TRANSLACIJA

Doc. dr Snežana MarkovićDoc. dr Snežana MarkovićDoc. dr Snežana MarkovićDoc. dr Snežana MarkovićIInstitut za biologiju i ekologijunstitut za biologiju i ekologijuPPrirodnorirodno--matematički fakultetmatematički fakultet

UUniverzitet u Kragujevcuniverzitet u Kragujevcu

BIOSINTEZA PROTEINA - TRANSLACIJA� U toku translacije dolazi do specifičnog prepoznavanja

– iRNK-tRNK– iRNK-rRNK– tRNK-rRNK– RNK-proteini– Proteini-proteini

� AKTIVACIJA AMINOKISELINA (AK)

� Aminoacil-tRNK sintetaze specifične za AK

� Izoakceptorske tRNK� 2 faze

– Aminoacil-tRNK sintetaza vezuje COOH grupu AK vezuje COOH grupu AK za AMP

– Oslobađa se AMP; aktivirana COOH grupa se vezuje za OH grupu riboze adeninskog nukleotida na 3’ kraju odgovaraju će tRNK → nastaje aminoacil-tRNK

AMP

� OPŠTI PREGLED TRANSLACIJE� Sinteza polipeptidnog lanca – formiranje peptidne veze između

COOH grupe na kraju rastućeg lanca i NH2 grupe aktivirane aminokiseline

� Energetski zavisan proces (peptidil-tRNK molekul→nova peptidna veza)

� Sparivanje kodon – antikodon� Ribozomi; poliribozomi� P (peptidil-tRNK), A

(aminoacil-tRNK) i E mesto (tRNK koja napušta ribozom)

� Ribozomalni ciklus

� INICIJACIJA TRANSLACIJE

� Proces udruživanja ribozomskih subjedinica, tRNK i iRNK → kompleks koji otpočinje elongaciju polipeptidnog lanca sa određenog lanca sa određenog mesta na iRNK (okvir čitanja)

� Faktori inicijacije translacije

� INICIJACIJA TRANSLACIJE KOD PROKARIOTA

� Dve tRNK za metionin (inicijatorska i elongacijska)

� Inicijatorska tRNK za metionin – NH2 grupa Met se formiluje (N10-formil-tetrahidrofolat) → N-formilmetionil-tRNK (fMet-tRNK f

Met)tRNK f )� fMet-tRNK f

Met prepoznaje start kodone (AUG, GUG)

� Nakon sintetisanog polipeptidnog lanca od 15-30 AK, deformilaza uklanja formil grupu startnog Met, a aminopeptidaza uklanja i Met (ne uvek)

� 30S INICIJACIONI KOMPLEKS: mala subjedinica ribozoma, GTP, iRNK, inicijacioni faktor 2 (IF-2) i fMet-tRNK f

Met

� Binarni (IF-2 i fMet-tRNK fMet) ili

ternarni kompleks (iRNK, GTP, IF-2 i fMet-tRNK f

Met)� Na čeonom nizu iRNK sa Šajn-

Dalgarnovim (ŠD) nizom (na 5’ Dalgarnovim (ŠD) nizom (na 5’ kraju), komplementaran 3’ kraju 16S rRNK (invertovani ponovci) → hibrid iRNK -rRNK

� Nekompletno P mesto sa AUG (GUG) kodonom vezuje inicijatorsku tRNK

� Više ŠD nizova na policistronskoj iRNK

� Sledeća faza: 30S kompleksu se pridružuje velika subjedinica (50S) ribozoma – 70S

� Dolazi do hidrolize GTP i oslobađanje IF

� Inicijatorska tRNK u kompletnom P mestukompletnom P mestu

� Prazno kompletno A mesto za vezivanje drugih tRNK

� Prva peptidna veza između formilmetionina i sledeće AK

� INICIJACIONI FAKTORI PROKARIOTA

� IF-1 – vezuje se za malu subjed. ribozoma u budućem A mestu; pomaže delovanje IF-3 i oslobađanje IF-2

� IF-2 – vezuje inicijatorsku � IF-2 – vezuje inicijatorsku tRNK za nekompletno P mesto na 30S; izaziva hidrolizu GTP

� IF-3 – za vezivanje male subjedinice na iRNK; disocijacija ribozoma na subjedinice; vezuje se za 30S i stabilizuje je (E mesto)

� INICIJACIJA TRANSLACIJE KOD EUKARIOTA� Start signal je AUG� Metionin u inicijatorskoj tRNK (Met-tRNK i

Met) nije formilovan� Prvo se vezuje inicijatorska tRNK za malu subjedinicu ribozoma, pa zatim

iRNK uz pomoć kompleksa eIF4� Inicijacioni kompleks

– Binarni kompleks (eIF-2 i GTP)– Ternarni kompleks (eIF-2, GTP, Met-tRNK i

Met)– Mala subjedinica ribozoma (40S) sa eIF-3– iRNK, eIF-4, uz hidrolizu ATP– iRNK, eIF-4, uz hidrolizu ATP

� Mala (40S) subjedinica se vezuje pomoću eIF-4 za iRNK (za 5’ kapu) → pomera se duž čeonog niza do prvog start kodona

� Prepoznavanje AUG kodona omogućeno je sparivanjem sa antikodonom inicijatorske tRNK

� Velika subjedinica se vezuje kada se oslobode eIF-2 i eIF-3 uz pomoć eIF-5

� Stvaranje kompletnog ribozoma (80S) u blizini start kodona i inicijatorska tRNK se vezuje za kompletno P mesto, uz hidrolizu GTPGTP

� INICIJACIONI FAKTORI EUKARIOTA� eIF-1, eIF-2, eIF-3, eIF-4A, eIF-4B – učestvuju u formiranju

40S inicijacionog kompleksa� eIF-5 - uklanja prethodne faktore� eIF4C – povezuje ribozomske subjedinice� eIF-3 – stimuliše disocijaciju ribozoma� eIF-6 – vezivanjem za 60S sprečava reasocijaciju ribozoma

� ELONGACIJA TRANSLACIJE

� Ribozom je formiran na inicijacionom kodonu, A mesto je kompletno, a na P mestu je inicijatorska tRNK sa Met, odnosno formilmet

� Tri faze elongacije� I faza:

– Aminoacil-tRNK se vezuje za A – Aminoacil-tRNK se vezuje za A mesto (P mesto zauzeto)

– EF-T (prokarioti) –termostabilna (EF-Ts) i termolabilna komponenta (EF-Tu)

Aminoacil-tRNK•EF-Tu•GTP → vezuje se za A mesto → oslobađa se EF-Tu•GDP → EF-Ts•EF-Tu → EF-Tu•GTP

– EF-1 (eukarioti), dve subjedinice

� II faza – transpeptidacija– Veza između COOH i tRNK

u P mestu se raskida, a stvara se peptidna veza sa NH2 grupom AK vezane za tRNK u A mestu

– Peptidil transferaza – deo velike subjedinice ribozoma (nekoliko r-proteina, 5S i deo (nekoliko r-proteina, 5S i deo 23S rRNK; ribozim)

– P mesto sa deacilovanom tRNK, A mesto sa rastućim polipeptidom (peptidil-tRNK)

� III faza – translokacija– Nova peptidil-tRNK se pomera iz A u P mesto, a ribozom se pomera za tri

nukleotida duž iRNK– Deacilovana tRNK iz A mesta prelazi u E mesto– Prva podfaza: Hibridno A/P mesto (akceptorski krak nove peptidil-tRNK prelazi u P mesto, a

antikodon je u A mestu) na velikoj subjediniciHibridno P/E mesto (akceptorski kraj deacilovane tRNK prelazi u E mesto, a

antikodon ostaje u P mestu) na velikoj subjedinici– Druga podfaza: EF-G•GTP – antikodonski krajevi ovih tRNK se pomeraju sa iRNK u odnosu EF-G•GTP – antikodonski krajevi ovih tRNK se pomeraju sa iRNK u odnosu

na malu subjedinicu ribozoma (peptidil-tRNK u P/P mestu)Oslobađanje tRNK iz E mesta, vezivanje nove aminoacil-tRNK za A mesto– EF-G (kod prokariota) sa GTPom se vezuje za ribozom, hidrolizu GTPa vrši

jedan od r-proteina– EF-T i EF-G se vezuju alternativno za ribozom– EF-2 kod eukariota– Energetski skup proces; 1 peptidna veza = 4 fosfodiestarske veze GTP (2 veze

za formiranje 2 aminoacil-tRNK, 1 za vezivanje aminoacil-tRNK za A mesto i 1 za translokaciju ribozoma)

� TERMINACIJA TRANSLACIJE� Stop kodon (UAA, UAG, UGA) se nađe u A mestu, za koje se

vezuje terminacioni faktor� Prokarioti: RF-1, RF-2, RF-3

– RF-1 prepoznaje stop kodone UAA i UAG– RF-2 prepoznaje stop kodone UAA i UGA– RF-3 vezuje GTP i stimuliše aktivnost prva dva faktora

� Eukarioti: eRF1 (analog RF1 i 2 prokariota) i eRF3 (analog RF3 prokariota)

� Pri vezivanju terminacionih faktora stimulisana je hidroliti čka aktivnost peptidil transferaze (hidroliza veze između tRNK i sintetisanog polipeptidnog lanca)

� Hidrolizom GTP dobija se energija za oslobađanje terminacionih faktora

� Izbacivanje dezacilovanih tRNK sa P i E mesta pomoću faktora za recikliranje ribozoma (RRF)

� Disocijacija iRNK sa ribozoma pomoću IF3� Recikliranje ribozoma

� TAČNOST TRANSLACIJE� Prosečna učestalost grešaka je 10-4 po kodonu� Greške usled:� 1. Aktivacije aminokiselina;

– sprečeno korekcionim mehanizmom u vezi aminoacil-tRNK sintetaze, tRNK i odgovarajuće AK

� 2. Interakcija kodon-antikodon; – Strukturne komponente ribozoma u okviru A mesta;

promena geometrije A mesta omogućena S4, S5 i S12 promena geometrije A mesta omogućena S4, S5 i S12 proteinima

– Brzina elongacije; brzina stvaranja peptidne veze – pravilno popunjavanje A mesta; S12 protein

– Delovanje kodona kao alosteričnog efektora; pravilno sparivanje kodon-antikodon → konformaciona promena aminoacil-tRNK → interakcije ostalih petlji tRNK sa r-proteinima

� REGULACIJA BRZINE SINTEZE PROTEINA U ĆELIJI� Prokarioti: ekspresija gena regulisana na nivou transkripcije� Eukarioti: regulacija translacije – klju čan faktor eIF-2

– eIF-2 od α, β i γ subjedinice, vezuje GTP i Met-tRNKiMet,

vezivanje za P mesto– Fosforilacija/defosforilacija α subjedinice posredstvom

kinaza (agensi koji stimulišu rast i proliferaciju inhibiraju aktivnost kinaze i obrnuto)

– Nakon inicijacije translacije neophodna je regeneracija – Nakon inicijacije translacije neophodna je regeneracija eIF-2•GDP

Zamenu GDP sa GTP vrši eIF-2B (manje količine u odnosu na eIF-2)

Fosforilisan eIF-2 čvršće vezuje eIF-2B → nedostatak slobodnog eIF-2B → usporavanje translacije

� INHIBITORI SINTEZE PROTEINA� Antibiotici, toksini se vezuju za različite proteine ribozoma� Antibiotici koji inhibiraju sintezu proteina samo kod prokariota:

– Tetraciklin – blokira vezivanje aminoacil-tRNK za A mesto– Streptomicin – sprečava prelazak inicijacionog kompleksa u kompletan

ribozom (visoke koncentracije) ili povećava greške u prevođenju genetičke šifre (niske koncentracije)

– Hloramfenikol – inhibira peptidil transferazu– Eritromicin – blokira translokaciju– Eritromicin – blokira translokaciju

� Antibiotici koji inhibiraju sintezu proteina prokariota i eukariota:– Puromicin – anologon 3’ kraju tRNK, ugrađuje se na A mesto

� Cikloheksamid inhibira eukariotsku peptidil transferazu� Sinteza proteina u mitohondrijama i hloroplastima je osetljiva na

inhibitore koji deluju na prokariote