DNA microarrays a NGS · Porovnanie NGS technológií Generácia Techológia Cena/ stroj Cena/ beh Cena/ Mb Čas behu Reads/ dĺžka Reads/ počet Objem Chybovosť 1. 3730XL 100k

DNA microarrays a NGS

Základy bioinformatického spracovania dát

Bratislava 10.-11. november 2015 Ľuboš Kľučár CC Attribution-ShareAlike License

NGS

Next Generation Sequencing

Sekvenovanie DNA

1. generácia

– Maxam-Gilbert

– Sanger

2. generácia (Next-generation Sequencing – NGS)

– masívne paralelné sekvenovanie

3. generácia

– sekvenovanie jednej molekuly DNA v reálnom čase

2. generácia sekvenovania

• Roche/454 FLX

• Illumina GA

• SOLiD

• IonTorrent

3. generácia sekvenovania

• Heliscope

• PacBio

Next-generation sequencing (NGS)

Výhody

– high-throughput

– nízka cena

– sekvenovanie de novo

Nevýhody

– nepresné sekvenovanie dlhých homopolymérnych úsekov

– náročnejšia analýza dát

Workflow NGS

• príprava DNA templátu (DNA knižnice)

• amplifikácia DNA knižnice

• sekvenovanie

Sanger NGS Výhody NGS

klonálna amplifikácia • nevyžaduje in vivo

klonovanie, transformáciu,

odpichovanie kolónií...

sekvenovania na čipoch • vyššia úroveň paralelizácie v

porovnaní s kapilárnym

sekvenovaním

Alex Sánchez, VHIR Vall d’Hebron Institut

de Recerca, 2011 http://www.slideshare.net/ueb52/introduction-to-next-

generation-sequencing-v2

a. Emulsion PCR (emPCR) A reaction mixture consisting of an oil–aqueous emulsion is created to encapsulate bead–DNA complexes into single aqueous droplets. PCR amplification is performed within these droplets to create beads containing several thousand copies of the same template sequence. EmPCR beads can be chemically attached to a glass slide or deposited into PicoTiterPlate wells . b. Solid-phase amplification Composed of two basic steps: initial priming and extending of the single-stranded, single-molecule template, and bridge amplification of the immobilized template with immediately adjacent primers to form clusters.

NGS – clonal amplification

NGS – imaging

Illumina

Helicos BioSciences

SOLiD

Ion Torrent - Process overview

Merriman B et al. Electrophoresis 33(23), 3397-417 (201). doi: 10.1002/elps.201200424

Ion Torrent

JM Rothberg et al. Nature 475, 348-352 (2011) doi:10.1038/nature10242

Sensor, well and chip architecture.

Ion Torrent

Wafer, die and chip packaging.


Ion Torrent Moore's Law style scaling of successive chip generations

Merriman B et al. Electrophoresis 33(23), 3397-417 (201). doi: 10.1002/elps.201200424

Ion PGM™ Sequencer

Ion Torrent Single read accuracy


Ion Torrent

Vibrio fisheri, E. coli, Rhodopseudomonas palustris and Homo sapiens


Porovnanie NGS technológií Generácia Technológia

Cena/ stroj

Cena/ beh

Cena/ Mb

Čas behu

Reads/ dĺžka

Reads/ počet

Objem Chybovosť

1. 3730XL 100k $ 100 $ 1 600 $ 2 h 800 60 kb substitúcie

0,1-1%

2.

454 FLX 500k $ 6 000 $ 7 $ 23 h 750 1 mil. 900 Mb indel 1%

HiSeq 2000 700k $ 24 000 $ 0,04 $ 11 dní 2 x 100 3 mld. 600 Gb substitúcie

>0,1%

SOLiD 5500 600k $ 10 000 $ 0,07 $ 14 dní 75 + 35 1,5 mld. 160 Gb indel

>0,01%

2. (desktop)

454 GS JR 100k $ 1 000 $ 22 $ 9 h 400 100 tis. 50 Mb indel 1%

MiSeq 120k $ 1 000 $ 1 $ 27 h 2 x 150 5 mil. 1 Gb substitúcie

>0,1%

IonTorrent

80k $

150k $

(314) 200 $ (316) 400 $ (318) 600 $ (P) 1 000 $

20 $ 4 $

0,6 $ 0,1 $

3 h

200

100

600 tis. 3 mil. 6 mil.

82 mil.

10 Mb 100 Mb

1 Gb 10 Gb

indel ~1%

3. PacBio RS 700k $ 300 $ 3-14 $ 1,5 h >1 000 50 tis. 100 Mb

indel ~15%

HeliScope 1M $ 0,5 $ 8 dní 55 1 mil. 35 Gb delécie

3%

Kontrola kvality

Posúdenie kvality – skóre Phred

Phred skóre (Phred-33 | Phred-64)

Pravdepodobnosť nesprávne priradenej bázy

Presnosť priradenia bázy

10 (+|J) 1 z 10 90%

20 (5|T) 1 zo 100 99%

30 (?|^) 1 z 1000 99,9%

40 (I|h) 1 z 10 000 99,99%

50 (S|r) 1 zo 100 000 99,999%

Phred skóre Q

• vlastnosť, ktorá má logaritmický vzťah k pravdepodobnosti P

nesprávneho priradenia bázy

• ASCII vyjadrenie pripočítaním 33 k Phred skóre

(Illumina pripočítava 64)

http://en.wikipedia.org/wiki/Phred_quality_score

Kódovanie kvality

SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS.....................................................

..........................XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX......................

...............................IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII......................

.................................JJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJ......................

LLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL....................................................

!"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~

| | | | | |

33 59 64 73 104 126

0........................26...31.......40

-5....0........9.............................40

0........9.............................40

3.....9.............................40

0........................26...31........41

S - Sanger Phred+33, raw reads typically (0, 40)

X - Solexa Solexa+64, raw reads typically (-5, 40)

I - Illumina 1.3+ Phred+64, raw reads typically (0, 40)

J - Illumina 1.5+ Phred+64, raw reads typically (3, 40)

with 0=unused, 1=unused, 2=Read Segment Quality Control Indicator (underline)

L - Illumina 1.8+ Phred+33, raw reads typically (0, 41)

@HWI-EAS209_0006_FC706VJ:5:58:5894:21141#ATCACG/1

TTAATTGGTAAATAAATCTCCTAATAGCTTAGATNTTACCTTNNNNNNNNNNTAGTTTCTTGAGATTTGTTGGGGGAGACATTTTTGTGATTGCCTTGAT

+HWI-EAS209_0006_FC706VJ:5:58:5894:21141#ATCACG/1

efcfffffcfeefffcffffffddf`feed]`]_Ba_^__[YBBBBBBBBBBRTT\]][]dddd`ddd^dddadd^BBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBB

http://en.wikipedia.org/wiki/Phred_quality_score

Distribúcia dát

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9

76657216666758978554765664398473

12334445555566666666677777788899

12334445555566666666677777788899

12334445555566666666677777788899

12334445555566666666677777788899

2

4

6

8

↑ ↑↑ ↑↑ ↑↑ ↑

min q1 median q3 max

box and whiskers

Reads statistics 1. C T T G G G A A A T A A T T T A T A A T

8 8 8 8 8 8 8 4 4 4 4 4 3 3 3 3 3 1 1 1

2. C T T G G G A A A T A A T T T A T A A A

7 7 7 7 7 7 4 4 4 4 4 4 4 4 3 3 1 1 1 1

3. T A T A A C A A A A T C C T T T T T A T

9 9 9 8 8 8 8 7 8 8 7 7 7 4 5 4 3 1 2 2

4. T G T A T C A A A A C A G C T T G G G A

9 8 8 5 7 7 7 7 8 8 7 5 4 4 4 4 4 1 2 2

5. G T T A G T G T G T G T A T C A A A A C

7 7 7 7 7 7 7 6 6 6 4 4 3 3 4 4 4 2 2 2

6. A T C T G T T A G T G T G T G T A T C A

8 8 8 5 5 5 5 5 4 5 5 5 4 4 4 4 4 2 2 2

7. A T A A C A A A A T C C T T T T T A T A

8 8 8 8 8 8 8 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 2 2 2

8. T T A T C G A T T A A A G A T A G A A A

8 8 8 8 8 8 8 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 2 2 2

9. T A G A G T A T C T G T T A G T G T G T

5 6 5 6 5 6 6 5 4 5 5 5 4 4 3 4 4 2 2 2

10. T A G A G T A T C T G T T A G T G T G T

4 6 5 4 4 8 6 5 4 5 4 5 2 4 3 4 4 1 1 1

0

2

4

6

4 5 6 Mean sequence quality (Phered Score)

Per sequence quality scores

0

2

4

6

8

10

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19

Position in read (bp)

Per base sequence quality

average 7 8 7 7 7 7 7 5 5 6 5 5 4 4 4 4 4 2 2 2

median 8 8 8 7 7 8 7 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 2 2 2

(per base)

average

(per sequence)

5

4

6

6

5

5

5

5

4

4

FastQC

quality control tool for high throughput sequence data

http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/

http://www.youtube.com/watch?v=bz93ReOv87Y

FastQC - Per base sequence quality

good sequence bad sequence

FastQC - Per sequence quality scores


FastQC - Per tile sequence quality

FastQC - Per base sequence content


FastQC - Per base GC content


FastQC - Per sequence GC content


FastQC - Per base N content


FastQC - Sequence Length Distribution


FastQC - Sequence Duplication Levels


FastQC - Overrepresented sequences


No overrepresented sequences

FastQC - Kmer Content


Štatistické parametre depth / depth of coverage /

coverage / read coverage

• (priemerný) počet nukleotidov ktorý prispel k získaniu sekvencie daného úseku (napr. 30x)

genome coverage

• podiel báz referenčného genómu, ktoré sú zachytené poskladanými kontigmi (napr. 99,9%)

N50

• dĺžka kontigu pre ktorý platí, že polovica kontigov ma takúto alebo väčšiu veľkosť (napr. 18 654 bp)

maximum / median / average contig size, number of contigs

• maximálna dĺžka, medián a priemerná dĺžka kontigov a ich počet

Chipster Open source platform for data analysis

http://http://chipster.csc.fi/

Galaxy Data intensive biology for everyone

http://galaxyproject.org/

IGV Integrative Genomics Viewer

http://www.broadinstitute.org/igv/

Knižnice

Príprava knižnice sinlge-end + jednoduchšie

+ 100 ng–1 μg DNA

- nevhodné na spájanie kontigov

paired-end + presnejší alignment

+ repeaty

- 100 ng–1 μg

mate pair + de novo

+ genome finishing

+ structural variants detection

- 5-120 μg DNA

200-800 bp

2-20 Kbp

mate pair knižnice

Berglund et al. Investigative Genetics 2011 2:23 doi:10.1186/2041-2223-2-23

Alignment a de novo assembly

Berglund et al. Investigative Genetics 2011 2:23 doi:10.1186/2041-2223-2-23

Alignment paired-end readov

De novo assembly

Multiplexing vzoriek (barcoding)

multiplex de-multiplex align

Illumina: An Introduction to Next-Generation Sequencing Technology.

+ až 120 rôznych vzoriek v jednom behu

De novo assembly

.fastq

assembler

.fasta

Velvet (de Bruijn grafy)

Mapovanie

.fastq

aligner .sam

.bam

BWA

Bowtie

SAM / BAM

SAM (Sequence Alignment Map format)

BAM (Binary Sequence Alignment) • binárna verzia formátu SAM

http://samtools.sourceforge.net/SAM1.pdf

SRR017937.312 16 chr20 43108717 37 76M * 0 0

TGAGCCTCCGGGCTATGTGTGCTCACTGACAGAAGACCTGGTCACCAAAGCCCGGGAAGAGCTGCAGGAAAAGCCG

?,@A=A<5=,@==A:BB@=B9(.;A@B;>@ABBB@@9BB@:@5<BBBB9)>BBB2<BBB@BBB?;;BABBBBBBB@

QNAME: Query name of the read

FLAG

RNAME: Reference sequence name

POS: Position of alignment in reference sequence

MAPQ: Mapping quality (Phred-scaled)

CIGAR: Specifics of the alignment against the reference

MRNM

MPOS

ISIZE

Detekcia variantov

.bam [pileup]

SAMTools

.bed

Rudy G: A Hitchhiker’s Guide to Next Generation Sequencing.

Štatistické predpoklady

• predpokladaný výskyt variantov je asi 1 na 1000 bp

• asi 85% variantov je už všeobecne známych

(dbSNP)

• pomer tranzícií/transverizií ma byť > 2 ak sú

varianty vysoko kvalitné (a pomer je ešte vyšší, ak

pochádzajú z kódujúcich oblastí)

Pileup

• prehľad alignmentu na každej pozícii

http://samtools.sourceforge.net/pileup.shtml

chr1 272 T 24 ,.$.....,,.,.,...,,,.,..^+. <<<+;<<<<<<<<<<<=<;<;7<&

chr1 273 T 23 ,.....,,.,.,...,,,.,..A <<<;<<<<<<<<<3<=<<<;<<+

chr1 274 T 23 ,.$....,,.,.+1A,...,,,.,... 7<7;<;<<<<<<<<<=<;<;<<6

chr1 275 A 23 ,$....,,.,-2AG,...,-2AG,.,...^l. <+;9*<<<<<<<<<=<<:;<<<<

chr1 276 G 22 ...T,,.,.,...,,,.,.... 33;+<<7=7<<7<&<<1;<<6<

ReferenceSeq [string] - name of the reference sequence

Coordinate [integer] - position in the reference sequence

ReferenceBase [A/C/G/T/N] - reference base at that position

#Reads [integer] - number of reads aligning to that base

ReadBases [variable length string, see below]

BaseQualities [variable length string, Phred encoded]

BED

BED (Browser Extensible Display format) • definícia dát pre zobrazenie v prehliadači

http://www.ensembl.org/info/website/upload/bed.html

chr22 25043062 25043063 I 0 +

chr22 25745895 25745896 I 0 +

chr22 26769465 26769466 I 0 -

chr22 26886954 26886955 D 0 +

chrom - the name of the chromosome (e.g. chr3, chrY)

chromStart - the starting position of the feature in the chromosome (1=0)

chromEnd - the ending position of the feature in the chromosome

name - defines the name of the feature

score - a score between 0 and 1000 (e.g for coloring the feature)

strand - defines the strand - either '+' or '-'.

RNA-seq

• štúdium úrovne expresie génov, detekcie nových génov a nekódujúcich RNA

• NGS alternatíva k DNA čipom

• nie je limitovaná iba pre známe gény

• poskytuje informácie o alternatívnom splicingu

• deteguje aj sekvenčné varianty

• minimálny alebo žiaden background

• nemá horný limit pre kvantifikáciu – rozsah 4 rády (v porovnaní s DNA čipmi - cca 2 rády)

RNA-seq

A.

B.

RNA-seq

FPKM

Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads

𝐹𝑃𝐾𝑀 =𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 𝒇𝒓𝒂𝒈𝒎𝒆𝒏𝒕𝒔

𝑒𝑥𝑜𝑛 𝑙𝑒𝑛𝑔𝑡ℎ 𝐾𝐵 ∗ 𝑚𝑎𝑝𝑝𝑒𝑑 𝑟𝑒𝑎𝑑𝑠 𝑚𝑖𝑙𝑙𝑖𝑜𝑛𝑠

RPKM

Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads

𝑅𝑃𝐾𝑀 =𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 𝒆𝒙𝒐𝒏 𝒓𝒆𝒂𝒅𝒔

𝑒𝑥𝑜𝑛 𝑙𝑒𝑛𝑔𝑡ℎ 𝐾𝐵 ∗ 𝑚𝑎𝑝𝑝𝑒𝑑 𝑟𝑒𝑎𝑑𝑠 𝑚𝑖𝑙𝑙𝑖𝑜𝑛𝑠

Kvantifikácia

• Normalizácia

• RPKM (reads per kilobase per millions)

Vzorka 1

Vzorka 2

6 mil

8 mil

Gén A – 0,6 kb Gén B – 1,1 kb Gén C – 1,4 kb

RPKM=12/(0,6*6)=3,33 RPKM=24/(1,1*6)=3,64 RPKM=11/(1,4*6)=1,31

RPKM=19/(0,6*8)=3,96 RPKM=28/(1,1*8)=1,94 RPKM=16/(1,4*8)=1,43

12 readov 24 readov 11 readov

19 readov 28 readov 16 readov

RNA-seq

Cufflinks

Cuffmerge

final transcriptome assembly .gtf

reads .fastq

TopHat

reads .fastq

mapped reads .bam

mapped reads .bam

mapped reads .bam

mapped reads .bam

Cuffdiff

differentialy expressed genes

condition A condition B reference genome

plný protokol

• pre genómy s horšie

preštudovaným

tranksriptómom (nové

genómy, onkogénne

genómy)

skrátený protokol

• dobre preštudované

genómy

• nekompletný alebo

nesprávne anotovaný

genóm zapríčiní

nepresné stanovenie

úrovne expresie génov

assembled transcripts .gtf

assembled transcripts .gtf

Tra

pnell

at

al. (

2012)

Natu

re

Pro

tocols

7(3

): 5

62-5

78.

Ribo-seq

(Ribo-seq = Ribosome profiling) • využitie NGS na monitorovanie

translácie in vivo • na rozdiel od RNA-seq je zameraná

iba na mRNA momentálne naviazané na ribozómy - ktoré sa momentálne translatujú

Využitie: – identifikácia miesta počiatku

translácie – určenie miery proteosyntézy – predpoveď množstva proteínu

Ingolia, NT (2014) Nat Rev Genet. 15:205-213

Documents

DNA microarrays a NGS · Porovnanie NGS technológií Generácia Techológia Cena/ stroj Cena/ beh Cena/ Mb Čas behu Reads/ dĺžka Reads/ počet Objem Chybovosť 1. 3730XL 100k