MIKOTOKSINI

Doc.dr.sc. Andreja Prevendar Crnić

Zavod za farmakologiju i toksikologiju Veterinarski fakultetSveučilišta u Zagrebu

BIOTOKSINI

zmijeopnokrilcikrpeljipauci otrovne biljke i

MIKOTOKSINIsu sekundarni produkti plijesni (gljivica).

MIKOTOKSINISaprofitske ubikvitarne gljivice i neke parazitske gljivice korisne su u proizvodnji antibiotika (Fleming), mliječnoj industriji, u mnogim drugim prirodnim procesima, pr. biopesticidi.Mogu biti i štetne:kad parazitiraju u ili na organizmu (koža, sluznica probavnog ili dišnog sustava) – MIKOZE.ili kad sintetiziraju biološki aktivne tvari -MIKOTOKSINE koje unesene ingestijom u organizam mogu izazvati otrovanja koje se nazivaju MIKOTOKSIKOZE.Neki su vrlo toksični, ima ih mnogo (više od 250).Otkriveni su prije 40 – 45 godina, pomoću analitičkih instrumentalnih metoda.

MIKOTOKSINIMikotoksin, kemijska struktura, gljivica koja ga proizvodi, supstrat koji je najčešće kontaminiran

Mikotoksin, kemijska struktura, gljivica koja ga proizvodi, supstrat koji je najčešće kontaminiran

Mikotoksin, kemijska struktura, gljivica koja ga proizvodi, supstrat koji je najčešće kontaminiran

MIKOTOKSIKOZEGljivice koje proizvode mikotoksine su ubikvitarneživotinje se mogu otrovati ako jedu kontaminirane:ŽITARICE (pšenica, raž, zob, kukuruz), ULJARICE (suncokret, soja, kikiriki), gotovu stočnu hranu, rižu, sijeno, silažu, sjenažu, mliječne i mesne proizvode, konzerve.

MIKOTOKSIKOZE

Najčešće mikotoksikoze izazivaju toksini koje proizvode plijesni iz rodova:

AspergillusPenicilliumFusarium (napadaju zrnje, plodove i gotove prerađevine);

Bilje u tijeku vegetacije napadaju plijesni iz rodova: Claviceps (C. purpurea –ražova glavica (povijest), Alternaria, Fusarium, Rhizopus i Helminthosporium.

Temperatura različito pogoduje rastu ovih vrsta, i s obzirom na to one se javljaju u različitim klimatskim pojasevima.

Izvori otrovanja

Posredni:sastavni dijelovi hrane kontaminirani plijesnima koje proizvode mikotoksine (žitarice ili uljarice) prije proizvodnje stočne hrane (pelete, silaža), ali su tijekom proizvodnje uništene, a mikotoksini zaostali u konačnom proizvodu.

Neposredni:Kad se gotova hrana kontaminira plijesnima (stočne smjese, pelete, konzervirana hrana, kruh i dr).

Izvori otrovanja

Plijesnima mogu biti kontaminirani i bjelančevinskidodaci hrani, enzimi, aditivi, mlijeko i mliječni proizvodi, meso i mesni prozvodi (psi, mačke), riblje, mesno, krvno i koštano brašno.

Od uljarica najčešće se mikotoksinima kontaminira kikiriki zbog specifičnog sastava i načina uzgoja.

Žitarice se mogu kontaminirati za

vrijeme vegetacije, uskladištenja i

prerade; osjetljivija su krupnija

i oštećena zrna (mehaničko oštećenje, oštećenja od parazita

(insekata) i ptica);kontaminaciji zrnja

pogoduje i deficijencija minerala

u tijeku razvoja, neprimjerena vlaga i

toplina tijekom rasta i zrenja.

Koje se životinje truju mikotoksinima?

Sve,ali najviše farmske životinje, jer je stočna hrana (uskladištena i konzervirana) najčešće kontaminirana mikotoksinima:svinjegoveda (tovna i mliječna)peradsporadično kod pasa, mačaka, konja, ovaca, kunića i riba.ljudi.

Postoje razlike u osjetljivosti životinja s obzirom na vrstu:svinjegovedaperad manje – ovce, kozena dob:mlade životinje su osjetljivije ili dosta stare;na ishranjenost (pothranjene, slabe životinje su osjetljivije);na okolišne činitelje (držanje, higijena);na stanište: klimatski uvijeti (u određenim područjima se javljaju specifične gljivice, pr. ohratoksikoze u sjevernijim krajevima).

odbijanje hrane

Klinička slika - najčešće vrlo nespecifična;obično su trovanja kroničnog tijeka;sliče nestašici nekih esencijalnih tvari (vitamina, minerala);sliče nekim trovanjima i bolestima uzrokovanim patogenim mikroorganizmima.Dijagnostika:složena; sigurna dg postavlja se nakon dokaza mikotoksinau hrani, izlučevinama i tkivima u određenoj koncentraciji.smatra se da neizbalansirana i nedostatna ishrana, te prisutnost nekih drugih toksičnih tvari u hrani pogoduje nastanku mikotokisikoza.

Velike su razlike u pojavnosti otrovanja na terenu u odnosu na experimentalneuvijete (uvijeti držanja u laboratorijima su izbalansirani i kontrolirani, a genetski faktori pokusnih životinja stabilni), na pr. niža količina mikotoksina može izazvati otrovanje, obično je prisutno, osim glavnog kojeg ima najiviše, više vrsta mikotoksina.

Poznato je da jedna plijesan stvara više mikotoksina, odnosno da jedan mikotoksinmože biti proizvod više gljivica; Prisutnost plijesni u hrani ne znači da one proizvode mikotoksine; Mikotoksin može biti u hrani i kad više nema plijesni; Kod kroničnih mikotoksikoza sva kontaminirana hrana može biti iskorištena prije nego li se pojave znakovi bolesti.

Zbog svega navedenog - u animalnoj patologiji mikotoksikoze su složen problem:

nespecifičan i nedovoljno izražen sindrom kliničke slike većine mikotoksikoza, razlike u osjetljivosti na mikotoksine među životinjama vezane uz genske – (vrsta i pasmina) i fiziološke faktore (dob, ishranjenost, prisutnost drugih bolesti) te činitelje okoliša (klima, način i higijena držanja) razlog su rijetkom postavljanju točne dijagnoze mikotoksikoze. Uz to, smatra se, da mikotoksini nisu jedini etiološki faktor sindroma mikotoksikoza, tj. da mikotoksikoze nisu rezultat samo kontaminacije hrane mikotoksinima, već da postoje i drugi etiopatogenetski faktori koji djeluju istovremeno (nedovoljno izbalansirana i nedostatna ishrana i prisutnost drugih toksičnih tvari u hrani).

Mehanizmi djelovanja mikotoksina

1. Inhibicija aktivnosti glukoneogenetskih enzima i aktivacija enzima koji sintetiziraju preteče glikogena i glikogen (aflatoksin B1, ohratoksin A, rubratoksin A).

2. Inhibicija funkcije mitohondrija – inhibicijaaktivnosti enzima trikarboksilnog (Krebsovog) ciklusa, s posljedično smanjenim iskorištavanjem kisika, inhibicija transporta elektrona i raskopčavanje oksidativne fosforilacije, te inhibicija transporta bjelančevina u mitohondrijima (aflatoksin B1, rubratoksin B i ohratoksin A).

Mehanizmi djelovanja mikotoksina

3. Poremete funkcije nukleinskih kiselina i sinteze bjelančevina (aflatoksini i trihoteceni). Aflatoksini reagiraju s DNK što mijenja kalup za produkciju RNK, inhibiraju RNK polimerazu pa remete transkripciju. Transkripciju u sintezi bjelančevina remete i trihoteceni, jer se vežu na 60S podjedinicu ribosoma i inhibiraju aktivnost enzima peptidil transferaze.

4. Kompetitivno inhibiraju biološki aktivne komplekse (fumonizini - kemijski analozi sfinganina i sfinganin-1-fosfata: inhibiraju aktivnost ceramid sintetaze, odnosno sintezu kompleksa sfingolipida. Time se mijenja funkcija bjelančevina na membrani stanica, mijenja se aktivnost protein kinaze, funkcija aktivnih lipida te rast i vitalnost stanice (apopotoza).

Mehanizmi djelovanja mikotoksina

5. Peroksidacija lipida, što je osnova hepatotoksičnosti i hepatokarcinogenosti mikotoksina.

6. Mikotoksini mogu djelovati kao imunomodulatori(mijenjaju normalnu imunološku reakciju organizma) i kada su u hrani u koncentraciji ispod granice detekcije. Radi se o supresiji celularnog i humoralnog dijela imunološke reakcije: aktivnosti T i B limfocita, produkcije antitijela i poremetnji funkcije makrofaga i retikuloendotela (aflatoksin B1, T-2 toksin, vomitoksin i deoksinivalenol).

Glavni mehanizmi toksičnosti mikotoksina

mikotoksini

Inhibicija sinteze proteina, DNK, RNK,

Oštećenja DNK (OTA, T-2, AFB1 itd)

Peroksidacija lipida,promjene građe i

funkcije membrana (većina mikotoksina)

Pokretanje programirane smrti stanice

(većina mikotoksina)

Imunosupresija, hepatotoksičnost, nefrotoksičnost,neurotoksičnost, gonotoksičnost

Prilagođeno od Surai, 2004.

Podjela mikotoksina

S obzirom na organ ili biološki sustav koji primarno i najviše oštećuju:hepatotoksine – oštećuju funkciju i integritet hepatocita do razvoja apoptoze, nekroze ili karcinoma (aflatoksini, rubratoksin, sporidezmin, sterigmatocistin te fumonizin kod konja).nefrotoksine – izazivaju insuficijenciju bubrega (ohratoksini, citrinin)citotoksini – oštećuju stanice različitih tkiva, poglavito epitelne stanice sluznice probavnoga sustava, stanice endotela krvnih žila, stanice limfnog sustava, slezene, testisa i dr. (trihoteceni).

Podjela mikotoksina

estrogeni mikotoksini – izazivaju poremetnje u reprodukciji, njačešće hiperestrogenizam i oštećenje spolnih stanica (zearalenon i zearanenol, ergot alkaloidi)imunotoksični mikotoksini – izazivaju celularnu i humoralnu imunosupresiju: smanjuju aktivnost T i B limfocita, usporavaju produkciju antitijela, remete funkciju retikuloendotela i dr. (trihoteceni, aflatoksin, ohratoksin, fumonizini). mikotoksini s učinkom na živčani sustav –tremorgeni mikotoksini

Mikotoksikološki lanac

HEPATOTOKSINI

mikotoksini koji primarno štetno djeluju na jetru

AFLATOKSINIRUBRATOKSINI A i BSTERIGMATOCISTIN

AFLATOKSINI

derivati difuranokumarina; policikličkifuranski spojevi metaboliti saprofitskih gljivica iz roda Aspergillus (A. flavus, A. parasiticus, A. nomius, A. niger, A. wentii, A. ruber, A. ohraceus), gljivica iz roda Penicillium(P. puberulum, P. variable, P. frequentans),te nekih pripadnika iz roda Rhizopus.

AFLATOKSININazvani su s obzirom na boju kojom fluoresciraju na tankoslojnoj kromatografiji : B1i B2 – blue, G1 i G2 – green, M1 i M2 – milk (otkriveni u mlijeku krava, a fluoresciraju plavo-ljubičasto i ljubičasto);Aflatoksin B1 je najtoksičniji; najviše ga ima u hrani za ljude i životinje.Aflatoksini M su 4-hidroksiderivati aflatoksina B (nađeni u mokraći, mlijeku, krvi, jetri, nakon dodavanja aflatoksina B1 u hranu; proizvode ga i plijesni A. flavus i A. parasiticus.

IZVORI OTROVANJA

Prva zabilježena mikotoksikoza: ranih 60. god. u Engleskoj – «turkey X disease»bolest purana s visokim mortalitetom –brašno kikirikija iz Brazila sadržavalo je Aspergillus flavus koji je proizvodio mikotoksine, nazvane po plijesni aflatoksini.Nakon kikirikija dokazani su u različitim žitaricama i uljaricama (grah, sjeme pamuka, kukuruzno brašno, riža, sirak), u gotovim stočnim smjesama i kod različitih vrsta životinja. Najpogodnijim supstartom za rast A. flavussmatraju se kikiriki, sjeme pamuka, jezgra kokosovog oraha i riblje brašno uz odgovarajuću temperaturu i vlažnost.

OTROVNOST

Među aflatoksinimanajotrovniji je B1.LD50 (p.o.) za aflatoksin B1je za:

svinju 0,62 mg/kgpuriće 0,5 mg/kgštakora 5-17 mg/kgmiša 9 mg/kgzamorčića 1,4 mg/kgmačku 0,55 mg/kgpsa 1 mg/kgpače 0,33-0,56 mg/kg

Aspergillus ear rot (aflatoxin)

Naglašena je osjetljivost mladih životinja, erazvijeni enzimi koji metaboliziraju aflatoksine. U životinja koje brzo metaboliziraju aflatoksinučinak aflatoksina je u pravilu akutan, dok je kod onih koje ga sporije metaboliziraju akutan ili kroničan, u štakora – kroničan. Perad – najosjetljivije je jednodnevno pače –služi kao biotest za taj toksin, zatim purići pa fazanski pilići.Od sisavaca su najosjetljiviji praščići i gravidnekrmače, pa telad.

OTROVNOST

Resorpcija – iz probavnog klanala je oskudna (i te male količine su toksične). Preživači – 95% aflatoksina razgradi se u predželucima, od ukupno pojedene količine 1% se izluči balegom, ostalo se resorbira.Nakon resorpcije se koncentrira u jetri.Biotransformacija – u jetri se biotransformirareakcijama hidroksilacije, demetilacije i epoksidacije (mikrosomski enzimi) u najmanje 7 metabolita koji su različito biološki aktivni (najaktivniji je visokoreaktivni elektrofilniepoksid).

Izlučivanje – mlijekom, jajima, mokraćom, sjemenom, s žuči - balegom.

METABOLIZAM

MEHANIZAM DJELOVANJA

Vrlo složenInhibira sintezu proteina na razini DNK i RNK (sintezu glasničke RNK)Aflatoksini reagiraju s DNK, što mijenja kalup za produkciju RNA, inhibiraju RNA-polimerazu, pa remete transkripciju.

Promjene na jetri su vrlo drastične smanjena količina enzima, strukturnih proteina jetre, smanjena količina antitijela, smanjena količina faktora zgrušavanja krvi, poremećaj metabolizma masti zbog nestašice proteina za prihvat lipida masna infiltracija i degeneracija jetre – steatoza.

KLINIČKA SLIKA

Rjeđe: akutno trovanje (hepatotoksikoza):depresija, gubitak teka, žutica, hemoragična dijateza, proljev, živčane smetnje – konvulzije, ubrzano i otežano disanje, kolike kod konja, tahikardija, povišena temperatura, fotosenzibilizacija nepigmentirane kože, izraziti konjunktivitis, životinje brzo kolabiraju i uginu.

KLINIČKA SLIKA

Češće: kronično trovanje:Vrlo nespecifično

gubitak teka, smanjeni prirast, povećana konverzija hrane, smanjena mliječnost, valivost, neuredan dlačni pokrov, povremeni proljev s tenezmom, ascites, rjeđe živčane smetnje, anemija, ikterus,krvarenja po sluznicama, poremećeno zgrušavanje krvi i poremećena funkcija jetre, povećana sklonost infekcijama zbog imunodeficijencije.

Aflatoksin prolazi kroz placentarnubarijeru i izaziva teške promjene na fetusu, te uginuće za nekoliko sati do 7 dana nakon poroda.Pačići – prije uginuća pojave se opistotonus, konvulzivni grčevi, krvarenja po bedrima.Psi – akutna aflatoksikoza: nagla slabost, povraćanje, velika žeđ, žutica, tamnožuta mokraća (leukocitoza i anemija, u urinu ↑bilirubin). Mortalitet za 3-4 dana 30-45%.Na oštećenje jetre ukazuju povećane koncentracije transaminaza u serumu ALT, AST.Treba imati dosta iskustva da bi se prepoznala aflatoksikoza.

PATO-ANATOMSKI NALAZ

Ikterus potkožja, sluznica, krvarenja –potkožna, mišićje, limfni čvorovi, epi –peri- endokard, seroza probavnih organa (hemoragični gastro-enetritis). Jetra jeblijeda i mutna, a leš žut (telad).U jetri – nekroza, masna infiltracija i degeneracija, hepatomegalija kod akutnih trovanja, ciroza kod kroničnih, fibrotičnajetraAscitesHidrotoraksHISTOLOŠKI: različite promjene u stanicama jetre

DIJAGNOZA

Složena, učinak aflatoksina može biti akutan i vrlo snažan, do kroničnog i jedva primijetljivog

Na temelju kliničke slike, anamneze, pato-anatomskog nalaza (važna je mikroskopska pretraga jetre) može se posumnjati, ali za sigurnu dg treba dokazati mikotoksine u određenoj količini u hrani, mokraći, mlijeku, jetrii bubregu.U obzir dolazi i pretraga hrane ultraljubičastim svijetlom - neki metaboliti plijesni Aspergillus flavus i A. parasiticusfluoresciraju zelenkasto-žuto.

LIJEČENJE I PREVENTIVA

Antioksidansi (selen, vitamin E),počinje se s nespecifičnim adsorbensima: Al-silikat, carbo animalis, glutation, cisteinako smatramo da ih još ima u probavnom sustavu),kasnije se daju tvari sa specifičnim afinitetom za određene mikotoksine –biološki spojevi, pr. Mycofix Plus, MycofixSelect, Mycosorb.

LIJEČENJE I PREVENTIVA

Preventiva: bitnija od liječenja - gljivicama onemogućiti rast;tretiranje pljesnive hrane blagim fungicidima nije jeftino ni jednostavno, a mikotoksine neće uništiti (propionat);bitno je kvalitetno uskladištenje stočne hrane ili sastojaka stočne hrane;ev. razrijediti hranu (nova ili stara šarža).

OSTACI U TKIVIMA

http://www.nn.hr/clanci/sluzbeno/2003/0531.htmPravilnik o količinama pesticida, toksina, mikotoksina, metala i histamina i sličnih tvari koje se mogu nalaziti u namirnicamaMDK za žitarice, grašak, leću, lješnjak, orah, badem, prženi kikiriki, čajeve – 5 µg/kgMDK za brašna od žita 3 µg/kgZa mlijeko 0,5 µg/kgMala je mogućnost da prijeđu u mesoMDK za stočna krmiva 10, 20 i 50 µg/kg (ovisno za koju su vrstu životinja namijenjene)

SUBLETALNO DJELOVANJE

Vrlo je bitno za aflatoksine:promjene u koncentraciji i međusobnom odnosu serumskih bjelančevinainhibicija humoralne i stanične imunostiKod laboratorijskih životinja dokazano je mutageno i kancerogeno (jedan od najsnažnijih

karcinogena za pokusne životinje) djelovanje aflatoksina, za domaće životinje to nije tako bitno, jer one ne žive dovoljno dugo

RUBRATOKSINI A i B

metaboliti plijesni Penicillium rubrum i P. purpurogenumizraziti hepatotoksini s naglašenim hemoragičnimučinkomnapadaju kukuruz, i druge žitaricetoksični učinak - vrlo sličan učinku aflatoksina, ali su manje toksični od njega

STERIGMATOCISTIN

metabolit više vrsta toksigenih plijesni, najviše roda Aspergillus, roda Chaetomium, Bipolaris i Farrowiarastu na žitu i proizvodima od žita

Jaki su hepatotoksiniObično dolaze u kombinaciji s aflatoksinom

NEFROTOKSINI

mikotoksini koji primarno štetno djeluju na bubrege:

OHRATOKSINI A, B i CCITRININ

OHRATOKSINI A, B i C

toksični su metaboliti sedam vrsta plijesni iz roda Penicillium, najviše P. viridicatum i šest vrsta plijesni iz roda Aspergillus,najviše A. ochreaceus;kemijski - derivati dihidroizokumarina;do sada ih je otkriveno 9, a ohratoksin A je od najvećeg značaja za toksikologiju.

OHRATOKSINI A, B i C

najviše parazitiraju na kukuruzu, zatim na žitu (zob, ječam), na proizvodima od žita, na sirku, riži, kikirikiju, zelenom zrnju kave.

Ohratoksin je tipični nefrotoksin.

Prirodna ohratoksikozajavlja se najčešće kod svinja, peradi, pura i kunića.

IZVORI OTROVANJA

Ohratoksin A prvi je puta izoliran 1965. god. iz kukuruznog brašna, a i danas se smatra isključivim uzročnikom prirodne ohratoksikoze.Za rast ovih toksogenih plijesni pogodna su hladnija i umjerena klimatska područja (12-25oC, čak i na 4oC)- sjeverniji krajevi: Njemačka, Skandinavske zemlje, Sjeverna Amerika, Kanada

OTROVNOSTAkutno 1-5 ppmKronično > 0,3 ppm

TOKSIKOKINETIKA

Resorpcija – iz probavnog klanala svinja je izdašna 67,7%U krvi se 99,8% veže za albumine;u jetri se transformira u aktivne metabolite;izlučuje se balegom, mokraćom i mlijekom. Biološko poluvrijeme u plazmi iznosi u svinja oko 90 sati.

MEHANIZAM DJELOVANJA

Ohratoksini PRIMARNO OŠTEĆUJU PROKSIMALNE TUBULE bubrega

- Umanjuju opseg izlučivanja elektrolita i sposobnost koncentriranja mokraće, koče transport aniona i uzrokuju otpuštanje enzima vezanih za membranu stanica bubrežnih tubula (pr. leucin aminopeptidaza)

- Sve bježi van – voda, minerali

MEHANIZAM DJELOVANJA

o Na razini stanice ohratoksin i citrinin:čvrsto se vežu za proteine (albumine)upliću se u sintezu transportne i glasničke RNKupliću se u sintezu proteinaprekidaju metabolizam ugljikohidrata (fosfoenolpiruvat-karboksikinaza)povećavaju stvaranje slobodnih radikala (metabolizam citokrom P-450 reduktaze).

Ohratoksin A povećava peroksidaciju lipida na membranama ER i remeti homeostazumikrosomskog Ca.

KLINIČKA SLIKA

SVINJE – najčešće otrovaneAkutno (rijetko se javi u prirodnim uvijetima) –gubitak teka, smanjen prirast ili gubitak tjelesne mase, polidipsija (svinje piju svoju mokraću), poliurija, proteinurija, glikozurija, smanjena specifična težina mokraće (u urinu – proteini, glukoza, krv).Kronično (svinje) gubitak teka, slabostpolidipsija i poliurijapovećana osjetljivost na infekcije

Sumnja na ohratoksikozu tek prilikom klanja kad se ustanove blijedi, tvrdi i fibrotični bubrezi.

PATO-ANATOMSKI NALAZ

Povećani, blijedi bubrezi, tvrđe konzistencijeHistološki: promjene u proksimalnim tubulimadegenerirana, stanjena stijenka (degeneracija epitela)fibroza intersticija, cirozamogu biti zahvaćeni i glomeruli(atrofija), ev. dilatacijadistalnih tubulaRjeđe - promjene na jetri i limfnom sustavu

DIJAGNOZA

Klinička slika, anamneza – sumnja kad životinje kroz duže vrijeme puno piju i puno mokre (svinje).Siguran dokaz – ohratoksin u stočnoj hrani, moraći ili balezi, odnosno bubrezima, jetri i mišićju uginule životinje.

TERAPIJA I PREVENTIVA

Vitamin E i selen – antioksidansiSpecifične biološke tvari koje vežu mikotoksine pr. Mycofix Plus, Mycofix Select, Mycosorb.

ev. potporna terapijaPreventiva – glavna

OSTACI U TKIVIMA

Kod nas nije neki veći problem, pa pravilnikom nije regulirana MDK za živežne namirnice (samo za žitarice).Sjever – problemi, meso se baca

SUBLETALNO DJELOVANJEOpasni suImunosupresivno i teratogeno djelovanja Nakon dugog izlaganja laboratorijskih životinjama niskim konc. ovog mikotoksina utvrđen je njegov teratogeni i kancerogeni učinak

CITRININ

je nefrotoksin, proizvode ga plijesni Penicillium viridicatumi P. citrininum.U pasa i štakora uzrokuje citotoksičniučinak u distalnimzavinutim kanalićima i Henleovoj petlji.