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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS
DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Unidad Zacatenco
Departamento de Farmacología
“Diseño y desarrollo de inhibidores no nucleósidos de la
transcriptasa reversa (NNRTIs) como agentes anti VIH-1”
T E S I S
Que presenta:
Q. F. B. Claudia Cahuantzi Tamalatzi
Para obtener el grado de:
Maestra en Ciencias en la Especialidad de Farmacología
Directora de tesis:
Dra. Martha Sonia Morales Ríos
Ciudad de México Febrero de 2020
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio 30 del
Departamento de Química del Centro de Investigación y de
Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV-IPN),
bajo la dirección de la Dra. Martha Sonia Morales Ríos ([email protected]),
en el marco del Programa de posgrado de Farmacología, con una beca otorgada
por el Consejo Nacional de Ciencia y tecnología (CONACyT),
con número de registro: CVU 802033
A mi familia
Por su infinito apoyo,
por siempre creer en mí,
y por ser mi fuente de motivación.
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Martha Sonia Morales Ríos por permitirme realizar el presente
trabajo de tesis en su laboratorio, por brindarme su apoyo y por el tiempo que
dedicó a mi formación, al compartirme sus conocimientos y enseñanzas.
A la Dra. Leonor Huerta Hernández por abrir las puertas de su laboratorio
para realizar la parte experimental biológica, y a su grupo de investigación
por el apoyo en la realización de los experimentos.
Al Dr. José Vázquez Prado y la Dra. Rosa María del Angel Núñez de
Cáceres por formar parte de mi comité tutorial, por sus comentarios y
consejos para enriquecer el presente trabajo.
A los auxiliares de investigación: QFB. Joel de Jesús Trujillo Serrato, QFB.
Nadia Azucena Pérez Rojas, QFB. Yolanda Mora Pérez, QFB. Elvia
Celina Álvarez Cisneros y QFB. Angelina Hernández Barragán, por su
colaboración en la parte experimental química del presente proyecto, y por
bridarme su amistad.
A mis compañeros de laboratorio por el tiempo compartido y por hacer más
amena mi estancia en el laboratorio.
A mis compañeros de maestría por el apoyo a lo largo del posgrado, por las
vivencias compartidas, y por su amistad.
Parte de los resultados durante la realización de esta tesis se presentaron en un
congreso internacional:
“Synthesis of beta tryptophan derivatives as potential antiretroviral drugs”
Claudia Cahuantzi-Tamalatzi, Tonatiuh Benítez-González, Cristian G. Arroyo-
Chavero, Gelacio Martínez-Gudiño, Yolanda Mora-Pérez, Martha S. Morales-Ríos.
RICT 2019. 55th International Conference on Medicinal Chemistry, Interfacing
chemical biology and drug discovery. Nantes, Pays de la Loire, France. Del 3 a 5 de
Julio de 2019. (Cartel).
ÍNDICE
ABREVIATURAS ........................................................................................................ i
ABSTRACT ................................................................................................................ ii
RESUMEN ................................................................................................................ iii
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1
1.2. Diseño racional de Fármacos ................................................................. 1
1.3. Enfermedad del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida ................... 3
1.3.1. Epidemiología de la infección por el VIH-1 ................................. 3
1.3.2. Estructura del VIH-1 ................................................................... 4
1.3.3. Ciclo de replicación del VIH-1 ..................................................... 6
1.3.4. Tratamiento contra el VIH-1 ........................................................ 7
1.3.5. Transcriptasa Reversa (RT) ....................................................... 8
1.3.5.1. Transcripción reversa ..................................................... 9
1.3.5.2. Los NNRTIs .................................................................. 11
1.3.5.3. Mecanismos de resistencia ........................................... 12
1.4. Diseño de NNRTIs ................................................................................ 13
1.4.1. Diseño y optimización de compuestos líder .............................. 13
1.5. Antecedentes........................................................................................ 16
2. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................... 17
3. HIPÓTESIS ....................................................................................................... 17
4. OBJETIVOS ..................................................................................................... 18
4.1. Objetivo general ................................................................................... 18
4.2. Objetivos específicos ............................................................................ 18
5. ESTRATEGIA GENERAL ................................................................................... 19
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 20
6.1. Métodos computacionales .................................................................... 20
6.1.1. Modelado molecular de las propanamidas 1-4 ......................... 20
6.1.2. Análisis de la energía de unión (ΔG) de las
propanamidas 1-6 ..................................................................... 22
6.1.3. Identificación de las interacciones enzima-ligando ................... 25
6.1.4. Las 5 reglas de Lipinski en las propanamidas 1-6. ................... 33
6.2. Síntesis química ................................................................................... 34
6.2.1. Síntesis química de las propanamidas 1-4 ............................... 35
6.3. Efecto in vitro de las propanamidas 1-6 sobre la actividad de la RT .... 38
6.3.1. Validación del ensayo in vitro con base en
medicamentos NNRTIs ............................................................. 38
6.3.2. Curvas dosis-respuesta de las propanamidas 1-6 .................... 39
7. CONCLUSIONES ............................................................................................. 42
8. MÉTODOS EXPERIMENTALES Y TEÓRICOS ..................................................... 43
8.1. Métodos computacionales .................................................................... 43
8.1.1. Búsqueda conformacional ........................................................ 43
8.1.2. Optimización de la geometría conformacional .......................... 43
8.1.3. Acoplamiento molecular o docking ........................................... 43
8.1.4. Determinación de las reglas de Lipinski ................................... 44
8.2. Síntesis Química .................................................................................. 44
8.2.1. Síntesis del 5-metoxi-N-acil-β2-triptófano 14 ............................ 45
8.2.2. Síntesis de las propanamidas 1-4............................................. 50
8.3. Evaluación biológica ............................................................................. 54
8.3.1. Ensayo in vitro «EnzChek® Reverse Transcriptase» ............... 54
9. BIBLIOGRAFÍA................................................................................................. 56
10. ANEXO ........................................................................................................... 63
10.1. Tablas de RMN de 1H y 13C (δ en ppm; J en Hz) del 5-metoxi-N-
acil-β2-triptófano 14 y las propanamidas 1-4 ....................................... 63
10.2. Espectros de RMN de 1H (300 MHz) y 13C (75 MHz) del 5-metoxi-
N-acil-β2-triptófano 14 y las propanamidas 1-4 .................................... 64
i
ABREVIATURAS
AcOEt Acetato de etilo
AcOH Ácido acético
Ac2O Anhídrido acético
Ar Argón
CENSIDA Centro nacional parar la prevención y control del VIH y el SIDA
CG Cromatografía de gases
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
dT Desoxitimina
DTT Ditiotreitol
dTTP Desoxitimidina trifosfato
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético
gHMBC Correlación heteronuclear multienlace
gHSQC Correlación heteronuclear cuántica simple
GPCR´s Receptores acoplados a proteínas G
HBA Aceptor de enlaces de hidrógeno
HBD Donador de enlaces de hidrógeno
HCl Ácido clorhídrico
H2O Agua
INEGI Instituto nacional de estadística y geografía
kb Kilo bases
KBr Bromuro de potasio
KCl Cloruro de potasio
i
KCN Cianuro de potasio
K2CO3 Carbonato de potasio
Log P Coeficiente de partición
MeI Yoduro de metilo
MeOH Metanol
(MeO)2CO Carbonato de dimetilo
MHC Complejo mayor de histocompatibilidad
MM Mecánica molecular
mRNA RNA mensajero
Na Sodio metálico
NaCl Cloruro de sodio
N(Et)3 Trietilamina
NaHCO3 Bicarbonato de sodio
NaOH Hidróxido de sodio
Na2SO4 Sulfato de sodio
NNRTIs Inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa reversa
nRotB Número de enlaces rotables
PDB Base de datos de proteínas
pf Punto de fusión
PM Peso molecular
QM Mecánica quántica
Rf Relación de frentes
RNA Ácido ribonucleico
UNAIDS Programa conjunto de las naciones unidas sobre el VIH/Sida
WHO Organización mundial de la salud
ii
ABSTRACT
The enzyme reverse transcriptase (RT), whose function is to copy the material
genetic of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV 1), is a target for anti-HIV
therapy. In this study, focused on the design and synthesis of RT inhibitors, a new
scaffold of potential leader molecules was designed upon the bases of known typical
characteristics of NNRTIs: 2 hydrophobic wings attached to a hydrophilic body.
Investigation involved several computational screening methods which were applied
in a series of 1-4 propanamides derived from β2-tryptophan, that incorporate into its
structure a homocyclic (1-3) or heterocyclic (4) hydrophobic aromatic group,
including its synthesis and experimental tests. Computed protein-ligand binding
energy and in vitro inhibitory activity were compared with those of propanamides 5
and 6 and the medicinal compounds delavirdina® and efavirenz®. It was shown that
although propanamides 1-6 theoretically bind at the allosteric site of RT, with a ΔG
of about -10 kcal / mol, they do not inhibit RT in vitro.
Scheme i. Propanamides 1-6 derivatives of β2-tryptophan.
“Wing I”
“Wing II”
“Hydrophilic body”
“Wing I”
“Wing II”
“Hydrophilic body” 1:
(S,R)-3:
(R,R)-2:
4:
5: 6:
iii
RESUMEN
La enzima transcriptasa reversa (RT), cuya función es copiar el material genético
del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH 1), es un blanco para la terapia
anti-VIH. En este estudio, enfocado en el diseño y síntesis de inhibidores de la RT,
se diseñó un nuevo andamiaje estructural de potenciales moléculas líder sobre la
base de las características típicas conocidas de los NNRTIs: 2 alas hidrofóbicas
unidas a un cuerpo hidrofílico. La investigación involucró varios métodos de cribado
computacional que se aplicaron a una serie de propanamidas 1-4 derivadas del β2-
triptófano, que incorporan en su estructura un grupo aromático homocíclico (1-3) o
heterocíclico (4) hidrofóbico, incluidas su síntesis y pruebas experimentales. La
energía de unión calculada del complejo proteína-ligando y la actividad inhibidora in
vitro se compararon con las obtenidas para las propanamidas 5 y 6 y con los
medicamentos delavirdina® y efavirenz®. Se demostró que a pesar de que las
propanamidas 1-6 se unen teóricamente en el sitio alostérico de la RT, con una ΔG
de alrededor de -10 kcal/mol, éstas no inhiben in vitro a la RT.
Esquema i. Propanamidas 1-6 derivadas del β2-triptófano.
“Ala I”
“Ala II”
“Cuerpo hidrofílico”
“Ala I”
“Ala II”
“Cuerpo hidrofílico” 1:
(S,R)-3:
(R,R)-2:
4:
5: 6:
1
Introducción
1. INTRODUCCIÓN
La investigación farmacéutica, tanto en el sector académico como en la industria,
se ha enriquecido con la creación de una nueva área tecnológica que permite
identificar estructuras químicas candidatas a presentar actividad biológica, a un
menor costo y tiempo de desarrollo. Por ello, el diseño de fármacos asistido por
computadora cobra cada vez mayor importancia en la investigación y desarrollo de
medicamentos [1, 2]. En el diseño de fármacos la variable dominante es la alta
afinidad entre el ligando (generalmente una molécula pequeña) y el blanco
terapéutico al que se une (generalmente una proteína). Dicho diseño es una tarea
compleja debido a que solo un pequeño porcentaje del vasto espacio químico es
biológicamente activo y, por lo tanto, relevante para el desarrollo de fármacos [3].
El espacio químico de posible interés para el descubrimiento de fármacos consiste
en todas las posibles moléculas estables con un peso molecular de hasta 500
Daltons. Los químicos teóricos lo han calculado en el orden astronómico de 1060
moléculas. Con las bases más grandes de datos que actualmente contienen hasta
65 millones de moléculas diferentes (ca. 108) y con alrededor de 12,000 nuevos
compuestos cada día, los químicos sólo han hecho recorridos bastante tentativos
en este espacio [4, 5].
1.2. Diseño racional de Fármacos
El desarrollo de fármacos dirigido hacia blancos farmacológicos específicos se ha
impulsado en los últimos años gracias a los avances y coordinación de diversas
disciplinas tales como la química computacional (modelado molecular), la biología
estructural (caracterización cristalográfica por rayos X de complejos proteína-
ligando) y la química medicinal (biososterismo, hibridación molecular, teoría de
multivalencia, etc.), (Figura 1) [6, 7].
2
Introducción
Figura 1. Enfoque racional en el diseño de fármacos [7].
Una de las herramientas más aplicadas en el descubrimiento de fármacos es el
modelado molecular que se basa en algoritmos que calculan datos estructurales y
energéticos de las moléculas. Esta técnica analiza desde entidades químicas
pequeñas hasta macromoléculas biológicas y ensamblajes de materiales con el
objetivo de racionalizar y estimar las propiedades de estos sistemas y sus
interacciones [8]. Particularmente, el docking molecular es un método que involucra
la búsqueda de la conformación y posición óptima de un ligando dentro de un blanco
molecular (tal como una proteína), identificando y caracterizando las interacciones
en el complejo formado [8, 9]. Por su parte, el modelado por análisis farmacofórico
evalúa un grupo de características estructurales en una molécula que es reconocida
por un sitio de la enzima y que es responsable de la actividad biológica de la
molécula [1, 10]. Mientras que, la evaluación de “las 5 reglas de Lipinski” (PM, Log
P, HBA, HBD y nRotB), permite predecir la solubilidad y permeabilidad de un
compuesto para determinar la biodisponibilidad de un fármaco administrado por vía
oral [11]. La utilización de estos métodos como herramientas complementarias en
el diseño de fármacos, ha potencializado la búsqueda de entidades químicas con la
máxima actividad terapéutica a un menor costo y tiempo de desarrollo.
3
Introducción
Los métodos cuantitativos de relación estructura-actividad (QSAR) son
herramientas importantes para la predicción del efecto biológico de compuestos
químicos basados en relaciones matemáticas y estadísticas. Los químicos
medicinales utilizan las técnicas de síntesis química para insertar nuevos grupos
químicos en un compuesto seleccionado y relacionar estas modificaciones
estructurales con sus posibles efectos biológicos, basados en el hecho de que existe
una relación entre la estructura molecular del compuesto químico y su actividad
biológica [12].
Una de las dificultades que entorpecen el diseño de compuestos bioactivos
innovadores, es debida a la complejidad que representa sintetizar nuevas
estructuras químicas. Por ello, uno de los criterios fundamentales para elegir una
estructura química novedosa es que ésta pueda ser candidata de presentar una alta
probabilidad de ser sintéticamente accesible y suficientemente estable para generar
una familia de compuestos que permita correlacionar las características
estructurales de cada compuesto en función de la variación de la respuesta
biológica que exhiben [13].
En el proceso de ejecución de cada una de las disciplinas enfocadas al desarrollo
de fármacos, existe un riesgo importante de que el compuesto no cumpla los
requisitos necesarios para seguir adelante con el proceso [13].
1.3. Enfermedad del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida
1.3.1. Epidemiología de la infección por el VIH-1
De acuerdo con las estadísticas de la WHO y UNAIDS (2018), 37.9 millones de
personas viven con VIH a nivel mundial, de las cuales, sólo el 59% recibieron
tratamiento antirretroviral y se prevé que para el 2030 alrededor del 89% de los
pacientes con VIH tengan acceso al tratamiento (Figura 2) [14, 15]. Específicamente
en nuestro país, el INEGI (2017) reportó 4,720 defunciones ocasionadas por el VIH-
1 incluyendo ambos géneros y todas las edades [16]. Mientras que el CENSIDA
(2018) registró 17,130 casos nuevos diagnosticados de VIH-1 y sida, a nivel
4
Introducción
nacional [17]. Por lo cual, aún se considera a la enfermedad causada por el virus de
inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) como un problema de salud pública
importante, que requiere de mejoras en el tratamiento.
Figura 2. Número de personas con VIH que tienen acceso al tratamiento
antirretroviral, a nivel mundial. Tomado y modificado de [14].
1.3.2. Estructura del VIH-1
El VIH-1 es un retrovirus, específicamente de la subfamilia de los lentivirus, su
genoma está constituido por dos copias de RNA, que se replican por medio de un
DNA intermedio usando la enzima transcriptasa reversa (RT). Así, el virus puede
replicarse y extenderse hacia las células del sistema inmunitario, siendo su principal
blanco los linfocitos T CD4+ [18, 19]. El VIH-1 tiene una forma esférica y en él se
pueden diferenciar 3 capas (Figura 3) [18]:
Capa externa o envoltura: una membrana o bicapa de lípidos donde se
encuentran insertadas glicoproteínas de superficie (gp120) y glicoproteínas
transmembranales (gp41), además de proteínas derivadas de la célula
huésped como el MHC I y II, actina y ubiquitina.
Cápside icosaédrica: donde se encuentran proteínas de matriz p17, y una
nucleocápside cónica compuesta por proteínas p24.
Capa interna o núcleo: donde se encuentran las nucleoproteínas p7, dos
copias de RNA de polaridad positiva (genoma con la misma polaridad que el
mRNA, y que puede ser traducido de forma inmediata en la célula huésped),
5
Introducción
que constituyen el genoma viral; adicionalmente los genes estructurales env,
gal y pol, y los genes reguladores o proteínas accesorias tat, rev, nef, vif, vpr,
vpu, vpx y tev; así como 3 enzimas importantes en la replicación viral: la
proteasa, integrasa y transcriptasa reversa (RT) [18].
Figura 3. Estructura del virus maduro del VIH, rodeado de las representaciones de
listón de las proteínas virales de las cuales está constituido. SU: gp120, NC: p7, CA:
p24, IN: integrasa, PR: proteasa, RT: transcriptasa reversa, TM: gp41, y MA: p17
[18].
6
Introducción
1.3.3. Ciclo de replicación del VIH-1
El ciclo de replicación del VIH-1 empieza con la entrada del virus a la célula huésped
por interacción de las glicoproteínas de superficie gp120 del VIH-1 con los
receptores de los linfocitos T CD4+, y el acople de los correceptores CCR5 y/o
CXCR4 de la familia de los GPCR´s (Figura 4, Paso 1), generando a su vez un
cambio conformacional que permite el anclaje de la glicoproteína transmembranal
gp40 del VIH-1 con la membrana de la célula huésped, permitiendo la fusión entre
la membranas (internalización) (Figura 4, Paso 2). Mientras que, la descapsidación
y liberación del material genético del virus, junto con enzimas importantes en la
replicación viral, se lleva a cabo en el citoplasma celular (Figura 4, Paso 3). Por otro
lado, en las inmediaciones del núcleo celular, la RT realiza la síntesis de DNA viral
de doble cadena (dsDNA), a partir de una molécula de RNA de cadena simple
(ssRNA) (Figura 4, Paso 4). A través de la integración de factores celulares y virales
junto con el DNA viral forman el “complejo de preintegración”, el cual es insertado
al genoma de la célula huésped por medio de la actividad de la integrasa (provirus)
(Figura 4, Paso 5). La activación o no activación de factores celulares como NF-KB
propicia que la replicación se mantenga en un periodo de latencia o genere una
replicación masiva. Por su parte, genes reguladores como tat y rev participan en los
procesos de transcripción, elongación y procesamiento del mRNA, que es
transportado hacia el retículo endoplásmico para la síntesis de proteínas virales
(Figura 4, Paso 7-9). La proteasa ensambla dichas proteínas virales para la
formación de un virus inmaduro, que finalmente es liberado por gemación para su
posterior maduración y diseminación a través del sistema inmunológico (Figura 4,
Paso 10-13) [18-21]. El proceso lleva a una colonización del virus en el organismo
de manera progresiva, expresándose en una disminución de la función habitual del
sistema inmune hasta el punto de no ser capaz de hacer frente a infecciones y
enfermedades que habitualmente son inofensivas, lo que se conoce como síndrome
de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) [19].
7
Introducción
Figura 4. Ciclo replicativo del virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) [21].
1.3.4. Tratamiento contra el VIH-1
La creación de una vacuna eficaz contra el VIH-1 se traduciría en la erradicación de
los casos de SIDA ocasionadas por el VIH-1. Debido a la gran variabilidad genética
que presenta el virus, sumado a su alta tasa de mutabilidad y recombinación, hasta
el momento no se cuenta con una vacuna viable [22, 23]. Es por ello que los
esfuerzos se siguen enfocando en la prevención y en el desarrollo de fármacos
como tratamiento antirretroviral.
Los fármacos actualmente disponibles se clasifican en 6 clases de inhibidores:
inhibidor de la fusión, del receptor CCR5, de la integrasa, de la proteasa (IP),
inhibidores nucleósidos de la transcriptasa reversa (NRTIs) y los inhibidores no
nucleósidos de la transcriptasa reversa (NNRTIs). De los cuales, las guías sobre
tratamiento contra el VIH-1 recomiendan que los pacientes sean administrados con
una combinación de al menos 2 o 3 fármacos de al menos 2 clases diferentes [24-
26], incluyendo a los inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa reversa
8
Introducción
(NNRTIs), esto con el objetivo de controlar la replicación viral y frenar la progresión
de la enfermedad [15, 26] desde diferentes puntos.
1.3.5. Transcriptasa Reversa (RT)
La RT del VIH-1 es un heterodímero asimétrico, constituido por una subunidad p66
(560 aminoácidos) y una subunidad p51 (440 aminoácidos). La estructura 3D de la
subunidad p66 es frecuentemente comparada con una mano derecha, los dedos
(azul) (aminoácidos del 1-85 y 118-155), la palma (rosa) (aminoácidos del 86-117 y
156-237) y el dominio de pulgar (verde) (aminoácidos 230-318) (Figura 5b) [24, 27].
A su vez, la subunidad p66 también contiene los dominios catalíticos de DNA
polimerasa y de RNAsa H (aminoácidos 427-560), ligado al dominio de conexión
(aminoácidos 319-426), vinculado a la subunidad p51 (Figura 5a) [24, 28]. A pesar
de la homología en su secuencia, la subunidad p66 asume una estructura abierta y
flexible, mientras que la subunidad p51 es más compacta, y parece jugar un rol
estructural, carente de actividad catalítica [24, 27].
Figura 5. Representación estructural de la RT del VIH-1. a) Subunidad p66/p51 de
la RT [28]. b) Subunidad p66, el sitio activo de unión de los NRTIs (NIBP, en rojo) y
el sitio alostérico de unión de los NNRTIs (NNIBP, amarillo) [24].
a) b)
9
Introducción
1.3.5.1. Transcripción reversa
La transcripción consiste en la síntesis de RNA tomando como molde DNA y
significa el paso de la información contenida en el DNA hacia el RNA. La
transferencia de la información del DNA hacia el RNA se realiza siguiendo las reglas
de complementariedad de las bases nitrogenadas y es semejante al proceso de
transcripción de textos, motivo por el que ha recibido este nombre. El RNA producto
de la transcripción recibe el nombre de transcrito [29]. Contrario a ello, la
transcripción reversa es una reacción que cataliza la enzima RT, donde las dos
actividades catalíticas de la RT, la polimerasa y la RNAsa H, cooperan para
sintetizar dsDNA a partir de una copia de ssRNA. Esta reacción es un paso central
en la infección viral, por lo cual se le considera un blanco potencial a inhibir [27, 30].
La transcripción reversa toma lugar en el citoplasma, específicamente en las
inmediaciones del núcleo de los linfocitos T CD4+. La síntesis de DNA inicia con el
tRNALys3 de la célula huésped, que funciona como un primer e hibrida al sitio de
unión al primer (pbs), un segmento de 18 nucleótidos de longitud, localizado cerca
del extremo terminal 5´ del RNA viral de polaridad positiva. Esto resulta en la síntesis
de un tramo corto de DNA de cadena simple (ssDNA), que se relocaliza e hibrida a
la secuencia repetida del extremo terminal 3´ del RNA viral. Después de que esta
cadena es transferida, la síntesis del ssDNA puede continuar, lo que requiere de
actividades enzimáticas múltiples: polimerización del DNA dependiente de RNA,
transferencia de la cadena (primer salto), y la actividad de la RNAsa H. La síntesis
de DNA genera una cadena híbrida RNA/DNA, en la que está involucrada la enzima
RT. Mientras que, la RNAsa H hidroliza el templado de RNA copiado, obteniendo
una ssDNA de polaridad negativa. La síntesis de la segunda cadena de DNA de
polaridad positiva usa como primers fragmentos de RNA hibridizados de la primera
cadena de DNA de polaridad negativa, incluyendo una secuencia específica rica en
purina conocida como tracto de polipurina (PPT), resistente a la degradación de la
RNAsaH. La síntesis de la segunda cadena de DNA de polaridad positiva también
requiere de la actividad de la RNAsa H y de una reacción de transferencia de cadena
(segundo salto). En la segunda transferencia de cadena, ambas cadenas de
10
Introducción
polaridad positiva y negativa son extendidas obteniendo un dsDNA, con secuencias
terminales similares en ambos extremos, nombrados como secuencias terminales
repetidas (LTRs) (Figura 6) [24, 27, 31].
Figura 6. Mecanismo de transcripción reversa del genoma del VIH-1. A) Una copia
de RNA + (azul claro) con un primer de tRNALys3, cerca del extremo terminal 5´. B)
El primer de tRNALys3 hibrida al sitio de unión al primer (pbs), generando un
fragmento corto de ssDNA - (azul fuerte). C) Primer salto: se relocaliza o transfiere
el tramo corto de ssDNA - al extremo terminal 3´para continuar con la síntesis de la
cadena de ssDNA -. D) Hidrólisis del templado de RNA + (línea punteada), por
acción de la RNAsa H. E) La secuencia rica en polipurina (ppt), sirve como primer
para la síntesis de la ssDNA +, al ser resistente a la actividad de la RNAsa H. F)
Remoción del primer tRNALys3 y transferencia de la segunda cadena de DNA +. G)
Extensión de las 2 cadenas de DNA +/-, previamente sintetizadas, para obtener un
dsDNA, con LTRs a ambos extremos de las cadenas. Tomado y modificado de [32].
11
Introducción
1.3.5.2. Los NNRTIs
Los NNRTIs son inhibidores no competitivos, que inhiben a la RT por unión a la
enzima en un “pocket” o sitio alostérico de unión a los NNRTIs (NNIBP), localizado
a una distancia de alrededor de 10 Å de su sitio catalítico. El NNIBP consiste en
residuos de aminoácidos tales como P59, L100, K101, K103, S105, V106, T107,
V108, D132, V179, Y181, Y188, V189, G190, E224, F227, W229, Y232, L234, P236
y Y318 de la subunidad p66. La interacción de los compuestos con el sitio alostérico
de la RT induce cambios conformacionales que impactan en las actividades
catalíticas de la enzima, interfiriendo en la síntesis de dsDNA (Figura 7a) [24, 27,
28]. Así mismo, los NNRTIs no necesitan de metabolización intracelular, como en el
caso de los NRTIs, y son inhibidores altamente específicos del VIH-1, es decir, no
son activos contra otros retrovirus [24].
Los NNRTIs, de primera generación tales como efavirenz (EFV), nevirapina (NVP),
delavirdina (DLV), y de segunda generación como etravirina (ETV), rilpivirina (RPV)
y doravirina (DOR), son importantes en la terapia combinada (nombrada terapia
antirretroviral altamente activa, HAART por sus siglas en inglés) contra la infección
por VIH-1 y SIDA, debido a su única actividad antiviral y alta especificidad. Sin
embargo, la resistencia a los fármacos es la principal razón del fracaso en el
tratamiento, relacionado en mayor parte a los NNRTIs de primera generación;
aunado a la baja solubilidad y biodisponibilidad oral de los NNRTIs de segunda
generación. Por lo que, los investigadores se han enfocado en el desarrollo de
nuevos NNRTIs con mejores perfiles de resistencia al fármaco, mayor
biodisponibilidad y con baja toxicidad [7, 27].
12
Introducción
Figura 7. Representación de las poses de unión de diferentes medicamentos en el
sitio alostérico de unión a los NNRTIs. a) NVP (rosa), EFV (azul) y RPV (verde) [28].
b) Dapivirina [27].
1.3.5.3. Mecanismos de resistencia
La tasa de mutación espontánea es la determinante principal de la diversidad y
evolución viral. Particularmente, el VIH-1 presenta una alta tasa de diversidad
genética, lo que le garantiza la habilidad de escape frente al sistema inmune, y la
rápida presencia de resistencia frente a los fármacos existentes, una de las
principales causas de fracaso al tratamiento antirretroviral, situación en la que la RT
del VIH-1 juega un papel fundamental [33]. Esto se ve reflejado en la infección del
VIH-1, que se caracteriza por una alta tasa de replicación, con la producción de 1 a
10 billones de nuevas partículas virales por día en un individuo infectado no tratado,
con una tasa de error por nucleótido detectable incorporado de 1/1700. Combinando
estos dos factores con la longitud del genoma viral (~10,000 nucleótidos, 9.7 kb), se
puede calcular que cada día se produce una mutante de cada posición del
nucleótido [24]. Aquellas mutaciones de resistencia a los NNRTIs reportadas,
incluyen a L100I, K101E, K103N, V106A, V179D, Y181C, Y188L, G190A y P236L,
que pueden presentarse individualmente o en combinación [27, 28]. Por ello, los
tratamientos subóptimos, como son los regímenes monoterapia, favorecen la
resistencia a los fármacos administrados [24].
a) b)
13
Introducción
1.4. Diseño de NNRTIs
A través de los continuos esfuerzos en el desarrollo de herramientas
computacionales y el incremento en la información sobre la estructura de la RT, se
ha favorecido el desarrollo de nuevas generaciones de NNRTIs. Dentro de las
principales características que se toman en cuenta para considerar un buen
candidato a fármaco, son las siguientes [7]:
Perfil alto de efectividad contra las mutaciones existentes de la RT.
Excelente biodisponibilidad oral y potencia duradera.
Baja toxicidad.
Síntesis accesible y formulación eficaz.
1.4.1. Diseño y optimización de compuestos líder
El modelado de farmacóforos basado en el receptor o en el ligando es una técnica
poderosa para estimar el modo de unión y la energía de nuevas moléculas
pequeñas, mejorando el proceso de diseño racional de fármacos. La dificultad
principal del modelado de farmacóforo basado en el receptor es la identificación de
aquellos residuos de aminoácidos que pueden formar interacciones fuertes con un
compuesto de peso molecular pequeño (ligando) [7, 28].
Aunque se ha dilucidado la estructura tridimensional de la transcriptasa reversa (RT)
del VIH, la flexibilidad inherente del NNIBP limita el diseño de NNRTIs basado en el
receptor. Es por ello, que una de las estrategias en química medicinal ampliamente
usada en el desarrollo de nuevos NNRTIs es el uso de métodos de modelado por
análisis farmacofórico del ligando. Este enfoque permite sugerir estructuras
novedosas de ligandos, no contenidas en ninguna base de datos, conocido como
“diseño de novo” [7, 28].
Particularmente, algunos de los NNRTIs que han sido aprobados en la clínica han
sido “diseñados de novo” siguiendo el modelo “tipo mariposa” (Figura 8) [7, 28]. El
modelo de “mariposa”, en la estructura de los NNRTIs, consiste en dos motivos
14
Introducción
hidrofóbicos (“ala I y ala II”), uno de las cuales está usualmente sustituido por un
átomo de halógeno, y ellos dos, están conectados a un cuerpo polar central o motivo
central hidrofílico (“cuerpo”: grupos amida o tiamida) (Figura 8). A su vez, las 2 alas
interactúan a través de interacciones π/hidrofóbicas con los residuos de
aminoácidos de carácter hidrofóbico, tales como: W229, F227, V106, P236, L100,
L234; y polares como: Y181 y Y188, en el sitio alostérico de la RT. Por su parte, el
cuerpo central es principalmente el responsable de la adaptación conformacional y
de las interacciones por aceptación o donación de puentes de hidrógeno con los
residuos de aminoácidos K101 y K103 [7, 28, 34, 35].
Figura 8. Representación del modelo farmacofórico de tipo “mariposa” para el
diseño y desarrollo de NNRTIs. Se esquematizan las alas de carácter hidrofóbico (I
y II), unidas a un cuerpo hidrofílico (A), con las distancias y ángulo que hay entre
éstas.
15
Introducción
Algunos ejemplos de fármacos ya aprobados como NNRTIs y que fueron diseñados
de novo” siguiendo el modelo de tipo “mariposa [7, 27, 28], se muestran en el
Esquema 1.
Esquema 1. NNRTIs aprobados como tratamiento antirretroviral, de primera
generacióna y segunda generaciónb.
Nevirapina a (NVP) Efavirenz a (EFV) Delavirdina a (DLV)
Lovirida b Trovirdina b
16
Antecedentes
1.5. Antecedentes
En la etapa inicial de un proceso de descubrimiento de fármacos, la selección y
optimización de un potencial ligando se basa principalmente en la energía libre de
unión (ΔG) del complejo receptor-ligando, que predice la afinidad de un compuesto
por su blanco terapéutico. Para que se forme un complejo estable la energía de
interacción (ΔG), ha de ser negativa, con un beneficio en la unión (entalpía) y una
limitación en la dinámica (costo en entropía). Un valor de ΔG lo más negativo da
como resultado la formación de un complejo enzima-ligando más estable.
Con el fin de diseñar compuestos bioactivos innovadores y encontrar un probable
líder que cumpla con el modelo farmacóforo de mariposa (Figura 8), típico de los
NNRTIs del VIH-1, Benítez-Gonzáles, T. (2017) [36] y Arroyo-Chavero, C. G. (2020)
[37], realizaron un análisis conformacional in silico y estudios de docking molecular
sobre un modelo estructural de amidas derivadas del β2-triptófano 5-8 (Esquema 2).
El resultado del análisis computacional estimó que las propanamidas (R)-5 y (R)-6
se unen al sitio alostérico de la RT y poseen una mejor energía de afinidad (ΔG)
enzima-ligando que aquella calculada para las amidas (R)-7 y (R)-8 (Esquema 2).
Esquema 2. Estructura de las amidas derivadas del β2-triptófano 5-8 como
potenciales NNRTIs del VIH-1. ΔG en kcal/mol.
ΔG = -10.17 ΔG = -10.12
ΔG = -8.70 ΔG = -9.93
(R)-5 (R)-6
(R)-7 (R)-8
17
Justificación e Hipótesis
2. JUSTIFICACIÓN
Con base en los antecedentes descritos (vide supra), se consideró que el núcleo
estructural de propanamida, que cumple con el modelo farmacofórico de los
inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa reversa (NNRTIs), puede servir de
punto de partida para realizar una serie de modificaciones estructurales y predecir
el efecto que éstas ejercerían sobre la energía de afinidad en el complejo RT-
ligando, en vías de descubrir nuevos inhibidores alostéricos de la RT.
3. HIPÓTESIS
La elaboración de perfiles de unión en conjunto con estudios in vitro proporcionará
información retrospectiva sobre las propiedades que afectan la afinidad del núcleo
de propanamida y resultarán útiles para guiar los pasos adicionales de optimización
de una serie de propanamidas (Esquema 3) como inhibidores alostéricos de la RT.
Esquema 3. Propanamidas derivadas del β2-triptófano 1-6 como NNRTIs del VIH-
1.
“Ala 1”
“Ala 2”
“Cuerpo hidrofílico”
“Ala 1”
“Ala 2”
“Cuerpo hidrofílico” 1:
(S,R)-3:
(R,R)-2:
4:
5: 6:
18
Objetivos
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Estimar el efecto que ejerce la inserción de un sustituyente electro donador en el
motivo hidrofóbico de indol en una serie de propanamidas sobre la energía de
afinidad (ΔG) del complejo formado enzima RT-ligando y correlacionar dichos
cambios estructurales con la inhibición de la RT mediante análisis SAR.
4.2. Objetivos específicos
1) Realizar el modelado molecular de cuatro propanamidas derivadas del β2-
triptófano 1-4 (Esquema 3) que cumplen con el modelo farmacofórico que
caracteriza a los inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa reversa
(NNRTIs) del VIH-1.
2) Estimar el modo de interacción de las propanamidas (R)-1, (S)-1, (R,R)-2,
(S,R)-3, (R)-4 y (S)-4, por acoplamiento en el sitio alostérico de la
transcriptasa reversa (RT) y analizar el efecto que ejerce la inserción de un
sustituyente electro donador en el motivo hidrofóbico del sistema indólico
sobre la energía de afinidad (ΔG) del complejo formado enzima RT-ligando.
3) Evaluar las 5 reglas de Lipinski para las propanamidas 1-6 y determinar
teóricamente si cumplen con las características típicas de un compuesto
biodisponible.
4) Siguiendo estrategias químicas, sintetizar las propanamidas 1 y 4 racémicas
y las propanamidas (R,R)-2 y (S,R)-3 enantiopuras, en donde el motivo
hidrofóbico de indol tiene insertado un grupo metoxilo electro donador en la
posición 5. Caracterizar las estructuras químicas de los productos
intermedios y finales por métodos espectrográficos.
5) Determinar la posible actividad farmacológica in vitro de las propanamidas 1-
6 sobre la RT utilizando el kit de ensayo «EnzChek® Reverse Transcriptase».
19
Estrategia general
5. ESTRATEGIA GENERAL
El proceso de diseño, desarrollo y evaluación biológica de las propanamidas 1-6 como
NNRTIs del VIH-1, se llevó a cabo siguiendo un protocolo que implicó la colaboración de
múltiples disciplinas, señaladas en los recuadros con línea continua; mientras que las
señaladas con líneas punteadas corresponden a las perspectivas del presente proyecto
(etapas más avanzadas en el desarrollo de fármacos) (Figura 9):
Figura 9. Protocolo de trabajo para el diseño, desarrollo y evaluación de las
propanamidas 1-6 como NNRTIs del VIH-1.
20
Resultados y discusión
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Métodos computacionales
En esta sección se presentan los resultados del estudio in silico de las
propanamidas 1-4 (Esquema 3), junto con aquellos obtenidos para los análogos 5
[36] y 6 [37] usando diversos programas informáticos. Los cálculos incluyen la
determinación del confórmero de mínima energía para cada una de las
propanamidas 1-4, la estimación de la energía de unión (ΔG) entre las
propanamidas y la estructura cristalina de la RT (PDB: 1KLM), la predicción de los
mecanismos de interacción de las propanamidas con los aminoácidos que
conforman el sitio alostérico de la RT y finalmente, el análisis teórico de la
biodisponibilidad de las propanamidas 1-6 a través de la estimación de las 5 reglas
de Lipinski.
6.1.1. Modelado molecular de las propanamidas 1-4
Con el fin de establecer la conformación más estable o de mínima energía de las
propanamidas 1-4, se realizó el análisis conformacional de cada una de ellas
mediante cálculos de modelado molecular, utilizando el algoritmo de Monte Carlo
en combinación con el campo de fuerzas Merck en fase acuosa (MMFFaq), a través
del uso del programa Spartan 14´ en mecánica molecular [38]. Este primer análisis
arrojó 100 conformaciones posibles para los enantiómeros (R) de cada una de las
propanamidas 1-4. La recategorización de la población conformacional se realizó
mediante el cálculo de energía ‹‹Single Point Energy››. La SPE consiste en cálculos
de predicción de la energía y propiedades relacionadas a la geometría específica
de una molécula [38]. En función de las energías y su relación geométrica, se
estimaron los confórmeros más estables para cada propanamida 1-4,
encontrándose que un intervalo de energía de 2 kcal/mol representa al 99.0% de la
población total. Se obtuvieron 14 confórmeros más estables para la propanamida
(R)-1, 10 confórmeros para (R)-2, 10 confórmeros para (R,R)-3 y 16 confórmeros
para (S,R)-4.
21
Resultados y discusión
1 2 3 4
Para garantizar que la molécula está representada en su conformación global de
mínima energía o la más estable de mínima energía, se realizó la optimización
energética de los confórmeros más estables obtenidos por SPE, a través del
programa Gaussian 09, empleando los niveles de cálculo B3LYP/6-31G+(d, p) y
teoría del funcional de la densidad (DFT), incorporando el método de polarización
continua (CPCM) en fase acuosa [39] simulando un entorno fisiológico o biológico.
El análisis conformacional demostró que el confórmero de mínima energía de cada
una de las propanamidas 1-4 cumple con las restricciones moleculares que definen
la relación geométrica entre las características químicas del modelo farmacóforo
3D, que caracteriza a los inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa reversa
(NNRTIs) del VIH-1. Esto es 2 alas hidrofóbicas y un grupo central hidrofílico (Tabla
1). Sin olvidar que la conformación que adquiere la molécula pequeña aislada no
tiene por qué ser la misma que adquiere cuando se encuentra formado parte del
complejo enzima-ligando.
Tabla 1. Geometría del confórmero de mínima energía de las propanamidas (R)-1,
(R,R)-2, (S,R)-3 y (R)-4 y su correspondiente energía libre de Gibbs de solvatación
(Gsolv) expresada en unidades a. u. y en kcal/mol y la población de Boltzmann (%).
Propanamida Gsolv
(a. u.)
Población de Boltzmann
(N, %)
(R)-1 -755620.03 26.36
(R,R)-2 -780292.33 39.89
(S,R)-3 -780292.81 45.13
(R)-4 -862839.93 45.71
(R)-1 (R,R)-2 (S,R)-3 (R)-4
22
Resultados y discusión
6.1.2. Análisis de la energía de unión (ΔG) de las propanamidas 1-6
Con el fin de predecir los modos de unión, afinidades e interacciones del par de
enantiómeros (R) y (S) de los ligandos 1 y 4 y del par diasteromérico (R,R)-2 y (S,R)-
3 dentro del NNBIP de la RT, se aplicó un método de acoplamiento molecular de
selección virtual (docking) usando el programa Autodock 4.2.
Previo al análisis docking de las propanamidas 1-6, la validación de los parámetros
de docking del programa Autodock 4.2 se realizó por modelado del inhibidor
delavirdina (DLV) que mostró la misma pose en el sitio de unión alostérico de la
enzima RT del VIH-1 que aquella obtenida por difracción de rayos-X para la
estructura cristalina de la RT wild tipe (WT) del VIH-1 cocristalizada con delavirdina
(PDB: 1KLM), con un valor de RMSD de 0.79 Å (RMSD <2.0 Å) (Figura 10).
Figura 10. Reconocimiento molecular de la delavirdina (DLV). a) Modelo de
interacción de la DLV con los residuos de aminoácidos en el NNIBP de la RT. b)
Estructura química de la DLV. c) Sobreposición de la pose experimental de la DLV
(PDB: 1KLM) (gris) vs. la pose teórica obtenida por Autodock 4.2 (azul) (RMSD =
0.79 Å).
Delavirdina (DLV)
(DLV) a) b)
c)
23
Resultados y discusión
En este trabajo el análisis docking de los compuestos 1-4 se delimitó al sitio de unión
alostérico de los NNRTIs (NNIBP) a la RT WT (PDB: 1KLM). Los ligandos utilizados
en el estudio docking fueron los confórmeros de mínima energía del par
enantiomérico (R) y (S) de las propanamidas 1 y 4 y del par diasteromérico (R,R)-2
y (S,R)-3, optimizados con Gaussian09.
Los resultados obtenidos de los cálculos de acoplamiento molecular de cada ligando
con la RT, se categorizaron conforme a los criterios:
1) La pose del complejo enzima-ligando cuya energía de unión es la menor y
por tanto la más estable.
2) La pose que ocupa la primera posición dentro del clúster más poblado (p en
%).
El protocolo que se siguió para llevar a cabo el docking molecular de los ligandos
(R)-1, (S)-1, (R,R)-2, (S,R)-3, (R)-4 y (S)-4, contempla el análisis de 100 poses
diferentes agrupadas (clúster), para cada caso. En la Tabla 2 se indican los
resultados de la categorización de las poses con base en la energía de unión (ΔG)
y la población (p).
Tomando en consideración el criterio 1 o de energía de unión del complejo, la mejor
pose para el enantiómero (R)-1, de entre 27 clústers encontrados, presenta una
energía de unión (ΔG) de -9.87 kcal/mol, con una población (p) de 4%. En tanto que
al emplear el criterio 2 o de distribución de la energía (clúster), la pose que ocupa la
primera posición dentro del clúster más poblado (p = 18%) corresponde a un mínimo
energético ΔG de -9.40 kcal/mol (Figura 11).
En el caso del enantiómero (S)-1 se encontraron 31 clústers, de los cuales el de
mayor población (p = 10%) presenta una energía de unión (ΔG) de -9.37 kcal/mol,
en tanto que el clúster más estable presenta un valor de ΔG de -9.68 kcal/mol (p =
8%) (Tabla 2, Figura 11).
En principio, es factible predecir que los enantiómeros (R) y (S) de las propanamidas
1 y 4 interactuarán de manera diferente en el sitio alostérico de la enzima RT debido
24
Resultados y discusión
a la formación implícita de complejos diastereoméricos. Por lo anterior, cabe resaltar
que las poses mejor clasificadas de los complejos (R) y (S) de las propanamidas 1
y 4 mostraron una afinidad similar (Tabla 2).
Tabla 2. Resultados del acoplamiento molecular para la mejor pose de las
propanamidas 1-6 y DLV. Número de clúster (n), energía de unión (ΔG, kcal/mol) y
población (p, %).
Propanamida Configuración Clúster Criterio 1 Criterio 2
n ΔG p ΔG p
1 R 27 -9.87 4 -9.40 18
S 31 -9.68 8 -9.37 10
2 R, R 32 -10.26 3 -8.15 13
3 S, R 30 -10.21 2 -9.83 18
4 R 27 -10.90 6 -9.68 37
S 42 -10.72 6 -9.03 11
5 a R 4 -10.17 7 -10.17 7
6 b R 26 -10.12 13 -9.99 15
DLV - 2 -13.04 99 -9.07 1
a Ref. [36]. b Ref. [37].
De la Tabla 2 se deduce que de entre las propanamidas 1-4 aquella que contiene
un motivo hidrofóbico constituido por un grupo aminoetilindol (ala II), (R)-4, forma el
complejo más estable con la RT al reunir ambos criterios de categorización de entre
27 clústers encontrados, es decir la pose que ocupa la primera posición (p = 37%)
corresponde al mínimo energético (-10.90 kcal/mol).
En la Figura 11 se muestra la distribución de los clúster resultantes de 100 poses
diferentes de los ligandos (R)-1, (S)-1, (R,R)-2, (S,R)-3, (R)-4 y (S)-4.
25
Resultados y discusión
Clúster de Confórmero más estable
Figura 11. Distribución de poses (clústers) de las propanamidas 1-4 con un RMSD
de 2.0. Clúster de la pose más estable en rojo. Clúster de la pose con mayor
población en verde.
6.1.3. Identificación de las interacciones enzima-ligando
Los ligandos se unen de manera reversible a las proteínas formando múltiples
interacciones no covalentes predominantemente con las cadenas laterales de los
residuos del bolsillo de unión. Estos contactos intermoleculares bastante débiles
comprenden una variedad de interacciones que no implican compartir electrones.
Dentro de las interacciones clave entre ligandos y macromoléculas destacan los
(R)-1
(R,R)-2
(S,R)-3
(R)-4
(S)-1
(S)-4
26
Resultados y discusión
enlaces de hidrógeno [40], apilamiento aromático π-π [41] y efectos hidrófobos [42].
Estas interacciones no covalentes son de primordial importancia en el
reconocimiento molecular y son la base del mecanismo de acción de los
medicamentos [43].
Entre las técnicas experimentales más empleadas para identificar las interacciones
proteína-ligando se encuentran la cristalografía de rayos-X, la resonancia magnética
nuclear (RMN) y la criomicroscopía electrónica. En particular, en el caso de los
NNRTIs se ha establecido que en el sitio de unión de la subunidad p66 de la RT se
localizan interacciones π/hidrofóbicas con los residuos de aminoácidos
hidrofóbicos: Leu100, Val106, Val179, Phe227, Trp229, Leu234, y con los residuos
de aminoácidos polares: Tyr181, Tyr188; mientras que los residuos de aminoácidos
Lys101 y Lys103 son responsables de interacciones dobles por puente de hidrógeno
(Figura 12) [24, 27, 28, 44-46].
Figura 12. Formación de dos puentes de hidrógeno por residuo de K101 o K103 en
a) EFV (PBD: 1FK9), Ref. [45] y b) DLV (PDB: 1KLM), Ref. [46], respectivamente.
a) b)
27
Resultados y discusión
La lisina es un aminoácido básico cargado positivamente en condiciones fisiológicas
y se encuentra generalmente expuesto en las superficies proteicas. La lisina, en la
superficie de la proteína juega un papel importante en la estabilidad de complejos
enzima-ligando al formar interacciones iónicas y enlaces de hidrógeno, así como al
interactuar con moléculas de agua [47].
Tomando en consideración lo anterior, se realizó la identificación de las principales
interacciones no covalentes y las consecuencias que en ellas induce la
estereoquímica (R) o (S) del carbono quiral que lleva el indol (“ala I” de la Figura 8),
así como la estereoquímica del grupo feniletilo (“ala II” de la Figura 8) en los
complejos enzima-ligando: (R)-1‒RT, (S)-1‒RT, (R,R)-2‒RT, (S,R)-3‒RT, (R)-4‒RT
y (S)-4‒RT. En cada caso se seleccionó la pose con mejor energía de unión (la más
estable). Los complejos que obtuvieron los mejores scorings se muestran en la
Figura 13 y las interacciones se resumen en la Tabla 3, aquellas que se consideran
esenciales [24, 27, 28, 44-46] se muestran en rojo.
El análisis docking del enantiómero (R)-1 permitió predecir la formación de 13
interacciones con residuos de aminoácidos presentes en el sitio de unión a NNRTIs:
ocho de tipo no polar, tres de tipo polar, una interacción tipo π-π que involucra al
residuo aromático de la tirosina Y181 y al anillo aromático del grupo bencilo (“ala II”)
y una interacción tipo puente de hidrógeno N-H···O entre el nitrógeno α-amino de la
lisina K103 y el oxígeno del grupo carbonilo de la acetamida. La pose con mejor
energía de unión del enantiómero (S), (S)-1, muestra un cambio significativo en la
conformación del ligando con respecto a su enantiómero (R)-1 de tal manera que,
aunque el puente de hidrógeno con la lisina K103 se mantiene, la interacción tipo
π-π difiere y ocurre entre la tirosina Y188 y el anillo aromático del grupo indol (“ala
I”), además no se conserva la interacción polar con la lisina K101. La diferencia en
la energía de unión entre los complejos (R)-1‒RT y (S)-1‒RT es de 0.19 kcal/mol.
El análisis de docking de la estructura (R,R)-2 permitió predecir la formación de 12
interacciones con residuos de aminoácidos presentes en la bolsa de unión a
NNRTIs: seis de tipo no polar, cinco de tipo polar y una interacción π-π que involucra
al residuo aromático de la tirosina Y181 y al anillo aromático del grupo feniletilo (“ala
28
Resultados y discusión
II”). En tanto que el análisis de la pose del ligando (S,R)-3 muestra una rotación de
la molécula de aparentemente 120° con respecto a su diasterómero (R,R)-2, en
donde la interacción π-π ocurre entre la tirosina Y318 y el anillo aromático del grupo
indol (“ala I”). Esta rotación en el modo de unión del ligando induce sólo cambios
sutiles en la energía de unión entre dichos complejos (Figura 13, Tabla 3).
El análisis de los resultados de docking de la estructura (R)-4 predijo 14
interacciones con los residuos de aminoácidos dentro del NNIBP: 8 de carácter no
polar y 6 de carácter polar. En tanto que para el enantiómero (S)-4 los resultados
de docking predicen 8 interacciones de carácter no polar, 6 de carácter polar y 2
interacciones π-π con los residuos de tirosina Y181/ala II y Y318/ala I.
El análisis de la Figura 13 demuestra que la estereoquímica del ligando influye
sensiblemente en la pose que éste adquiere en el complejo. Sin embargo, no altera
sustancialmente las interacciones con los residuos de aminoácidos en el NNIBP de
la RT y consecuentemente la energía de afinidad. Adicionalmente, el sustituyente
metoxilo, en el “ala 1” de las propanamidas 1-4 no favorece las interacciones de
carácter hidrofóbicas.
29
Resultados y discusión
Tabla 3. Resultados de las interacciones de las propanamidas 1-6 y DLV con los
residuos de aminoácidos dentro del sitio alostérico de unión. ΔG en kcal/mol.
Ligando ΔG
Interacciones con los residuos de aminoácidos a
No polar Polar Puentes de Hidrógeno
π-π
(R)-1 -9.87
L100, V106, V179, G190, F227, W229, L234, P236
K101, Y188, Y318
K103 Y181
(S)-1 -9.68
P95, L100, V106, V179, F227, W229,
L234
Y181, Y318 K103 Y188
(R,R)-2 -10.26 L100, V106, V179, F227, W229, L234
K101, K103, Y188, H235,
Y318 - Y181
(S,R)-3 -10.21
P95, L100, V106, V179, F227, W229, L234, P236
K102, K103, Y181, Y188
- Y318
(R)-4 -10.90
L100, V106, G190, V179, F227, W229, L234, P236
K101, K102, K103, Y181, Y188, Y318
- -
(S)-4 -10.72
P95, L100, V106, V179, F227, W229, L234, P236
K101, K102, K103, Y188
- Y181, Y318
(R)-5 b -10.17 L100, V106, V179, L234,
P236
K101, Y181, Y188, H235
K103 -
(R)-6 c -10.12
S105, V106, G190, F227, W229, L234,
P236
K103, K104, Y188, Y318,
H235 K101 -
DLV d -13.04
L100, V106, P225, P226, F227, W229, L234, P236
K101, K102, K104, Y181, Y188, E224, H235, Y318
K103 e -
a Interacciones esenciales de acuerdo a la DLV en rojo b Ref. [36]. c Ref. [37]. d Ref.
[46].e Puente de hidrógeno doble.
30
Resultados y discusión
HIS235
TYR318
PHE227
LEU234
TRP229
TYR188
TYR181
VAL179
LYS103
LYS101LEU100
VAL106
PRO236
TYR318
PHE227
LEU234
TRP229
TYR188
TYR181
VAL179
GLY190
LYS103
LYS101LEU100
VAL106
PRO236
TYR318
PHE227
LEU234
TRP229
TYR188
TYR181
VAL179
LYS103
LYS102
LEU100
VAL106
PRO95
TYR318
PHE227
LEU234
TRP229
TYR188
TYR181
VAL179
PRO95
LYS103
LEU100
VAL106
Figura 13. Acoplamiento molecular de las propanamidas 1-4 y su interacción con
los residuos de aminoácidos dentro del sitio alostérico de la RT (NNIBP).
ΔG = -9.87 kcal/mol
ΔG = -10.26 kcal/mol
(R)-1
ΔG =-10.21 kcal/mol
(S,R)-3
(R,R)-2
(S)-1
ΔG = -9.68 kcal/mol
31
Resultados y discusión
PRO236
TYR318
PHE227
LEU234
TRP229
TYR188
TYR181
VAL179
LYS103
LYS102
LEU100
VAL106
LYS101
GLY190
Figura 13. Continúa de la página 30.
Las interacciones selectas observadas en los complejos formados entre las
propanamidas 1-6 y la RT, junto con aquellas del complejo RT-delavirdina en el
NNIBP, así como la energía de afinidad (ΔG) del complejo se indican en la Tabla 4.
Tabla 4. Interacciones RT-ligando y energía de afinidad (ΔG) de los complejos.
Ligando ΔG a L100 V106 Y181 F227 W229 L234 K101 b K103b
(R)-1... -9.87 + + + + + + - +
(S)-1... -9.68 + + + + + + - +
(R,R)-2... -10.26 + + + + + + - -
(S,R)-3... -10.21 + + + + + + - -
(R)-4... -10.90 + + + + + + - -
(S)-4... -10.72 + + + + + + - -
(R)-5 c. -10.17 + + + - - + - +
(R)-6 d. -10.12 - + - + + - + -
DLV -13.04 + + + + + + - + e
a kcal/mol. b Interacción por puente de hidrógeno. c Ref. [36].
d Ref. [37].
e Doble.
(R)-4
(S)-4
ΔG = -10.90 kcal/mol
ΔG = -10.72 kcal/mol
32
Resultados y discusión
A fin de realizar una comparación entre la conformación de las propanamidas 1-4 y
el fármaco de referencia DLV, se realizó el aislamiento virtual de las estructuras 3D
de las conformaciones más estables de los ligandos 1-4 resultantes de los estudios
docking, y se alinearon con la conformación de la DLV obtenida de rayos-X (PBD:
1KLM). En la Figura 14 puede observarse que la conformación que adoptan las
“alas I y II” de la DLV (azul) en el complejo RT-DLV, en general, corresponde a un
ángulo más abierto que aquel que adquieren dichas alas en los ligandos 1-4,
situación que puede atribuirse en parte a una estabilización inducida por las
interacciones con los residuos de aminoácidos del NNBIP.
Figura 14. Alineación del confórmero de la DLV (azul marino), obtenida por
difracción de rayos X (PDB: 1KLM), con los confórmeros de mínima energía de las
propanamidas (R)-1 (amarillo), (S)-1 (azul claro), (R,R)-2 (verde), (S,R)-3 (rosa),
(R)-4 (naranja) y (S)-4 (gris); obtenidos del estudio docking.
(R)-1
(R,R)-2
(S,R)-3
(R)-4
(S)-1
(S)-4
33
Resultados y discusión
El análisis de los datos en las Tablas 3 y 4 predice que los ligandos 1-6 se unen en
el NNIBP de la RT e interactúan con la mayoría de los residuos de aminoácidos que
componen al sitio alostérico, principalmente de carácter hidrofóbico y alguna
interacción de carácter hidrofílico con K103. Sin embargo, no se ve favorecida la
doble interacción por puente de hidrógeno con K103, tal como se observa con la
DLV y que es esencial en la unión enzima-ligando [34, 46]. Este esquema de
interacciones puede explicar porque la DLV tiene una energía de unión (ΔG)
enzima-ligando más favorable, por ~ 3 kcal/mol, que aquella estimada para los
compuestos 1-6 en todos los casos.
6.1.4. Las 5 reglas de Lipinski en las propanamidas 1-6.
La regla de cinco de Lipinski permite evaluar cualitativamente la biodisponibilidad
de un compuesto químico diseñado para ser ingerido por vía oral. La regla describe
las propiedades moleculares que tienen importancia farmacocinética en el cuerpo
humano, incluyendo la absorción, distribución, metabolismo, y excreción ("ADME")
[11].
El nombre del modelo se debe a que los parámetros de evaluación se enmarcan en
múltiplos de 5 y la molécula candidata no puede violar más de una de las siguientes
reglas: no más de 5 átomos de nitrógeno y oxígeno donantes de puentes de
hidrógeno, no más de 10 átomos de nitrógeno y oxígeno receptores de puentes de
hidrógeno, peso molecular por debajo de los 500 Daltons, un coeficiente de partición
octanol-agua (Log P) menor de 5 y menos de 5 enlaces rotables [11].
Para predecir las propiedades farmacocinéticas de las propanamidas1-6 se hizo uso
de la quimio-informática, a través de los programas Spartan 14´ y ChemDraw Ultra
12.0.2. Los resultados fueron comparados con los compuestos de referencia DLV,
EFV y NVP (Tabla 5). Previo a la determinación teórica, se obtuvieron los datos
experimentales de los fármacos de referencia (DLV, EFV y NVP) a través de la base
de datos DrugBank, y se compararon con los determinados teóricamente por los
programas antes mencionados. Los resultados fueron equiparables, por lo que se
34
Resultados y discusión
procedió a determinar los parámetros de las propanamidas 1-6 (Tabla 5). En los
compuestos 1-6 se cumplen con 4 de las 5 reglas de Lipinski, lo que teóricamente
predice que estos compuestos presentan una buena biodisponibilidad.
Tabla 5. Determinación de las 5 reglas de Lipinski en las propanamidas 1-6 y en los
fármacos de referencia DLV, EFV y NVP.
Compuestos
Reglas de Lipinski
PM (g/mol) Log P HBD HBA nRotB
≤ 500 ≤ 5 ≤ 5 ≤ 10 ≤ 5
1 365.43 1.97 3 3 6
2 379.46 2.28 3 3 6
3 379.46 2.28 3 3 6
4 418.49 2.15 3 3 7
5 375.42 1.37 4 3 5
6 349.43 1.94 3 2 5
DLV 456.56 2.80 3 4 6
EFV 315.67 4.60 1 2 1
NVP 266.29 2.50 1 3 1
6.2. Síntesis química
Una vez que se corroboró a través de los estudios in silico, que las propanamidas
1-4 se unen teóricamente en el NNIBP de la RT se procedió a realizar la síntesis
química de las propanamidas 1-4.
En esta sección se presentan los resultados del desarrollo de una ruta de síntesis
que consta dos etapas. La primera etapa consiste en la obtención del β2-amidoácido
14 que incluye una serie 5 reacciones a partir del 5-metoxiindol 9 [48]. La segunda
etapa involucra la obtención de las propanamidas 1-4, a través de la formación del
enlace amida [49] resultante de la condensación del bloque de construcción 5-
35
Resultados y discusión
metoxi-N-acil-β-triptófano 14 con 3 aminas comerciales: bencilamina 15, (R)-
feniletilamina 16 y 3-aminoetilindol 17.
6.2.1. Síntesis química de las propanamidas 1-4
En una primera etapa, la síntesis del 5-metoxi-N-acil-β-triptófano 14 se inició a partir
del 5-metoxi-1H-indol 9, que por reacción de formilación-alquilación con NHEt2 y
CH2O (reacción de Mannich) dio la N-etil-N-((5-metoxi-1H-indol-3-il)metil)etanamina
10. El tratamiento de 10 con MeI seguido de KCN dio el 2-(5-metoxi-1H-indol-3-
il)acetonitrilo 11. El tratamiento de 11 con Na y (MeO)2CO condujo al 3-metil(1-
ciano-2-metoxi-2-oxoetil)-5-metoxi-1H-indol-1-carboxilato 12. La hidrogenación
catalítica de 12 en presencia de Ni/Raney redujo al grupo ciano a la correspondiente
amina primaria que por reacción con anhídrido acético, presente en el medio de
reacción, dio el 3-metil(3-acetamido-1-metoxi-1-oxopropano-2-il)-5-metoxi-1H-
indol-1-carboxilato 13. A continuación, el tratamiento de 13 con K2CO3 a reflujo de
MeOH/H2O condujo al ácido 3-acetamido-2-(5-metoxi-1H-indol-3-il)propanoico 14
(5-metoxi-N-acil-β2-triptófano), resultante de la hidrólisis selectiva del grupo éster y
concomitante N-descarboalcoxilación (Esquema 4). El β2-amidoácido 14 no se
encuentra descrito en la literatura por lo que su caracterización se realizó por
análisis de sus espectros de RMN, EM e IR, y se confirmó por un estudio de
difracción de rayos X (Figura 15, Tabla 6).
Esquema 4. Ruta de síntesis para la obtención del 5-metoxi-N-acil-β2-triptófano 14.
9
10
11
12
13
14
36
Resultados y discusión
N1
C2
C3
C3a
C4
C5
C6
C7
C7a
O5
C14
C9
O13a
O13b
C8
C13
N10
C11
O11
C12
Figura 15. Estructura obtenida por difracción de rayos-X del 5-metoxi-N-acil-β2-
triptófano 14 cocristalizada con una molécula de disolvente.
Tabla 6. Datos del cristal y detalles relacionados con la colección y refinamiento de
la estructura obtenida por difracción de rayos-X del 5-metoxi-N-acil-β2-triptófano 14.
Parámetros 14 Parámetros 14
Fórmula C14H16N2O4 ·
(C4 H7 O2)
Dcalc (mg mm-3) 1.280
T (K) 297(2) Z 4
Dimensiones (mm) 0.48 x 0.35 x 0.29 μ (mm-1) 0.097
Sistema cristalino monoclínico θrange (°) 2.58-30.59
Grupo espacial P 21/c Refl. totales 91604
a (Å) 7.358(3) Refl. únicas 5730
b (Å) 39.471(2) Rint 0.0432
c (Å) 7.062(4) Refl. observadas 4183
α (°)| 90 Param. refinados 249
β (°) 113(2) R (%), Rw (%) 8.37, 25.23
γ (°) 90 emax (eÅ-3) -0.368
V (Å3) 1885.51(17)
37
Resultados y discusión
En la segunda etapa se realizó la síntesis de las propanamidas 1-4 mediante la
formación de un enlace amida [49]. Así, la condensación del intermediario común,
el β2-amidoácido 14, con la amina correspondiente, ya sea la bencilamina 15, la (R)-
feniletilamina 16 o el 3-aminoetilindol 17, en presencia de un agente acoplante la 1-
etil-3-(3’-dimetilamino)carbodiimida (EDC) y del hidroxibenzotriazol (HOBt), cuya
función es minimizar posibles reacciones secundarias, dio las correspondientes
propanamidas racémicas 1 y 4 y las propanamidas diastereoméricas (R*R*)-2 y
(S*,R*)-3 en rendimientos del 40.0-86.5% (Esquema 5). Las propanamidas 1-4 no
se encuentran descritas en la literatura por lo que su caracterización se realizó por
análisis de sus espectros de RMN, EM e IR.
Esquema 5. Síntesis de las propanamidas 1-4 a partir del β2-amidoácido 14.
16
14
17
15
1
4
2
3
38
Resultados y discusión
6.3. Efecto in vitro de las propanamidas 1-6 sobre la actividad de la RT
La evaluación de la capacidad de los compuestos 1-6 para inhibir la actividad de la
RT del VIH-1 in vitro fue realizada en el departamento de Inmunología del Instituto
de Investigaciones Biomédicas la UNAM bajo la tutoría de la Dra. Leonor Huerta
Hernández.
La actividad de RT se midió usando el kit de ensayo «EnzChek® Reverse
Transcriptase» según el protocolo del fabricante [50]. La reducción de la actividad o
inhibición de la RT se monitorizó midiendo la fluorescencia, en donde el % de
fluorescencia generada del ensayo es proporcional a la actividad de la RT.
En el ensayo, la actividad biológica de la RT genera una cadena heterodúplex de
RNA-DNA a partir de un templado de poli (A), un primer oligo-dT y dTTP. La cadena
heterodúplex de RNA-DNA formada es detectada por el reactivo PicoGreen, un
fluoróforo que emite fluorescencia tras la unión al DNA; la intensidad de la
fluorescencia del complejo resultante depende directamente de la cantidad de DNA
objetivo en la muestra [51].
6.3.1. Validación del ensayo in vitro con base en medicamentos
NNRTIs
Previa a la evaluación de la actividad inhibitoria in vitro de los compuestos 1-6, frente
a la RT WT recombinante del VIH-1, se determinaron las curvas dosis-respuesta
para dos inhibidores de la RT usados como referencia, el Efavirenz® (EFV) y la
Nevirapina® (NVP). La concentración inhibitoria semimáxima (IC50) es la medida
más ampliamente utilizada e informativa de la eficacia de un fármaco. Indica cuánto
fármaco se necesita para inhibir un proceso biológico a la mitad, proporcionando así
una medida de potencia del fármaco en la investigación farmacológica [52, 53]. Las
curvas IC50 de EFV y NVP se muestran en la Gráfica 1. Se obtuvieron IC50s de 0.028
μM y 0.89 μM para EFV y NVP, valores que son comparables con los descritos en
la literatura [28, 54], por lo que el ensayo se consideró como validado y viable para
la determinación de la IC50 de los compuestos 1-6.
39
Resultados y discusión
Gráfica 1. IC50 de los fármacos de referencia: a) EFV y b) NVP.
6.3.2. Curvas dosis-respuesta de las propanamidas 1-6
A continuación, se realizaron curvas dosis-respuesta para evaluar la actividad
inhibitoria de las propanamidas 1-6, usando el mismo lote de RT WT recombinante
del VIH-1. Los pozos tratados con EFV y NVP se tomaron como control positivo,
mientras que los pozos no tratados se tomaron como control negativo y los pozos
tratados con DMSO se tomaron como control del vehículo. Las propanamidas 1-6
se evaluaron en un intervalo de concentración de 0.01 a 100 µM.
Como se observa en la Gráfica 2 y en la Tabla 7, las curvas dosis-respuesta
resultantes de ensayos replicativos in vitro de los compuestos 1-6 no muestran
cambios significativos en el porcentaje de fluorescencia lo que se interpreta como
una pobre o ausencia de actividad inhibitoria de los compuestos 1-6 frente a la RT.
-3 -2 -1 0 1 2 3
0
50
100
Efavirenz (EFV)
log[Concentración], M
% F
luo
rescen
cia log IC50= -1.549 M
IC50= 0.02828 M
-3 -2 -1 0 1 2 3
0
50
100
Nevirapina (NVP)
log[Concentración], M
% F
luo
rescen
cia
log IC50= -0.04705 M
IC50= 0.8973 M
a)
b)
40
Resultados y discusión
Propanamida 1
0 20 40 60 80 1000
50
100
1
EFV
Concentración (M)
% d
e F
luo
res
ce
nc
iaPropanamida 2
0 20 40 60 80 1000
50
100
2
EFV
Concentración (M)
% d
e F
luo
res
ce
nc
ia
Propanamida 3
0 20 40 60 80 1000
50
100
3
EFV
Concentración (M)
% d
e F
luo
res
ce
nc
ia
Propanamida 4
0 20 40 60 80 1000
50
100
4
EFV
Concentración (M)
% d
e F
luo
res
ce
nc
ia
Propanamida 5
0 20 40 60 80 1000
50
100
5
EFV
Concentración (M)
% d
e F
luo
res
ce
nc
ia
Propanamida 6
0 20 40 60 80 1000
50
100
6
EFV
Concentración (M)
% d
e F
luo
res
ce
nc
ia
Wf
Gráfica 2. Evaluación in vitro de la inhibición de la RT a diferentes concentraciones
de las propanamidas 1-6 y en comparación con el fármaco de referencia EFV.
41
Resultados y discusión
Tabla 7. Por ciento de inhibición de las propanamidas 1-6 y del fármaco de
referencia EFV.
Inhibición (%)
Comp [0.00] a [0.01] a [0.05] a [0.10] a [4.00] a [40.00] a [100.00] a
1 0.00 5.74 9.72 11.56 11.36 9.25 3.43
2 0.00 1.65 3.18 9.83 8.23 2.90 0.00
3 0.00 8.77 7.61 3.16 0.00 2.87 0.57
4 0.00 10.00 10.37 15.53 9.41 4.45 0.00
5 0.00 18.64 28.21 28.76 14.83 4.07 0.00
6 0.00 9.81 12.16 23.34 15.09 11.80 14.16
EFV 0.00 27.40 66.10 71.53 93.92 99.68 99.36
a μM.
El examen de los modos de interacción de las propanamidas 1-6 en el sitio
alostérico de unión a los NNRTIs de acuerdo con las predicciones de los modelos
docking permite explicar su falta de actividad biológica. En efecto, una de las
principales diferencias en el modo de unión de la delavirdina y el efavirenz con
respecto a las propanamidas 1-6 es que si bien, éstas últimas muestran interacción
con los residuos K101 o K103 de tipo polar e inclusive tipo puente de hidrógeno en
el caso de 1, 5 y 6, este puente no es doble. Es decir, 1, 5 y 6 no forman dos puentes
de hidrógeno por residuo de K101 o K103 (Tabla 4). El puente de hidrógeno doble
aumenta la estabilidad del complejo y caracteriza la interacción RT-NNRTI (Figura
12) [45, 46].
42
Conclusiones
7. CONCLUSIONES
Como resultado de la investigación realizada, se diseñaron in silico 4 nuevos
compuestos 1-4, los que se sintetizaron por métodos químicos y se probaron en
experimentos in vitro. A pesar de que ninguno de ellos mostró actividad inhibitoria
significativa, el motivo estructural de propanamida continúa siendo una perspectiva
en términos de diseño de una nueva clase química de fármacos NNRTIs por los
siguientes motivos:
1. Los estudios in silico predicen la unión de estos compuestos en el sitio
alostérico de la diana terapéutica, la RT.
2. El análisis docking reconoce la formación de entre 12 y 14 interacciones en
los complejos 1-4-RT, características de los NNRTIs, incluidas aquellas de
tipo no polar, polar, π-π y por puente de hidrógeno con la lisina 103,
considera ésta última como esencial para el reconocimiento molecular.
3. Dichas interacciones generan una energía de unión (ΔG ~ -10 kcal/mol) en
los complejos, que se aproxima a aquella determinada para la DLV (ΔG = -
13.04 kcal/mol).
Un paso hacia delante en esta investigación consiste en disponer, por síntesis
química, de una biblioteca amplia de compuestos que contengan el núcleo de
propanamida, que en su conjunto incluya y presente cambios estructurales diversos
en términos de factores estéricos, lipofílicos y electrónicos, con la finalidad de
detectar, mediante estudios de relación estructura-actividad (SAR), perfiles
estructurales de alta afinidad del ligando con el blanco terapéutico, la RT.
43
Métodos experimentales y teóricos
8. MÉTODOS EXPERIMENTALES Y TEÓRICOS
8.1. Métodos computacionales
En esta sección se describen las herramientas computacionales que se usaron para
determinar la estructura conformacional de mínima energía de las propanamidas 1-
4, así como identificar y caracterizar las interacciones entre la enzima RT y los
posibles ligandos.
8.1.1. Búsqueda conformacional
La búsqueda conformacional de las propanamidas 1-4 se realizó mediante el
programa Spartan ´14, empleando el algoritmo de Monte Carlo con el método
campo de fuerza mecánica molecular en fase acuosa (MMFFaq), seguido del
método Single Point Energy, empleando el nivel de cálculo B3LYP/6-31G* en fase
acuosa [38]. La selección de los confórmeros se realizó por comparación
geométrica, valor energético y su contribución a la distribución de Boltzmann.
8.1.2. Optimización de la geometría conformacional
La optimización de la geometría de los confórmeros seleccionados de mínima
energía se realizó con el programa Gaussian ´09 empleando el nivel de cálculo
B3LYP/6-31G+(d, p) y teoría de funcionales de la densidad (DFT) en fase acuosa
[39].
8.1.3. Acoplamiento molecular o docking
Para el análisis de acoplamiento proteína-ligando, se utilizó el programa
AutoDockTools 1.5.6 [55]. El criterio de búsqueda se refinó dentro de una zona de
60x60x60 Å centrado en la región del bolsillo de unión de la RT (PDB: 1KLM), con
una desviación media cuadrática (RMSD) de tolerancia en los resultados de 2.0 Å.
Se llevó a cabo un protocolo estándar con una población inicial al azar de 100
posiciones individuales y un número máximo de evaluaciones de energía de 25 x
107 por ciclo de análisis. Todos los parámetros se mantuvieron en su posición
estándar. Se generaron 100 conformaciones de acoplamiento de la enzima para
44
Métodos experimentales y teóricos
cada ligando, categorizadas en grupos (<clústers>) en función de la energía de
afinidad (ΔG).
8.1.4. Determinación de las reglas de Lipinski
El análisis de los parámetros que conforman las 5 reglas de Lipinski para las
propanamidas 1-6 se realizó utilizando el programa ChemDraw Ultra 12.0.2 [56] y
Spartan ́ 14 [38]. Este análisis incluyó a 3 fármacos aprobados y usados en la clínica
DLV, EFV y NVP.
8.2. Síntesis Química
En este apartado se describe el proceso por el cual se sintetizó el bloque de
construcción el N-acil-β2-triptófano 14 a partir del precursor 5-metoxiindol, así como
la formación del enlace amida para dar las propanamidas 1-4.
Procedimiento general
Las materias primas utilizadas fueron adquiridas de Sigma-Aldrich Chemical Co.,
sin purificación adicional. La cromatografía en capa fina se realizó usando placas
precoladas con sílica gel 60 e indicador fluorescente (Merck Chem Co.), reveladas
por luz ultravioleta a 254 nm o con Ce(SO4). La cromatografía en columna flash se
realizó usando sílica gel 60 (Merck Chem Co.). Los puntos de fusión se
determinaron en el equipo Fisher-Johns y se presentan no corregidos.
La caracterización de las estructuras químicas se realizó por:
Resonancia Magnética Nuclear (RMN). Los espectros de RMN de 1H y 13C
fueron obtenidos en espectrómetros Varian Mercury operando a 300 y 75
MHz respectivamente, utilizando SiMe4 como referencia interna. La
multiplicidad de señales se indica por medio de una o más de las siguientes
abreviaciones: s (simple), d (doble), t (triple), m (múltiple).
Espectrometría de Masas (EM). Las mediciones por EM se efectuaron en un
cromatógrafo de gases Varian CP3800 acoplado a un detector de masa
selectivo Varian Saturn 2000. Los análisis de EM se obtuvieron en el modo
de impacto electrónico (IE) con un voltaje de ionización de 70 eV.
45
Métodos experimentales y teóricos
Infrarrojo (IR). Los espectros de infrarrojo se obtuvieron en un
espectrofotómetro Buck Scientific modelo 500 IR en pastilla de KBr.
8.2.1. Síntesis del 5-metoxi-N-acil-β2-triptófano 14
N-Etil-N-((5-metoxi-1H-indol-3-il)metil)etanamina (10).
La etapa de síntesis consistió en la reacción de
formilación-alquilación del 5-metoxiindol 9 con
dietilamina y formaldehído (reacción de Mannich) para
dar el compuesto 10 (Esquema 4) [48].
A una solución de formaldehído (1.2 mL) al 35% a 5°C y bajo agitación, se le
adicionó gota a gota ácido acético glacial (3.2 mL), seguido de la adición lenta gota
a gota de dietilamina (1.68 mL) (en esta etapa se presentó desprendimiento de
vapores y calor). A continuación, se adicionó a la solución anterior el 5-metoxi-1H-
indol 9 (2 g, 13.59 mmol) y la mezcla se mantuvo bajo agitación durante 17 h a
temperatura ambiente. A la mezcla de reacción enfriada a 5 °C y bajo agitación, se
le adicionó una solución de NaOH al 20% hasta pH 13-14 (11.2 mL), formándose
un sólido blanquecino. El sólido se recuperó por filtración, se disolvió en AcOEt (25
mL) y la solución se transfirió a un embudo de separación, donde se le realizaron
lavados por triplicado con agua destilada, seguido de lavados por triplicado con una
solución saturada de NaCl. La fase orgánica recuperada, se secó sobre Na2SO4 y
se concentró en rotavapor a presión reducida. El compuesto 10 se obtuvo por
cristalización de una mezcla de AcOEt-hexano en proporción 2:1, como cristales de
color amarillo pálido en un rendimiento de 64.4 %.
46
Métodos experimentales y teóricos
2-(5-Metoxi-1H-indol-3-il)acetonitril (11).
El tratamiento de 10 con MeI seguido de KCN condujo a la
obtención de 11 (Esquema 4) [48].
A una solución del compuesto 10 (2.0 g, 8.61 mmol) en
MeOH (8.78 mL) enfriada a 5°C, se adicionó MeI (1.23 mL): la mezcla de reacción
se mantuvo bajo agitación y a temperatura ambiente durante 2 h (en esta etapa la
solución inicialmente translúcida se transformó en una mezcla turbia). A
continuación, se adicionó gota agota y bajo agitación una solución de KCN al 35%
(1.14 g en 1.76 mL de agua destilada). La mezcla de reacción se mantuvo bajo
reflujo, agitación y en atmósfera de Ar durante 2 h. Al término, la solución resultante
se evaporó a sequedad. El sólido obtenido se disolvió en 5 mL de agua destilada y
se transfirió a un embudo de separación, dónde se adicionaron 25 mL de AcOEt.
Se realizaron lavados por triplicado con agua destilada, desechando la fase acuosa
que contiene trazas de la sal de cianuro. Posteriormente, se realizaron lavados por
triplicado con una solución de HCl al 5%, seguido de lavados por triplicado con una
solución saturada de NaCl. La fase orgánica recuperada se secó con Na2SO4 y se
evaporó hasta la obtención de una miel viscosa de color ámbar que se purifica por
destilación a presión reducida para obtener al compuesto 11 como un aceite verde
pálido, el cual solidificó por enfriamiento prolongado a 4°C, en un rendimiento del
74.9%. Estos datos concuerdan con los reportados en la literatura [48].
47
Métodos experimentales y teóricos
3-Metil(1-ciano-2-metoxi-2-oxoetil)-5-metoxi-1H-indol-1-carboxilato (12).
El tratamiento de 11 con Na y (MeO)2CO condujo a la
obtención de 12 (Esquema 4) [48].
Una solución del compuesto 11 (2.0 g, 10.74 mmol) en
(MeO)2CO (17.6 mL) se calentó a 50 °C y se le adicionó
Na (556.5 mg) en trozos pequeños, manteniendo la mezcla
de reacción bajo agitación. Terminada la adición, se elevó la temperatura y la
mezcla se mantuvo bajo reflujo y en atmósfera de Ar durante 2 h (formándose un
sólido de color café claro). Al término de la reacción, la solución se filtró y se
recuperó el sólido, el cual se disolvió con una solución diluida de AcOH glacial (2.64
mL en 10.53 mL de agua destilada). La mezcla se extrajo con AcOEt, la fase
orgánica se lavó por triplicado con agua destilada, seguido de lavados por triplicado
con una solución saturada de NaCl, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se
evaporó hasta sequedad. El residuo se cristalizó de MeOH para dar al compuesto
12 como cristales finos de color amarillo en un rendimiento de 80.3%. Estos datos
concuerdan con los ya reportados en la literatura [48].
48
Métodos experimentales y teóricos
3-Metil(3-acetamido-1metoxi-1oxopropano-2-il)-5-metoxi-1H-indol-1-
carboxilato(13).
La hidrogenación catalítica de 12 en presencia de
Ni/Raney redujo al grupo ciano a la correspondiente
amina primaria, que por tratamiento con Ac2O se
obtuvo a 13 (Esquema 4) [48].
Una solución del compuesto 12 (2.0 g, 6.62 mmol) en Ac2O (52.4 mL) se hidrogenó
durante 20 h a 50 psi, en presencia del catalizador Ni-Raney (2.9 g), previamente
lavado a absoluta neutralidad. Terminada la reacción, el catalizador se separó por
filtración, el filtrado obtenido se concentró al vacío dejando una miel de color ámbar
que se disolvió en AcOEt y se llevó a un embudo de separación. La solución
orgánica se lavó 5 veces con una solución de K2CO3 al 5%, seguido de lavados por
triplicado con solución saturada de NaCl, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y
se evaporó a sequedad. El residuo se cristalizó de una mezcla AcOEt-hexano para
dar al compuesto 13 como cristales de color blanquecino opaco a amarillo claro en
un rendimiento de 80.6%. Estos datos concuerdan con los reportados en la literatura
[48].
49
Métodos experimentales y teóricos
Ácido 3-acetamido-2-(5-metoxi-1H-indol-3-il)propanoico (14).
La hidrólisis selectiva del grupo éster y concomitante
N-descarboalcoxilación de 13 se realizó por
tratamiento con K2CO3 a reflujo de MeOH/H2O para
obtener a 14 (Esquema 4) [48].
A un matraz de fondo redondo se le adicionó el 3-metil (3-acetamido-1-metoxi-1-
oxopropano-2-il)-5-metoxi-1H-indol-1-carboxilato 13 (1.0 g, 2.87 mmol) y el sólido
se suspendió en una solución acuosa de MeOH al 75% (157.4 mL), la mezcla se
mantuvo bajo agitación mecánica continua a temperatura ambiente.
Posteriormente, se adicionó a dicha mezcla, K2CO3 en polvo (3.27 g) manteniendo
la agitación mecánica. La mezcla se calentó a reflujo durante 2 h para dar una
solución traslúcida de color amarillo claro. La solución se enfrió a temperatura
ambiente y se evaporó al vacío para dar un residuo sólido de color amarillo. Dicho
sólido se disolvió en agua (15 mL) y se acidificó con HCl concentrado al 37% (por
goteo lento y con agitación) hasta alcanzar un pH 2-3. La mezcla de reacción
acidificada se transfirió a un embudo de separación y se extrajo con AcOEt (3 x 15
mL). La fase orgánica se secó con Na2SO4, se filtró y se concentró al vacío. El
residuo en forma de aceite color ámbar se recristalizó de AcOEt para dar 14 como
cristales finos de color blanquecino a amarillo opaco en un rendimiento de 88.5%
(701.7 mg, 2.54 mmol). pf = 79-81°C; Rf = 0.5 (AcOEt/MeOH 1:1); IR (KBr, cm-1)
vmax = 3357, 3115, 2970, 1717, 1650; CG-EM (IE, 70eV): m/z (% intensidad relativa)
= 277 (M+), 173 (82), 232 (83), 160 (100); RMN 1H y 13C ver en anexo Tablas 1-4,
Figuras 1-4.
50
Métodos experimentales y teóricos
8.2.2. Síntesis de las propanamidas 1-4
Síntesis de 3-acetamido-N-bencil-2-(5-metoxi-1H-indol-3-il) propanamida (1).
A un matraz de 3 bocas con refrigerante se le adicionó el ácido 3-acetamido-2-(5-
metoxi-1H-indol-3-il) propanoico 14 (500.0 mg, 1.81 mmol) en DMF (9.1 mL), la
mezcla se agitó durante 20 min a temperatura ambiente y bajo atmósfera de argón
para dar una solución ligeramente ámbar. Inmediatamente se adicionó bajo
agitación EDC (391.56 mg, 1.81 mmol), seguido de HOBt (248.95 mg, 1.81 mmol)
en intervalos de 20 y 10 minutos respectivamente, para dar una solución
homogénea. A continuación, se adicionó la bencilamina 15 (200 mg, 1.86 mmol) y
N(Et)3 (340 μL), la mezcla se mantuvo bajo agitación durante 4 h a temperatura
ambiente formándose una solución ámbar. La mezcla de reacción se llevó a
sequedad con corriente de aire para dar una miel de color ámbar. Posteriormente,
se adicionó gota a gota y bajo agitación una solución saturada de NaHCO3 hasta
alcanzar un pH= 9-10 y se continuó agitando durante 30 min más para dar un
precipitado café claro. La mezcla de reacción alcalinizada se disolvió en 30 mL de
MeOH. La solución se concentró al vacío y el residuo en forma de aceite color ámbar
se recristalizó de MeOH para dar 1 en un rendimiento del 80.1% (529.85 mg, 1.45
mmol). Cristales opacos de color blanco pf = 198-200°C; Rf = 0.33 (AcOEt/MeOH
9:1); IR (KBr, cm-1) vmax = 3297, 2976, 1638; CG-EM (IE, 70eV): m/z (% intensidad
relativa) = 366 (M+), 160 (69), 306 (90), 173 (100); RMN 1H y 13C ver en anexo
Tablas 5-7, Figuras 5 y 6.
14
15
1
51
Métodos experimentales y teóricos
Síntesis de (R)-3-acetamido-2-(5-metoxi-1H-indol-3-il)-N-((R)-1-feniletil)
propanamida (2) y (S)-3-acetamido-2-(5-metoxi-1H-indol-3-il)-N-(R)-1-
feniletilamina) propanamida (3).
A un matraz de 3 bocas con refrigerante se le adicionó el ácido 3-acetamido-2-(5-
metoxi-1H-indol-3-il) propanoico 14 (500 mg, 1.81 mmol) en DMF (9.1 mL), la
mezcla se agitó durante 20 min a temperatura ambiente y bajo atmósfera de argón
para dar una solución amarilla. Inmediatamente se adicionó bajo agitación EDC
(391.56 mg, 1.81 mmol), seguido de HOBt (248.95 mg, 1.81 mmol) en intervalos de
20 y 10 minutos respectivamente, para dar una solución homogénea. A
continuación, se adicionó la (R)-(+)-α-metil-bencilamina 16 (220 μL, 1.81 mmol) y
N(Et)3 (340 μL), la mezcla se mantuvo bajo agitación durante 4 h a temperatura
ambiente para dar una solución ámbar rojiza. La mezcla de reacción se llevó a
sequedad con corriente de aire para dar una miel de color ámbar a rojizo.
Posteriormente, se adicionó gota a gota y bajo agitación una solución saturada de
NaHCO3 hasta alcanzar un pH= 9-10 y la mezcla se agitó durante 30 min más para
dar un precipitado blanquecino. El espectro de RMN 1H del sólido indicó la presencia
de una mezcla diastereomérica de 2 y 3 (relación 1:1). La cristalización fraccionada
de MeOH de dicha mezcla dio puro el diasterómero 2 en un rendimiento del 42.5%
(291.85 mg, 7.69 mmol). Sólido de color blanco opaco pf = 194-196°C; Rf = 0.29
(AcOEt/MeOH 9:1); IR (KBr, cm-1) vmax = 3274, 2971, 1664; CG-EM (IE, 70eV): m/z
(% intensidad relativa) = 378 (M+), 320 (35), 201 (75), 173 (100); RMN 1H y 13C ver
en anexo Tablas 8-10, Figuras 7 y 8.
16
14
2, 3
52
Métodos experimentales y teóricos
Por otro lado, el diasterómero 3 se purificó por cromatografía en placa de capa
preparativa. Se utilizó una placa de sílica 30 (Merck) con indicador fluorescente (20
x 20 cm, 2 mm de espesor) como fase estacionaria. Una vez aplicada la muestra
(20.0 mg) disuelta en MeOH, la placa se colocó en una cámara y se eluyó con un
sistema AcOEt/THF en proporción 9:1. La banda de interés (identificada por UV) se
desprendió del soporte de vidrio, y el gel de sílice con el compuesto adsorbido, se
transfirió a un Erlenmeyer. Se adicionó MeOH (30 mL), la mezcla se agitó durante
20 min, se filtró y el filtrado se concentró en rotavapor al vacío. El compuesto 3 se
obtuvo puro en un rendimiento del 40.04% (11.0 mg, 0.029 mmol). Sólido fino de
color café claro, pf = 177-179°C; Rf = 0.45 (AcOEt/MeOH 9:1) IR (KBr, cm-1) vmax =
3284, 2916, 1655; 1648; CG-EM (IE, 70eV): m/z (% intensidad relativa) = 377 (M+),
320 (39), 201 (71), 173 (100); RMN 1H y 13C ver en anexo Tablas 11-13, Figuras 9
y 10.
53
Métodos experimentales y teóricos
Síntesis de N-(2-(1H-indol-3-il)etil)-3-acetamido-2-(5-metoxi-1H-indol-3-il)
propanamida (4).
A un matraz de 3 bocas con refrigerante se le adicionó el ácido 3-acetamido-2-(5-
metoxi-1H-indol-3-il) propanoico 14 (500 mg, 1.81 mmol) en DMF (9.1 mL), la
mezcla se agitó durante 20 min a temperatura ambiente y bajo atmósfera de argón
para dar una solución ligeramente ámbar. Inmediatamente y bajo agitación se
adicionó EDC (391.56, 1.81 mmol) seguido de HOBt (248.95 mg, 1.81 mmol) en
intervalos de 20 y 10 min respectivamente, para dar una solución homogénea. A
continuación, se adicionó la triptamina 17 (290 mg, 1.81 mmol) y N(Et)3 (340 μL), la
mezcla se mantuvo bajo agitación durante 4 h a temperatura ambiente formándose
una solución ámbar rojiza. La mezcla de reacción se llevó a sequedad con corriente
de aire para dar una miel de color ámbar. Posteriormente, se adicionó gota a gota y
bajo agitación constante una solución saturada de NaHCO3 hasta alcanzar un pH=
9-10 y la agitación se mantuvo durante 30 min más para dar una solución aceitosa.
La mezcla de reacción alcalinizada se disolvió en MeOH (30 mL), se purificó por
cromatografía flash en un sistema de AcOEt/MeOH (9:1). Las fracciones de interés
se concentraron al vacío y el residuo en forma de aceite color ámbar solidificó a
temperatura ambiente para dar a 4 en un rendimiento del 86.5% (655.10 mg, 1.56
mmol). Sólido ámbar, pf = 89-91°C; Rf = 0.27 (AcOEt/MeOH 9:1) IR (KBr, cm-1) vmax
= 3286, 2990, 1652; CG-EM (IE, 70eV): m/z (% intensidad relativa) = 417 (M+), 231
(14), 130 (27), 60 (100); RMN 1H y 13C ver en anexo Tablas 14-16, Figuras 11 y 12.
17
14
4
54
Métodos experimentales y teóricos
8.3. Evaluación biológica
La evaluación de la actividad biológica de las Propanamidas 1-6 se llevó a cabo
utilizando el kit de ensayo «EnzChek® Reverse Transcriptase», (Ensayos
moleculares, Invitrogen), como se describe en el manual [50]. El ensayo está
basado en la cuantificación de dsDNA con el reactivo PicoGreen. Este reactivo
muestra un pronunciado incremento de fluorescencia al unirse con el dsDNA o una
cadena heterodúplex RNA/DNA [50, 51].
8.3.1. Ensayo in vitro «EnzChek® Reverse Transcriptase»
El ensayo de inhibición de la RT del VIH-1 se llevó a cabo utilizando los siguientes
materiales: reactivo PicoGreen para la cuantificación de dsDNA, buffer TE 20 X,
templado de ribonucleótido poli (A), primer oligo-dT, buffer de polimerización, EDTA
a 200 mM, RT WT recombinante de Escherichia coli, buffer diluyente de la enzima
y agua libre de nucleasas.
Protocolo experimental
Para 100 reacciones: Un templado de poli-A (5 µL) de aproximadamente 350 bases
de longitud, y un primer de oligo-dT (5 µL), son alineados por 60 min, a temperatura
ambiente. La mezcla de reacción anterior se diluyó en 2 mL de buffer de
polimerización (60 mM Tris-HCl, 60 mM KCl, 8 mM MgCl2, 13 mM DTT, 100 μM
dTTP, pH 8.1), y se llevaron 20 μL a cada pozo (en una placa de 96 pozos totales).
A cada pozo se adicionan 5 μL de solución de RT, diluida en una solución adecuada
en buffer diluyente de la enzima (50 mM Tris-HCl), 20% de glicerol, 2 mM DTT, pH
7.6). Las reacciones se incuban por 45 min a 25 °C, posteriormente se adicionó la
solución de paro de reacción, 2 μL de EDTA (200 mM). La cadena heterodúplex
RNA/DNA se detectó por la adición de 173 µL del reactivo de trabajo PicoGreen ((50
µL de reactivo PicoGreen en 17.2 mL de buffer TE 1X (1 mL de buffer TE 20X en
19 mL de agua libre de nucleasas)).
La fluorescencia se midió usando un lector de microplacas SynergyTM HTX (BioTeK)
a una λ excitación ~480 nm, emisión ~520 nm. Para la prueba de actividad de los
compuestos contra la RT, se realizaron las diluciones correspondientes para cada
55
Métodos experimentales y teóricos
compuesto, de acuerdo con las concentraciones finales 0.01, 0.05, 0.1, 4.0, 40.0 y
100.0 µM, antes de la adición de la solución de la enzima RT se adicionaron 2 µL
de la dilución de compuestos a cada pozo. Los pozos controles son el compuesto
sin RT, igualando el volumen con diluyente de la enzima. La curva estándar se
realizó con diluciones seriadas de una cantidad conocida de la enzima (RT) en
buffer diluyente de la enzima. Los resultados se expresaron en fluorescencia
relativa, que es, la señal de fluorescencia de la mezcla de reacción con el
compuesto, dividido por la señal de la misma mezcla de reacción sin el compuesto,
donde el % de fluorescencia es directamente proporcional a la actividad de la
enzima (RT) [50, 57]. Los resultados fueron analizados usando el programa
GraphPad Prism 5, para una gráfica de regresión no lineal y una curva dosis-
respuesta.
56
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63
Anexo
10. ANEXO
10.1. Tablas de RMN de 1H y 13C (δ en ppm; J en Hz) del 5-metoxi-N-acil-
β2
-triptófano 14 y las propanamidas 1-4 a
Tabla 1. Datos de RMN 1H del 5-metoxi-N-acil-β2-triptófano 14 .......................... 65
Tabla 2. Datos de RMN 13C del 5-metoxi-N-acil-β2-triptófano 14 .......................... 66
Tabla 3. Correlaciones gHMBC del 5-metoxi-N-acil-β2-triptófano 14 (CD3OD) ..... 67
Tabla 4. Correlaciones gHMBC del 5-metoxi-N-acil-β2-triptófano 14 .................... 68
Tabla 5. Datos de RMN 1H de la propanamida 1 .................................................. 69
Tabla 6. Datos de RMN 13C de la propanamida 1 ................................................. 70
Tabla 7. Correlaciones gHMBC de la propanamida 1 ........................................... 71
Tabla 8. Datos de RMN 1H de la propanamida 2 .................................................. 72
Tabla 9. Datos de RMN 13C de la propanamida 2 ................................................. 73
Tabla 10. Correlaciones gHMBC de la propanamida 2 ......................................... 74
Tabla 11. Datos de RMN 1H de la propanamida 3 ................................................ 75
Tabla 12. Datos de RMN 13C de la propanamida 3 ............................................... 76
Tabla 13. Correlaciones gHMBC de la propanamida 3 ......................................... 77
Tabla 14. Datos de RMN 1H de la propanamida 4 ................................................ 78
Tabla 15. Datos de RMN 13C de la propanamida 4 ............................................... 79
Tabla 16. Correlaciones gHMBC de la propanamida 4 ......................................... 80
a En DMSO-d6, excepto que se indique lo contrario.
64
Anexo
10.2. Espectros de RMN de 1H (300 MHz) y 13C (75 MHz) del 5-metoxi-N-
acil-β2
-triptófano 14 y las propanamidas 1-4 a
Figura 1. Espectro de RMN 1H del 5-metoxi-N-acil-β
2-triptófano 14 (CD
3OD) ...... 82
Figura 2. Espectro de RMN 13
C del 5-metoxi-N-acil-β2-triptófano 14 (CD3OD) .... 83
Figura 3. Espectro de RMN 1H del 5-metoxi-N-acil-β
2-triptófano 14 ..................... 84
Figura 4. Espectro de RMN 13
C del 5-metoxi-N-acil-β2-triptófano 14 .................... 85
Figura 5. Espectro de RMN 1H de la propanamida 1 ............................................ 86
Figura 6. Espectro de RMN 13
C de la propanamida 1 .......................................... 87
Figura 7. Espectro de RMN 1H de la propanamida 2 ............................................ 88
Figura 8. Espectro de RMN 13
C de la propanamida 2 .......................................... 89
Figura 9. Espectro de RMN 1H de la propanamida 3 ............................................ 90
Figura 10. Espectro de RMN 13
C de la propanamida 3 ........................................ 91
Figura 11. Espectro de RMN 1H de la propanamida 4 .......................................... 92
Figura 12. Espectro de RMN 13
C de la propanamida 4 ........................................ 93
a En DMSO-d6, excepto que se indique lo contrario.
65
Anexo
Tabla 1. Datos de RMN 1H del 5-metoxi-N-acil-β2-triptófano 14
Estructura a): ácido 3-acetamido propanoico
HX-2 HB-3 HA-3 NHM-4 C5-Me
MeOD-d4 δ 4.15 dd 3.76 dd 3.66 dd -a 1.93 s
J 8.6, 6.6 13.3, 8.6 13.3, 6.6
DMSO-d6 δ 3.93 dd 3.6-3.3b m 8.03 m 1.77 s
J 8.5, 6.2 - m -
Fragmento: R1
NH-1′ H-2′ H-4′ H-6′ H-7′ C5′-OMe
MeOD-d4 δ -a 7.17 s 7.21 d 6.80 dd 7.26 d 3.85 s
J - - 2.4 8.8, 2.4 8.8 -
DMSO-d6 δ 10.82 s 7.14 d 7.09 6.73 dd 7.24 d 3.73 s
J - 2.5 2.4 8.8, 2.4 8.8 -
a Intercambio H/D.
b Región oscurecida por la humedad.
a)
66
Anexo
Tabla 2. Datos de RMN 13C del 5-metoxi-N-acil-β2-triptófano 14
Estructura a): ácido 3-acetamido propanoico
C-1 C-2 C-3 C-5 C5-Me
CD3OD δ 177.7 44.9 44.0 174.5 23.4
DMSO-d6 δ 174.3 42.7 41.3 169.6 22.5
Fragmento: R1
C-2′ C-3′ C-3a′ C-4′ C-5′ C-6′ C-7′ C-7a′
CD3OD δ 125.3 110.2 129.1 102.4 156.1 111.7 111.7 134.1
DMSO-d6 δ 123.5 110.3 126.8 100.6 153.1 111.2 112.2 131.3
C5′-OMe
CD3OD δ 57.1
DMSO-d6 δ 55.3
a)
67
Anexo
Tabla 3. Correlaciones gHMBC del 5-metoxi-N-acil-β2-triptófano 14 (CD
3OD)
Posición Tipo δC δH gHMBC
1 C=O 177.7 - -
5 C=O 174.5 - -
5′ C 156.1 - -
7a′ C 134.1 - -
3a′ C 129.1 - -
2′ CH 125.3 7.17 134.1, 129.1, 112.4, 44.9
7′ CH 111.7 7.26 156.1, 129.1
6′ CH 111.7 6.80 156.1, 134.1, 102.4
3′ C 110.2 - -
4′ CH 102.4 7.21 134.1, 111.7
C5´-OMe CH3 57.1 3.85 156.1
2 CH 44.9 4.15 177.3, 129.1, 125.3, 110.2, 44.0
3 CH2 44.0 3.70 177.3, 174.5, 110.2, 44.9
C5-Me CH3 23.4 1.93 174.5
68
Anexo
Tabla 4. Correlaciones gHMBC del 5-metoxi-N-acil-β2-triptófano 14
Posición Tipo δC δH gHMBC
1 C=O 174.3 - -
5 C=O 169.6 - -
5′ C 153.1 - -
7a′ C 131.3 - -
3a′ C 126.8 - -
2′ CH 123.5 7.14 131.3, 126.8, 110.3, 42.7
7′ CH 112.2 7.24 153.1, 126.8
6′ CH 111.2 6.703 131.3, 100.6
3′ C 110.3 - -
4′ CH 100.6 7.09 153.1, 131.3, 111.2
C5´-OMe CH3 55.3 3.73 153.1
2 CH 42.7 3.93 174.3, 126.8, 123.5, 110.3, 41.3
3 CH2 41.3 3.48 174.3, 169.6, 110.3, 42.7
C5-Me CH3 22.5 1.77 169.6
4 NH 8.03 169.6, 41.3
1´ NH 10.82 131.3, 126.8, 123.5, 110.3
69
Anexo
Tabla 5. Datos de RMN 1H de la propanamida 1
Estructura b): 3-acetamido propanamida
HX-2 HB-3 HA-3 NHM-4 C5-Me NH-6
DMSO-d6 δ 4.02 dd 3.50 m 8.09 m 1.79 s 8.58 dd
J 8.9, 5.7 - - - 6.0, 5.9
Fragmento: R1
NH-1′ H-2′ H-4′ H-6′ H-7′ C5′-OMe
DMSO-d6 δ 10.75 d 7.09 d 7.28 d 6.70 dd 7.21 da 3.72 s
J 2.5 2.5 2.4 8.6, 2.4 8.6 -
Fragmento: R2
HB-7 HA-7 C-o, m, p
DMSO-d6 δ 4.35 dd 4.21 dd 7.21 m
J 15.4, 6.2 15.2, 5.6 -a
a Señal parcialmente sobrepuesta.
b)
70
Anexo
Tabla 6. Datos de RMN 13C de la propanamida 1
Estructura b): 3-acetamido propanamida
C-1 C-2 C-3 C-5 C5-Me
DMSO-d6 δ 172.7 43.7 41.9 170.1 23.0
Fragmento: R1
C-2′ C-3′ C-3a′ C-4′ C-5′ C-6′ C-7′ C-7a′
DMSO-d6 δ 123.6 112.1 127.5 101.3 153.5 111.7 112.4 131.6
C5′-OMe
DMSO-d6 δ 55.8
Fragmento: R2
C-7 C-i C-o C-m C-p
DMSO-d6 δ 42.5 140.1 127.5 128.6 127.1
b)
71
Anexo
Tabla 7. Correlaciones gHMBC de la propanamida 1
Posición Tipo δC δH gHMBC
1 C=O 172.7 - -
5 C=O 170.1 - -
5′ C 153.5 - -
Ci C 140.1 - -
7a′ C 131.6 - -
Cm CH 128.6 7.21 -
3a′ C 127.5 - -
Co CH 127.5 7.21 -
Cp CH 127.1 7.21 -
2′ CH 123.6 7.09 131.6, 127.5, 112.1
7′ CH 112.4 7.21 -
3′ C 112.1 - -
6′ CH 111.7 6.70 153.5, 131.6, 101.3
4′ CH 101.3 7.28 131.6, 111.7
C5´-OMe CH3 55.8 3.72 153.5
2 CH 43.7 4.02 172.7, 127.5, 123.6, 112.1, 41.9
7 CH2 42.5 4.21; 4.35 172.7, 140.1, 127.5
3 CH2 41.9 3.50 172.7, 170.1, 112.1, 43.7
C5-Me CH3 23.0 1.79 170.1
1´ NH 10.75 131.6, 127.5, 123.6, 112.1
6 NH 8.58 172.7, 42.5
4 NH 8.09 170.1, 41.9
72
Anexo
Tabla 8. Datos de RMN 1H de la propanamida 2
Estructura b): 3-acetamido propanamida
HX-2 HB-3 HA-3 NHM-4 C5-Me NH-6
DMSO-d6 δ 4.0 dd 3.33 ma 8.07 dd 1.81 s 8.57 d
J 9.1, 5.4 - 6.2, 5.9 - 8.2
Fragmento: R1
NH-1′ H-2′ H-4′ H-6′ H-7′ C5′-OMe
DMSO-d6 δ 10.70 s 6.96 d 7.27 d 6.67 dd 7.18 d 3.70 s
J - 2.5 2.4 8.8, 2.5 8.8 -
Fragmento: R2
H-7 H7- Me C-o, m, p
DMSO-d6 δ 4.96 t 1.36 d 7.21-7.32 m
J 7.5 7.0 -a
a Señal parcialmente sobrepuesta.
b)
73
Anexo
Tabla 9. Datos de RMN 13C de la propanamida 2
Estructura b): 3-acetamido propanamida
C-1 C-2 C-3 C-5 C5-Me
DMSO-d6 δ 171.3 43.1 41.3 169.6 22.6
Fragmento: R1
C-2′ C-3′ C-3a′ C-4′ C-5′ C-6′ C-7′ C-7a′
DMSO-d6 δ 123.0 111.7 127.1 100.8 153.0 111.2 111.9 131.1
C5′-OMe
DMSO-d6 δ 55.3
Fragmento: R2
C-7 C7-Me C-i C-o C-m C-p
DMSO-d6 δ 47.8 22.9 144.7 125.9 128.0 126.4
b)
74
Anexo
Tabla 10. Correlaciones gHMBC de la propanamida 2
Posición Tipo δC δH gHMBC
1 C=O 171.3 - -
5 C=O 169.6 - -
5′ C 153.0 - -
Ci C 144.7 - -
7a′ C 131.1 - -
Cm CH 128.0 7.13 144.7, 128.0
3a′ C 127.1 - -
Cp CH 126.4 7.12 -
Co CH 125.9 7.19 125.9
2′ CH 123.0 6.96 131.1, 127.1, 111.7
7′ CH 111.9 7.18 153.0, 127.1
3′ C 111.7 - -
6′ CH 111.2 6.67 153.0, 131.1, 100.8
4′ CH 100.8 7.26 131.1, 111.2
C5´-OMe CH3 55.3 3.70 153.0
7 CH 47.8 4.96 171.3, 144.7, 125.9, 22.9
2 CH 43.1 4.00 171.3, 127.1, 123.0, 111.7, 41.3
3 CH2 41.3 3.47 171.3, 169.6, 111.7, 43.1
C7-Me CH3 22.9 1.36 144.7, 47.8
C5-Me CH3 22.6 1.81 169.6
1´ NH 10.78 131.1, 127.1, 123.0, 111.7
6 NH 8.61 171.3, 47.8
4 NH 8.11 169.6, 41.3
75
Anexo
Tabla 11. Datos de RMN 1H de la propanamida 3
Estructura b): 3-acetamido propanamida
HX-2 HB-3 HA-3 NHM-4 C5-Me NH-6
DMSO-d6 δ 4.07 dd 3.47 m 8.03 t 1.75 s 8.58 d
J 9.1, 5.4 - 5.8 - 8.2
Fragmento: R1
NH-1′ H-2′ H-4′ H-6′ H-7′ C5′-OMe
DMSO-d6 δ 10.75 s 7.10 d 7.32 d 6.70 dd 7.21 d 3.74 s
J - 2.5 2.4 8.8, 2.4 8.5 -
Fragmento: R2
H-7 H7-Me C-o, m, p
DMSO-d6 δ 4.95 t 1.26 d 7.13-7.19
J 7.45 7.0 -a
a Señal parcialmente sobrepuesta.
b)
76
Anexo
Tabla 12. Datos de RMN 13C de la propanamida 3
Estructura b): 3-acetamido propanamida
C-1 C-2 C-3 C-5 C5-Me
DMSO-d6 δ 171.3 43.0 41.5 169.7 22.6
Fragmento: R1
C-2′ C-3′ C-3a′ C-4′ C-5′ C-6′ C-7′ C-7a′
DMSO-d6 δ 123.0 111.8 127.1 100.9 153.0 111.3 112.0 131.2
C5′-OMe
DMSO-d6 δ 55.4
Fragmento: R2
C-7 C7-Me C-i C-o C-m C-p
DMSO-d6 δ 47.6 22.3 144.8 126.0 128.2 126.5
b)
77
Anexo
Tabla 13. Correlaciones gHMBC de la propanamida 3
Posición Tipo δC δH gHMBC
1 C=O 171.3 - -
5 C=O 169.7 - -
5′ C 153.0 - -
Ci C 144.8 - -
7a′ C 131.2 - -
Cm CH 128.2 7.31 128.2
3a′ C 127.1 - -
Cp CH 126.5 7.21 153.0, 127.1
Co CH 126.0 7.32 128.2
2′ CH 123.0 7.10 131.2
7′ CH 112.0 7.21 153.0, 127.1
3′ C 111.8 - -
6′ CH 111.3 6.70 153.0, 131.2, 100.9
4′ CH 100.9 7.32 111.3
C5´-OMe CH3 55.4 3.75 153.0
7 CH 47.6 4.95 171.3, 144.8, 126.0, 22.3
2 CH 43.0 4.07 171.3, 127.1, 41.5
3 CH2 41.5 3.33
C5-Me CH3 22.6 1.75 169.7
C7-Me CH3 22.3 1.26 144.8, 47.6
1´ NH 10.75 131.2, 127.1, 123.0, 112.0
6 NH 8.58 171.3
4 NH 8.03 169.7
78
Anexo
Tabla 14. Datos de RMN 1H de la propanamida 4
Estructura b): 3-acetamido propanamida
HX-2 HB-3 HA-3 NHM-4 C5-Me NH-6
DMSO-d6 δ 3.91 dd 3.42, 3.52 ma 8.03 t 1.78 s 8.18 t
J 9.1, 5.6 - 5.9 - 5.6
Fragmento: R1
NH-1′ H-2′ H-4′ H-6′ H-7′ C5′-OMe
DMSO-d6 δ 10.72 s 7.10 d 7.28 d 6.70 dd 7.21 d 3.74 s
J - 2.3 2.6 8.8, 2.3 8.8 -
Fragmento: R2
HB-7 HA-7 H-8 H-2" H-1" H-7" H-6"
DMSO-d6 δ 3.34 ma 2.79 dd 7.07 d 10.75 s 7.31 d 7.03 dd
J - 7.6, 76 2.6 - 8.2 7.9, 1.3
H-4" H-5"
DMSO-d6 δ 7.51 d 6.94 ddd
J 7.6 14.7, 7.5, 1.0
a Señal parcialmente sobrepuesta.
b)
79
Anexo
Tabla 15. Datos de RMN 13C de la propanamida 4
Estructura b): 3-acetamido propanamida
C-1 C-2 C-3 C-5 C5-Me
DMSO-d6 δ 172.1 43.4 41.5 169.6 22.6
Fragmento: R1
C-2′ C-3′ C-3a′ C-4′ C-5′ C-6′ C-7′ C-7a′
DMSO-d6 δ 123.2 111.9 127.1 100.9 153.0 111.2 112.0 131.2
C5′-OMe
DMSO-d6 δ 55.3
Fragmento: R2
C-7 C-8 C-2" C-3" C-3a" C-4" C-5" C-6"
DMSO-d6 δ 39.7 25.3 122.6 111.8 127.2 118.3 118.2 120.9
C-7" C-7a"
DMSO-d6 δ 111.4 136.2
b)
80
Anexo
Tabla 16. Correlaciones gHMBC de la propanamida 4
Posición Tipo δC δH gHMBC
1 C=O 172.1 - -
5 C=O 169.6 - -
5′ C 153.0 - -
7a C 136.2 - -
7a′ C 131.2 - -
3a′′ C 127.2 - -
3a′ C 127.1 - -
2′ CH 123.2 7.10 131.2, 127.1, 111.9
2′′ CH 122.6 7.07 136.2, 127.2, 111.8
6′′ CH 120.9 7.03 136.2, 118.3
4′′ CH 118.3 7.51 136.2, 127.2, 120.9, 111.8
5′′ CH 118.2 6.94 127.2, 111.4
7′ CH 112.0 7.21 153.0, 127.1
3′ C 111.9 - -
3′′ C 111.8 - -
7′′ CH 111.4 7.31 127.2, 118.2
6′ CH 111.2 6.70 153.0, 131.2, 100.9
4′ CH 100.9 7.28 131.2, 111.9, 111.2
C5′-OMe CH3 55.3 3.74 153.0
2 CH 43.4 3.91 172.1, 127.1, 123.2, 111.9, 41.5
3 CH2 41.5 3.52; 3.42 172.1, 169.6, 111.9, 43.4
7 CH2 39.7 3.34 172.1, 111.8, 25.3
Continúa…
81
Anexo
Tabla 16. Correlaciones gHMBC de la propanamida 4 (Continuación).
Posición Tipo δC δH gHMBC
8 CH2 25.3 ..2.79 127.2, 122.6, 111.8, 39.7
C5-Me CH3 22.6 1.78 169.6
1′′ NH - 10.75 136.2, 127.2, 122.6, 111.8
1′ NH - 10.72 131.2, 127.1, 123.2 111.9
6 NH - 8.18 172.1, 39.7
4 NH - 8.03 169.6, 41.5
82
Anexo
6
2
4 7
CD3OD
C5 -OMe
C5-Me
CD3OD
2 3
Figura 1. Espectro de RMN 1H del 5-metoxi-N-acil-β
2-triptófano del 5-metoxi-N-acil-β
2-triptófano 14 (CD
3OD)
83
Anexo
Figura 2. Espectro de RMN 13
C del 5-metoxi-N-acil-β2-triptófano 14 (CD
3OD)
6
2
4
7
C5 -OMeC5-Me
CD3OD
3
3 1
5
5
7a
3a
2
84
Anexo
DMSO-d6H2O
C5-Me
C5 -OMe
23
6 2 4
7
1 4
Figura 3. Espectro de RMN 1H del 5-metoxi-N-acil-β
2-triptófano 14
85
Anexo
2 4
C5 -OMe C5-Me
33
1
55
7a 3a
26 7
DMSO-d6
Figura 4. Espectro de RMN 13
C del 5-metoxi-N-acil-β2-triptófano 14
86
Anexo
4
DMSO-d6
H2O
C5-Me
C5 -OMe
2 3
6 2
41 6
7 , Ho, Hm, Hp
7
Figura 5. Espectro de RMN 1H de la propanamida 1
87
Anexo
2 4 C5 -OMe C5-Me
3
1 5 5 7a
3a
26 7
Ci
Cm
Co Cp 37
DMSO-d6
Figura 6. Espectro de RMN 13
C de la propanamida 1
88
Anexo
4
2
61
4 6
2 37
C5 -OMe
H2O
DMSO-d6
C5-Me
C7-Me
7 , Ho, Hm, Hp
Figura 7. Espectro de RMN 1H de la propanamida 2
89
Anexo
3
17a
4
3a
5
6
5 Ci
2
7
Cm
Cp
Co
C5 -OMe
C5-Me
2 3
7
C7-Me
DMSO-d6
Figura 8. Espectro de RMN 13
C de la propanamida 2
90
Anexo
C5 -OMe
H2O
DMSO-d6
C5-Me
C7-Me
461
2
3
7
2 6
7
4 , Ho, Hm, Hp
Figura 9. Espectro de RMN 1H de la propanamida 3
91
Anexo
1 7a 4
5 5
Ci
2
C5 -OMe
2 3
7
X
X
3 3a 6 7
Cm
Cp
Co C5-MeC7-Me
DMSO-d6
Figura 10. Espectro de RMN 13
C de la propanamida 3
92
Anexo
4
C5 -OMe
C5-Me
2
2
6
7
3
7
1 1
4
H2O
DMSO-d6
8
7
4
2
6 5 6
Figura 11. Espectro de RMN 1H de la propanamida 4
93
Anexo
2
4
C5 -OMeC5-Me3a 1 5 5 7a
2
6 7
3
37a
2
5 3
7 6
4 8
7
DMSO-d6
Figura 12. Espectro de RMN 13
C de la propanamida 4
94
Anexo
