu oproti divokému kmeni za aerobních

podmínek).

Obrázky č. 14 a 15: A1B352 UspA domain protein. Obrázek vlevo znázorňuje průměrnou intenzitu spotu 3211, obrázek vpravo znázorňuje profil transkriptu genu 1849, přičemž hodnota 2-∆∆Ct vyjadřuje, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců je u obou obrázků stejné: zleva wt A, wt S, wt N, FnrP- A, FnrP- S, FnrP- N, NNR- A, NNR- S, NNR- N, NarR- A, NarR- S, NarR- N (A = aerobní podmínky, S = semiaerobní podmínky, N = podmínky semiaerobní s dusičnanem).

0

5

10

15

1

2-∆∆Ct

49

0

1

2

4

5

1

2-∆∆Ct

Obrázky č. 16 a 17: A1B9V5 Respiratory nitrate reductase beta subunit. Obrázek vlevo znázorňuje průměrnou intenzitu spotu 5710, obrázek vpravo znázorňuje profil transkriptu genu 4235, přičemž hodnota 2-∆∆Ct vyjadřuje, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str.48.

Obrázky č. 18 a 19: Q51700 Nitrite reductase. Obrázek vlevo znázorňuje průměrnou intenzitu spotu 1701, obrázek vpravo znázorňuje profil transkriptu genu 2487, přičemž hodnota 2-∆∆Ct vyjadřuje, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str.48.

-1

2

4

6

8

10

12

1

2-∆∆Ct

50

Obrázky č. 20 a 21: A1B9T9 Nitrous-oxide reductase. Obrázek vlevo znázorňuje průměrnou intenzitu spotu 2701, graf obrázek znázorňuje profil transkriptu genu 4219, přičemž hodnota 2-∆∆Ct vyjadřuje, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str.48.

Obrázky č. 22 a 23: A1B859 OmpW family protein. Obrázek vlevo znázorňuje průměrnou intenzitu spotu 4107, obrázek vpravo znázorňuje profil transkriptu genu 3636, přičemž hodnota 2-∆∆Ct vyjadřuje, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str.48.

-1

5

11

16

1

2-∆∆Ct

-1

1

3

5

7

9

11

1

2-∆∆Ct

51

Obrázky č. 24 a 25: A1B859 OmpW family protein. Obrázek vlevo znázorňuje průměrnou intenzitu spotu 5105, obrázek vpravo znázorňuje profil transkriptu genu 3636, přičemž hodnota 2-∆∆Ct vyjadřuje, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str.48.

Obrázky č. 26 a 27: A1B597 SSU ribosomal protein S30P / sigma 54 modulation protein. Obrázek vlevo znázorňuje průměrnou intenzitu spotu 5202, obrázek vpravo znázorňuje profil transkriptu genu 2604, přičemž hodnota 2-∆∆Ct vyjadřuje, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str.48.

-1

1

3

5

7

9

11

1

2-∆∆Ct

0

2

4

6

8

1

2-∆∆Ct

52

Obrázky č. 28 a 29: A1B7I4 ABC transporter related. Obrázek vlevo znázorňuje průměrnou intenzitu spotu 8417, obrázek vpravo znázorňuje profil transkriptu genu 3407, přičemž hodnota 2-∆∆Ct vyjadřuje, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str. 48.

0

10

20

30

40

50

1

2-∆∆Ct

53

Obrázky č. 30, 31, 32: Potvrzení operonu. Obrázky znázorňují průměrnou intenzitu spotů (zleva) 3203, 1406 a 1301, které odpovídají genům 4982, 4983 a 4984. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str.48.

Obrázky č. 33, 34, 35: Potvrzení operonu. Obrázky znázorňují profil transkriptů genů (zleva) 4982, 4983 a 4984, přičemž osa y představuje hodnotu 2-∆∆Ct vyjadřující kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str.48.

0

50

100

150

200

1 0

20

40

60

80

100

1 0

100

200

300

400

500

600

1

54

Obrázky č. 36, 37, 38: TonB-dependent receptors. Obrázky znázorňují průměrnou intenzitu spotů (bráno zleva) 804 (A1B5A3 TonB-dependent receptor), 806 (A1B3P4 TonB-dependent receptor) a směsného spotu 1814 (A1B6E6 TonB-dependent siderophore receptor a A1B3P4 TonB-dependent receptor). Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str. 48.

Obrázky č. 39, 40, 41: TonB-dependent receptors. Obrázky znázorňují profily transkriptů genů (zleva) 2610 (odpovídá spotu 804), 3007 (odpovídá převažujícímu proteinu ve směsném spotu 1814) a 3527 (odpovídá minoritnímu proteinu ve směsném spotu 1814). Osa y představuje hodnotu 2-∆∆Ct vyjadřující, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str. 48.

-2

1

3

5

7

9

1

0

50

100

150

200

250

300

1

0

50

100

150

200

250

1

55

V. DISKUZE

Pokrytí proteomu P. denitrificans

V rámci diplomové práce se podařilo významně rozšířit pokrytí proteomu bakterie

Paracoccus denitrificans. Díky kompletnímu osekvenování genomu došlo ke zvýšení

efektivity identifikace z 2-D gelu oproti předchozí proteomické studii P. denitrificans 23 ze

4 genových produktů až na 640. Genom bakterie obsahuje 5134 genů kódujících proteiny, je

tedy zřejmé, že pomocí námi zvoleného přístupu jsme schopni detekovat jen něco přes 12 %

teoretických genových produktů. Na druhou stranu lze předpokládat, že zdaleka ne všechny

geny jsou za zvolených podmínek exprimovány. Limitace použité technologie spočívá

zejména ve spektru detekovaných proteinů, kdy pomocí 2-DE detekujeme zejména proteiny

s nejvyššími hladinami exprese, které jsou současně hydrofilní. Hydrofobní membránové

proteiny s více než jednou transmembránovou doménou touto metodou zpravidla není možné

analyzovat 24, což v našem experimentu pěkně dokumentuje membránově vázaný enzym

nitrátreduktasa, kdy jsme dle našeho očekávání detekovali jen její nejméně hydrofobní α a

β-podjednotky.

Proteiny obsahující ve svém promotoru FNR-box

Protein identifikovaný ve spotu 3211 je produkt genu 1849 reprezentující „UspA

domain protein“. Univerzální stresový protein A je malý cytoplazmatický protein, jehož

exprese je zvýšena při vystavení buňky stresovým vlivům. Výrazně zvyšuje míru přežití

buněk při delším působení těchto vlivů a aktivuje pochody vedoucí k obecné odolnosti vůči

stresu 33. Gen pro tento protein se u P. denitrificans nachází přímo vedle genu pro samotný

transkripční faktor FnrP (gen 1850). Také na základě profilu jeho exprese (obrázek č. 14) se

dá předpokládat, že se nachází ve stejném operonu jako FnrP. Tento fakt byl potvrzen na

úrovni mRNA (obrázek č. 15) – exprese tohoto genu je výrazně potlačena u FnrP- mutanta za

všech růstových podmínek ve srovnání s ostatními kmeny. Expresní profily tohoto genového

produktu tedy biologicky validují celý experiment od konstrukce FnrP- mutanta až po

kvantifikaci a identifikaci proteinu.

56

Jelikož do syntézy denitrifikačních enzymů jsou podle současných znalostí zapojeny

všechny 3 regulační proteiny (FnrP, NNR a NarR), kvantitativní změny těchto enzymů slouží

jako vnitřní kontrola zjištěných dat. Je totiž známo, že geny všech těchto enzymů obsahují ve

svém promotoru vazebnou sekvenci pro FNR proteiny. Ve spotu 5710 se podařilo

identifikovat nejméně hydrofobní β-podjednotku membránové nitrátreduktasy. Jak je vidět

z obrázku č. 16, exprese za aerobních podmínek je dle očekávání vždy nejnižší oproti zbylým

dvěma podmínkám v rámci daného kmene, navíc u mutanta NarR- je exprese za podmínek

semiaerobních a semiaerobních s dusičnanem vždy nižší ve srovnání se stejnou růstovou

podmínkou u jiných kmenů, což potvrzuje fakt, že NarR aktivuje expresi daného enzymu. Na

úrovni cDNA (obrázek č. 17) je také patrná nižší hladina transkriptu příslušného genu u

mutanta NarR- oproti kmenu divokému. Zejména však z tabulky VII vyplývá výrazné snížení

exprese u všech mutantních kmenů za semiaerobních podmínek s dusičnanem, což je

v případě kmenů FnrP- a NarR- v souladu s publikovanými daty 6. Zajímavé je snížení

exprese i u kmene NNR-, což poukazuje na možnost větší provázanosti regulačních procesů,

než se dosud předpokládalo. Nitritreduktasa (spot 1701) vykazuje za aerobních podmínek

totéž očekávané chování jako ostatní denitrifikační enzymy, a sice velmi nízkou expresi

(obrázek č. 18). Ovlivnění tohoto enzymu pomocí NNR 9 se ale nepodařilo na úrovni

proteinu potvrdit. Na úrovni cDNA (obrázek č. 19) jsou změny v hladinách transkriptů tak

malé, že z nich taktéž nelze učinit žádný závěr. Ve spotu 2701 byla identifikována N2O

reduktasa. Doposud nebylo studováno, kterým ze tří transkripčních faktorů je exprese tohoto

enzymu regulována, nicméně v promotoru příslušného genu se nachází FNR-box o sekvenci

5´-TTGACCTAAGTCAA-3´ 26. Naše výsledky naznačují, že pozitivním regulátorem by

mohl být FnrP, jelikož u na úrovni proteinu dochází ke snížení exprese u mutanta FnrP- za

semiaerobních podmínek (tabulka VII, obrázek č. 20). Data na úrovni cDNA toto chování za

semiaerobních podmínek potvrzují (obrázek č. 21). Čtvrtý enzym denitrifikační dráhy, NO

reduktasa, byla identifikována pouze ve směsném spotu, informace o jejím proteinovém

expresním profilu proto nemůžeme z tohoto experimentu získat.

Sníženou expresi u FnrP- mutanta za všech podmínek vykazoval protein „OmpW

family protein” (spoty 4107 a 5105, gen 3636, obrázky č. 22-25), což by nasvědčovalo

pozitivní regulaci pomocí FnrP. Pomocí bioinformatické analýzy byl v promotoru tohoto

57

genu nalezen FNR-box o sekvenci 5´-TTGATCCAGATCAA-3´ v pozici -41,5 od počátku

transkripce, což tuto myšlenku o pozitivní regulaci pomocí FnrP plně potvrzuje. Navíc

existuje i analogie u E.coli, u níž se v operonu ompW také nachází sekvence FNR-boxu a

tento operon je pozitivně regulován 28. OmpW patří do rodiny malých proteinů vnější

membrány, jež jsou rozšířeny u gram-negativních bakterií. Jejich funkce není známa, ale

současné studie naznačují, že se mohou podílet na ochraně bakterií před stresovými vlivy

vnějšího prostředí (jak to bylo prokázáno u původce cholery Vibrio cholerae 29) a také na

transportu malých hydrofobních molekul skrz vnější membránu 30. U E. coli je ompW za

normálních růstových podmínek exprimován jen v malé míře a slouží jako receptor pro

kolicin S4 31, což je protein produkovaný některými kmeny E. coli a zároveň je pro některé

kmeny této bakterie toxický.

Spot 7104 byl identifikován jako produkt genu 2377 (A1B4M3 Short-chain

dehydrogenase/reductase SDR). FNR-box (5´-TTGACGGGTGTTAA-3´) se v tomto

případě nachází v promotoru genu 2387. Tento gen leží už poměrně daleko od námi

identifikovaného genu, je tedy otázkou, zda je i tento gen regulován pomocí některého

z transkripčních faktorů typu FNR. Homologní protein byl nalezen ve spotu 2206 (gen 0206,

A1AYH6 Short-chain dehydrogenase/reductase SDR), který vykazuje stejné chování jako

spot 7104 (tabulky V a VI). U tohoto genu jsem nalezla v promotorové oblasti sekvenci

podobnou FNR-boxu (5´-GTGATCGACATCAA-3´). Nelze však s jistotou tvrdit, že je tato

sekvence proteiny typu FNR rozpoznávána a že se tudíž jedná o opravdový FNR-box, což by

znamenalo, že exprese tohoto proteinu je pomocí některého těchto proteinů regulována.

Proteiny, jejichž geny se nacházejí v blízkosti genu pro transkripční faktor jiného typu

U transkripčních regulátorů (TR) typu FNR se gen pro samotný regulátor mnohdy

nachází v blízkosti genu, jehož expresi reguluje, což má svůj význam z hlediska

synchronizace exprese, kdy tyto TR často regulují i expresi sebe samých. Proto jsme se

snažili u genů, jejichž exprese se významně měnila v závislosti na růstových podmínkách,

hledat v jejich okolí gen i pro TR jiného typu. Bohužel názvy těchto proteinů odkazují jen na

jejich strukturu a motiv DNA vazebné domény, nikoli na to, jaké geny regulují.

U 3 genů se v blízkosti nacházel TR ze superrodiny s DNA vazebnou doménou

„winged helix“, konkrétně tedy „two component transcription regulator, winged helix

58

family“. Dvoukomponentní regulační systémy jsou obvykle spojeny s odpovědí na změny

vnějšího prostředí a uplatňují se také při regulaci exprese virulentních znaků. Skládají se ze

senzoru v podobě kinasy a odpovídajícího regulátoru, který je fosforylován senzorovou

kinasou prostřednictvím signálu, který následuje po vnějším stimulu 32. Spot 8417, jenž

vykazuje sníženou expresi u NNR- mutanta za semiaerobních podmínek s dusičnanem

(tabulka VII, obrázek č. 28), byl identifikován jako gen 3407, „ABC transporter related“, a

TR je kódován genem 3403. Snížení exprese u NNR- mutanta za semiaerobních podmínek

s dusičnanem bylo potvrzeno i na úrovni mRNA (obrázek č. 29). Ve druhém případě jde o

„Short-chain dehydrogenase/reductase SDR“ (spot 7104, gen 2377), TR je kódován genem

2374. U posledního genu 2604 kódující „SSU ribosomal protein S30P / sigma 54 modulation

protein“ (spot 5202) se v okolí nachází kromě výše zmíněného TR (gen 2600) i TR z rodiny

MarR (gen 2601), který také náleží do superrodiny „winged helix“.

U dvou genů se v blízkosti nacházel TR z rodiny GntR. Tato rodina náleží opět do

superrodiny „winged helix“, na N-konci obsahuje vazebnou doménu helix-otáčka-helix, na

C-konci se nachází doména pro vazbu efektoru 33. Jedná se o protein „Transcriptional

activator, TenA family“ (spot 1114, gen 3673), který je sám o sobě transkripčním

regulátorem, navíc gen 3677 kóduje TR z rodiny GntR. Ve druhém případě jde o „TolB, N-

terminal domain protein“ (spot 5507,gen 0686), kde je TR kódován genem 0680.

Dalším typem TR, který byl nalezen v blízkosti lokusu 2 genů, je TR z rodiny LysR.

Většina proteinů z této rodiny jsou transkripčními aktivátory a zároveň negativně regulují

svoji vlastní expresi. V blízkosti N-konce obsahují vazebnou doménu helix-otáčka-helix 33.

Prvním genem je gen 0206 pro „Short-chain dehydrogenase/reductase SDR“ (spot 2206), kde

je TR z rodiny LysR kódován genem 0209. Druhým je gen 1697 kódující transketolasu (spot

5706), zde je TR kódován genem 1694.

TR z rodiny MerR kódovaný genem 2867 se nachází v blízkosti genu 2871 pro 3-

hydroxyacyl-CoA-dehydrogenasu (spot 8701). TR z této rodiny zprostředkovávají indukci

operonu pro rezistenci ke rtuti 33. Dalším nalezeným TR je transkripční antiterminační

protein NusG (gen 0742) v blízkosti genu 0745 pro „50S ribosomal protein L10“ (spot 1110).

Protein NusG je součásti transkripčního komplexu a ovlivňuje terminaci transkripce, navíc

interaguje s terminačním ρ-faktorem a RNA polymerasou 33. TR z rodiny AsnC (gen 0653)

59

se nachází nedaleko genu 0657 pro „Putative uncharacterized protein“ (spot 1121). Rodina

těchto TR se podílí na regulaci metabolismu aminokyselin a s tím spojenými procesy 33.

Hned vedle genu 3025 pro „Putative uncharacterized protein“ (spot 7114) se nachází TR

BadM z rodiny Rrf2. Některé proteiny z této rodiny se uplatňují jako represory, konkrétně u

BadM bylo prokázáno, že u bakterie Rhodopseudomonas palustris působí jako represor

exprese benzoyl-CoA-reduktasy 34.

Potvrzení operonu

Pomocí MS byly ve spotech identifikovány produkty genů 4982, 4983 a 4984, jež se

v genomu nacházejí za sebou. Profil exprese proteinů ve spotech byl stejný (obrázky č. 30-

32), dalo by se tedy předpokládat, že jsou přepisovány v jednom operonu, a tím pádem stejně

regulovány. Toto jsme validovali i na úrovni mRNA. Jak je vidět z obrázků č. 33-35, trendy

se opět shodují, až na hodnotu pro gen 4984 u NNR- S, kde se může jednat o odlehlý

výsledek.

„TonB-dependent receptors“

Protein s názvem „TonB-dependent receptor“ byl nalezen jako produkt různých genů

v několika spotech ve formě homologních proteinů. TonB je protein buněčné stěny gram-

negativních bakterií, který se podílí na transportu komplexů kovů (převážně sideroforů) přes

vnější membránu za spotřeby energie 35. Na TonB závislé transportéry (TonB-dependent

transporters) aktivně pumpují cheláty iontů železa (siderofory) přes vnější membránu do

buňky. Energie pro tyto transportéry je dodávána komplexem tří proteinů (TonB – in vivo

vytváří dimer, ExbB a ExbD), které využívají protonový gradient udržovaný na

cytoplazmatické membráně. Přesný mechanismus využití elektrochemického potenciálu

k importu sideroforů není jasný. Do této různorodé skupiny proteinů náleží například

transportéry pro citrát železitý (FecA), ferrichrom (FhuA), železitý enterobactin (FepA), další

organokovové sloučeniny, jako vitamin B12 (BtuB) 36, a také některé koliciny 37. Všechny

spoty obsahující „TonB-dependent receptor“ vykazovaly stejný trend, kdy exprese za

aerobních podmínek byla u všech mutantů výrazně snížená (tabulky V a VI), u divokého

60

kmene byla navíc exprese výrazně zvýšená za semiaerobních podmínek s dusičnanem ve

srovnání s ostatními kmeny za dané podmínky (tabulka VII, obrázky č. 36-38). Stejné trendy

se podařilo potvrdit i na úrovni transkriptů příslušných genů (obrázky č. 39-41).

V promotorech odpovídajících genů jsme nenalezli žádný FNR box, takže se dá

předpokládat, že mechanismus regulace nebude přímo závislý na FNR regulátorech.

V souhrnu lze říci, že denitrifikační enzymy a jejich regulace pomocí FNR proteinů je

jasně popsaná a dává fyziologický smysl. V případě proteinu „TonB-dependent receptor“ by

se dalo uvažovat o zapojení do transportu železa, které je stavební složkou denitrifikačních

enzymů. Fyziologická souvislost funkce detekovaných proteinů, jejichž promotory

neobsahují FNR-box, a předpokládaná regulace jejich genové exprese však jasná není a je

otázkou, zda je důsledkem prosté biologické variability, zda se jedná o evoluční pozůstatek,

anebo jde o regulaci za účasti proteinů s dosud neobjasněnou funkcí. Jako možné vysvětlení

se jeví také analogie s bakterií Pseudomonas aeruginosa 32, kde byly za využití

bioinformatické analýzy genomu popsány regulační sítě s různou hierarchií transkripčních

regulátorů. Regulátory z rodiny FNR proteinů přitom hrály dominantní roli, přičemž byly

prokázány regulace cílových proteinů prostřednictvím podřízených transkripčních regulátorů,

například z rodiny LysR nebo GntR. Pro detailní objasnění těchto hypotéz by však byla třeba

řada dalších analýz. Naše výsledky přitom prokazují použitelnost proteomických technik

k tomuto účelu.

61

VI. SOUHRN

Za využití 2-DE experimentu byl studován účinek regulačních proteinů typu FNR

(FnrP, NNR a NarR) bakterie P. denitrificans na globální proteomové úrovni. Proteomová

analýza potvrdila řadu známých mechanismů, které byly validovány jednak vyhledáním

FNR-boxů (rekogniční DNA sekvence FNR regulačních proteinů), jednak metodou

kvantitativní real-time PCR. To potvrzuje, že řádně designovaný a provedený proteomický

experiment je schopen takovéto regulace odhalit. Statistickou analýzou 2-DE gelů byly

nalezeny proteiny, jejichž exprese se mění v závislosti na růstových podmínkách (aerobní,

semiaerobní a semiaerobní s dusičnanem) nebo v závislosti na přítomnosti mutace v genu pro

regulační protein. Ne u všech takto zjištěných proteinů je ale jasná jejich biologická funkce.

Na základě kvantitativní analýzy spotů obsahující proteiny kódované geny 4982,

4983 a 4984, které vykazovaly stejný profil exprese, a následně na základě real-time PCR

(stanovení hladiny transkriptů daných genů) se podařilo potvrdit, že tyto geny jsou

přepisovány z jednoho operonu.

Zajímavá změna v expresi byla odhalena u proteinů s názvem „TonB-dependent

receptor“, které jsou součástí transportního systému pro kovy (železo) přes vnější membránu

bakterií. Je zde zřejmá jistá regulace v expresi, která byla potvrzena i pomocí real-time PCR.

Regulace těchto proteinů ale pravděpodobně nebude přímo závislá na regulátorech typu

FNR.

V tzv. „postgenomové“ éře, kdy už existuje osekvenovaný genom daného organismu,

nejde jen o to pochopit funkce všech proteinů anotovaných v genomu, ale další výzvou je

bezesporu porozumění globální regulaci exprese těchto proteinů. Při přechodu z aerobního

metabolismu P. denitrificans k denitrifikaci se na regulaci exprese zcela jistě nepodílí jen

samotné transkripční regulátory FnrP, NNR a NarR. Tato regulace bude určitě složitější. Je

také pravděpodobné, že pro různé proteiny se budou uplatňovat různé mechanismy regulace.

62

VII. SUMMARY

A role of FNR-type regulation proteins (FnrP, NNR and NarR) in the bacterium

Paracoccus denitrificans was studied on the global proteomic level using 2-DE experiment.

Proteomic analysis confirmed several known mechanisms that were validated by both

searching of FNR-boxes (DNA recognition sequence motif of FNR-type regulators) and

quantitative real-time PCR method. It certifies that a properly designed and realized

proteomic experiment is able to reveal such regulations. There were proteins found by the

statistical analysis of 2-DE gels whose expression is altered depending on either growth

conditions (aerobic, semiaerobic and semiaerobic with nitrate) or a mutation of the gene of

the regulation protein. However the biological role of some of these proteins remains unclear.

Based on the quantitative analysis of the spots containing the proteins encoded by

genes 4982, 4983 and 4984, that exhibited the same expression profile, and subsequently

based on real-time PCR (determination of particular gene transcripts level), it was

acknowledged that these genes are transcribed in the same operon.

There was an interesting altered expression of proteins called TonB-dependent

receptor revealed. Such proteins are part of the metal (especially iron) transport systems

across the outer membrane of the bacteria. Regulation of the expression is evident and it was

validated by real-time PCR. But regulation of these proteins is probably not FNR-type

regulators dependent.

In the so called “postgenomic” age as there is a genome of particular organism

sequenced it is not only the understanding the proteins function itself but another challenge

there is the understanding of the global regulation of the proteins expression. During the shift

from aerobic metabolism to denitrification in P. denitrificans there are surely more effects

than only transcription regulators FnrP, NNR and NarR participating in the regulation of the

expression. This regulation is certainly more complex, it is probable that for different

proteins there are different regulation mechanisms involved.

63

VIII. LITERATURA

1. Otten M.F., van der Oost J., Reijnders W.N.M., Westerhoff H.V., Ludwig B. and van

Spanning R.J.M. (2001), Cytochromes c550, c552 and c1 in the electron transport network

of Paracoccus denitrificans: Redundant or subtly different in function?, J. Bacteriol.,

183, 7017 – 7026

2. Otten M. F., Stork D. M., Reijnders W. N. M., Westerhoff H. V. and van Spanning R. J.

M., (2001), Regulation of expression of terminal oxidases in Paracoccus denitrificans.,

Eur. J. Biochem., 268, 2486-2497

3. Zickermann I., Anemüller S., Richter H. O.-M., Tautu S.O., Link A.T., Ludwig B., (1996),

Biochemical and spectroscopic properties of four-subunit quinol oxidase (cytochrome

ba3) from Paracoccus denitrificans., Biochim. Biophys. Acta, 1277, 93 – 102

4. Baker S.C., Ferguson S.J., Ludwig B., Page M. D., Richter H. O.-M. and van Spanning R J

M., (1998), Molecular genetics of the genus Paracoccus: Metabolically versatile bacteria

with bioenergetic flexibility., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, 1046-1078

5. Zumft W. G., (1997), Cell biology and molecular basis of denitrification, Microbiol.

Mol. Biol. Rev., 61(4), 533-616.

6. Wood N. J., Alizadeh T., Bennett S., Pearce J., Ferguson S. J., Richardson D. J. and Moir

J. W. B., (2001), Maximal expression of membrane-bound nitrate reductase in

Paracoccus is induced by nitrate via a third FNR-like regulator named NarR, J.

Bacteriol., 183(12), 3606-13

7. Veldman R., Reijnders W. N. M., van Spanning R. J. M., (2006), Specificity of FNR-type

regulators in Paracoccus denitrificans, Biochem. Soc. Trans., 34(Pt 1), 94-6

64

8. Lazazzera A. B., Beinert H., Khoroshilova N., Kennedy M. C., Kiley P. J., DNA binding

and dimerization of the Fe–S-containing FNR protein from Escherichia coli are

regulated by oxygen, J. Biol. Chem., 271, 2762-2768

9. van Spanning R. J. M., De Boer A. P. N., Reijnders W. N. M., Spiro S., Westerhoff H. V.,

Stouthamer A. H. a van der Oost J., (1995), Nitrite and nitric oxide reduction in

Paracoccus denitrificans is under the control of NNR, a regulatory protein that belongs

to the FNR family of transcriptional activators, FEBS Lett., 360(2), 151-4

10. van Spanning R. J. M., Houben E., Reijnders W. N. M, Spiro S., Westerhoff H. V. and

Saunders N., (1999), Nitric oxide is a signal for NNR-mediated transcription activation

in Paracoccus denitrificans, J. Bacteriol., 181(13), 4129-32

11. Lee Y. Y., Shearer N and Spiro S., (2006), Transcription factor NNR from Paracoccus

denitrificans is a sensor of both nitric oxide and oxygen: isolation of nnr* alleles

encoding effector-independent proteins and evidence for a haem-based sensing

mechanism, Microbiology, 152(Pt 5), 1461-70

12. Görg A., Weiss W., Dunn J. M., (2004), Current two-dimensional electrophoresis

technology for proteomics, Proteomics, 4, 3663-3685

13. López J. L., (2007), Two-dimensional electrophoresis in proteome expression

analysis, J. Chromatogr. B, 849, 190-202

14. Westermeier R., Naven T., (2002), Proteomics in practice, Wiley-VCH Verlag-GmbH,

Weinheim, ISBN 3-527-30354-5, 43

15. Liebler D. C., (2002), Introduction to proteomics: tools for the new biology, Humana

Press Inc., ISBN 0-89603-991-9, 55-69

65

16. Kodíček M., (2007), transkripce reversní. Biochemické pojmy: výkladový slovník,

Praha, VŠCHT , http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002/ebook.html?p=transkripce_reversni,

20.1.2009

17. Voet D., Voet G. J., (2004), Biochemistry, 3rd edition, ISBN 0-471-19350-x, 113

18. Šmarda J., Doškař J., Pantůček R., Růžičková V., Kostíková J., (2005), Metody

molekulární biologie, 124-125

19. Pavlík E., Pavlíková A., (2004), Molekulárně biologické techniky pro

mikrobiologickou diagnostiku – část 11, Labor Aktuell, 3, 10-13

20. Ginzinger G. D., (2002), Gene quantification using real-time quantitative PCR: An

emerging technology hits the mainstream, Exp. Hematol., 30(6), 503-512

21. Antonín Libra, Kvantifikace genové exprese pomocí real-time PCR, http://mat.skola-

biotechnologie.cz/2006/III.workshop/Q_PCR.pdf, 22.2. 2009

22. Tereza Vyhlídalová, (2007), Metabolická odezva bakterie Paracoccus denitrificans na

změny redoxního stavu prostředí, diplomová práce, MU, Brno

23. Bouchal P., Přecechtělová P., Zdráhal Z., Kučera I., (2004), Protein composition of

Paracoccus denitrificans cells grown on various electron acceptors and in the presence

of azide. Proteomics, 4, 2662-2671

24. Santoni V., Molloy M., Rabilloud T., (2000), Membrane proteins and proteomics: un

amour impossible?, Electrophoresis, 21(6), 1054-70

25. Läemmli U. K, (1970), Cleavage of structural proteins during the assembly of the

head of bacteriophage T4, Nature, 227(5259), 680-5

66

26. van Spanning R. J. M., Vrije Universiteit Amsterdam, nepublikovaná data

27. Kunitz, M., (1950), Crystalline desoxyribonuclease; isolation and general properties;

spectrophotometric method for the measurement of desoxyribonuclease activity, J. Gen.

Physiol., 33(4), 349-362

28. Constantinidou C., Hobman J. L., Griffiths L., Patel M. D., Penn C. W., Cole J. A.,

Overton T.W., (2006), A reassessment of the FNR regulon and transcriptomic analysis of

the effects of nitrate, nitrite, NarXL, and NarQP as Escherichia coli K12 adapts from

aerobic to anaerobic growth, J. Biol. Chem., 281(8), 4802-15

29. Nandi B., Nandy R. K., Sarkar A., Ghose A. C., (2005), Structural features, properties

and regulation of the outer-membrane protein W (OmpW) of Vibrio cholerae,

Microbiology, 151(9), 2975-86

30. Hong H., Patel D. R., Tamm L. K., van den Berg B., (2006), The outer membrane

protein OmpW forms an eight-stranded beta-barrel with a hydrophobic channel, J.

Biol. Chem., 281(11), 7568-77

31. Pilsl H., Šmajs D., Braun V., (1999), Characterization of colicin S4 and its receptor,

OmpW, a minor protein of the Escherichia coli outer membrane, J. Bacteriol., 181(11),

3578-81

32. Potvin E., Sanschagrin F., Levesque R. C., (2008), Sigma factors in Pseudomonas

aeruginosa, FEMS Microbiol. Rev., 32(1), 38-55

33. http://pfam.sanger.ac.uk, 12.4. 2009

67

34. Peres C. M., Harwood C. S., (2006), BadM Is a Transcriptional Repressor and One of

Three Regulators That Control Benzoyl Coenzyme A Reductase Gene Expression in

Rhodopseudomonas palustris, J. Bacteriol., 188(24), 8662–8665

35. Kaserer W. A., Jiang X., Xiao Q., Scott D. C., Bauler M., Copeland D., Newton S. M.,

Klebba P. E., (2008), Insight from TonB hybrid proteins into the mechanism of iron

transport through the outer membrane, J. Bacteriol., 190(11), 4001-16

36. Ferguson A. D., Amezcua C. A., Halabi N. M., Chelliah Y., Rosen M. K., Ranganathan

R., Deisenhofer J., (2007), Signal transduction pathway of TonB-dependent transporters,

Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 104(2), 513-18

37. Mikalová L., (2007), Produkce specifických antibakteriálních agens u Salmonella

enterica, diplomová práce, MU, Brno

Documents

Diplomka Complete[1]