NO se producira u svim moždanim stanicama uključujući neurone,endotelne stanice i glija stanice (astrociti, oligodendrociti i mikroglija) pomoću Ca2+ /kalmodulin ovisnih NOS izoformi

U neuronima (nNOS, NOS tip1) i endotelnim stanicama(eNOS, NOS tip3) se fiziološki produciraju nanomolarne količine NO u kratkim periodima kao odgovor na prolazno povećanje intracelularne koncentracije kalcija

To je vrlo važno za: kontrolu cerebralnog protoka krvi i neurotransmisije sinaptičku aktivnost prilagođavanje endokrine funkcije proces memorije aktivnost ponašanja

NO igra važnu ulogu u kontroli toksičnosti CNS-a

Njegov je učinak dvostruki:

Potiče protektivni efekt modulirajući fiziološke procese i kompleksne imunološke funkcije u CNS-u

S druge strane sudjeluje u oštećenju tkiva

Značajna uloga u patofiziologiji mnogih neurodegenerativnih poremećaja:

Parkinsonova bolest Alzheimerova bolest Huntingtonova bolest

Multipla skleroza

Simultano povećanje NO i proizvodnja superoksida veže se s neurodegenerativnim promjenama

Povećanje nitrita, nitrata i slobodnog nitrotirozina je pronađeno u cerebrospinalnoj tekućini te se upravo to smatra markerom neurodegenerativnosti

Jednom formiran u bolesti mozga, peroksinitrit može pokazati svoje toksične efekte u multiplim mehanizmima uključujući :

lipidnu peroksidacijuoštećenje mitohondrija

nitraciju i oksidaciju proteina aktivaciju ili inhibiciju mnogih signalnih puteva

uništenje zalihe antioksidansa( posebice glutationa) oštećenju DNA

Nitracija tirozina predstavlja veliki citotoksični signalni put u živčanom sustavu koji dopridonosi razvoju neurodegenerativnih bolesti

Najčešća meta nitracije i oksidacije tirozina tj. tirozina u proteinu su upravo mitohondriji

Povećanje produkcije superoksida u mitihondriju ga čini podložnim štetnom utjecaju NO

Peroksinitrit oštećuje kompleks 1 u mitohondrijima i uzrokuje nitraciju i inaktivaciju mitohondrijske Mn-SOD

Inaktivacijom Mn-SOD(superoksid dismutaza) dolazi do vakuolizacije mitohondrija i oksidacije lipidnih zaliha

Genetski inducirana ekspresija mitohondrijske Mn-SOD ili indukcija samog enzima tijekom stresa štiti mitohondrije i stanice od štetnih učinaka oksidativnog stresa

Inaktivacija Mn-SOD s peroksinitritom čini mitohondrije podložnije oštećenju

Meta nitracije su i razni strukturni proteini s velikim udjelom tirozina

Tirozin je hidrofoban i može stvarati kontaktne regije među podjedinicama, no može i formirati vodikove veze u vodenom okruženju kada su podjedinice razdvojene

Često je lociran blizu kiselih i bazičnih ostataka koji povećavaju mogućnost njegove nitracije

Nitracija strukturnih proteina može dovesti do velikih promjena u njihovoj funkciji i uzrokovati mnoge sterične interakcije, može ozbiljno ugroziti formaciju neke velike strukture i dovesti do promjena u funkciji čitavog proteina

Neurofilament-L (NFL) i GFAP (glial fibrillary acid protein) su bili među prvim proteinima za koje se ustanovilo da su endogeno nitrirani in vivo

SOD se također pokazao kao učinkovit kod kataliziranja nitracije rastavljenih NFL podjedinica peroksinitritom in vitro, a djelomično kad je SOD oskudan cinkom

Nitracija malog udjela NFL-a (<10%) je dostatna da poremeti sklop neurofilamenata

Nitracija NFL-a može djelomično biti važna u ALS gdje motoneuroni sadrže ogromne koncentracije neurofilamentnih proteina koji su potrebni za podupiranje golemih aksona koji se mjere u metrima

Mutacije do alfa sinukleina se povezuju sa malim dijelom slučajeva Parkinsonove bolesti

Divlji tip alfa sinukleina je većinska komponenta Lewyevih tijela kao i inkluzija vlaknastih proteina u sporadičnoj Parkinsonovoj bolesti

Nitracijski stres potiče stvaranje agregata alfa sinukleina koji su otporni na proteolizu

Imunološki posredovana, upalna bolest koja uzrokuje žarišna oštećenja u bijeloj tvari napadajući nasumično različita područja CNS-a

Sposobnost neurona za provođenje impulsa je promijenjena, gube svoju mijelinsku ovojnicu i dolazi do sekundarnog gubitka aksona

Klinički simptomi:

tremor

ataksija

gubitak vida

dvostruki prikaz

slabost i paraliza

poteškoće u govoru

gubitak kontrole mokrenja i konstipacije

kognitivna oštećenja

bolne mišićne spazme

Upalni plakovi kod pacijenata oboljelih od MS-e pokazuju povećanu imunoreaktivnost iNOS-a i nitrotirozina popraćenu povećanom razinom nitrata i nitrita u cerebrospinalnoj tekućini, urinu i serumu

Nitracija tirozina može doprinjeti oštećenju krvno-moždane barijere (dopuštajući ulazak upalnih stanica) koje je bitna karakteristika aktivne MS-e

Ekspresija iNOS-a se povećava u demijeliziranim plakovima kod MS bolesnika kada se smanji upala

Eksperiment:

Inhibicija iNOS-a u eksperimentalnom alergijskom, autoimunom encefalomijelitisu (EAE; mišji model MS)

Kontroverzni rezultatati (pokazano i smanjenje i povećanje upale)

Merkaptoetilgvanidin (MEG) i gvanidinoetildisulfid (GED) štite jedino od EAE indukcijske faze, ali nisu spriječili progresiju bolesti

Koristan inhibitor nitracije tirozina

Zaštitnik krvno-moždane barijere Sprečava ulazak upalnih stanica

u CNS Sprečava nastanak CNS

oštećenja nakon što upalne stanice prodru u CNS

Razina mokraćne kiseline u serumu bi mogla biti biopokazatelj kod praćenja aktivnosti bolesti

Karakterizirana je progresivnim gubitkom dopaminergičkih neurona unutar substantia nigra pars reticulata

Rezultira smanjenom razinom dopamina i gubitkom dopaminergičke neurotransmisije koja je bitna za funkciju bazalnih ganglija,ključnih u motornoj funkciji i koordinaciji

Smatra se da su riskantni čimbenici:

oksidativni stres, upala,

ekscitotoksičnost, mitohondrijalna disfunkcija te

nasljedni i faktori okoliša

Točan razlog gubitka dopaminergičkih neurona ostaje još uvijek nepoznat

post mortalna istraživanja su pokazala peroksinitritom posredovana oksidativna i/ili dušična oštećenja

povećana akumulacija nitrotirozina je nađena kod Lewyjevih tijela i polimorfonuklearnim stanicama oboljelih od PD-i

akumulacija proteina koji sadrže nitrotirozin je bila popraćena pretjeranom ekspresijom nNOS-a (Neuronal Nitric Oxide Synthase)

Peroksinitrit:

Peroksinitrit može izazvati nitraciju tirozin-hidroksilaze, početnog enzima koji ograničava brzinu biosinteze dopamina, što dovodi do inhibicije enzimske aktivnosti te poteškoća u sintezi dopamina

Tirozinski ostaci su također osnovni za specifičnost monoamin oksidaze B (MAO B) što vodi do narušavanja metabolizma dopamina nakon nitracije tih ostataka

Doprinosi gubitku intracelularnog glutationa iz substantia nigra (rani proces kod PD-i) inaktivirajući glutation-reduktazu, enzim odgovoran za regeneraciju glutationa iz njegove oksidirane forme

Inducira apoptozu u dopaminergičkim neuronima

Novija istraživanja:

Inhibicija mitohondrijalnog kompleksa I može biti glavni uzrok sporadične PD

Nepravilnosti u kompleksu I vode k agregaciji alfa sinukleina koja doprinosi oštećenju dopaminergičkih neurona

Akumulacija i agregacija alfa sinukleina može dodatno pomoći smrt dopaminergičkih neurona narušavajući detoksifikaciju

Mitohondrijski kompleks I i sinuklein mogu biti mete za nitraciju proteina izazvanu peroksinitritom

Progresivan neurodegenerativni poremećaj

Neizbježno vodi progresivnom globalnom kognitivnom padu čega je rezultat demencija povezana sa starenjem

Prisutan je povećani oksidativni stres koji je rani događaj u procesu neurodegeneracije povezane s AD

Neuro i glija NO sintetaza imaju ulogu u patogenezi AD i formaciji peroksinitrita

Karakterizirana je:

Nastankom neuronskih plakova koji su bogati beta amiloidom (peptidom neurofibrilarnog spleta bogatog hiperfosforiliranim tau proteinima)

Proliferacijom glija stanica i neuroinflamatornih odgovara uključujući astrocite i mikrogliju

Povećana ekspresija NOS-a

nNOS ( u neuronima): U neuronima s neirofibrilarnim spletovima u

hipokampusu i entorinalnoj kori AD pacijenata U reaktivnim astrocitima pokraj amiloidnih plakova

iNOS (u glija stanicama) : Prisutnost stanica neuronskih plakova

eNOS (u endotelnim stanicama) : Prisutnost stanica neuronskih plakova u astrocitima

Disfunkcionalni neuroni i neurofibrilarni spletovi često pokazuju različite markere nitracijskog stresa, uključujući 3-NT - znak stvaranja peroksinitrita

Povišene razine nitrotirozina su prisutne u hipokampusu, neokortikalnim područjima, i ventrikularnim tekućinama i CSF-u kod AD pacijenata

Visoke razine 3-NT u cerebrospinalnoj tekućini povezane s porastom kognitivnih funkcija kod AD pacijenata

Suprotno tome, istraživanja nisu pronašla nikakvu razliku u količini 3-NT u CSF-u kod pacijenata s AD

Poznata kao i Lou Gehrigova bolest ili bolest motornih neurona

Najčešća bolest motornih neurona koja najviše pogađa sredovječne ljude

Karakterizirana je brzom, progresivnom degeneracijom motornih neurona u motoričnom korteksu, moždanom deblu i leđnoj moždini

Vodi progresivnoj slabosti, paralizi i prijevremenoj smrti unutar 3-5 godina od početka simptoma

Pacijenti nisu kognitivno oštećeni i zato potpuno svjesni svoje progresivne nesposobnosti

Kod oko 10 % slucajeva javlja kao nasljedna bolest, dok je većina ALS slučajeva sporadična bez genetskog nasljeđivanja

Točna patogeneza je još uvijek nepoznata

Uzroci bolesti:

oksidativni stres, autoimunost, greška u neurološkom transportu i toksičnost

glutamata, akumulacija neurofilamenata, negenetski faktori (virusi, toksini), disfunkcija mitohondrija i mutacije kod SOD

mogući tretman ne može spriječiti progresiju bolesti i smrt te može produžiti život za samo nekoliko tjedana

120 različitih misens mutacija koja se pojavljuju na oko 45 različitih mjesta koja su povezana s ALS-om

Bolest uzrokovana SOD mutacijama je općenito, ne klinički ili patološki razlučiva od sporadičnih slučajeva ALS-a

Mutacije SOD-a su dominantne, i skoro svi mutanti pokazuju ekspresiju aktivnog SOD proteina

Jako izražena ekspresija mnogih, ali ne svih ALS mutacija u transgeničnim miševima ili štakorima rezultira razvojem bolesti motornih neurona, što podupire ideju o toksičnosti SOD induciranu mutacijama

Bolest očito nije rezultat gubitka SOD aktivnosti čišćenja, zato jer knockout miševi ( kod kojih je inaktiviran ovaj gen) ne razvijaju bolest motornih neurona

Istraživači su pronašli povišenu nitraciju tirozina i kod ALS pacijenata i kod transgeničnih miševa kao dvaju modela obiteljske ALS

Nitracija proteina ima ulogu u ALS patogenezi, direktno inhibirajući funkciju specifičnih proteina i indirektno interferirajući s putevima

Eksperiment:

SOD proteini su očišćeni i pažljivo tretirani kako bi sadržavali 100 % komplementa bakra i cinka

ALS mutanti SOD proteini su se ponašali isto kao i divlji tip Cu,Zn-SOD, reagirajući s peroksinitritom s istom učinkovitošću, i imali su jednaku aktivnost čišćenja za superoksid

Proteini su malo nestabilniji nego divlji tip SOD i često su oskudni cinkom

Kada su SOD proteini napravljeni s nedostatkom cinka, snizila im se aktivnost čišćenja za superoksid i bili su puno učinkovitiji s peroksinitritom kod katalize nitracije tirozina

Bakar iz SOD je imao višu redoks aktivnost i brzo je reagirao s askorbatom i ostalim reducensima niske molekularne mase koje se inače nalaze u stanici

Ova neprirodna redoks aktivnost iscrpljuje antioksidativnu obranu stanice.

Bakrom i cinkom oskudni SOD će biti potpuno reduciran, neprestano reagirajući s kisikom stvarajući superoksid

U prisutnosti NO, cinkom oskudni SOD će proizvoditi peroksinitrit i dovesti do povišene aktivnosti nitracije tirozina

Gubitak cinka prevodi superoksid-dismutazu (SOD) u jak prooksidativni enzim

Gubitak cinka iz «wild tipa» SOD nosi iste funkcionalne posljedice kao i gubitak cinka iz bilo koje od ALS mutiranih SOD

Mutacije povećavaju vjerojatnost da SOD nedostaje esencijalni cink što destabilizira strukturu SOD

Gubitak cinka iz SOD mogao bi biti uključen u patologiju 98% ALS pacijenata koji nemaju mutacije SOD proteina.

Toksičnost svih SOD kojima nedostaje cink može biti inhibirana bakrovim kelatorima ili inhibicijom sinteze NO

Izlaganje motoričkih neurona egzogenom NO nije djelovalo toksično, ali nadilazi zaštitu pruženu od strane NOS inhibitora

SOD kojoj nedostaje cink povećavala je tirozin-nitraciju motoričkih neurona prije indukcije stanične smrti

Cu,Zn ALS-mutirane SOD nisu bile toksične za motorne neurone i pružale su jednaku zaštitu kao i Cu,Zn SOD

Wild tip» SOD motornim neuronima podvrgnutim deprivaciji trofičkog faktora

Gubitak cinka iz SOD objašnjava kako mutacije ovog važnog enzima mogu uzrokovati selektivnu smrt motornih neurona kod ALS

Progresivna, autosomalno dominantna bolest srednje dobi uzrokovana nestabilnom ekspanzijom trinukleotid-poliglutamin-ponavljajućeg slijeda na N-terminalnom kraju proteina na kromosomu 4

Karakterizirana je degeneracijom neurona bazalnih ganglija i kortikalne regije što rezultira motoričkim smetnjama (drhtanje, distonija) te psihičkim smetnjama, demencijom

prevalencija HD je mnogo niža od većine prethodno opisanih neurodegenerativnih poremećaja

terapija HD je većinom simptomatska

Povećanje oksidativnog stresa i prekomjerna produkcija NO doprinose razvoju HD oštećenjem susjednih neurona

Povećanje iNOS ekspresije promatrano je u neuronskim, glialnim i vakularnim stanicama mozga HD pacijenata i mišjih modela

Povećanje 3-NT u tkivu mozga(neuroni, glia, vaskulatura) transgeničnog miša s HD mutacijom, štakora kojima je u striatum injektirana kinolinska kiselina te u HD pacijenata

NOS inhibitori i peroksinitrit smanjili su moždano oštećenje, utjecali su na progresiju bolesti i smanjili su razinu 3-NT u mozgu kod eksperimentalnih modela

Ti su rezultati ukazali su da peroksinitrit bi mogao biti važan

Traumatic brain injury (TBI) karakterizirana je:

oštećenjem aksonalnih i neuronskih stanica

cerebralnim edemom

povećanjem permeabilnosti krvno-moždane barijere

posttraumatskim promjenama u kognitivnoj i neurološkoj funkciji

Jedna je od vodećih uzroka onesposobljenosti i rane smrtnosti sa veoma malim mogućnostima liječenja

TBI može aktivirati brojne patofiziološke procese uključujući:

oslobađanje inflamatornih citokina disregulaciju krvnog moždanog toka oksidativni stres smrt stanica putem apoptoze ili nekroze

Patološka uloga peroksinitrita u TBI potvrđena je istraživanjima na eksperimentalnim miševima i štakorima

Evidentirano je povećanje razina 3-NT u tkivu mozga

Dokazano dobrobitno djelovanje NOS inhibitora i peroksinitrita u redukciji neuronske ozljede te je time omogućen oporavak

Sve do sada navedeno potvrda nam je važne uloge

peroksinitrita/ nitracije proteina u neurodegenerativnim

poremećajima

Ukazuje nam na mogućnost da neutralizacijom ovih

reaktivnih specija možemo postići značajnu terapijsku

dobrobit za pacijente koji boluju od navedenih poremećaja!!