Forschungsbericht 2014 15

AnAtomie

Institut für Zellbiologie im Zentrum Anatomie

�� Direktor: Prof. Dr. Ernst UngewickellTel.: 0511/532-6744 • E-Mail: Ungewickell.Ernst@mh-hannover.de • www.mh-hannover.de/zellbiologie.html�� Keywords: Anatomie, Adaptoren, Bin 1, Biokompatibilität, Clathrin, Detergenz-resistente Membranen, Implantate, Medicalschoolbook, MHC

I, Regeneration, Virus, Zellbiologie

Forschungsprofil

Im Mittelpunkt des Forschungsinteresses der Abteilung stehen:1) die Aufklärung der Mechanismen bei der Clathrinkäfigbildung; 2) die Entwicklung nanobiotechnologischer An-sätze zur Nutzung von Clathrinnetzwerken auf Oberflächen; 3) Untersuchungen von Transportvorgängen bei der Antigenprozessierung; 4) Aufklärung der Funktion von Clathrin und Adaptoren bei der Phagozytose; 5) Interaktionen der verschiedenen Gewebe mit biokompatiblen Implanatatmaterialien im Mittelohr und kardiovaskulären System; 6) Untersuchungen zur Funktion von Amphiphysin in der Niere. Zur Bearbeitung unserer Fragestellungen werden biochemische, molekularbiologische, fluoreszenzmikroskopische und elektronenmikroskopische Methoden eingesetzt.

Forschungsprojekte

Einfluss der Oligomerisierung von MHC I auf seine Membrandomänenassoziation und EndozytoseEine adaptive Immunreaktion gegen Viren und einige in Körperzellen parasitierende Bakterien beruht im Wesentlichen auf MHC I-Molekülen. Diese stellen auf der Oberfläche einer infizierten Zelle kleine Stücke des Pathogens wie auf einem Präsentationsteller zur Schau. Die präsentierten Stücke können dann von spezifischen zytotoxischen T-Zellen erkannt werden. Das hat drastische Konsequenzen, denn die infizierte Zelle wird daraufhin von der zytotoxischen T-Zelle in eine Art von Selbstmord getrieben, was die weitere Ausbreitung der Pathogene im Organismus unterbindet.

Dass MHC I-Moleküle bereits kurz nach ihrer Biosynthese im rauen Endoplasmatischen Retikulum der Wirtszelle mit Pathogenbruchstücken beladen werden und danach zur Zelloberfläche transportiert werden, ist bereits lange bekannt. In den letzten Jahren ist die Beladung von MHC I-Molekülen mit Bruchstücken von Pathogenen, die von außen aufgenommen worden sind, in den Fokus des Forschungsinteresses gerückt. Solche als "cross presentation" bezeichneten Vorgänge spielen bei der Initiation einer adaptiven Immunantwort gegen Viren- oder Bakterien-infizierte Körperzellen eine große Rolle und sind in der Regel auf wenige, spezialisierte Zelltypen beschränkt. Dabei erfolgt die Beladung von MHC I oft innerhalb von endozytotischen Kompartimenten, zu denen MHC I durch Endozytose von der Plasmamembran gelangt. Der erste Schritt dieses Transportvorgangs wird auch als wichtig für den normalen "turno-ver" von MHC I-Molekülen angesehen, ist in mehreren Zelltypen untersucht und beruht auf einem Arf6-regulierten, Dynamin2-unabhängigen Mechanismus.

Endozytose von MHC I lässt sich bei zwei weiteren Prozessen beobachten: zum einen bei der Aufnahme von SV40-Viren, die an das Sphingolipid GM1 und an MHC I binden und so in die Wirtszelle gelangen. Zum anderen fungieren MHC I-Moleküle als Liganden für inhibierende Rezeptoren von natürlichen Killer(NK)-Zellen (KIRs), was die Bildung einer temporären immunologischen Synapse zwischen NK-Zelle und Zielzelle einleitet. Bei der Auflösung der Synapse kommt es zur Internalisation von KIR-MHC I-Komplexen in die Zielzelle, wobei der zugrundeliegende Mechanismus noch nicht verstanden ist. Allerdings scheint beiden Vorgängen eine Internalisierung von oligomeren MHC I Molekülen

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zugrunde zu liegen. Wir haben deshalb die Endozytosewege von oligomeren und nicht-oligomeren MHC I-Molekülen in einem Modellsystem verglichen.

Anstelle eines natürlichen Liganden von MHC I haben wir zur Oligomerisierung Antikörper eingesetzt und zunächst in sogenannten "co-patching" Experimenten untersucht, inwieweit sich oligomerisiertes MHC I in unterschiedliche Membrandomänen der Plasmamembran verteilt (Abb. 1). Oligomerisiertes MHC I co-lokalisierte dabei mit GM1 als Marker für Cholesterin- und Spingolipid-reiche Membrandomänen, aber nicht mit Caveolin-1, einem Marker für Einstül-pungen der Plasmamembran (Caveolae), die auch bei Endozytosevorgängen eine Rolle spielen können. Biochemische Äquivalente von Membrandomänen lassen sich nach Extraktion mit dem Detergenz Brij98 in Flotationsgradienten isolieren, und hierbei zeigte sich, dass etwa 50 % der MHC I Moleküle nach Oligomerisierung durch Antikörper und Ultrazentrifugation in die Position von Detergenz-resistenten Membranen flotieren, während MHC I ohne vorherige Oligomerisierung praktisch vollständig vom Detergenz aus der Membran gelöst wird (Abb. 2). Interessanterweise führte eine Oligomerisierung des Sphingolipids GM1 durch Choleratoxin B zur Verschiebung seiner Flotationsposition, die nun mit der von oligomerisiertem MHC I überlappt. Dies deutet darauf hin, dass sich sowohl MHC I als auch GM1 nach Oligomerisierung in einer ähnlichen Membrandomäne befinden. Diese ist frei von Caveolin, wie wir in Immuni-solationsexperimenten zeigen konnten.

Abb. 1: Co-Lokalisation von oligomerisiertem MHC I (rot) mit GM1 (nach Bindung an Choleratoxin-B (CTB), grün, oben) oder mit Caveolin1 (grün, unten) in 3T3 Fibroblasten. Die Oligomerisierung erfolgte nach Bindung von Antikörpern/CTB durch 5-minütige Inkubation bei 37oC ("patching"). Dargestellt sind konfokale Schnitte (etwa 600 nm Dicke) auf Ebene der Plasmamembran. Abb. 2: Flotationsanalyse von Brij98-resistenten Membranen. 3T3-Fibroblasten wurden mit anti-MHC I Antikörpern bzw. CTB behandelt oder unbehandelt belassen. Nach "patching" erfolgte eine Extraktion mit dem Detergenz Brij98 und die Trennung von löslichen Material und Brij98-resistenten Membranen durch Ultrazentrifugation in 10-40 % Sucrosegradienten.

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Mit der Membrandomänenassoziation von MHC I nach Oligomerisierung geht auch eine Veränderung im Endozytoseverhalten von MHC I einher: Oligomerisiertes MHC I wird wesentlich schneller internalisiert als die nicht-oligomerisierte Form (Abb. 3, rechts) und es werden unterschiedlich lokalisierte endozytotische Kompartimente (Abb. 3, links) erreicht. Da dieser Befund auf die Existenz unterschiedlicher Endozytosewege hinwies, haben wir diese in Hinblick auf ihre Sensitivität gegenüber transfizierten dominant-interferierenden GTP-bindenden Proteinen wie Arf6 Q67L und Dynamin2 K44A untersucht. Damit gelang es uns, für oligomerisiertes MHC I einen bislang noch nicht beschriebenen Arf6- und Dynamin2- unabhängigen Endozytoseweg zu charakterisieren und für nicht-oligomerisiertes MHC I den bereits bekannten Arf6-regulierten Endozytoseweg zu bestätigen. Die an diesem Modellsystem gewon-nenen Erkenntnisse sollen nun als Grundlage für eine Überprüfung der Befunde in NK-Synapsen und eventuell bei der Internalisierung von SV40-Virus dienen.

Abb. 3: Analyse der Endozytosekinetik von oligomerisiertem und nicht-oligomerisiertem MHC I in 3T3-Fibroblasten. Bildleiste links (nicht-oligomerisiert): MHC I auf der Zelloberfläche grün, endozytiertes MHC I im Zytoplasma rot. Bildspalte rechts (oligomerisiert): MHC I auf der Zelloberfläche gelb, endozytiertes MHC I rot. Abgebildet sind konfokale Schnitte mit einer Dicke von etwa 600 nm. Oligomerisiertes MHC I wird in verstreute Vesikel internalisiert, während sich nicht-oligomerisiertes MHC I in perinukleären endozytotischen Organellen anreichert. Diagramm: Quantifizierung der Endozytose von oligomerisiertem und nicht-oligomerisiertem MHC I mittels FACS-Analyse. Oligomerisiertes MHC I wird schneller und zu einem höheren Prozentsatz internalisiert als nicht-oligomerisiertes MHC I. Die Abflachung der Graphen deutet auf Recyclingprozesse hin.

�� Projektleitung: Lindner, Robert (Dr. rer. nat.)

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Weitere Forschungsprojekte

Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen zur Zellbiologie von Herpesviren�� Projektleitung: Bauerfeind, Rudolf (Dr. rer. nat.); Kooperationspartner: Sodeik, Beate (Prof. Dr. rer. nat.), Messerle,

Martin (Prof. Dr. rer. nat.), Schulz, Thomas (Prof. Dr. med.), Institut für Virologie; Bailer, Susanne (PD Dr. rer. nat.), Institut für Grenzflächenverfahrenstechnik IGVT, Universität Stuttgart; Diefenbach, Russel (PhD), Westmead Millennium Institute, Westmead, Australia; Förderung: bei den Kooperationspartnern

Ultrastruktureller Nachweis der zellbiologischen Effekte in der Mittelohrschleimhaut nach Einsetzen von Bioverit® II-Implantaten mit einer neuartigen Silbersilikatbeschichtung bei Kaninchen�� Projektleitung: Brandes, Gudrun (Dr. med.) unter Beteiligung des FWJler Wullstein, Maximilian; Kooperationspartner:

Duda, Franziska, Prenzler, Nils (Dr. med.), Lenarz, Thomas (Prof. Prof. Dr. med.), HNO-Klinik; Behrens, Peter (Prof. Dr.), Institut für anorganische Chemie, LUH; Förderung: DFG (SFB599 - Zukunftsfähige bioresorbierbare und permanente Implantate aus metallischen und keramischen Werkstoffen)

Elektronenmikroskopische Analyse des Einheilungsverhalten von biologischen und degradierbaren Implantaten im kardiovaskulären System�� Projektleitung: Brandes, Gudrun (Dr. med.); Kooperationspartner: Hinz, Carolyn (Dr. med. vet.), Schilling, Tobias (Dr.

med.), Cebotari, Serghei (PD Dr. med.), Haverich, Axel (Prof. Dr. med.), Kinik für Herz-, Thorax-, Transplantations- und Gefäßchirurgie; Förderung: DFG (SFB599 - Zukunftsfähige bioresorbierbare und permanente Implantate aus metallischen und keramischen Werkstoffen)

Ultrastrukturelle Untersuchung der Endozytose von murinen B-Zellen mit einem Defekt in LAMTOR2�� Projektleitung: Brandes, Gudrun (Dr. med.); Kooperationspartner: Kotlarz, Daniel (Dr. med.), Klein, Christoph (Prof.

Dr. med. Dr. sci. nat.), Genzentrum der Ludwig-Maximilians-Universität München

Allosterische Regulation der Bindung des AP2 Adaptor-Komplexes an Clathrin (Kelly et al., Science 345, 459-463 (2014)�� Projektleitung: Dannhauser, Philip (Dr. rer. nat), Ungewickell, Ernst (Prof. Dr. rer. nat.); Kooperationspartner: Owen,

David (Prof. Dr.), Kelly, Bernard (Dr.), University of Cambridge, Großbritannien; Höning, Stefan (Prof. Dr. rer. nat.), Universität zu Köln; Förderung: bei den Kooperationspartnern

Funktionelle und strukturelle Charakterisierung 2-dimensionaler Clathringitter auf Liposomen und Festphasen (Dannhauser et. al. Traffic in press)�� Projektleitung: Dannhauser, Philip (Dr.rer.nat), Ungewickell, Ernst (Prof. Dr. rer. nat.); Kooperationspartner: Schaap,

Iwan (Dr.), Physikalisches Institut der Universität Göttingen

Bin 1 (Amphiphysin 2): Charakterisierung, Lokalisation und Funktion im Nierenepithel�� Projektleitung: Groos, Stephanie (Dr. med.); Beteiligte Wissenschaftler: Bargsten, Anna (Arzt), Dannhauser, Philip

(Dr. rer. nat.), Wittrock, Inga-Mayte (Arzt); Kooperationspartner: Münster-Kühnel, Anja (Dr.), Weinhold, Birgit (Dr.), Institut für Zelluläre Chemie

Blended Learning im Studium der Humanmedizin: Erfahrungen mit dem "Medicalschoolbook Zellbiologie"�� Projektleitung: Groos, Stephanie (Dr. med.); Kooperationspartner: Behrends, Marianne (Dr.), Kupka, Thomas (Dr.),

Peter L. Reichertz Institut für Medizinische Informatik

Extraktion ähnlicher Gruppen detergenzresistenter Membranen durch unterschiedliche Detergenzien�� Projektleitung: Lindner, Robert (Dr. rer. nat.); Mitarbeiter: Möller, Hanna; Szaroszyk, Malgorzata (B.Sc.)

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Gap Junctions in der Leber bei Gallengangatresie im BALB/c-Mausmodell�� Projektleitung: Luciano, Liliana (Prof. Dr.); beteiligte Wissenschaftler: Groos, Stephanie (Dr. med.); Kooperationspartner:

Andruszkow, Julia (Dr. med.), Institut für Pathologie, Uniklinik RWTH Aachen; Petersen, Claus J. (Prof. Dr. med.), Klinik für Kinderchirurgie

OriginalpublikationenBoztug K, Järvinen PM, Salzer E, Racek T, Mönch S, Garncarz W, Gertz EM, Schäffer AA, Antonopoulos A, Haslam SM, Schieck L, Puchalka J, Diestelhorst J, Appaswamy G, Lescoeur B, Giambruno R, Bigenzahn JW, Elling U, Pfeifer D, Conde CD, Albert MH, Welte K, Brandes G, Sherkat R, van der Werff Ten Bosch J, Rezaei N, Etzioni A, Bellanne-Chantelot C, Superti-Furga G, Penninger JM, Bennett KL, von Blume J, Dell A, Donadieu J, Klein C. JAGN1 deficiency causes aberrant myeloid cell homeostasis and congenital neutro-penia. Nat Genet 2014;46(9):1021-1027

Carracedo S, Sacher F, Brandes G, Braun U, Leitges M. Redundant Role of Protein Kinase C Delta and Epsilon during Mouse Embryonic Development. PLoS One 2014;9(8):e103686

Happle C, Lachmann N, Skuljec J, Wetzke M, Ackermann M, Brennig S, Mucci A, Jirmo AC, Groos S, Mirenska A, Hennig C, Rodt T, Bankstahl JP, Schwerk N, Moritz T, Hansen G. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med 2014;6(250):250ra113

Hauser JT, Lindner R. Coalescence of B cell receptor and invariant chain MHC II in a raft-like membrane domain. J Leukoc Biol 2014;96(5):843-855

Kelly BJ, Bauerfeind R, Binz A, Sodeik B, Laimbacher AS, Fraefel C, Diefenbach RJ. The interaction of the HSV-1 tegument proteins pUL36 and pUL37 is essential for secondary envelopment during viral egress. Virology 2014;454-455:67-77

Kelly BT, Graham SC, Liska N, Dannhauser PN, Honing S, Un-gewickell EJ, Owen DJ. Clathrin adaptors. AP2 controls clathrin polymerization with a membrane-activated switch. Science 2014;345(6195):459-463

Wullstein M, Duda F, Abendroth P, Heemeier T, Esser KH, Behrens P, Prenzler N, Lenarz T, Brandes G. Phagocytic activity of the epi-thelium in the middle ear - A comparative electron microscopical study in rabbits implanted with various silica-coated Bioverit® II-TORPs for 21 days. Biomed Tech 2014;59:S73-S74

Abstracts2014 wurden 13 Abstracts publiziert.

PromotionenFett, Matthias (Dr. med.): Clathrin und Clathrin-assoziierte Proteine in der Fcγ-Rezeptor-vermittelten Phagozytose.