저 시-비 리- 경 지 2.0 한민

는 아래 조건 르는 경 에 한하여 게

l 저 물 복제, 포, 전송, 전시, 공연 송할 수 습니다.

다 과 같 조건 라야 합니다:

l 하는, 저 물 나 포 경 , 저 물에 적 된 허락조건 명확하게 나타내어야 합니다.

l 저 터 허가를 면 러한 조건들 적 되지 않습니다.

저 에 른 리는 내 에 하여 향 지 않습니다.

것 허락규약(Legal Code) 해하 쉽게 약한 것 니다.

Disclaimer

저 시. 하는 원저 를 시하여야 합니다.

비 리. 하는 저 물 리 목적 할 수 없습니다.

경 지. 하는 저 물 개 , 형 또는 가공할 수 없습니다.

이 사 논

상 포-신경 포간 상 작용과

소포체 스트 스가 알 이 병

병인 에 미 는 향 연구

Studies on the mechanism of

astrocyte-neuron interactions and ER

stress in Alzheimer’s disease

pathogenesis

2014 8 월

울 자연과 원

공 동과 공

i

상 포-신경 포간 상 작용과

소포체 스트 스가 알 이 병

병인 에 미 는 향 연구

지도 인 희

이 논 이 사 논 출함

2014 08 월

울 자연과 원

공 동과 공

이 사 논 인 함

2014 08 월

원 장 (인)

부 원장 (인)

원 (인)

원 (인)

원 (인)

ii

Studies on the mechanism of

astrocyte-neuron interactions and ER

stress in Alzheimer’s disease

pathogenesis

Interdisciplinary Graduate Program

in Genetic Engineering

In Seoul National University

By Eun Sun Jung

August, 2014

Doctor’s Committee:

Professor Chairman

Professor Vice chairman

Professor

Professor

Professor

iii

미 아 포 재 상 포는 알 이 병

(Alzheimer’s disease, AD) 병리 특징 나인

노인 (senile plaque) 주변에 공통 견 다.

상 포는 주변에 존재 는 신경 포 상 작용 면 ATP를

포함 여러 가지 신경아 달 질 분 다고 알 있지만

어떻게 신경 포 를 조 는지에 과

병인과 연 잘 알 있지 않다. 본 연구에 는

알 이 병에 신경아 달 질 나인 ATP 분 변

ATP가 신경 포에 어떻게 향 주고 그 인해 시냅스 가소 이

조 는지에 해 인 고자 다. 그 불어 신경아

달 질 분 시냅스 에 주요 역 담당 는 칼슘이

알 이 병에 소포체 스트 스를 도 다는 것이 알 있

에 소포체 스트 스가 알 이 병 원인 단 질인 베타

아 이드 (Aβ) 구 단 질 알 진 APP에 어떠 향

주는지 규명해 보고자 다. 알 이 병 원인 독

단 질인 Aβ에 해 신경아 달 질인 ATP 분 가

양 상 포에 증가 는 것 인 다. 이 게

분 ATP가 놀랍게도 Aβ처리에 해 해 시냅스

가소 과 이 있는 시냅스 신 달 구조

iv

단 질들 , Field EPSPs (Field excitatory postsynaptic

potentials; fEPSPs), 신경 포 상돌 가시 (dendritic spine)

도에 해 purinergic 용체를 통해 보 는 효과를

나타냄 양 해마 신경 포에 규명 다. Aβ는

포 내 칼슘 항상 해 다고 알 있고 이런 칼슘

스트 스를 롯 여 여러 종 소포체 스트 스를 도했

APP가 ubiquitin-proteasome system 통해 격 게 분해

인 다. 그리고 알 이 병에 처럼 proteasome 이

망가 있는 상황에 는 APP가 소포체 스트 스를 았

소포체에 상 축 는 것 찰 다. 라

상 포 신경 포 사이 상 작용과 신경아 달 질

분 포 내 스트 스 상황에 proteasome

조 다면 알 이 병 료를 약 개 새 운

목 있 것 다.

----------------------------------------------------------------------------------------------

주요어: 알 이 병, 베타 아 이드, 시냅스가소 , ATP, APP,

ER stress, 칼슘, UPS

번: 2009-30843

v

도 약어 목

3MA : 3-methyladenine

aCSF : artificial cerebrospinal fluid

Aβ : amyloid beta peptide

AD : Alzheimer’s disease

AMC : 7-amino-4-methylcoumarin

APP : amyloid precursor protein

ATPγS : adenosine 5’-[γ-thio] triphosphate

Baf : Bafilomycin

BACE : beta site APP-cleavage enzyme

DMEM : Dulbesco’s modifiec Eagle’s medium

EC50 : half maximal effective concentration

ECL : Enhanced chemiluminescence

ER : endoplasmic reticulum

ERAD : ER-associated degradation

fEPSPs : Field excitatory postsynaptic potentials

FBS : fetal bovine serum

HBSS : Hank’s Balanced Salt Solution

HRP : horse radish peroxidase

LTP : Long-term potentiation

NFT : neurofibrillary tangle

PFA : paraformaldehyde

PPADS : pyridoxal phosphate-6-azophenyl-2, 4’-disulphonic acid

sAPPα: soluble APP-alpha

TBS : theta burst stimulation

UPR : unfolded protein response,

UPS : ubiquitin-proteasome system

Veh : vehicle

vi

목 차

.............................................................................. i

도 약어 목 ....................................................... iii

목차............................................................................ iv

그림 목 ........................................................... v

.............................................................................1

실험재료 법 .......................................................13

결과...........................................................................24

고찰...........................................................................54

결 ...........................................................................67

참고 헌 ....................................................................68

( ) ...............................................................84

vii

그림 목

그림 1. Amyloid precursor protein 사과 ......................... 5

그림 2. 건강 추신경계에 상아 포 능.................. 6

그림 3. 상아 포 부 래 신 에 시냅스 과

시냅스후 시냅스 달 조 ......................................... 7

그림 4. 퇴행 신경질 과 UPS ................................................ 11

그림 5. 소포체에 일어나는 단 질 힘, 품질검사

신 달 ...................................................................... 12

그림 6. Primary astrocyte U373 포주에 Aβ42 처리

시 분 는 ATP ................................................ 30

그림 7. primary rat hippocampal neuron 에 Aβ42에

상돌 가시 도 감소에 ATP 효과

규명 ............................................................................. 31

그림 8. 해마 편에 Aβ42에 LTP 에

ATP 효과 규명 ........................................................ 32

그림 9. Primary hippocampal neurons에 Aβ42에 해

감소 시냅스 단 질에 ATP 효과 인 ............. 35

그림 10. Aβ42에 해 감소 는 시냅스 단 질에

viii

ATP 효과가 P2 purinergic 용체를 통함

PPADS를 이용 여 규명 ............................................. 37

그림 11. 포 내 칼슘증가가 APP 사과 에 미 는 향

인 ............................................................................. 45

그림 12. 소포체 스트 스가 APP 분해를 도함 인 ...... 47

그림 13. APP가 소포체 스트 스 상황에 APP가

아좀에 특이 인 경 를 통해 분해 인 .. 49

그림 14. 포 내 칼슘 증가에 APP 퀴틴 인 ... 50

그림 15. 소포체 스트 스가 소포체 연 단 분해과

통해 APP 안 조 함 규명........................... 51

그림 16. 소포체 스트 스 상황에 아좀 해 시

APP가 소포체에 축 인 ................................... 53

1

알 이 병 (Alzheimer’s disease; AD) 장 간에 걸

시냅스 신경 포 능 사멸에 인 는 인

퇴행 신경질 매 자 50~60%가 이에 해당 다.

임상 인 특징 는 억과 단, 언어능 등과 같 지 능

진 인 감퇴 일상생 능 , 인격, 행동양상 장애 등이 알

있다. 달과 불어 근 평균 명이 증가 에 라

부분 노인 에 병 게 는 특징과 맞 알 이 병

앓고 있는 자 는 계속 증가 고 있는 추 이다 (1).

알 이 병 가장 인 병리 특징 상

과다생 과 불충분 거 포 에 베타 아 이드 (amyloid

beta peptide; Aβ)가 축 어 나타나는 노인 (senile

plaque)과 포 내 tau 단 질 과인산 인 신경 덩어리

(neurofibrillary tangle; NFT)가 있다 (2). Aβ는 베타-

시크리 아 (β-secretase, BACE1) 감마-시크리 아 (γ-

secretase complex)에 해 아 이드 구 단 질 (amyloid

precursor protein; APP)이 차 잘리면 생 다

(3)(그림 1).

Part 1. 신경아 달 질인 ATP가 Aβ에 시냅스

2

가소 변 에 미 는 향 연구

알 이 병 주요 병리 특징인 노인 주변에 는

미 아 포 재 상 포, 그리고 퇴행

신경 포들이 찰 다고 보고 었다 (4, 5). 상 포는

추신경계를 구 는 포 에 가장 많 존재는

주요 신경 포 종 이다 (6). 상 포는 주변에

존재 는 신경 포, 뇌 포 그리고 다른 신경 포들 요

트 포 신경 포 구조 사를 돕는 능뿐만 아니라

뇌에 신경 조 주도 있다. 상 포

주요 능 나는 신경 포 시냅스 간극에 신경 달 질

는 신경아 달 질들 거나 분 는 것이다 (그림 2)

(7). 신경아 달 질 신경 포 부 분 는 질

상 포는 직 glutamate, D-serine, ATP 같

신경아 달 질들 분 여 신경 포 용체를

있다 (8). 상 포에 분 는 glutamate는 신경 포

분 에 많 효과를 가함이 알 있는 면에 D-serine

NMDA 용체가 매개 는 시냅스 가소 조 에 여 다는

보고가 있다 (그림 3) (9, 10). 그리고 상 포 부 분

ATP는 요 포 신 달 질이면 직 는

사산 인 adenosine 통해 시냅스 달 조 는 purinergic

용체 내 리간드 작용 다고 알 있다 (그림 3) (11,

3

12). 상 포 래 ATP는 시냅스 후 purinergic 용체

통해 mEPSCs (miniature EPSPs) 진폭 증가시키는

면에 편 는 해마부 에 GABAergic 뉴런이 매개 는

이종 시냅스 에 여 다는 보고가 있다 (13, 14). 이는

상 포가 여러 종 상아 달 질 분 여 신경

를 여러 법 조 있 것 상 있고

상아 달 질 신경 포 는 시냅스에 라 다른

역 있 것 사료 다.

상 포는 알 이 병 모델 마우스 뇌 Aβ가

축 어있는 노인 주변에 견 고 이는 상 포

노인 사이에 요 상 작용이 존재 다는 것 미 다 (15,

16). 그러나 상아 달 질, 그 에 도 ATP가

알 이 병 병인 에 어떤 향 미 는 지에 해 는

명 게 지지 않았다. 라 본 연구에 는 ATP가 시냅스

에 향 미 는 지에 해 알아보고자 다.

본 연구에 는 Aβ 있는 시냅스 변 가 상아

달 질인 ATP에 해 보 다는 것 인 다.

구체 살펴보면, Aβ1-42 에 해 도 시냅스 단 질들

양, 상돌 가시 (dendritic spine) 도 그리고 장 상승 작용

(Long-term potentiation; LTP) 포함 시냅스 가소 해

변 가 ATP에 해 복구 는 것 실험 증명 다.

4

나아가 본 연구에 는 ATP 이 같 보 인 역 이 P2

purinergic 용체 신 달 경 를 통해 매개 추가

인 다. 이 같 여러가지 결과들 종합해 보았 상아

달 질 나인 ATP가 신경독 는 Aβ가 원인이 는

여러 시냅스 능 장애들에 여 보 인 역 다는 것

규명 다. 라 상아 달 질인 ATP를 통

상 포 신경 포 사이 상 작용이 시냅스 조 에 매우

요 역 것 는 이다.

5

(Vingtdeux et al. Front. Physiol., 05 July 2012)

그림 1. Amyloid precursor protein 사과

6

(Acta Neuropathol (2010) 119:7–35)

그림 2. 건강 추신경계에 상아 포 능

7

(Philip G. Haydon et al, Physiological Reviews, 1 July 2006)

그림 3. 상아 포 부 래 신 에 시냅스 과

시냅스후 시냅스 달 조

8

Part 2. 소포체 스트 스가 베타 아 이드 구 단 질

조 는 연구

칼슘 뇌에 일어나는 다양 일들에 해 매우 요 역

다는 것 잘 알 있다. 이런 칼슘이 알 이 병 자

뇌에 보이는 퇴행 신경 포에 그 양이 증가 어 있다는

보고가 있다 (17). 베타 아 이드 구 단 질 (amyloid

precursor protein; APP) 내재 막 단 질 알 이 병

병인 에 요 역 다. 여러 보고들 통해 칼슘

항상 불균 이 APP 사과 에 향 다는 것이

알 있다 (18, 19). 이런 칼슘과 APP 사과 간 요 에도

불구 고 이 부 인 작 많이 알 있지 않다.

퀴틴- 아좀 시스 (ubiquitin-proteasome system;

UPS)는 진핵 포에 단 질 포 내 주요

경 이면 (20) 알 이 병 뿐만 아니라 헌 병, 킨슨병,

리 병 그리고 루게릭병 포함 여러 종 퇴행

신경질 과도 이 있다는 것이 보고를 통해 알 진

있다 (그림 4) (21). 근 규명 증거들 상 인 단 질

힘과 집이 다양 퇴행 신경질 공통 인 원인인 것과

동시에 병리 인 변 를 보인다고 시 고 있다. 퀴틴

알 이 병 가지 주요 병리 특징인 노인 과

신경 덩어리 모 에 축 어 있 이 보고 었다 (22, 23).

9

몇몇 연구자들 아좀 이 알 이 병 자 뇌에

변질 어있 인 고 이 결과를 통해 아좀

시스 상 인 조 이 알 이 병 생에 게

계 어 있 시 다 (24, 25). 퀴틴- 아좀

시스 (UPS) 소포체 스트 스에 해 매개 는 잘못

진 단 질들 분해에 매우 요 역 다 (26). 이

같 상 인 소포체 단 질들 증가는 매우 신속히 ‘ 히지

않 단 질 ’ (unfolded protein response, UPR)과 소포체

연 단 분해 과 (ER-associated degradation; ERAD)

시킨다고 알 있다 (27, 28) (그림 5). 상 인 칼슘

항상 소포체 스트 스 능 를 도 는 요인

나이다 (29).

APP 는 소포체에 만들어 진 뒤 분 경 를 통해 원 질막

이동 뒤 알 -시크리 아 에 해 잘 지면 신경보 질

가진 sAPPα (soluble APP-alpha)를 는 면, 신경독

는 Aβ는 소포체 골지/후 골지망에 베타-시크리 아

감마-시크리 아 차 인 단에 해 생 다 (30, 31).

그러므 APP 사과 과 포 내 에 연구는

알 이 병 병인 히는데 있어 요 다. 근

연구들 상 인 칼슘 항상 포함 소포체 스트 스가

APP 사과 에 향 미 뿐만 아니라 알 이 병

10

심 인 병리 상임 시사 다 (32). 그 지만 소포체

스트 스 상황에 APP 사과 과 UPS 경 사이 계는

진 가 미 다. 본 연구에 는 이러 상 인 포 내

칼슘 양 증가 같 소포체 스트 스 상황에 APP 가 APP

퀴틴 를 조 는 효소 상 작용에 해 UPS 를 통 여

매우 극 인 분해를 겪게 인 다.

11

Neuron, Vol. 40, 427–446, October 9, 2003

그림 4. 퇴행 신경질 과 UPS

12

Kidney International (2010) 77, 187–193

그림 5. 소포체에 일어나는 단 질 힘, 품질검사 신 달

13

실험 재료 법

Part 1. 신경아 달 질인 ATP 가 Aβ에 시냅스

가소 변 에 미 는 향 연구

1. 실험에 이용 실험동

Primary hippocampal neuronal culture를 해 암컷 Sprague-

Dawley rats (KOATECH, Korea) 18일 아 (embryos;

E18) 임신 ICR mice 부 출생 날 (postnatal day 1;

P1) 새끼 를 이용 여 primary hippocampal neuronal

culture astrocyte culture를 다. field EPSPs

(fEPSPs)를 여 3~4개월 컷 C57BL/6 mice를

사용 다.

2. 포주 (Cell lines) 포 양

포는 human astrocyte 포주인 U373 사용 고 0.1 mg/ml

penicillin/streptomycin (P/S; Sigma, MO, USA)과 10% fetal

bovine serum (FBS; Hyclone, UT, USA)이 포함 Dulbesco’s

modifiec Eagle’s medium (DMEM; Hyclone, UT, USA)에

37℃, 5% CO2 조건에 양 다. P1 ICR mice

hippocampus cortex 부분 분리 여 잘게 자른 다 Hank’s

14

Balanced Salt Solution (HBSS; WelGENE, Korea)에 후

0.5% trypsin (2.5% trypsin; Sigma, MO, USA) 나

포 분리시키는 과 거 다. 분리 포는 포 를

후에 poly-D-lysine (Sigma, MO, USA) 해 plate에

아 다. Astrocyte culture는 cortex 부 분리 포를 U373

포 동일 조건에 양 고 hippocampal neuron

0.1mg/ml PS, L-glutamine (0.5 mM), B27 (Invitrogen,

California, USA)이 포함 neurobasal medium (Invitrogen,

California, USA)에 양 다.

3. 시약 시약처리

ATP, adenosine 5’-[γ-thio] triphosphate (ATPγS), PPADS

(pyridoxal phosphate-6-azophenyl-2, 4’-disulphonic acid; a

P2X purinergic receptor antagonist)는 Sigma에 구입 고

Aβ1-42는 American Peptide (Sunnyvale, CA, USA)에

구입 다. Aβ1-42는 U373 포 astrocyte에 각각 2 는 10,

2 는 4 μM 농도 3시간 처리 고 primary hippocampal

neuron에는 2 μM 48시간 동안 처리 다. ATP ATPγS

그리고 PPADS는 Aβ1-42 처리 30분 에 미리 처리 다.

15

Primary neuron에 시약 처리 에는 존 양 미 어

거 고 새 양 미 어 에 종 처리 농도 시약 희

다 추가 는 법 사용 다.

4. 생리

(본 실험 포항공 훈 님 실험실에 진행 다)

Field EPSPs (fEPSPs)를 3~4개월 컷 C57BL/6 부

얻 해마 편 (400 μm 께)에 다. 해마 조직

37℃ 산소 (95% O2, 5% CO2) 인공 뇌척 액 (artificial

cerebrospinal fluid ; aCSF)에 1시간 이상 고 계속해 산소

aCSF를 시 주었다. fEPSPs는 해마 CA1 striatum

radiatum 부 에 microelectrode를 이용 여 다. LTP는

5번 0.1Hz theta burst stimulation (TBS) 도 다.

데이 는 Axopatch 200A amplifer Digidata 1200 (Axon

Instrument)를 통해 얻었다.

5. Western Blot

단 질 양 해 시약 처리가 난 포에 RIPA

buffer를 이용 여 단 질 추출 고 BCA 법 량

16

다. 량 후 20~30 μg 단 질 8% SDS-PAGE gel에

동 고 PVDF membrane (millipore, MA, USA)에 4℃에

90분간 transfer 후 1시간 동안 5% skim milk 실 에

blocking 다. 이 후 보고자 는 단 질에 특이 인 1차

항체를 4℃에 루 동안 시킨 후 horse radish peroxidase

(HRP)가 결합 2차 항체를 상 에 1시간 동안 처리 다.

단 질에 결합 항체는 Enhanced chemiluminescence (ECL)

solution (GE Healthcare) 이용 여 LAS-3000 (Fugi photo

Film, Japan) 분 다. 사용 1차 항체는 다 과 같다.

Anti-NMDAR2A antibody (1:2000; Millipore, MA, USA), anti-

NMDAR1 antibody (1:2000; Cell Signaling Technology, MA,

USA), anti-PSD-95 antibody (1:2000; Abcam), anti-β-actin

(1:2000; Sigma-Aldrich, MO, USA), and anti-tubulin antibody

(1:2000; Applied Biological Materials).

6. ATP

U373 포 astrocyte에 분 는 ATP를 해 ATP

determination kit (A22066; Invitrogen)를 사용 다.

Luciferase가 substrate인 luciferin 자르 해 ATP가

17

사용 는 원리를 이용 여 ATP를 는 법 시약 처리가

난 후 양 포 지 100 ㎕를 kit에 공 는 용액과

시킨 다 luminometer (Infinite M200, Tecan)

분 다.

7. Phalloidin 염색

신경 포 상돌 가시 (dendritic spine) 도 도를

인 해 phalloidin 염색 다. 시약 처리 후 PBS

번 척 고 4% paraformaldehyde (PFA) 실 에 10분간

고 뒤 0.1% Trioton X-100 3~5분간 실 에

permeabilization시킨다. 그 다 PBS 다시 척 고

는 Alexa Fluor 488-phalloidin fluorescent Phallotoxin

(Invitrogen) 상 에 20분간 염색 다. 염색 포는

공 이 미경 (LSCM; Olympus Fluoview 300)

분 다.

8. 상돌 가시 (Dendritic Spine) 도 분

공 이 미경 찍 신경 포 Phalloidin 염색

사진에 신경 포 상돌 부 일 이 내에 존재 는

18

spine 개 를 어 평균값 계산 여 조군과 실험군 차이를

다.

9. 통계처리

모든 결과는 mean ± SEM 값 나타내었다. 모든 통계

분 GraphPad Prizm 5를 사용 고 그룹 간 는 one-way

ANOVA Tukey’s multiple-comparisons test를 이용 여

분 다. 통계 인 분 p값이 0.05 이 일 경우

미 다고 다.

19

Part 2. 소포체 스트 스가 베타 아 이드 구 단 질

조 는 연구

1. 포주 (Cell lines) 포 양

포는 CHO, 7w-PSML, HEK293 포주를 사용 고 0.1

mg/ml penicillin/streptomycin (P/S; Sigma, MO, USA)과 10%

fetal bovine serum (FBS; Hyclone, UT, USA)이 포함

Dulbesco’s modifiec Eagle’s medium (DMEM; Hyclone, UT,

USA)에 37℃, 5% CO2 조건에 양 다. 7w-PSML 포는

wild type APP mutant PS (M146L)이 과 어있는 CHO

포 UC San Diego David Kang 부 공 았다.

2. 시약 시약 처리

A23187, thapsigargin, tunicamycin, MG132, lactacystin,

bafilomycin, NH4Cl, 3-methyladenine (3MA)는 sigma 부

구입 다. A23187, thapsigagin, tunicamycin 12시간

동안 처리 고 MG132, lactacytin, bafilomycin, NH4Cl,

3MA는 다른 시약 처리 30분 에 미리 처리 다.

3. Western Blot

실험 법 Part 1 것과 동일 고 사용 1차 항체는 다 과

같다.

APP sAPPα를 인 해 각각 Anti-22C11 antibody

20

(Millipore), anti-6E10 antibody (Signet)를 사용 다. 그

이외에 anti-sAPPβ antibody (Covance), anti-HA antibody

(Cell signaling), anti-USP25 antibody (Santa Cruz), anti-HRD1

antibody (Abgent), anti-Calnexin antibody (Enzo), anti-β-

actin antibody 그리고 anti-tubulin antibody (Sigma-Aldrich)를

사용 다.

4. 포 생존도

포 생존도는 MTT 분 통해 다. 시약 처리가 난

96well plate에 2.5 μg/mL MTT가 포함 phenol red가

없는 양액 50 ㎕ 꾸어 뒤 37℃에 2시간 동안

양 다. 이 후 140 ㎕ isopropanol 첨가 여 37℃에

30분간 양 고 실 에 30분간 뒤 plate reader

(POWER-XS; Bio-TEK)를 이용 여 540nm에 도를

여 분 다.

5. Transfection

CHO 포는 60 mm 양 시에 24시간 동안 키운 다

lipofectamin LTX (Invitrogen)를 이용 여 HA-ubiquitin cDNA

21

벡 를 transfection 다. Opti-MEM (Invitrogen)에

cDNA transfection 용액 상 에 30분간 합 뒤 Opti-

mem 양액 갈아 CHO 포에 첨가 다. 이 후 4시간

지난 다 serum이 포함 양액 존 양액 양만큼 첨가 고

다시 2시간 뒤에는 원래 포 양액 꿔 다.

6. 면역침강법 (Immunoprecipitaion)

Ubiquitination이 APP를 인 해 면역침강법 이용

다. 시약 처리가 난 포를 1% CHAPS buffer 단 질 추출

다 BCA 량 여 400 μg 단 질과 Flag antibody

함께 4℃에 루 동안 시킨 후 protein A/G bead를 첨가

여 4℃에 시간 동안 추가 시킨다. 원심 분리 여

protein A/G bead를 가라앉힌 다 bead만 남 고 조심스럽게 상

액 버리고 4~5회 1% CHAPS 척 고 2xSB를 후

인 다 western blot 행 다.

7. 면역 포염색 (Immunocytochemistry)

CHO 포를 염색용 plate에 키운 후 시약 처리 고 PBS 척

후, 4% PFA 실 에 20분간 고 다. 그리고 0.1% Triton

X-100 permeabilization 고 5% BSA가 들어간 PBST

blocking 다. 이 후 1차 항체 함께 4℃에 overnight 고

22

척 다 Alexa-fluorescent가 붙 2차 항체를 실 에 시

간 동안 시 다. 다 척 고 4-6-diamidino-2-

phenylindole (DAPI) 핵 염색 고, 공 미경 분

다.

8. 20S proteasome

20S proteasome 는 20S proteasome activity assay kit

(APT280, Millipore) 사용 를 참고 여 다. 간략 게,

Proteasome에 해 kit에 공 는 질인 LLVY-AMC가

뛰는 7-amino-4-methylcoumarin (AMC)잘 지게 면 그

는 원리이다. Protein sample (20 μM) 37°C에

proteasome substrate, LLVY-AMC, 시킨 이후

fluorometer (POWER-XS; BIO-TEK)를 이용 여 360/460nm

에 도를 다.

9. Aβ ELISA

7w-PSML 포 양 양액 부 분 Aβ40과 Aβ42

양 sandwich ELISA kit (Human Aβ immunoassay kit ;

IBL)를 사용 여 다. 시약 처리가 난 후 양 양액

거 뒤 1500g 5분간 4℃에 원심분리 여 포 찌꺼 들

거 고 100㎕를 에 사용 다. 이 난 뒤에 ELISA

plate reader (POWER-XS; Bio-TEK)를 이용 여 450nm에

23

도를 여 분 다.

10. RNA 분리 Real-time PCR

HEK293 포 부 체 RNA 분리는 Qiagen RNeasy kit

(Qiagen) 이용 다. 분리 RNA는 량 후 동일 양 (2 μ

g) Maxtime RT Premix_Oligo dT primer kit (intron

biotechnology, Seoul, Korea)를 사용 여 역 사 다 cDNA

변 다. 변 cDNA는 mRNA 양 인 해

ABI stepone 2.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)

이용 여 Real-Time PCR 행 다. Real-time PCR에 사용

primer는 APP (forward : GCAGTGAGAAGAGTACCAAC /

reverse : ACCTCATCACCATCCTCATC), actin (forward :

AGCCTCGCCTTTGCCGA / reverse : CTGGTGCCTGGGGCG)이

다. Actin gene endogenous 조군 RNA 양

는데 사용 다.

11. 통계처리

모든 결과는 mean ± SEM 값 나타내었다. 모든 통계 분

GraphPad Prizm 5를 사용 고 그룹 간 는 one-way

ANOVA Tukey’s multiple-comparisons test를 이용 여 분

다. 통계 인 분 p값이 0.05 이 일 경우 통계

미 다고 다.

24

결 과

Part 1. 신경아 달 질인 ATP가 Aβ에

시냅스 가소 변 에 미 는 향 연구

1. primary astroctye U373 cell line에 Aβ42에

ATP 분 증가

상 포에 자연히 생 는 칼슘 진동 상아 달 질인

glutamate 분 를 도 다는 것이 알 있고 Aβ

양 상 포 칼슘 신 달 동 해 다는 보고가

있다 (33, 34). 라 , Aβ42 처리가 1차 양

상 포 상 포 포주인 U373 포에 ATP 분 에

향 주는지 인해 본 결과, U373 포 1차 양

상 포에 모 Aβ42 처리 시 분 는 ATP 양이

증가 는 것 인 다 (그림 6A,B). 이를 통해 Aβ42에 해

상 포 부 상아 달 질인 ATP 분 가

증가 다는 것 규명 다.

2. Aβ42에 상돌 도 감소에 ATP 보

25

효과

상돌 도는 시냅스 가소 , 습 그리고 억과

이 있 에 (35) 1차 양 해마 신경 포에 상돌

도에 ATP 효과를 알아보았다. 이 보고에 다양

포주 조직에 포 ATP 양이 nM에 μM 지

다는 것이 알 진 있다 (36). ATP 효과 인

농도 (EC50 ; half maximal effective concentration)가 10μM ~

100μM 보고 있어 본 실험에 는 10μM ATP를 처리해

주었다 (37-39). 양 해마 신경 포에 Aβ42 (2μM)를

48시간 동안 처리 뒤 상돌 를 찰 해 phalloidin

염색 뒤 분 결과, Aβ42에 해 상돌 도가

군과 했 격히 감소 는 것 인 다 (그림 7).

면 미롭게도 ATP (10 μM)를 Aβ42 처리 30분 에

처리해 그룹에 는 Aβ42에 해 감소 었 상돌 도가

군 회복 는 것 찰 다. 이를 통해 ATP가

Aβ42에 상돌 도 감소에 보 인 효과를 보임

알 있었다.

3. Aβ42에 해 도 장 상승 작용 (Long-term

26

potentiation; LTP) 감소에 ATP 회복 효과

LTP 상돌 도는 시냅스 가소 과 있다는 것이 알

있다 (40-42). 이 연구들에 합 Aβ 처리가 in vitro

in vivo 경에 해마 LTP를 해 다는 것이 보고 었다 (43,

44). ATP가 Aβ42에 해 도 LTP 해에 해 보 인

효과를 보이는지 알아보 해 해마 편 이용 여 Aβ42 (200

nM)를 처리 여 LTP를 다. 해마 편에 TBS (theta

burst stimulation) LTP를 도 Aβ42가 처리

조건에 는 이 보고 동일 게 LTP가 크게 것

인 다 (그림 8). 그러나 Aβ42 ATP를 함께 처리해 주었

경우에는 Aβ42에 LTP감소를 있었고, 이

군 LTP가 회복 는 것 인 다. 라 이

결과를 통해 ATP가 Aβ42에 여 보 인 효과를

있 알 있었다. 이런 ATP 보 인 역 TBS 처리 후

(10분) 그리고 후 (60분) 단계에 모 찰 다 (그림

8B, C). 다 농도 Aβ42 (200 nM)에 LTP가 가

찰 것 탕 앞 인했 상돌 도에 효과를

농도 Aβ42에 도 일어나는지 인해본 결과, 상했

농도 Aβ42 처리에 해 도 매우 격 게 해마 상돌

27

도가 감소 는 것 인 고, 불어 ATP 보 인 역

재 인 다 (그림 8D-F). 이 결과를 통해 ATP

인 효과 함께 Aβ42가 농도에 도 시냅스 를

조 있 규명 다. 본 실험 포항공 훈 님

연구실에 행 다.

4. Aβ42에 시냅스 단 질들 감소에 ATP 회복

효과를 해마 신경 포에 규명

ATP가 Aβ42에 해 감소 LTP에 여 보 인 능

다는 것 인 에 시냅스 가소 조 다고

알 진 NMDA 용체 (45, 46) 뇌 특이 구조단 질

(scaffolding protein)인 PSD-95 같 시냅스 단 질들 양이

변 는지를 알아보고자 다. PSD-95 단 질 NMDA

용체 닛인 NR2A NR2B 상 작용 여 시냅스

신 달과 가소 조 다고 알 있다 (47, 48). NMDA

용체 2A (NR2A) PSD-95 양 해마 신경 포 (21 DIV)에

Aβ42 (2 μM)를 48시간동안 처리했 게 감소 는

것 인 다 (그림 9A-C). 지만 NMDA 용체 1

(NR1) 양 변 지 않았다. 그 다면 ATP가 Aβ42에 해

28

시냅스 단 질이 감소 신경 포를 보 있는지 알아보고자

Aβ42를 처리 30분 이 에 ATP (10 μM) 처리 여

인해 보았다. 그 결과 ATP를 Aβ42 처리 이 에 처리

그룹에 는 Aβ42 처리시에 찰 NR2A PSD-95

단 질 감소가 보이지 않 인 다 (그림 9). ATP는 생체

내에 가 분해 어 adenosine과 같 사산 만들어 내

에 앞 인 ATP 효과가 ATP 효과인지 아니면

ATP 사산 에 효과인지를 명 게 규명 해

가 분해가 지 않는 상사 ATP (ATP analog)인 ATPγS를

가지고 동일 실험 행 다. 실험결과, 해마 신경 포에

ATPγS (20μM)를 Aβ42처리 30분 에 처리 ATP가

보여주었 Aβ42에 NR2A PSD-95 단 질 감소에

보 효과가 동일 게 찰 인 다 (그림 9E, F).

라 이 결과를 토 ATP가 그것 사산 이 아닌 ATP

자체 Aβ42에 해 감소 신경 포 시냅스 단 질에

보 능 함 욱 실 게 증명 있었다.

5. P2 purinergic 용체를 통 여 ATP가 Aβ42에

시냅스 단 질들 감소에 여 보 능 나타냄 규명

29

포 ATP는 P2 purinergic 용체를 통 여 포 내

신 달에 요 역 다 (49). P2 purinergic 용체는

다시 이 P2X 리간드 개폐 이 채 (ligand-gated ion

channel)과 사 P2Y G단 질 결합 용체 (G-protein coupled

receptor) 나 어진다 (50, 51). 해마 신경 포는 P2X P2Y

purinergic 용체 모 를 다. PPADS는 택 이지는

않 나 범 지도 않 P2 용체 항 P1 용체를

억 지는 않는다 (52, 53). ATP가 Aβ42에 해 매개 는

시냅스 단 질들 감소에 보 작이 purinergic 용체를

통 신 달에 해 일어나는지 알아보고자 해마 신경 포에

ATP를 처리 에 PPADS (50 μM)를 처리 다. 그 결과

ATP가 Aβ42에 해 도 NR2A PSD-95 같 시냅스

단 질 감소를 보 라도 (그림 9A) PPADS를 처리 는

조건에 는 ATP NR2A PSD-95 단 질에 보 인

효과가 억 는 것 인 다 (그림 10A, lane 4). 이 결과를

통해 ATP가 P2 purinergic 용체 신 달 통해

Aβ42에 해 감소 시냅스 단 질들 보 함 좀 명 게

증명 있었다.

30

그림 6. Primary astrocyte U373 포주에 Aβ42 처리 시

분 는 ATP

(A) Primary astrocyte 에 Aβ42 (2 는 4 μM)를 3 시간

처리 후 분 ATP 를 했 4μM Aβ42 처리 시

게 ATP 분 량이 증가함 인

(B)U373 포주에 Aβ42 (2 는 10 μM) 를 3 시간 동안 처리

시 분 는 ATP 양이 증가함 인 양 양액에

존재 는 포 분 ATP luciferin-luciferase

assay 를 통해 다. 3 번 독립 인 실험 분 함

**p<0.01 versus vehicle (control) group. Vcl, Vehicle

31

그림 7. primary rat hippocampal neuron 에 Aβ42에

상돌 가시 도 감소에 ATP 효과 규명

Primary rat hippocampal neurons (21 DIV) 에 Aβ42 (2μM,

48시간)를 처리 30분 에 ATP (10 μM)를 처리 는

미처리 다.

(A) 상돌 가시를 찰 해 phalloidin Alexa-488

(녹색) 이용 여 염색함

(B) 그림 7(A)에 흰색 시 역 이미지

(C) 상돌 분 내 상돌 가시 를 량

**p<0.01 versus vehicle (control) group; #p<0.05 versus

Aβ42 처리군. Scale bar, 10μm.

32

33

그림 8. 해마 편에 Aβ42에 LTP 에 ATP 효과

규명

(A) fEPSPs는 해마 CA1 부 에

Aβ42 (200 nM)는 TBS 도 LTP를 해 는 면 ATP

(5 μM) 함께 처리시에는 Aβ42에 LTP 해를 보 함.

각각 fEPSP slope (상) fEPSP 그래 (상)에 검 과 빨강색

살 시 시간 LTP 평균 값 나타내는 trace ( )

회색막 는 TBS처리 20분 동안 aCSF (control) 는 시약 (A

β42, Aβ42+ATP, ATP)를 주입 시간 나타냄

(B, C) TBS 처리 후 각각 10분 (B)과 60분 (C) fEPSP

. *p<0.01 or ***p< 0.001 versus control group; #p<0.05

34

versus Aβ42처리군

(D) 농도 Aβ42 (200 nM)가 상돌 가시 도에 미 는 향

인

Primary rat hippocampal neurons (21 DIV)에 Aβ42를 48시간

동안 처리 30분 에 ATP를 처리 는 미처리함 Phalloidin

Alexa-488 (녹색) 상돌 가시 염색함

(E) D에 시 지역 이미지. ***p <0.001

versus vehicle (control) group; ###p<0.001 versus Aβ42

처리군. Scale bar, 10 μm.

35

그림 9. Primary hippocampal neurons에 Aβ42에 해 감소

시냅스 단 질에 ATP 효과 인

Primary hippocampal neurons (21 DIV)에 Aβ42를 48시간동안

처리 30분 에 ATP를 처리 는 미처리함

(A) Western blotting 통해 NR2A, PSD-95, NR1 양

인함 β-actin loading control 사용. 살 PSD-95를

나타내고 별 는 특이 인 드를 나타냄

36

(B–D) NR2A (B), PSD-95 (C), 그리고 NR1 (D) 량

Aβ42에 해 감소 NR2A PSD-95 양이 ATP 처리에

해 보 는 면 NR1 변 없 인 **p<0.01,

***p<0.001 versus vehicle (Veh; control) group (n=6);

#p<0.05, ##p<0.01 versus Aβ42 처리군 (n=6).

(E)Aβ42에 시냅스 단 질 감소에 ATPγS (20

μM) 효과 **p<0.01, ***p<0.001 versus vehicle (control)

group; #p<0.05 versus Aβ42 처리군

37

그림 10. Aβ42 에 해 감소 는 시냅스 단 질에 ATP

효과가 P2 purinergic 용체를 통함 PPADS 를 이용 여 규명

(A) Primary hippocampal neurons 에 Aβ42 (2 μM) 처리

30 분 에 ATP 를 PPADS (50 μM ; P2 purinergic 용체

항 ) 함께 처리 거나 단독 처리함 Western Blot

행 여 NR2A, PSD-95, NR1 양 인함. 살 는 PSD-

95 특이 인 드를 나타냄. Tubulin loading control

사용함

(B, C) NR2A (B) PSD-95 (C) western blot 결과 부

량 *p< 0.05 versus vehicle (Veh) group; #p<0.05 versus Aβ

42 처리군; &p<0.05 versus Aβ42 ATP를 함께 처리 군

38

Part 2. 소포체 스트 스가 베타 아 이드 구

단 질 조 는 연구

1. 포 내 칼슘 증가가 APP 단 질 사과 에 미 는

효과

A23187 잘 알 진 칼슘 ionophore 포 내 칼슘

증가시키 목 실험에 리 사용 는 시약이다. 칼슘

스트 스가 APP 사과 에 향 주는지 알아보고자 7w-PSML

포에 A23187 (1μM) 12 시간동안 처리 다. 7w-PSML

포는 야생 (wild type) APP 돌연변이 (mutant)

presenilin-1 (M146L) 안 고 있는 Chinese

hamster ovary (CHO) 포이다. 그러므 이 포는 APP 함께

APP 사 산 인 Aβ40 과 Aβ42 를 찰 에 효과 인

포이다. A23187 처리 7w-PSML 포는 APP 를 포함 여

sAPPα, sAPPβ가 50% 이상 군과 여 감소 것

인 다 (그림 11A, B). Aβ40 과 Aβ42 양도

A23187 처리시 매우 크게 감소 는 것 찰 다 (그림 11C).

게다가 낮 농도 A23187 (500 nM)과 시약 처리 후 짧 시간

이내에 APP 가 매우 격히 감소함 인 다 (그림 11D).

A23187 포 독 효과를 인 해 MTT 분 해본

결과, A23187 포 생존 에 향 주지 않 며 앞 실험

39

조건 에 는 포 독 나타내지 않 인 있었다

(그림 11E). 이는 A23187 에 APP 감소가 포 죽 에

결과는 아님 증명 있다. 그 다면 APP 감소가

사단계에 조 는지를 알아보고자 A23187 처리 다

real-time RT-PCR 행 여 APP mRNA 양 인 다.

그 결과 A23187 처리 그룹과 군 사이에 APP mRNA

양 차이가 나이지 않 찰함 써 A23187 처리에

포 내 칼슘증가는 APP mRNA 가 아닌 단 질 양

감소시킬 있 인 다. 이 결과는 APP 가 포 내 칼슘

증가에 해 사 후 단계에 향조 시사 다.

2. 소포체 스트 스 인 퀴틴- 아좀 경 를 통

APP 분해 인

APP mRNA 가 A23187 처리시에 변 지 않았 에 APP

단 질 감소 원인이 아좀에 분해 결과인지를

인해보 여 A23187 처리 30 분 에 아좀 해 인

MG132 (10μM) 처리 다 APP 단 질 양 찰 다.

그 결과, A23187 처리에 해 격히 어들었 APP 가

MG132 가 처리 조건에 는 군과 사 APP 가

감소 지 않았 인 다 (그림 12A). 이런 찰 좀

명 히 인 해 MG132 보다 좀 특이 26S

40

아좀 해 있는 lactacystin (10μM)

처리 여 APP 양 해보았다. Lactacystin 처리에

해 도 마찬가지 A23187 처리시에 감소했 APP 양이

보 인함 써 포 내 칼슘증가 인 소포체

스트 스가 아좀 통 APP 분해를 야 함 알

있었다. 포 내 칼슘증가 인 소포체 스트 스가 APP

분해를 도 다는 것 증명 다른 실험 소포체

스트 스를 생시킨다고 알 진 소포에 칼슘 펌 해 인

thapsigargin 과 단 질 실 해 인 tunicamycin

이용 다. 이 thapsigargin 과 tunicamycin 처리시

A23187 처리시 동일 게 APP 가 감소 는 것 보았고 이런

감소는 아좀 해시 회복 인 다 (그림 12B, C).

A23187 과 thapsigargin 모 포 내 칼슘 증가시키고 그

인해 소포체 스트 스를 에 포 내 증가 칼슘이

APP 감소에 향 끼 는 지 인 고자 칼슘 킬 이 인

BAPTA/AM 이용 다. 칼슘 킬 이 처리 시 ionophore 에

APP 감소에 보 효과를 인 고 (그림 12D), 이

결과들 망가진 칼슘 항상 포함 소포체 스트 스가

아좀 통해 APP 분해를 도함 인 다.

41

3. 소포체 스트 스에 APP 분해가 아좀 특이

경 를 통함 인

포 동 포에 토 지 퀴틴- 아좀 시스

(UPS) 포 내 단 질 분해를 인 경 잘 알

있다 (54). APP 분해가 소포체 스트 스 상황에 UPS 를 통

것인지를 인 해 포 내 여러 가지 단 질 분해 경

해 들 이용 다. 7w-PSML 포에 토 지 해 인

3MA (3-methyladenine) 리소좀 능 해 인 bafilomycin

A1 과 ammonium chloride (NH4Cl)를 처리 이후 30 분

뒤에 A23187 처리 뒤 APP 양 인 해 보았다.

미롭게도 칼슘 ionophre 에 해 야 APP 분해가

직 아좀 해 인 MG132 처리 조건에 만 보 는

것 찰 다 (그림 13).

4. 칼슘 과부 에 APP 폴리 퀴틴 인

UPS 를 통 APP 분해를 인 고 실 칼슘 ionophore

처리 시 아좀 가 변 는지를 해보았다. 칼슘

ionophore 처리시 군에 해 20% 가량 20S 아좀

이 게 증가 인 다 (그림 14A).

아좀 통 단 질 분해는 드시 분해 단 질

42

폴리 퀴틴 (poly-ubiquitination)가 동 어야 에

APP 도 이런 규 르는지를 알아 보 해 CHO 포에

HA 태그가 붙어있는 퀴틴 트 스펙 (transfection) 다

아좀 해 인 MG132 를 ionophore 를 처리 30 분 에

처리 뒤 ionophore 는 12 시간동안 처리 다. 이후

면역침강법 인 결과, 아좀 해 를 사 처리

조건에 폴리 퀴틴 가 APP 를 찰 다 (그림 14B).

라 실 APP 가 칼슘 과부 인 소포체 스트 스 인해

폴리 퀴틴 어 아좀 통해 분해 규명 다.

4. 소포체 스트 스 인 APP 분해 소포체 연 단 분해

과 (ER-associated degradation; ERAD) 인

소포체 스트 스 상황 동안 포 내에 작동 는 주요 보 인

는 보충 알 진 것 ‘ 히지 않 단 질 ’

(unfolded protein response, UPR)이다 (55, 56). UPR 소포체

연과 단 분해 과 (ER-associated degradation; ERAD)과

있는 단 질들 증가를 통해 ‘잘 못 힌 단 질’ (misfolded

protein) 분해를 증가시키는 것 알 있다. 다

소포체 스트 스가 ERAD 단 질들 양에 향

주는지 인 결과 APP USP25 (ubiquitin-specific protease

25)는 ionophore 는 tunicamycin 처리시 감소 면에 HRD1

43

(human homolog of yeast Hrd1p/Der3p)과 BiP (binding

immunoglobulin protein) 증가 다 (그림 15A). USP25 는

탈 퀴틴 효소이고 HRD1 ERAD E3 퀴틴 합 효소

(E3 ubiquitin ligase)이다. 이 보고에 APP 는 HRD1 질

나임이 진 있다 (57). 라 탈 퀴틴 효소인

USP25 APP 사이 상 작용 인해보 해

면역침강법 이용 결과, APP 가 USP25 결합 는 것과 함께

ionophore 처리 이후에 단 질 사이 결합이 감소

인 다 (그림 15B). USP25 가 과 조건에

A23187 처리에 APP 감소가 회복 는 경향

인 고 (그림 15C) 이 같 결과들 통해 소포체 스트 스

인 ERAD 가 APP 분해를 야 고 USP25 는

proteasome 통 APP 분해를 보 있 인 다.

5. 소포체 스트 스 상황에 아좀 해는 소포체에

APP 축 래함 인

APP 는 소포체에 생 뒤 골지 이동 에 소포체

스트 스를 도 상황에 APP 가 소포체에 축 는지를

면역 포염색법 사용 여 인 다. 소포체를 찰 해

44

소포체 지 단 질인 calnexin 염색 다. A23187 처리

CHO 포는 앞에 인 결과 동일 게 APP 염색강도가

군과 했 감소해 있 인 고 lactacystin

처리 여 아좀 해 조건에 는 A23187

처리 게 면 clanexin 과 APP 염색 신 가 겹 는 강도가

증가 는 것 인 다 (그림 16). 이 실험결과는 아좀

해 인 lactacystin 에 해 소포체 스트 스 인 APP

분해가 해 면 소포체에 APP 가 축 보여주고 있다.

소포체는 포 내 Aβ 생 장소 역 고 있 므 이

결과를 탕 소포체에 상 인 APP 축 Aβ

생 원인이 있 시사 다.

45

그림 11. 포 내 칼슘증가가 APP 사과 에 미 는 향 인

7w-PSML 포주에 A23187 (1 μM) 12시간동안 처리함

(A) 체 단 질 얻 뒤 각각 항체를 이용 여 western

blot 행 여 단 질 양 인함

(B) Western blot 결과를 통 sAPPα (6E10 항체) sAPPβ

량

(C) 시약 처리 후 양 양액 이용 여 ELISA Aβ40과 A

β42 양 함

(D) 7w-PSML 포주에 A23187 처리 시 다양 시간과 농도를

46

사용 뒤 western blot 통해 APP 양 인

(E) 포 생존 (Cell viability) MTT 분 법 통해 인

결과 A23187 처리 시 포 생존 에는 향이 없 인함

(F) 체 APP mRNA양 A23187 처리시 변 없 RT-PCR

통해 인함 (N=4, ***P < 0.001 versus 조군)

47

그림 12. 소포체 스트 스가 APP 분해를 도함 인

(A) 7w-PSML 포주에 A23187 (1 μM 12 h) 처리 30분

에 10 μM MG132 (proteasome 해 )를 처리 는

미처리 다. 시약 처리 후 체 단 질 얻어 western blot

행 여 APP (22C11) 양 인함 아래 역 western blot

이미지 쪽 역 이미지상 농도계를 이용 여 APP 양

량 그래

(B, C) MG132 (proteasome 해 ) 처리가 소포체 스트

스에 APP 분해를 보 함 7w-PSML 포주에

48

thapsigargin (B) 는 tunicamycin (C) 12시간 동안 처리

30분 에 MG132를 처리 고 시약 처리가 난 뒤 western blot

행 여 APP (22C11) 양 인함

(D) 7w-PSML 포주에 A23187 (1 μM) 12시간 동안 처리

시간 에 BAPTA/AM (5 μM) 처리 고 western blot

이용 여 APP 양 인 BAPTA를 통해 포 내 칼슘 킬 이

했 APP 분해가 보 인 (N=4, ***P < 0.001 and

**P < 0.05)

49

그림 13. APP 가 소포체 스트 스 상황에 APP 가 아좀에

특이 인 경 를 통해 분해 인

(A) 7w-PSML 포주에 A23187 (1 μM_12 h) 처리

30 분 에 10 μM MG132 (proteasome 해 ), 1 mM 3MA

( 포자식작용, autophagy, 해 ), 20 mM NH4Cl 는 10 nM

Bafilomycin (Baf) (Lysosome 해 )를 처리함 Western blot

행 여 APP 양 인함 β-actin loading control

사용함

(B) Western blot 결과에 APP 단 질양 량 (N=4; *P <

0.05, ***P < 0.001)

50

그림 14. 포 내 칼슘 증가에 APP 퀴틴 인

(A) CHO 포주에 A23187 (1 μM) 12 시간 동안 처리 후,

20S proteasome activity kit (APT280; Millipore)를 사용 여

proteasome activity 를 함 (N=4. *P < 0.05 versus 조군)

(B) CHO 포주에 HA-tagged ubiquitin (Ub-HA)과 Flag-

tagged APP 를 co-transfection 고 24 시간이 지난 후,

12 시간동안 A23187 처리 30 분 에 MG132 를 처리

미처리 다. 체 단 질 얻 후에 Flag 항체를

이용 여 면역침강 고 HA 항체 western blot 함

51

그림 15. 소포체 스트 스가 소포체 연 단 분해과 통해

APP 안 조 함 규명

(A) CHO 포주에 A23187 는 tunicamycin 12 시간 처리

뒤 체 단 질 얻어 22C11 (APP), USP25, HRD1, BiP, β-

actin 항체를 이용 여 western blot 행함

(B) CHO 포주에 A23187 12 시간동안 처리 30 분 에

MG132 (proteasome 해 )를 처리 는 미처리함 시약

처리 후 체 단 질 얻어 USP25 항체를 사용 여

면역침강 고 22C11 (APP), USP25, HRD1, β-actin 항체를

이용 여 western blot 행함

52

(C) CHO 포주에 USP25 transfection 거나 지 않

조건에 A23187 12 시간 동안 처리 다 체 단 질

얻 뒤 western blot 행 여 APP 양 량함 (N=2. *P

< 0.05 versus 조군)

53

그림 16. 소포체 스트 스 상황에 아좀 해 시 APP 가

소포체에 축 인

CHO 포주에 A23187 12 시간동안 처리 30 분 에

lactacystin (proteasome 해 ) 처리 는 미처리함 시약

처리가 난 뒤 22C11 (APP)과 calnexin 항체 각각 APP

소포체를 염색 고 Alexa 594 Alexa 488 이 결합 이차

항체를 이용 뒤 공 미경 찰함 Scale bar; 20 μm

54

고 찰

Part 1. 신경아 달 질인 ATP가 Aβ에 시냅스

가소 변 에 미 는 향 연구

본 연구는 신경아 달 질 나인 ATP가 Aβ에 해

도 시냅스 가소 해에 는 역 행 있다는

여러 요 증거를 공 다. 첫째 , Aβ42가 1차 양

상 포 U373 포주에 ATP 분 를 증가시킴

인 다. 째, ATP는 1차 양 해마 신경 포에 Aβ42

인 상돌 가시 도 감소에 보 능 다. 째,

ATP는 해마 편에 Aβ42에 LTP 붕 를 회복시킨다.

째, ATP는 Aβ42 인 시냅스 단 질들 감소를 P2

purinergic 용체를 통 여 회복시킨다. 이런 여러 가지 결과들

Aβ42에 해 도 시냅스 가소 장애에 여 ATP가 보

능 갖는다는 사실 뒷 침 있는 다양 증거들

공 다. Aβ 독 과 연 신경 포 죽 과 이

연구들 일 신경 포에만 연구 었다. 우리

뇌 추신경계를 구 고 있는 가장 많 신경 포는

상 포이다. 상 포는 원래 신경 포를 구조

55

지지 는 동 인 역 만이 알 있었지만 지난 10 간 여러

연구들 통해 상 포가 시냅스 가소 포함 신경 포

능에 능동 이고 직 인 역 있다는 다 견해들이

보고 었다. 지만 추신경계에 상 포 요 에도

불구 고 신경 포 상 포간 상 작용에 분자

에 것 많이 알 지지 않았다. 상 포에 칼슘

신 달 뇌에 상 포 신경 포 사이 상 통신에 있어

요 역 행 다 (58). 신경 포 망가진 칼슘 항상

알 이 병 드러진 특징 Aβ는 신경 포 포 내

칼슘 항상 크게 망가 릴 있다. 몇몇 근 연구들에

Aβ가 상 포 칼슘 신 달 상아 달 질 분 를

변 시키는 것이 보고 었다. 2009 Kuchibhotla 그룹 Aβ

라크를 포함 고 있는 APP/PS1 질 알 이 병 모델

마우스 뇌 상 포에 칼슘 동이 찰 보고 다

(59). Aβ25-35를 처리 미 아 포 상 포에

glutamate ATP 분 가 증가 는 것 찰 보고도

있다 (60). 그러므 Aβ42에 해 도 상 포

ATP분 는 잘 못 변 상 포 칼슘 진동 일 가능 이

있다 (그림 6). 본 연구에 인 Aβ42에 해 도 LTP

56

는 이 여러 연구들에 보고 었다 (61-63). 그래 본

연구에 는 ATP가 Aβ42 처리 조건에 LTP를 보

있는지를 인해보았고 그림 8에 보는 것처럼 Aβ42 처리에

해 감소 LTP가 ATP 인해 회복 는 것 찰 다.

상돌 가시 신경 포 시냅스 가소 과 LTP 매우

게 어 있 에 상돌 가시 도에

ATP 효과를 인해보고자 다. 지만 상 포를 양

양액에는 ATP를 포함 glutamate, 조 면역 cytokine

chemokine들과 같 매우 다양 질 포함 고 있 에

상아 달 질인 ATP 신경 포에 독립 인 효과를

연구 는 것 실험 인 에 어 움이 있다. 라 본

연구에 는 glutamate 여러 면역 질들 포함 여러 가지

상 포 부 래 다른 인자들 효과들 고

ATP만 효과를 연구 해 1차 양 신경 포에 포 에

합 ATP를 처리 는 법 사용 다. 이 같 법

Aβ42에 해 감소 상돌 가시 도 게 ATP

처리 회복 는 것 인 다. 라 이 같 결과들

탕 Aβ42에 해 망가진 시냅스 가소 에 ATP

보 인 능 규명 있다. NMDA 용체는 시냅스 가소 과

57

억에 능 조 는 주요 질 잘 알 있다.

NMDA 용체는 각각 개 NR1과 NR2 닛 구

heterotetramer 복합체 (64-66) 알 이 병

병리생리 인 면에 요 역 다 (67). NR2A

NR2B는 NMDA 용체 닛 주 이다. 시냅스 후 구조

단 질인 PSD-95는 PSD-95/discs large/zona occludens-

1이라는 도 인 통해 NMDA 용체 닛 나인

NR2A 결합 다고 알 있 에 (68) NR2A PSD-

95 변 는 사 태 찰 것 상 다. 상

것처럼 Aβ42 처리시 동시에 감소 NR2A PSD-95는 ATP에

해 다시 회복 는 것 인 다 (그림 9). 본 연구에 는

시냅스 신 달에 요 시냅스 소낭 당단 질인 synaptophysin

Aβ42에 해 감소 었다가 ATP에 해 보 는

결과를 1차 양 해마 신경 포에 찰 다. 포 ATP는

P2 purinergic 용체 결합 통해 다양 포 내 과 들

조 있는 신 작용 다 (69). P2 purinergic 용체는

7개 리간드 개폐 이 채 인 P2X 용체 닛 (P2X1-7)

(70)과 8개 사 G단 질 결합 용체인 P2Y 용체

(P2Y1,2,4,6,11,12,13,14) 구 어있다 (36). P2X 용체 닛

58

신경 포뿐만 아니라 신경 포 지 루 다 (70, 71). P2X

용체는 ATP에 른 시냅스 매개 는 면에 P2Y

용체는 신경 포 막 느린 변 를 가 다 (69, 72-

74). 1차 양 해마 신경 포에 PPADS를 처리했 , ATP는

Aβ42에 시냅스 단 질들 감소를 보 지 못 다 (그림

10). 이 결과는 신경 포에 ATP 보 능이 P2 용체를

통해 일어나는 것임 시사 다. In vitro상에 PPADS는

heteromeric P2X2/3 과 P2X1/5 용체뿐만 아니라 homomeric

P2X1, P2X2, P2X3, P2X5, P2Y1 용체에 해효과를

나타낸다. 지만 PPADS는 homomeric P2X4, P2X6, P2X7,

P2Y2, P2Y4, P2Y6, or P2Y11 용체에 해 는 해 지

못 다는 것이 보고 었다 (51). 라 이후 후속 연구에 는

ATP 보 인 신 달에 여 는 P2 용체

아 에 해 분명 게 힐 요가 있 시사 다. 포

ATP는 에 ectonucleotidase에 해 ADP 는 AMP

변 고 AMP는 adenosine 가 분해 다 (75). Adenosine

추신경계에 P1 purinergic 용체를 통해 포

조 는 신 달 질 알 있다 (76, 77). Adenosine

효과를 여 본 연구에 는 가 분해 지 않는 ATP

59

analog인 ATPγS를 사용 다. 그 결과 ATP처리시 찰

결과 동일 게 Aβ42 처리 인해 감소했 시냅스 단 질들이

ATPγS에 해 보 는 것 인 고 (그림 9E,F) 본

연구에 사용 PPADS는 P2 용체는 해 지만 adenosine이

결합 는 P1 용체는 해 지 않는다는 보고 (52)를 탕

ATP 사산 효과가 아닌 ATP 자체 보 능임

규명 다. 이런 결과들 근거 후속 연구에 는 알 이 병

동 마우스에 ATP 다양 아 에 특이 인 작용 질

(agonist) 항 (antagonist)들 주입 는 in vivo 실험

계획 있고 마우스 행동실험 롯 여 여러 가지 실험들

통해 시냅스 능 인 다면 in vitro에 규명 결과를 욱

강 게 뒷 침 해 있 것 는 이다.

본 연구 종합 결과들 상 포 부 분 ATP는

신경 포 P2 purinergic 용체를 시킴 써 시냅스

가소 조 다는 것 안 다. 게다가 이러 ATP가

주요 게 NR2A PSD-95 단 질 양, 해마 상돌 가시

도, LTP를 조 있 다. 라 본 연구에 규명

상 포에 래 ATP 신경 포 시냅스 가소 사이

결 탕 상아 달 질 분 를 조 는

60

질과 이 알 이 병 새 운 료 이 있다고

생각 는 이다.

Part 1 연구 결과는 Journal of neuroscience, February 29,

32(9):3081–3087 (2012)에 논 있다.

61

Part 2. 소포체 스트 스가 베타 아 이드 구 단 질

조 는 연구

본 연구에 는 소포체 스트 스에 해 도 APP 사과 이

퀴틴- 아좀 시스 에 해 일어남 규명 다.

그림11에 본 것과 같이 칼슘 ionophore 처리 시 APP APP

사 질인 souble APP들 그리고 Aβ 지 격히 감소 는 것

인 고 이러 감소가 아좀 해 인 MG132에 해

회복 는 것 알아내었다. 일 APP 단 질

(maturated APP) Aβ 생 증가시킨다고 알 있다 (78).

게다가 몇몇 연구들 Aβ가 후 골지망 뿐만 아니라 소포체에 도

생 이 다고 보고 있다 (31, 79). 상 인 APP

사과 Aβ 생 증가시킬 있다. 그러므 APP

사과 조 는 연구는 요 다고 있다. 소포체는

칼슘 항상 조 에 있어 요 역 행 는 포 내

칼슘 항상 불균 일 소포체 스트 스

어있다. 본 연구에 는 소포체 스트 스에 해 APP가

격 게 분해 는 것 찰했 뿐만 아니라 이런 상이

일어나는 에 해 도 규명 다. 칼슘 ionophore 인

APP 감소가 벽 게 아좀 해 에 해 보 는 것

인함 써 소포체 스트 스에 APP 분해가 UPS

62

이 있 상 다. 그러나 UPS는 포 내 단 질

분해를 담당 는 일 아니다. 토 지는 다른 포

내 단 질 분해를 조 는 주요 경 알 있다 (80).

라 본 연구에 는 UPS 이외 다른 포 내 단 질

분해경 를 통 APP 감소 가능 에 실험 행 해

토 지 리소좀 능 해 를 처리 뒤 A23187에

APP 감소를 해본 결과 직 아좀 해 만이

회복효과가 있 인 다 (그림 13). 이 결과는 소포체

스트 스에 APP 분해가 UPS 특이 인 역 임

안 다. 아좀 통 분해 경 달리 토 지는 주

래 단 질과 포질내 다른 질들 거에 여 다 (81,

82). 토 지는 량 분해에 여 는 일 양이

결 조건에 는 포 내 알 있다 (80).

그에 해 UPS는 부분 짧게 존재 는 단 질들 특이 인

분해 시스 이다 (20). 본 연구에 는 APP가 A23187처리 1시간

이후, 즉 매우 이른 시 에 부 격히 분해 는 것 찰 다

(그림 11D). 칼슘 ionophore인 A23187 포 내 칼슘 증가를

목 매우 리 사용 시약이나 몇몇 연구에 는

A23187 처리 시 포사멸 도 다고 보고 있 에

63

(83, 84) 본 연구에 는 포사멸에 APP 분해 가능

인 해 coomassie blue 염색과 포 생존도 실험 행

결과 체 단 질 양에는 군과 A23187 처리 군 간 차이가

없 인 고 포 생존도도 사 결과를 얻 있었다.

라 이 결과는 A23187처리 시 감소 APP가 UPS를 통

분해 결과임 보충 있다. 칼슘 ionophore 뿐만 아니라

tunicamycin 는 thapsigargin과 같 질들 소포체

스트 스를 도 있다고 알 있다. A23187 처리시

인했 결과 동일 게 tunicamycin과 thapsigargin 처리에

해 도 APP가 감소 고 감소 APP는 아좀 해 에

해 회복 는 것 인 다 (그림 12B,C). A23187과

tunicamycin 처리 시 ERAD 단 질들이 조 는 것

찰함 써 본 연구에 는 APP 감소가 단지 칼슘 항상

불균 에 결과가 아니라 소포체 스트 스 인 것임

상 있었다. 근 APP가 ERAD 단 질인 E3

합효소인 HRD1과 탈 퀴틴 효소인 USP25 질이라는

보고가 있다 (57, 85). 본 연구 결과에 소포체

스트 스를 도했 USP25는 감소 면 HRD1과 BiP

증가 것 인 다. 라 소포체 스트 스 상황에

64

탈 퀴틴 능 가진 USP25 감소 퀴틴 E3

합효소인 HRD1 증가는 APP 퀴틴 를

증가시키는데 있어 시 지 효과를 공함 써 격 APP

분해를 야 했 것 생각 다. 는 가벼운 소포체

스트 스는 포 생존과 해 일 소포체에

존재 는 샤페 (chaperone)과 ERAD 구 단 질

도 는 면 지속 이고 과도 소포체 스트 스는

포사멸 는 포 능 를 래 는 것 알 있다

(86, 87).

칼슘 항상 불균 과 같 소포체 스트 스는 단 질 힘

해 고 결과 잘 못 힌 는 히지 않 단 질

소포체에 축 야 함 써 UPR 시킨다. 이 게

UPR 포에 해 운 잘 못 힌 단 질들 증가를

차단 다는 것이 알 있다 (88, 89). 알 이 병 잘 못

히거나 집 단 질들이 특징 견 며 병 진행에

APP는 소포체 내에 잘 못 힐 가능 이 높고 ERAD

타겟이 있다 (90). 본 연구에 는 소포체 스트 스가

아좀 증가시키는 것 인 다 (그림 14A).

아좀 ERAD를 통 잘 못 힌 APP 단 질

65

분해 여 것 상 다. 아좀 상 는

소포체 스트 스 상황에 포를 보 지만 알 이 병에 는

그 능이 망가 있 이 보고 었다 (24). 알 이 병에 Aβ

축 만 인 소포체 스트 스를 도 다 (91, 92). 본

연구에 아좀 해 를 처리 상태에 A23187

처리 APP가 소포체 지 단 질인 calnexin과 동일

에 염색 는 것 인함 써 아좀 능이

상태에 소포체 스트 스가 생 면 APP가 상

소포체에 축 알 있었다 (그림 16). BACE1 에

소포체에 합 고 일부 BACE1에 단이 계속 소포체에

생 다고 보고 있 며 감마 시크리 아 는 소포체에

드러지게 존재 는 것이 알 있다 (93, 94). 라 본 연구를

통해 아좀 능 에 소포체에 상 인

APP 축 이 지속 인 소포체 스트 스 같 알 이 병

생리 경에 포 내 Aβ 생 증가 시킬 있 것

생각 다.

본 연구 종합 결과들 소포체 스트 스는 ERAD 연

단 질과 샤페 도 여 잘못 히거나 히지 않

APP 단 질 거를 해 퀴틴- 아좀 경 를 이용 여

66

APP를 른 시간 내에 분해함 써 종 Aβ 생

있 안 고 있다. 결 본 연구는 는

만 소포체 스트 스에 APP 사과 연구 요

공 뿐만 아니라 아좀이 알 이 병 료를

요 이 있 시사 고 있다.

본 연구 결과는 재 논 고 에 있다.

67

결

알 이 병 칼슘 항상 불균 과 같 다양 스트 스

상황 롯 여 뇌 속에 존재 는 신경 포 상 포간

트워크 등 인 여 병 는 병 진행

가속 있는 매우 복잡 병인 갖고 있다. 본

연구에 는 알 이 병 원인 단 질 알 진 Aβ에 해

상 포 부 분 는 상아 달 질인 ATP가 증가 는

것 찰 다. 이 게 분 ATP는 Aβ에 해 해

LTP를 롯 여 시냅스 가소 과 이 있는 시냅스

단 질과 신경 포 상돌 가시 도 감소에 해 보

효과를 나타냄 인 다. Aβ 구 단 질인 APP가

Aβ에 해 야 있는 소포체 스트 스 상황에 UPS에

특이 분해 찰 다. 이러 결과를 통해 Aβ에

해 야 있는 포 내 스트 스 상황에 신경 포

상 포 사이 트워크 APP 사과 이 료 요

이 있 시사 는 이다.

68

참 고 헌

1. Roberson ED, Mucke L. 100 years and counting:

prospects for defeating Alzheimer's disease. Science.

2006;314(5800):781-4.

2. Hardy J, Selkoe DJ. The amyloid hypothesis of

Alzheimer's disease: progress and problems on the road to

therapeutics. Science. 2002;297(5580):353-6.

3. Vingtdeux V, Sergeant N, Buee L. Potential contribution

of exosomes to the prion-like propagation of lesions in

Alzheimer's disease. Frontiers in physiology. 2012;3:229.

4. Wisniewski HM, Robe A, Zigman W, Silverman W.

Neuropathological diagnosis of Alzheimer disease. Journal of

neuropathology and experimental neurology. 1989;48(6):606-

9.

5. Selkoe DJ. The origins of Alzheimer disease: a is for

amyloid. JAMA : the journal of the American Medical

Association. 2000;283(12):1615-7.

6. Raff MC, Abney ER, Cohen J, Lindsay R, Noble M. Two

types of astrocytes in cultures of developing rat white matter:

differences in morphology, surface gangliosides, and growth

characteristics. The Journal of neuroscience : the official

69

journal of the Society for Neuroscience. 1983;3(6):1289-300.

7. Kimelberg HK, Cai Z, Rastogi P, Charniga CJ, Goderie S,

Dave V, et al. Transmitter-induced calcium responses differ in

astrocytes acutely isolated from rat brain and in culture. Journal

of neurochemistry. 1997;68(3):1088-98.

8. Halassa MM, Fellin T, Haydon PG. The tripartite

synapse: roles for gliotransmission in health and disease.

Trends in molecular medicine. 2007;13(2):54-63.

9. Angulo MC, Kozlov AS, Charpak S, Audinat E. Glutamate

released from glial cells synchronizes neuronal activity in the

hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal

of the Society for Neuroscience. 2004;24(31):6920-7.

10. Yang Y, Ge W, Chen Y, Zhang Z, Shen W, Wu C, et al.

Contribution of astrocytes to hippocampal long-term

potentiation through release of D-serine. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America.

2003;100(25):15194-9.

11. Gordon GR, Baimoukhametova DV, Hewitt SA,

Rajapaksha WR, Fisher TE, Bains JS. Norepinephrine triggers

release of glial ATP to increase postsynaptic efficacy. Nature

neuroscience. 2005;8(8):1078-86.

12. Pascual O, Casper KB, Kubera C, Zhang J, Revilla-

70

Sanchez R, Sul JY, et al. Astrocytic purinergic signaling

coordinates synaptic networks. Science. 2005;310(5745):113-

6.

13. Zhang JM, Wang HK, Ye CQ, Ge W, Chen Y, Jiang ZL, et

al. ATP released by astrocytes mediates glutamatergic

activity-dependent heterosynaptic suppression. Neuron.

2003;40(5):971-82.

14. Bowser DN, Khakh BS. ATP excites interneurons and

astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks.

The Journal of neuroscience : the official journal of the Society

for Neuroscience. 2004;24(39):8606-20.

15. Akiyama H, Barger S, Barnum S, Bradt B, Bauer J, Cole

GM, et al. Inflammation and Alzheimer's disease. Neurobiology

of aging. 2000;21(3):383-421.

16. Wegiel J, Wang KC, Tarnawski M, Lach B. Microglia

cells are the driving force in fibrillar plaque formation, whereas

astrocytes are a leading factor in plague degradation. Acta

neuropathologica. 2000;100(4):356-64.

17. Murray FE, Landsberg JP, Williams RJ, Esiri MM, Watt

F. Elemental analysis of neurofibrillary tangles in Alzheimer's

disease using proton-induced X-ray analysis. Ciba Foundation

symposium. 1992;169:201-10; discussion 10-6.

71

18. Sennvik K, Benedikz E, Fastbom J, Sundstrom E,

Winblad B, Ankarcrona M. Calcium ionophore A23187

specifically decreases the secretion of beta-secretase cleaved

amyloid precursor protein during apoptosis in primary rat

cortical cultures. Journal of neuroscience research.

2001;63(5):429-37.

19. Querfurth HW, Selkoe DJ. Calcium ionophore increases

amyloid beta peptide production by cultured cells. Biochemistry.

1994;33(15):4550-61.

20. Hershko A, Ciechanover A. The ubiquitin system.

Annual review of biochemistry. 1998;67:425-79.

21. Ciechanover A, Brundin P. The ubiquitin proteasome

system in neurodegenerative diseases: sometimes the chicken,

sometimes the egg. Neuron. 2003;40(2):427-46.

22. Perry G, Friedman R, Shaw G, Chau V. Ubiquitin is

detected in neurofibrillary tangles and senile plaque neurites of

Alzheimer disease brains. Proceedings of the National Academy

of Sciences of the United States of America. 1987;84(9):3033-

6.

23. Mori H, Kondo J, Ihara Y. Ubiquitin is a component of

paired helical filaments in Alzheimer's disease. Science.

1987;235(4796):1641-4.

72

24. Keller JN, Hanni KB, Markesbery WR. Impaired

proteasome function in Alzheimer's disease. Journal of

neurochemistry. 2000;75(1):436-9.

25. Oddo S. The ubiquitin-proteasome system in

Alzheimer's disease. Journal of cellular and molecular medicine.

2008;12(2):363-73.

26. Meusser B, Hirsch C, Jarosch E, Sommer T. ERAD: the

long road to destruction. Nature cell biology. 2005;7(8):766-

72.

27. McCracken AA, Brodsky JL. A molecular portrait of the

response to unfolded proteins. Genome biology.

2000;1(2):REVIEWS1013.

28. Menendez-Benito V, Verhoef LG, Masucci MG, Dantuma

NP. Endoplasmic reticulum stress compromises the ubiquitin-

proteasome system. Human molecular genetics.

2005;14(19):2787-99.

29. Gorlach A, Klappa P, Kietzmann T. The endoplasmic

reticulum: folding, calcium homeostasis, signaling, and redox

control. Antioxidants & redox signaling. 2006;8(9-10):1391-

418.

30. Greenfield JP, Tsai J, Gouras GK, Hai B, Thinakaran G,

Checler F, et al. Endoplasmic reticulum and trans-Golgi

73

network generate distinct populations of Alzheimer beta-

amyloid peptides. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America. 1999;96(2):742-7.

31. Hartmann T, Bieger SC, Bruhl B, Tienari PJ, Ida N,

Allsop D, et al. Distinct sites of intracellular production for

Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature

medicine. 1997;3(9):1016-20.

32. Mattson MP, Chan SL. Neuronal and glial calcium

signaling in Alzheimer's disease. Cell calcium. 2003;34(4-

5):385-97.

33. Stix B, Reiser G. Beta-amyloid peptide 25-35 regulates

basal and hormone-stimulated Ca2+ levels in cultured rat

astrocytes. Neuroscience letters. 1998;243(1-3):121-4.

34. Abramov AY, Canevari L, Duchen MR. Changes in

intracellular calcium and glutathione in astrocytes as the

primary mechanism of amyloid neurotoxicity. The Journal of

neuroscience : the official journal of the Society for

Neuroscience. 2003;23(12):5088-95.

35. Collin C, Miyaguchi K, Segal M. Dendritic spine density

and LTP induction in cultured hippocampal slices. Journal of

neurophysiology. 1997;77(3):1614-23.

36. Lazarowski ER, Boucher RC, Harden TK. Mechanisms of

74

release of nucleotides and integration of their action as P2X-

and P2Y-receptor activating molecules. Molecular

pharmacology. 2003;64(4):785-95.

37. Gandelman M, Peluffo H, Beckman JS, Cassina P,

Barbeito L. Extracellular ATP and the P2X7 receptor in

astrocyte-mediated motor neuron death: implications for

amyotrophic lateral sclerosis. Journal of neuroinflammation.

2010;7:33.

38. Sun XP, Stanley EF. An ATP-activated, ligand-gated

ion channel on a cholinergic presynaptic nerve terminal.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America. 1996;93(5):1859-63.

39. Zhou X, Galligan JJ. P2X purinoceptors in cultured

myenteric neurons of guinea-pig small intestine. The Journal of

physiology. 1996;496 ( Pt 3):719-29.

40. Moser MB, Trommald M, Andersen P. An increase in

dendritic spine density on hippocampal CA1 pyramidal cells

following spatial learning in adult rats suggests the formation of

new synapses. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America. 1994;91(26):12673-

5.

41. Geinisman Y, deToledo-Morrell L, Morrell F. Induction

75

of long-term potentiation is associated with an increase in the

number of axospinous synapses with segmented postsynaptic

densities. Brain research. 1991;566(1-2):77-88.

42. Geinisman Y. Structural synaptic modifications

associated with hippocampal LTP and behavioral learning.

Cerebral cortex. 2000;10(10):952-62.

43. Cullen WK, Suh YH, Anwyl R, Rowan MJ. Block of LTP

in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein

fragments. Neuroreport. 1997;8(15):3213-7.

44. Chen QS, Kagan BL, Hirakura Y, Xie CW. Impairment of

hippocampal long-term potentiation by Alzheimer amyloid

beta-peptides. Journal of neuroscience research.

2000;60(1):65-72.

45. Collingridge GL, Kehl SJ, McLennan H. Excitatory amino

acids in synaptic transmission in the Schaffer collateral-

commissural pathway of the rat hippocampus. The Journal of

physiology. 1983;334:33-46.

46. Elgersma Y, Silva AJ. Molecular mechanisms of synaptic

plasticity and memory. Current opinion in neurobiology.

1999;9(2):209-13.

47. Kornau HC, Schenker LT, Kennedy MB, Seeburg PH.

Domain interaction between NMDA receptor subunits and the

76

postsynaptic density protein PSD-95. Science.

1995;269(5231):1737-40.

48. Beique JC, Andrade R. PSD-95 regulates synaptic

transmission and plasticity in rat cerebral cortex. The Journal

of physiology. 2003;546(Pt 3):859-67.

49. Kanjhan R, Housley GD, Thorne PR, Christie DL, Palmer

DJ, Luo L, et al. Localization of ATP-gated ion channels in

cerebellum using P2x2R subunit-specific antisera. Neuroreport.

1996;7(15-17):2665-9.

50. Bogdanov Y, Rubino A, Burnstock G. Characterisation of

subtypes of the P2X and P2Y families of ATP receptors in the

foetal human heart. Life sciences. 1998;62(8):697-703.

51. Ralevic V, Burnstock G. Receptors for purines and

pyrimidines. Pharmacological reviews. 1998;50(3):413-92.

52. Lambrecht G. Agonists and antagonists acting at P2X

receptors: selectivity profiles and functional implications.

Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology.

2000;362(4-5):340-50.

53. Lambrecht G, Braun K, Damer M, Ganso M, Hildebrandt

C, Ullmann H, et al. Structure-activity relationships of suramin

and pyridoxal-5'-phosphate derivatives as P2 receptor

antagonists. Current pharmaceutical design. 2002;8(26):2371-

77

99.

54. Knecht E, Aguado C, Carcel J, Esteban I, Esteve JM,

Ghislat G, et al. Intracellular protein degradation in mammalian

cells: recent developments. Cellular and molecular life sciences :

CMLS. 2009;66(15):2427-43.

55. Schroder M, Kaufman RJ. The mammalian unfolded

protein response. Annual review of biochemistry.

2005;74:739-89.

56. Harding HP, Calfon M, Urano F, Novoa I, Ron D.

Transcriptional and translational control in the Mammalian

unfolded protein response. Annual review of cell and

developmental biology. 2002;18:575-99.

57. Kaneko M, Koike H, Saito R, Kitamura Y, Okuma Y,

Nomura Y. Loss of HRD1-mediated protein degradation causes

amyloid precursor protein accumulation and amyloid-beta

generation. The Journal of neuroscience : the official journal of

the Society for Neuroscience. 2010;30(11):3924-32.

58. Araque A. Astrocytes process synaptic information.

Neuron glia biology. 2008;4(1):3-10.

59. Kuchibhotla KV, Lattarulo CR, Hyman BT, Bacskai BJ.

Synchronous hyperactivity and intercellular calcium waves in

astrocytes in Alzheimer mice. Science. 2009;323(5918):1211-

78

5.

60. Orellana JA, Shoji KF, Abudara V, Ezan P, Amigou E,

Saez PJ, et al. Amyloid beta-induced death in neurons involves

glial and neuronal hemichannels. The Journal of neuroscience :

the official journal of the Society for Neuroscience.

2011;31(13):4962-77.

61. Walsh DM, Klyubin I, Fadeeva JV, Cullen WK, Anwyl R,

Wolfe MS, et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta

protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in

vivo. Nature. 2002;416(6880):535-9.

62. Wang Q, Walsh DM, Rowan MJ, Selkoe DJ, Anwyl R.

Block of long-term potentiation by naturally secreted and

synthetic amyloid beta-peptide in hippocampal slices is

mediated via activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase,

cyclin-dependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein

kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5. The

Journal of neuroscience : the official journal of the Society for

Neuroscience. 2004;24(13):3370-8.

63. Zhao D, Watson JB, Xie CW. Amyloid beta prevents

activation of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II

and AMPA receptor phosphorylation during hippocampal long-

term potentiation. Journal of neurophysiology.

79

2004;92(5):2853-8.

64. Monyer H, Sprengel R, Schoepfer R, Herb A, Higuchi M,

Lomeli H, et al. Heteromeric NMDA receptors: molecular and

functional distinction of subtypes. Science.

1992;256(5060):1217-21.

65. Nakanishi S. Molecular diversity of glutamate receptors

and implications for brain function. Science.

1992;258(5082):597-603.

66. Ishii T, Moriyoshi K, Sugihara H, Sakurada K, Kadotani

H, Yokoi M, et al. Molecular characterization of the family of the

N-methyl-D-aspartate receptor subunits. The Journal of

biological chemistry. 1993;268(4):2836-43.

67. Hynd MR, Scott HL, Dodd PR. Glutamate-mediated

excitotoxicity and neurodegeneration in Alzheimer's disease.

Neurochemistry international. 2004;45(5):583-95.

68. Niethammer M, Kim E, Sheng M. Interaction between

the C terminus of NMDA receptor subunits and multiple

members of the PSD-95 family of membrane-associated

guanylate kinases. The Journal of neuroscience : the official

journal of the Society for Neuroscience. 1996;16(7):2157-63.

69. Burnstock G, Knight GE. Cellular distribution and

functions of P2 receptor subtypes in different systems.

80

International review of cytology. 2004;240:31-304.

70. North RA. Molecular physiology of P2X receptors.

Physiological reviews. 2002;82(4):1013-67.

71. Rubio ME, Soto F. Distinct Localization of P2X receptors

at excitatory postsynaptic specializations. The Journal of

neuroscience : the official journal of the Society for

Neuroscience. 2001;21(2):641-53.

72. Khakh BS. Molecular physiology of P2X receptors and

ATP signalling at synapses. Nature reviews Neuroscience.

2001;2(3):165-74.

73. Robertson SJ, Ennion SJ, Evans RJ, Edwards FA.

Synaptic P2X receptors. Current opinion in neurobiology.

2001;11(3):378-86.

74. Illes P, Alexandre Ribeiro J. Molecular physiology of P2

receptors in the central nervous system. European journal of

pharmacology. 2004;483(1):5-17.

75. Zimmermann H. Signalling via ATP in the nervous

system. Trends in neurosciences. 1994;17(10):420-6.

76. Kaster MP, Rosa AO, Rosso MM, Goulart EC, Santos AR,

Rodrigues AL. Adenosine administration produces an

antidepressant-like effect in mice: evidence for the

involvement of A1 and A2A receptors. Neuroscience letters.

81

2004;355(1-2):21-4.

77. Dare E, Schulte G, Karovic O, Hammarberg C, Fredholm

BB. Modulation of glial cell functions by adenosine receptors.

Physiology & behavior. 2007;92(1-2):15-20.

78. Haass C, Hung AY, Schlossmacher MG, Teplow DB,

Selkoe DJ. beta-Amyloid peptide and a 3-kDa fragment are

derived by distinct cellular mechanisms. The Journal of

biological chemistry. 1993;268(5):3021-4.

79. Wild-Bode C, Yamazaki T, Capell A, Leimer U, Steiner

H, Ihara Y, et al. Intracellular generation and accumulation of

amyloid beta-peptide terminating at amino acid 42. The Journal

of biological chemistry. 1997;272(26):16085-8.

80. Klionsky DJ, Emr SD. Autophagy as a regulated pathway

of cellular degradation. Science. 2000;290(5497):1717-21.

81. Levine B, Klionsky DJ. Development by self-digestion:

molecular mechanisms and biological functions of autophagy.

Developmental cell. 2004;6(4):463-77.

82. Lum JJ, DeBerardinis RJ, Thompson CB. Autophagy in

metazoans: cell survival in the land of plenty. Nature reviews

Molecular cell biology. 2005;6(6):439-48.

83. Kajitani N, Kobuchi H, Fujita H, Yano H, Fujiwara T,

Yasuda T, et al. Mechanism of A23187-induced apoptosis in

82

HL-60 cells: dependency on mitochondrial permeability

transition but not on NADPH oxidase. Bioscience, biotechnology,

and biochemistry. 2007;71(11):2701-11.

84. Kozian D, Proulle V, Nitsche A, Galitzine M, Martinez

MC, Schumann B, et al. Identification of genes involved in Ca2+

ionophore A23187-mediated apoptosis and demonstration of a

high susceptibility for transcriptional repression of cell cycle

genes in B lymphoblasts from a patient with Scott syndrome.

BMC genomics. 2005;6:146.

85. Blount JR, Burr AA, Denuc A, Marfany G, Todi SV.

Ubiquitin-specific protease 25 functions in Endoplasmic

Reticulum-associated degradation. PloS one.

2012;7(5):e36542.

86. Lafleur MA, Stevens JL, Lawrence JW. Xenobiotic

perturbation of ER stress and the unfolded protein response.

Toxicologic pathology. 2013;41(2):235-62.

87. Walter P, Ron D. The unfolded protein response: from

stress pathway to homeostatic regulation. Science.

2011;334(6059):1081-6.

88. Zhang K, Kaufman RJ. Signaling the unfolded protein

response from the endoplasmic reticulum. The Journal of

biological chemistry. 2004;279(25):25935-8.

83

89. Rutkowski DT, Kaufman RJ. A trip to the ER: coping

with stress. Trends in cell biology. 2004;14(1):20-8.

90. Hare JF. Intracellular pathways of folded and misfolded

amyloid precursor protein degradation. Archives of

biochemistry and biophysics. 2006;451(1):79-90.

91. Hoozemans JJ, Veerhuis R, Van Haastert ES, Rozemuller

JM, Baas F, Eikelenboom P, et al. The unfolded protein

response is activated in Alzheimer's disease. Acta

neuropathologica. 2005;110(2):165-72.

92. Unterberger U, Voigtlander T, Budka H. Pathogenesis of

prion diseases. Acta neuropathologica. 2005;109(1):32-48.

93. Ko MH, Puglielli L. Two endoplasmic reticulum (ER)/ER

Golgi intermediate compartment-based lysine

acetyltransferases post-translationally regulate BACE1 levels.

The Journal of biological chemistry. 2009;284(4):2482-92.

94. Cupers P, Bentahir M, Craessaerts K, Orlans I,

Vanderstichele H, Saftig P, et al. The discrepancy between

presenilin subcellular localization and gamma-secretase

processing of amyloid precursor protein. The Journal of cell

biology. 2001;154(4):731-40.

84

Abstract

Eun Sun Jung

Interdisciplinary Graduate Program

in Genetic Engineering

Seoul National University

Activated microglia and reactive astrocytes are commonly

found in and around the senile plaque, which is the central

pathological hallmark of Alzheimer’s disease. Astrocytes

respond to neuronal activity through the release of

gliotransmitters such as glutamate, D-serine, and ATP.

However, it is largely unknown whether and how

gliotransmitters affect neuronal functions. In this study, we

explored the effect of a gliotransmitter, ATP, on neurons

damaged by Aβ. We found that Aβ42 increased the release of

ATP in cultures of primary astrocytes and U373 astrocyte cell

line. We also found that exogenous ATP protected Aβ42-

mediated reduction in synaptic molecules, such as NMDA

receptor 2A and PSD-95, through P2 purinergic receptors and

prevented Aβ42-induced spine reduction and impairment of

long-term potentiation. Our findings suggest that Aβ-induced

release of gliotransmitter ATP plays a protective role against

85

Aβ42-mediated disruption of synaptic plasticity. In addition,

we found that APP is rapidly degraded by ubiquitin-proteasome

system (UPS) in CHO cell lines in response to ER stress, such

as calcium dyshomeostasis. It is known that Aβ42 can induce

calcium dyshomeostasis. Increased intracellular calcium by

A23187 induces polyubiquitination of APP, causing degradation

of APP. A23187-induced reduction of APP prevented by only

poteasome inhibitor MG132. Also, we observed that APP was

accumulated in the ER by MG132. Impaired proteasome activity

have been reported in Alzheimer’s disease. Taken together,

these results suggest that astrocyte can protects neuron

through gliostransmitter, ATP and proteasome may prevents

accumulation of misfolded APP through rapid degradation under

pathological stress such as Aβ or calcium dyshomeostasis.

Threfore, regulation of astrocyte-neuron interaction and

proteasome activity under phathological stress such as Aβ and

calcium dyshomeostasis may provide therapeutic targets for

treating AD.

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Keywords: Alzheimer’s disease, β-amyloid (Aβ), synaptic

plasticity, ATP, Amyloid precursor protein (APP), ER stress,

calcium, Ubiquitin-Proteasome System (UPS)

Student number: 2009 – 30843