Sessile Organisms 32（1）：1–6（2015）

© The Sessile Organisms Society of Japan 2015

速報/Rapid Communication

新規外来フジツボPerforatus perforatusの日本への侵入確認およびリアルタイムPCR法を用いた検出方法について野方靖行 1）*・吉村えり奈 2）・佐藤加奈 2）・加戸隆介 3）・岡野桂樹 4）

1） （一財）電力中央研究所　環境科学研究所　〒270–1194 千葉県我孫子市我孫子16462） （株）セレス　〒270–1153 千葉県我孫子市緑1–4–53） 北里大学　海洋生命科学部　海洋生命科学科　〒252–0373神奈川県相模原市南区北里1–15–14） 秋田県立大学　生物資源科学部　応用生物科学科　〒010–0195 秋田市下新城中野字街道端西241–438

The first find of the invasive alien barnacle Perforatus perforatus in Japan and the development of a detection method using real-time PCRYasuyuki Nogata,1）* Erina Yoshimura,2） Kana Sato,2） Ryusuke Kado,3） and Keiju Okano4）

1） Environmental Science Research Labolatory, Central Research Institute of Electric Power Industry, 1646, Abiko, Abiko, Chiba, 270–1194, Japan

2） SERES Inc., 1–4–5, Midori, Abiko, Chiba, 270–1153, Japan3） School of Marine Biosciences, Kitasato University, 1–15–1, Kitasato, Minami-ku, Sagamihara, Kanagawa, 252–0373 Japan4） Department of Biotechnology, Faculty of Bioresource Sciences, Akita Prefectural University, 241–438, Shimoshinjo-Nakano, Akita-shi,

Akita 010–0195, Japan* Corresponding author: Yasuyuki Nogata E-mail: noga@criepi.denken.or.jp

（Received September 11, 2014; Accepted December 3, 2014; Published Online January 30, 2015）

AbstractThe acorn barnacle Perforatus perforatus is a common European species that is distributed from southwest England to

the Mediterranean and the northwest coast of Africa. Here, we present the first record of invasion of P. perforatus in Japan. This species was found in September, 2012, at a high density on a buoy in Toga Bay in Akita Prefecture, northwest Honshu. It was identified based on the morphological characteristics of the shell and opercular valves, and by molecular analysis us-ing a 300 bp nucleotide sequence of the mitochondrial 12S rRNA. Additionally, a detection and quantification method for P. perforatus using species-specific primer sets for quantitative real-time polymerase chain reaction was developed. Using this method, it was possible to identify and quantify the planktonic nauplius larvae of this alien species.

Keywords: Perforatus perforatus, invasive species, barnacle, detection method, real-time PCR

緒言近年、海上交通の発達に伴う世界規模での物資の輸送の増加に伴い、本来の生息場所とは異なる地域に移入し、そこでの再生産および分布拡大を行う外来種による問題が世界各地で報告されている（Courchamp, 2013）。我が国においても特定外来生物被害防止法が施行されているが、海産の付着生物は要注意外来生物リストには記載されているものの、規制の対象とはされていない。海産種の場合、水産物や水産物に混入して移入された生物の他に、バラスト水や船体付着に起因する外来種も多く報告されている（岩崎，2007）。また、国際海事機関（IMO）では、「Ten of the Most Unwanted」としてバラスト水や船体付着に起因する外来種とそれらが引き起こす問題などを取り上げている（Steve and Gould, 2011）。それに伴い、2004年にバラスト水管理条約が採択されており、近い将来、発効に至ると考えられる。加えて、船

体への生物付着を防止するための条約も検討されている（海洋政策研究財団，2010）。そのため、今後、海洋生物の外来種問題についても様々な課題が生じ、対応が求められてくると考えられる。現在の我が国沿岸に出現する外来種とその問題については、これまでにいくつかの調査結果がまとめられている（岩崎ら，2004; 岩崎・木下，2004; 岩崎，2006, 2007, 2012）。その中で、外来のフジツボ類については、タテジマフジツボ（Amphibalanus amphitrite）やアメリカフジツボ（Amphibalanus eburneus）などは、かなり古くから日本に移入した種類と考えられており、現在ではほぼ日本全土に分布が拡大している（岩崎ら，2004）。また近年、新たに我が国に定着したフジツボ類として、キタアメリカフジツボ（Balanus glandula）やココポーマアカフジツボ（Megabalanus coccopoma）が報告されている（Kado, 2003; Yamaguchi et al., 2009）。これら 2種のフ

The  Sessile  Organisms Society  of  Japan

DOI: 10.4282/sosj.32.1

Sessile Organisms Vol. 32, No. 1, 20152

ジツボも最初の発見後、かなりの速度で分布を広げており（加戸，2006; 山口ら，2010, 2011）、太平洋側では在来種との競合や漁業被害などの問題を引き起こしている。一方、日本海側に関しては、岩崎（2012）の外来海洋生物の分布調査によると、キタアメリカフジツボやココポーマアカフジツボの移入は無く、タテジマフジツボ、アメリカフジツボおよびヨーロッパフジツボ（Amphibal-anus improvisus）の分布が報告されているのみである。今回、我々は秋田県男鹿半島の戸賀湾で採集したフジツボサンプル中に新規外来フジツボと考えられる個体が大量に付着しているのを見出したので、その同定結果、形態的特徴、および遺伝情報を用いた検出方法を報告する。なお、フジツボの学名の記載については、Pitombo（2004）に従った。

材料と方法1. 生物試料

2012年 9月 27日に秋田県男鹿半島の戸賀湾のイワガキ養殖に使用していたブイ（Fig. 1）に付着したフジツボ群集を採集し、冷蔵にて電力中央研究所へ輸送した。その後、目視観察により、在来のアカフジツボ（Megabalanus rosa）およびサンカクフジツボ（Balanus trigonus）と異なると考えられた個体（10個体；殻底長径10 mm～20 mm程度）を選定し取り出した。得られた個体から軟体部を取り出しエタノールで固定し、遺伝子解析に供した。また、周殻および蓋板については、軟体部を除去した後に乾燥させ形態観察に用いた。形態観察は、山口（1979）に従い、周殻の枚数および殻の表面の観察を行うと共に、楯板と背板の形態を調べた。遺伝子配列の解読は遠藤・野方（2009）および

Endo et al.（2010）に従い、筋肉組織を含む軟体部からDNeasy® Blood Tissue Kit（Qiagen）を用いて抽出したDNAをフジツボ類のミトコンドリアDNA 12S rRNA領域（以降 12S rRNA）のユニバーサルプライマー：5′-GAACCAGGATTAGATACCC-3′ （12S-F） and 5′- TTTCCCGCGAGCGACGGGCG-3′ （12S-R） （Begum et al., 2004）を用いて polymerase chain reaction（PCR）により増幅させた。PCR産物はDNA断片の増幅を確認した 後 に BigDye® Terminator Cycle Sequencing Ready Reac-tion kit（Applied Biosystems）および12S-Fプライマーを用いたダイレクトシークエンシングに供した。塩基配列の解析にはABI Prism® 3130 genetic analyzer（Applied Biosystems）およびABI Prism® DNA Sequencing Analysis Software（Applied Biosystems）を用い、得られた塩基配列を用いEMBL/GenBank/DDBJに登録されているフジツボ類の配列との比較を行った。2. リアルタイムPCR1） プライマー設計得られたフジツボの 12S rRNA領域の部分塩基配列

と、遠藤・野方（2009）およびEndo et al.（2010）で報告されているフジツボ類24種の12S rRNA領域の部分塩基配列を CLUSTAL X software（Jeanmougin et al., 1998）により多重整列し、得られた結果を元に、目的種に特異的な領域を選定し、種特異的なリアルタイムPCR用プライマーセットを設計した。2） 特異性検証設計したリアルタイムPCR用プライマーセットと同

種および他種フジツボの成体から抽出したDNAを用いたPCRを行い特異性の検証を行った。特異性検証に用いたフジツボ成体は我が国の関東以北の浅海域で主に見出される在来種・移入種の 12種（ドロフジツボ，Fistulobalanus kondakovi; チシマフジツボ，Semibalanus cariosus; ハナフジツボ，Balanus crenatus; キタアメリカフジツボ，B. glandula; ミネフジツボ，Balanus rostratus; ココポーマアカフジツボ，M. coccopoma; アカフジツボ，M. rosa; サンカクフジツボ，B. trigonus; イワフジツボ，Chthamalus challengeri; エボシガイ，Lepas anatifera; オオアカフジツボ，Megabalanus. volcano; シロスジフジツボ，Fistulobalanus. albicostatus）と共に、既に沖縄での生息が知られており、今後の分布の拡大も考えられるBalanus zhujiangensis（Puspasari et al., 2002）を用いた。B. zhujiangensis以外の12種についてはEndo et al.（2010）と同一の採集場所・抽出方法により得られたDNAのうち最もメジャーなハプロタイプを使用した。また、B. zhujiangensisについては、2009年3月に沖縄県具志川市で採集した個体をEndo et al.（2010）に従いDNAを抽出後に使用した。PCRにはAdvantage® 2 PCR Kit（Clontech Laboratories）お よ び TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice® T600（Takara Bio）を用いた。Advantage® 2 PCR Kitに付属のマニュアルに準じて総量20 µlの反応液を調整し、95°C、1分を1サイクル、95°C、30秒；60°C、30秒；68°C、30秒を30サイクル繰り返す条件下で反応を行った。反応後，6 µlのPCR産物を2％アガロース電気泳動に供した。泳動後のゲルはSYBR Safe™ DNA gel stain（Invitrogen

Fig. 1. Heavy settlement of barnacles including Perforatus per-foratus on a buoy for oyster culture immersed in Toga Bay, Akita Prefecture (27 Sep. 2012). About 70 percent of the barnacles are P. perforatus.

Perforatus perforatusの侵入確認と検出法 3

Corporation）を用いて染色し、DNAバンドを可視化し、DNAの増幅の有無を確認した。3） 定量性検証定量性の検証はリアルタイムPCRで実施し、SYBR®

Premix Ex Taq（Takara Bio）および Smart Cycler® II Sys-tem（Takara Bio）を用い、95°C、10秒を1サイクル、95°C、5秒；60°C、30秒を40サイクル繰り返す条件下で反応を行った後、融解曲線分析によりmelting temperature（Tm）値を求めた。反応液は総量 25 µlとし、添加する鋳型DNAは遺伝子配列の解析に用いた成体のうち3個体から、DNA量を、0.25、0.5、2.5、5、10、25および 50 ngと変化させ、反応後の threshold cycle（Ct）値を測定し、3個体の平均値より検量線を作成した。また、形態観察・遺伝子解析用のサンプルと同様の方法で得たフジツボの一部を水槽内（塩分36、水温20°C）に収容し、ノープリウス幼生を孵出させた。孵出後のノープリウス幼生は II期の段階で70％エタノールにより固定し、遠藤・野方（2009）に従いDNA量の定量に用いた。フジツボノープリウス II期幼生1、2、5、10、20、50および100個体から各々エタノールを遠心エバポレーターにより除去した後、Quick Gene-Mini80（FUJIF-ILME Corp.; 現KURABO）およびQuick Gene DNA tissue kit S（FUJIFILME Corp.; 現KURABO）を用い、付属のマニュアルに準じてDNAの抽出を行った。得られたDNAは 100 µlの 10 mM Tris-HCl/1 mM EDTAバッファー（pH 8.0）に溶解し、DNA抽出液とした。リアルタイムPCRの条件は成体と同一とし、テンプレートの抽出DNA量は各2 µlとした。結果として、それぞれ、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1および 2個体分に相当するDNAを含むこととなる。実験は3回繰り返し、測定したCt値の平均値から検量線を作成した。

結果1. 同定1） 周殻・蓋板の形態周殻は6枚の殻板から形成された円錐状で、その表面は平滑か殻口から殻底に伸びた浅く細い肋が存在する。色調は白色から薄紫色であり、ほとんどの個体で細い紫色の縦縞が確認できた（Fig. 2）。殻口は楕円形で、殻底サイズに比べて概ね小さく、小型個体では殻口長径は殻底長径に対して1/3程度、殻底長径が20 mm程度の個体でも殻口長径が殻底長径の1/2を越えることはなかった。殻口が摩耗していない個体では上縁部は鋸歯状となる。翼部は輻部に覆われ、殻口付近でのみ確認できる。蓋板は殻口から離れて奥に位置する。楯板（Fig. 3b, d）の表面には明瞭な成長線隆起が見られる。内面には閉殻隆起が明瞭でほぼ頂部から底縁部付近まで伸びる。背板（Fig. 3a, c）は頂部が嘴状に伸び、底縁部は距に向かって傾斜する。背板表面の距に続く縦溝は細く深い。関節溝の上部はやや湾入する。距は細く、その長さは幅の約1.5倍ほどである。内面の下掣筋裂刻は不明瞭である。

蓋板開口部の外套膜縁辺部（蓋弁）は鮮やかな薄青色を呈し、蓋板を開口した時には特徴的である。以上の形態的特徴のうち、殻の形、殻口の大きさ、周殻の色、楯板および背板の形態は、Balanus perforatusの記述（Darwin, 1854）とよく一致していた。2） 遺伝子配列

12S rRNA領域の配列は 300 bp読み取ることができ、

Fig. 2. Right-side view of Perforatus perforatus detached from the buoy shown in Fig. 1.

Fig. 3. Outer (a, b) and inner (c, d) views of terga (left) and scuta (right) of Perforatus perforatus from Toga Bay.

Fig. 4. Nucleotide sequence of the mitochondrial 12S rRNA gene region of Perforatus perforatus from Toga bay. The most frequent-ly occurring sequence is shown. Underlines indicate regions for which primers were designed for real-time PCR (Table 1).

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今回解析に用いた10個体から得られた配列には3つのハプロタイプが確認された。8個体から得られた最も頻度の高かった配列をFig. 4に示す。Fig. 4に示した配列についてNCBIのBlast検索を行った結果、P. perforatus （AY520663）（Pérez-Losada et al., 2004）のみが、相当する箇所284 bpについて100％の相同性を示し、他種の場合は94％以下（Balanus balanus, 94％; Menesiniella aquila, 94％; F. kondakovi, 93％; B. trigonus, 92％など）の相同性であった。残りの 2個体についても、P. perforatusの配列（AY520663）と比較した所、それぞれ1塩基（Fig. 4の125番目）と2塩基（Fig. 4の125番目と217番目）の変異であり、いずれも99％の高い相同性を示した。2. 検出用プライマーの特異性・定量性設計したプライマーセット（Table 1）を用いたPCR

の結果をFig. 5に示す。P. perforatusから抽出したDNAを鋳型としたPCRでは、Fig. 5のAに示すようにアガロースゲル電気泳動により明確なシングルバンドが認められた。また、マーカーとの比較により推測された増幅産物のDNAバンドの泳動位置は約110 bp程度であり、設計したプライマーセットにより増幅するDNA断片サイズ（110 bp）とほぼ一致していた。一方、Fig. 5のB～Nで示しているように、プライマーセットに対応してい

ないフジツボ類から抽出したDNAを鋳型とした場合には、DNA断片の増幅は認められなかった。濃度の異なるP. perforatus成体由来のDNAを鋳型としたリアルタイムPCRの結果得られたCt値から作成した検量線をFig. 6aに示した。Tm値は78.5°Cであり、プライマーダイマーの生成は確認できなかった。成体由来DNAを鋳型とした場合のCt値は、添加した鋳型DNA濃度と高い相関を示し、リアルタイムPCRの結果得られるCt値からP. perforatusのDNA量への換算が可能であった。同様に、Fig. 6bに示すように、幼生数とCt値の間にも高い相関がみられ、Ct値よりノープリウス II期幼生数への換算が可能であった。

考察2012年10月に秋田県男鹿半島の戸賀湾で採集した不

明種のフジツボについて、形態観察および12S rRNA配列の比較により同定を試みた。その結果、12SrRNA配列がGenebankに登録されている配列と一致したこと、および形態的特徴が既報と一致したことから、これらはこれまで我が国で出現が報告されていないP. perforatus

Table 1. Species-specific primer set for real-time PCR.

species name length sequence (5′-3′)

Perforatus perforatus Pperf_12S_F1 21 CGATGAACCACGAATTTACTCPperf_12S_R1 21 CTTGAAGTCCATGACTTTCCC

Fig. 5. PCR amplification of the 12S rRNA gene region of 14 species of coastal barnacles using the primer set for Perforatus perforatus (30 cycles). Template DNAs were extracted from adult barnacles. The templates used are: lane A, P. perforatus; lane B, Fistulobalanus kondakovi; lane C, Semibalanus cariosus; lane D, Balanus crenatus; lane E, Balanus glandula; lane F, Balanus rostratus; lane G, Megabalanus coccopoma; lane H, Megabalanus rosa; lane I, Balanus trigonus; lane J, Chthamalus challengeri; lane K, Lepas anatifera ; lane L, Megabalanus volcano; lane M, Bala-nus zhujiangensis; lane N, Fistulobalanus albicostatus.

Fig. 6. Real-time PCR standard curves of template DNA extracted from adult Perforatus perforatus (a) and its nauplius larvae (b) us-ing the primer set for Perforatus perforatus. The threshold cycle (Ct) values are plotted against the quantity of template DNA (ng) on a log scale (a) and number of 2nd stage nauplius larvae, also on a log scale (b). Error bars indicate SD (3 replications).

Perforatus perforatusの侵入確認と検出法 5

であることが確認された。今後、在来種と本種を区別する際に有効な形態的特徴としては、1）殻口が殻底の大きさに比べて小さいこと（1/2～1/3）、2）周殻の色調が薄紫で細い紫の縦縞が存在すること、3）生時の蓋板開口時には蓋弁が鮮やかな薄青色であること、4）背板の楯板縁上部が湾入すること、などが挙げられる。P. perforatusは、イギリス南西部から地中海、西アフリカにかけての熱帯・亜熱帯域から温帯域に分布するフジツボで、潮間帯下部から潮下帯に生息する中・大型の種である（Norris and Crisp, 1953）。本種はヨーロッパでは一般的な種であり、数多くの研究事例がある。ヨーロッパにおいても、温暖化による海面水温の上昇に伴い、分布が広がっている事が報告されている（Herbert et al., 2003; Rees and Southward, 2009）。一方、移入種としての報告については、Kim and Hong（2010）が韓国内への本種の移入と分布状況を報告している。それによると、2006年に本種の韓国への侵入が確認されており、2008年には潮間帯の岩礁だけでなく、船体やブイ、腹足類の貝殻にも多数付着し、韓国内の31港湾中13箇所で移入が確認され、その何れもが朝鮮半島の東海岸に位置している。彼らは本種の分布と水温について言及し、ヨーロッパでの分布北限の表面水温（9.0°C～10.8°C）と南限の表面水温（25.2°C～26.9°C）を基に、韓国全体がその水温範囲に収まることから今後さらに分布を広げる可能性を指摘している。また、Choi et al.（2013）は対馬暖流により2008年以降も北に150 km/年の速度で分布を拡大していると推定している。一方、わが国においては、岩崎（2012）が日本海側で2006年から2010年にベントスの外来種調査を行っており、戸賀湾および周辺域は2007年に調べられている。これらの調査では本種の出現は確認されていない。今回、日本海側への侵入が確認されたことから、Kim and Hong（2010）の報告を考慮すると、韓国での分布拡大が明らかになった2008年以降に、日本海沿岸に分布を広げたと考えられる。また、我が国周辺の夏期の水温はヨーロッパにおける本種の分布水温範囲に収まっていることを考えると、急速にその分布を広げる可能性がある事が懸念される。その一例として、既に東北太平洋側へ分布が拡大していることが確認されている（加戸ら，未発表）。今後、日本沿岸での分布拡大および漁業をはじめとする産業への被害が心配される。新規外来種の同定は、侵入地では過去に分布報告がないため、広く世界中のフジツボの形態を調べねばならず、同定に時間がかかる可能性がある。また、再生産や分散状況を確認するためには、プランクトンである幼生期の同定が必要であるが、形態が非常に似通っているフジツボ類の幼生を同定する作業は困難を極める。そこで、P. perforatusに特異的なプライマーの設計を試みた。その結果、P. perforatusが見つかった周辺で主に観察されるフジツボ類には反応せず、本種の出現を確認するための特異性は満足するものと考えられた。よって、作成したプライマーを用いることにより、形態的判別が困難

な小型個体や幼生であっても、DNAの抽出が可能であれば、P. perforatusの特定が可能である。また、特異的なプライマーを用いたPCRは、シークエンサーを用いて配列を解読する必要もなく、DNAの増幅確認のみで種の特定が可能であり、簡便かつ迅速な方法であると考えられる。加えて、プランクトンネットで採集したサンプルなどから選別することなく直接DNAを抽出し、設計したプライマーセットを用いたリアルタイムPCRを行うことで、P. perforatus幼生の存在の有無を効率よく検出でき、大よその幼生量として定量することが可能である。今後、分布の確認のみでなく、幼生の出現量などの調査を行う際にも、有効なツールとなると期待できる。

謝辞B. zhujiangensisをご提供くださいました山口寿之博士、フジツボサンプルの採集にご協力いただいた秋田県水産振興センター各位に深謝いたします。本研究の一部は文部科学省東北マリンサイエンス拠点形成事業「海洋生態系の調査研究」の助成を受けました。

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