PRESENTA:

APARICIO LÓPEZ EDEN

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA BENITO JUÁREZ DE OAXACA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

ASESORA: DRA. EN C. ITANDEHUI BELEM GALLEGOS VELASCO

OAXACA DE JUÁREZ, OAXACA MARZO 2015

EXPRESIÓN DEL ANTÍGENO T Y GALECTINA 3 EN CÉLULAS MCF-7 ESTIMULADAS CON

LIPOPOLISACÁRIDOS.

PROTOCOLO DE TESIS

ÍNDICE

I. FUNDAMENTO TEÓRICO......................................................................................................4

LINEAS CELULARES DEL CANCER DE MAMA....................................................................4

LINEA CELULAR MCF-7............................................................................................................6

ANTÍGENO T................................................................................................................................7

LECTINAS....................................................................................................................................9

GALECTINAS.............................................................................................................................10

GALECTINA 3............................................................................................................................10

PARTICIPACIÓN DE LA GALECTINA-3 EN EL DESARROLLO DEL CANCER DE MAMA.....................................................................................................................................12

LIPOPOLISACÁRIDOS..............................................................................................................13

II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.................................................................................15

III. JUSTIFICACIÓN.................................................................................................................16

IV. OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN...................................................................................17

V. HIPÓTESIS..............................................................................................................................17

VI. METODOLOGÍA................................................................................................................18

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS A UTILIZAR........................................................18

MUESTRA..................................................................................................................................18

PREPARACIÓN DE LAS CÉLULAS MCF-7............................................................................18

PREPACIÓN DE PLACAS PARA CITOQUÍMICA..................................................................19

TIPO DE ESTUDIO.....................................................................................................................19

VARIABLES...............................................................................................................................20

BIBLIOGRAFÍA.............................................................................................................................21

I. FUNDAMENTO TEÓRICO

1.1 LINEAS CELULARES DEL CANCER DE MAMA

La primera línea celular humana fue creada en un laboratorio de Baltimore, hace más de 50 años por George Gey (1). Esta línea celular llamada HeLa deriva de una dama cuyo nombre era Henrietta Lacks, que tenía carcinoma cervical. La visión de Gey allanó el camino para el cultivo celular tal como la conocemos hoy en día, lo que permite su desarrollo generalizado como una herramienta experimental importante en la investigación del cáncer. Uno de los principales beneficios de usar líneas de células cultivadas en la investigación del cáncer es que ofrecen un suministro infinito de una población de células relativamente homogéneas que son capaces de autorreplicarse en un medio de cultivo celular estándar.

La primera línea celular de cáncer de mama humano (BT-20) fue establecido por Lasfargues y Ozzello en 1958 a partir del cultivo de un pedazo de explante de un tumor de una mujer caucásica de 74 años de edad (2). Estas células son receptor alfa de estrógeno (ER) negativas, receptor de progesterona (PR) negativas, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) positivas, y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) positivas (3).

BT-20 es la línea celular de cáncer de mama más antiguamente establecida, sin embargo, no es la línea más comúnmente utilizada. Por el momento, la línea celular de cáncer de mama más ampliamente utilizado en todo el mundo es la línea celular MCF-7 (4). Fue establecida en 1973 por Soule y sus colegas de la Michigan Cancer Foundation, de donde se deriva su nombre. Las célilas MCF-7 fueron aisladas de la efusión plural de una mujer de 69 años de edad con enfermedad metastásica (5). Desde su creación, MCF7 se ha convertido en el modelo de cáncer de mama positivo para ER (6). El establecimiento de otras líneas celulares ha seguido, incluyendo los de otros tipos de cáncer de mama, como mutante BRCA, triple negativo, que sobreexpresan HER2, y los derivados de las células epiteliales mamarias normales como las células MCF-10A.

La evaluación de las líneas celulares existentes indica que la mayoría de las líneas celulares de cáncer de mama en uso se derivan de cáncer metastásico y no de otros fenotipos de cáncer de mama (7). De hecho, la tasa global de éxito del establecimiento de una línea celular es sólo el 10%.

La mayoría de las líneas celulares que existen en la actualidad se han derivado de derrame pleural en lugar provenir de tumores primarios y son principalmente líneas-ER (revisado en Lacroix y Laclercq, 2004). Esto es sorprendente, ya que cáncer de mama ER negativo sólo

se detectaron en el 20 - 30% de todos los tumores primarios, mientras que los tumores ER + se detectan 55-60%.

LINEA CELULAR

SIGNIFICADO ORGANISMO ORIGEN MORFOLOGIA

MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7

Humano Glandula mamaria

Carcinoma mamario ductal invasivo

MDA-MB-231

M.D. Anderson-metastatic breast

Humano Mama Cáncer

T-47D Ductal tumor Humano Glandula mamaria

Epitelial

MDA-MB-468

M.D. Anderson-metastatic breas

Humano Mama Cancer

MDA.MB-435

M.D. Anderson-metastatic breast

Humano Mama Melanoma o carcinoma (disputado)

SK-BR-3 Sloan-Kettering Humano Mama Epitelial

MA-CLS-2 Cell line service Humano Glandula mamaria

Epitelial

colo.824 Human breast squamoust carcinoma cells

Humano mama Epitelial

Tabla 1.- Lista de líneas celulares más comunes de cáncer de mama

1.2 LINEA CELULAR MCF-7

MCF-7 es una línea celular de cáncer de mama aislado en 1970 de una mujer Caucásica de

69 años de edad con grupo sanguíneo “O” Rh +. MCF-7 es el acrónimo de la Fundación-7

Cáncer de Michigan, en referencia al instituto en Detroit, donde se estableció la línea

celular en 1973 por Herbert Soule y compañeros de trabajo (8).

La paciente, cuyo nombre era Frances Mallon, es desconocido para la gran mayoría de los

investigadores del cáncer, murió en 1970. Sus células son la fuente de gran parte de los

conocimientos actuales sobre el cáncer de mama. En el momento del muestreo, era una

monja en el convento de la Inmaculada corazón de María en Monroe, Michigan, bajo el

nombre de Sor Catalina Frances (9).

Antes de la línea MCF-7, no fue posible para los investigadores del cáncer obtener una

línea de células mamarias que fuera capaz de vivir más de unos pocos meses (10).

Las características de las células MCF-7 son:

- Tumor primario: carcinoma ductal de mama invasivo

- Origen de las células: derrame pleural

- La presencia de receptores de estrógeno, progesterona, andrógeno y glocorticoides.

- Respuesta proliferativa a los estrógenos.

- No presentea amplificación del gen ErbB2 (HER2/neu con sobreexpresión de la

proteína)

- Si presenta tumorigenicidad en ratones, pero sólo con la administración de

suplementos de estrógenos

- Fenotipo: epitelial luminal

Esta línea celular retiene varias características del epitelio mamario diferenciado,

incluyendo la capacidad para procesar el estradiol a través de los receptores de estrógeno

citoplasmáticos y la capacidad de formación de cúpulas.

El cultivo de líneas celulares de cáncer de mama humano exhiben vástago propiedades

funcionales similares a las células tales como la división simétrica y auto-renovación y una

variedad de propiedades fenotípicas, tales como HER2, CD49f, proteína fosfatasa y

homólogo de tensina - PTEN, EpCAM, mucina 1 ( MUC1), CD44 + / CD24-, y aldehído

deshidrogenasa 1 - ALDH1, entre otros.

ANTÍGENO T

Los oligosacáridos son cadenas cortas de monosacáridos unidos entre sí por medio de

enlaces glicosídicos, los cuales se encuentran formando parte de glicoproteínas y

glicolípidos, presentes en la parte externa de las membranas celulares, donde intervienen en

funciones como anclaje a la membrana basal, tráfico de proteínas, interacciones de ligandos

con sus receptores, relación huésped-parasito.

Las cadenas oligosacarídicas están constituidas por tres regiones principales:

a) el núcleo o core, es la región en donde se encuentran los carbohidratos más cercanos al

sitio de unión con la cadena polipeptídica, b) el esqueleto, que es la región en donde se

determina la longitud del oligosacarído y c) la región periférica, donde se encuentran

antígenos de importancia biológica, como por ejemplo los antigenos de los grupos

sanguíneos.

Las glicoproteínas se clasifican de acuerdo a la unión entre el azúcar y el aminoácido, en N-

y O-glicanos, si la unión es con el nitrógeno (N) del aminoácido asparagina (Asn) o con el

oxígeno (O) de la serina (Ser) o de la treonina (Thr) respectivamente.

Los N-glicanos, que generalmente presentan un residuo de N-acetil-Dglucosamina

(GlcNAc) unida al nitrógeno de la Asn, se clasifican en tres grandes grupos: a) con un alto

contenido de manosa (Man) en su estructura, b) las estructuras del tipo lactosamínico, las

cuales tienen como característica principal, la presencia de Galβ(1-4)GlcNAc y c) las

estructuras híbridas, las cuales contienen una mezcla de las estructuras lactosamínicas y de

manosas. Sin embargo, hasta el momento no se han encontrados Nglicanos asociados al

desarrollo de cáncer de mama.

Por otro lado, los Oglicanos poseen una N-acetil-Dgalactosamina (GalNAc) unida al

hidroxilo de la Ser o de la Thr de la cadena polipeptídica y presentan mayor variedad de

estructuras que los Nglicanos, ya que se han descrito ocho diferentes núcleos (core) de los

cuales se derivan el resto de estructuras oligosacarídicas presentes en las glicoproteínas. Por

su gran complejidad y diversidad, los O-glicanos se encuentran participando en funciones

tan diversas como en la conformación de la estructura secundaria, terciaria e inclusive de la

cuaternaria de algunas proteínas, como en el caso de las mucinas y también participan

evitando la agregación de las proteínas (11).

Como consecuencia de la transformación maligna (cáncer) ocurren cambios muy

importantes en la glicosilación, sobre todo en la etapa de elongación de los O-glicanos. Esto

determina que algunos tipos de núcleos (cores), que en las células normales se encuentran

enmascarados por la adición de otros azúcares, queden expuestos en la superficie celular,

resultando en la formación de nuevos antígenos asociados al cáncer. Los antígenos mejor

caracterizados en el cáncer de mama son los antígenos Tn,[GalNAc(α1-O-)Ser/Thr], sialil-

Tn[NeuA(α2-6)GalNAc(α1-O-)Ser/Thr], T o TF [Gal(β1-3)GalNAc(α1-O-)Ser/Thr] y

sialil-T [NeuA(α2-6)Neu(α2-3) Gal(β1-3)GalNAc(α1-O-)Ser/Thr] (12). La

expresión de estos antígenos es el resultado de una glicosilación incompleta, lo que origina

que las cadenas de oligosacáridos de las proteínas se acorten, exponiendo carbohidratos que

normalmente se encuentran enmascarados por la adición de otros azúcares, quedando

expuestos en la superficie celular y originan nuevos antígenos. La expresión de estos

antígenos suele ser discontinua a lo largo de la cadena polipeptídica. El antígeno Tn es el

precursor del antígeno T o TF que se forma por la acción de una β galactosil transferasa, la

cual puede estar bloqueada y provocar una sialilación temprana del antígeno Tn, (13), que

normalmente se encuentra sustituido con galactosa (Gal) o N-acetilglucosamina (GlcNAc),

lo que permite la formación del esqueleto del oligosacárido y finalmente su terminación

con la adición del ácido siálico (NeuA). La expresión del antígeno sialil-Tn se ha asociado

con diferentes carcinomas, como el adenocarcinoma gástrico difuso, los cánceres de

pulmón, cervico-uterino y de hígado (14). Al antígeno Tn también se le puede adicionar

Nacetilglucosamina (GlcNAc) formando los núcleos 3, 4 y 6 y Nacetilgalactosamina

(GalNAc) formando los núcleos 5, 7 y 8. La expresión de estos "cores", no se ha

relacionado con cáncer de mama.

El antígeno Sialil Lewis es un pentasacárido, que se expresa en células del sistema inmune,

que participan en procesos inflamatorios, siendo su receptor en las células endoteliales la E-

selectina. La expresión de antígenos del tipo Sialil-Lewis, se ha asociado con la capacidad

de las células transformadas para invadir otros tejidos y evadir al sistema inmune.

Estos O-glicanos algunas veces están unidos a glicoproteínas que pueden ser expresadas en

las membranas celulares, lo que permitiría la búsqueda de nuevos marcadores glicosilados

para la detección del cáncer de mama desde sus fases iniciales, en donde los métodos

histológicos no logran diferenciar la morfología celular.

LECTINAS

El término lectina se aplica a proteínas o glicoproteínas de origen no inmune que

reconocen de manera específica carbohidratos de la superficie celular o en suspensión,

aglutinan células y precipitan glicoconjugados; las lectinas poseen por los menos dos sitios

de reconocimiento a carbohidrato, de ahí su capacidad para aglutinar células, aunque en la

actualidad el término de lectina se ha aplicado a proteínas con un solo sitio de

reconocimiento a carbohidrato como es el caso de las selectinas. Las lectinas no poseen

actividad enzimática y no son producto de una respuesta inmune. Estas proteínas se

encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza y han sido identificadas en diversos

organismos como virus, bacterias, hongos, plantas, así como en vertebrados superiores.

Debido a la capacidad de estas proteínas para interactuar con células de la respuesta

inmune, algunas lectinas poseen efectos inmunosupresores, otras también son tóxicas,

inhiben el crecimiento de células tumorales y participan en la adhesión celular.

Todas las actividades biológicas reportadas para las lectinas tienen en común el

reconocimiento de un receptor oligosacarídico (15).

Actualmente se han empleado lectinas para investigar el desarrollo de cáncer, como por

ejemplo por medio de histoquímica, se ha demostrado que la lectina de Vicia villosa

(VVA), (16) y la lectina de Helix pomatia (HPA) (17), ambas con especificidad hacia

GalNAc, han sido utilizadas como factor pronóstico en el cáncer de mama. La lectina de

Arachis hypogeae (PNA), específica para el antígeno TF, ha demostrado servir como

marcador pronósticos en el cáncer de mama (18), la lectina de Amaranthus leucocarpus

(ALL), específica para los antígenos Tn y TF, se ha empleado en el estudio del cáncer

cervicouterino y en fibroadenoma (19, 20 ). En los tejidos animales, se han aislado lectinas

que son receptores potenciales de las estructuras oligosacaridicas, expresadas en las células

y que pueden tener participación en diversos fenómenos biológicos, un ejemplo de estas

lectinas, son las galectinas.

GALECTINAS

Es una familia de proteínas extremadamente conservadas a través de la evolución; que

participan en diversos eventos biológicos. Son capaces de descifrar glicocódigos

específicos en macromoléculas complejas situadas en las membranas celulares o en la

matriz extracelular 21, 22), a través de un dominio de 130 aminoácidos filogenéticamente

conservado desde invertebrados inferiores a mamíferos, denominado dominio de

reconocimiento de carbohidratos (DRC), con el cual reconocen β-galactósidos. Su amplia

distribución en la naturaleza y sus secuencias aminoacídicas conservadas a través de la

evolución, sugieren que estas proteínas podrían cumplir papeles fisiológicos esenciales,

estas proteínas han sido involucradas en fenómenos de inmunomodulación, adhesión

celular, regulación del crecimiento, metástasis (23) y proliferación (24). Se ha observado

que estas proteínas de unión a carbohidratos ejercen sus efectos biológicos a través del

reconocimiento de azúcares específicos en ligandos intracelulares, receptores de membrana

y glicoproteínas extracelulares. La ejecución de sus funciones varía en forma considerable

de acuerdo a su localización subcelular.

Las galectinas pueden tener efectos contrarios, así por ejemplo mientras que la galectina-1

inhibe la desgranulación de mastocitos y la migración de los leucocitos, la galectina-3

promueve la migración de los mastocitos y migración leucocitaria. La familia de las

galectinas, pueden ser clasificadas en tres grupos: aquellas que tienen un dominio de

reconocimiento de carbohidratos (DRC) y son las galectinas -1,-2, -5, -7, -10, -11, -13, -14

y -15, las que tienen dos DRC, uno encima de otro, y se unen por un fragmento peptídico

de 70 aminoácidos y corresponden a las galectinas -4, -6, -8, -9 y -12 y las de tipo

quimérico que tienen un dominio proteico amino terminal con secuencias repetitivas de

glicina y prolina como la galectina-3.

GALECTINA 3

Hallada en el núcleo de los fibroblastos 3T3 de ratón en 1986, utilizando

inmunofluorescencia, descrita en un principio como PFC-35, posteriormente llamada

también CBP-35 proteína ligante de carbohidratos 35, Mac-2, IgEBP proteína ligante de Ig

E, CBP-30, RL-29, L-29, L-31. L-31, L-34 Y LBL.

La galectina-3 es una proteína de 26 kDa, cuyo gen que la sintetiza se encuentra en el

cromosoma 14q21.3 (25). Funciona como un receptor para ligandos que contienen poli-

Nacetil-galactosamina. Normalmente se encuentra en el epitelio de diferentes órganos y en

células de respuesta inflamatoria como los macrófagos, células dendríticas y de Kupffer. La

galectina-3 tiene funciones tanto intracelulares como extracelulares.

En relación con sus funciones intracelulares se le ha identificado como un componente de

ribocucleoproteínas heterogéneas y como un factor en el empalme del RNA mensajero. Así

mismo, participa en el control del ciclo celular y reduce la apoptosis de las células T

probablemente a través de la interacción con miembros de la familia del Bcl-2. La

galectina-3 se secreta por monocitos, macrófagos y células epiteliales. Como molécula

extracelular activa a monocitos, macrófagos, mastocitos, neutrófilos y linfocitos e

interviene en las interacciones entre célula y célula, así como entre célula y matriz

extracelular. Promueve el crecimiento de las neuritas, induce la diferenciación y

angiogénesis de las células endoteliales y funciona como una sustancia quimio atrayente de

los monocitos y células endoteliales. La galectina-3, se sintetiza en el citoplasma y

habitualmente se localizada en el núcleo, en el líquido extracelular y en la superficie

celular, donde la enriquecen y se acoplan a glicoconjugados de la membrana plasmática y

de la matriz extracelular aunque también ejercen interacciones homo- y heterotipicas con

otras lectinas multivalentes (26). La localización intracelular de la galectina-3 juega un

papel importante en la protección contra apoptosis, la regulación de la expresión génica

ciclina D1 (27) y la regulación del corte y empalme o “splicing”, siendo este un proceso de

eliminación de los intrones del transcrito primario y la posterior unión de los exones en el

pre-RNA nuclear. Por otra parte, su localización en la superficie celular y en el medio

extracelular indica su participación en la interacción célula-célula, adhesión celular,

proliferación, angiogénesis, crecimiento celular.

PARTICIPACIÓN DE LA GALECTINA-3 EN EL DESARROLLO DEL CANCER

DE MAMA

El papel de la galectina-3 en el desarrollo de cáncer se debe, a su participación en varios

mecanismos, como por ejemplo: adhesión célula-célula, interacción matriz extracelular-

célula, apoptosis y angiogénesis (30). Existe evidencia que la expresión de la galectina-3 es

necesaria para el inicio de la transformación celular, en el desarrollo del tumor (29). El

mecanismo por el cual la galectina-3 participa en la trasformación celular, no ha sido

esclarecido con certeza, pero puede estar relacionado con su habilidad para interactuar con

K-RAS y facilitar la transducción de la señal hacia RAF y fosfatidilinositol 3 cinasa. La

galectina-3 también puede estimular la producción de ciclina D y c-MYC. Estudios en

líneas celulares de carcinoma mamario han demostrado que después de inhibir la expresión

de la galectina-3, pierden su fenotipo característico en el medio de cultivo celular (30)

La función más estudiada de la galectina-3, se relaciona con la inhibición de la apoptosis

(33). El mecanismo por el cual la galectina-3 lleva a cabo esta función, no ha sido

esclarecido, pero se cree que después de un estímulo apoptótico, la galectina-3 puede

traslocar del citosol o núcleo hacia la mitocondria, donde bloquea cambios en el potencial

de membrana de la mitocondria, previniendo la apoptosis, sin embargo, la galectina-3

presente en el núcleo debe ser fosforilada, para poder emigrar del núcleo, así mismo la

galectina-3, regula la vía de la proteína cinasa activada por nitrógeno (MAKP), implicada

en la regulación de la apoptosis.

El papel de la galectina-3 en el desarrollo del cáncer de mama no es muy claro, sin

embargo, en estudios in vitro (34) se determinó que el bloqueo de la expresión de galectina-

3 en el núcleo y el citoplasma de la línea celular cancerígena de alta malignidad MDA-MB-

435 inyectada a ratones desnudos suprimía el crecimiento de tumores, sugiriendo que la

expresión de galectina-3 es necesaria para la tumoregenidad en el cáncer de mama MDA-

MB-435. Más tarde, (33) se proporcionó evidencia en la cual la galectina-3 promovía el

potencial metastásico en las células de cáncer de mama BT549 quedando sobre entendido

que la sobre expresión otorga esta propiedad. Mayoral et al., analizaron diferentes tejidos

glandulares de autopsias (34) sometidas a inmunohistoquímica con anticuerpos anti-

galectina-3, encontrando que no existe reacción hacia galectina-3 en el tejido normal de

mama en contraste con la fuerte inmunorreactividad hacia galectina-3 en el cáncer de mama

metastásico al cerebro. En estos tejidos se observó la inmunorreactividad ante la galectina-3

tanto intracelular como extracelular se reporta una baja reactivad hacia galectina-3 en el

cáncer metastásico hacia el cerebro de origen mamario comparado con la reacción en el

tejido de cáncer de mama. Estudios preliminares demuestran que la expresión de antígeno

T, no varía según el estadio del cáncer de mama, mientras que la galectina-3 varía según el

grado de diferenciación del cáncer ductal infiltrante. Estudios recientes han correlacionado

la presencia del antígeno TF y de la galectina-3 en la adhesion de las células transformadas

al endotelio, promoviendo su migración los ganglios localizados en las axilas (35).

LIPOPOLISACÁRIDOS

Todas las células poseen una membrana citoplasmática compuesta de una bicapa de

fosfolípidos que limitan el interior celular. Adicionalmente a esta “frontera”, un grupo de

bacterias denominadas Gram negativas, evolucionaron desarrollando una segunda

membrana exterior a la citoplasmática. Esta membrana externa tiene una configuración

asimétrica: la cara interna está compuesta de fosfolípidos, mientras que la externa está

compuesta mayoritariamente de unas moléculas únicas en la naturaleza denominadas

lipopolisacáridos (LPS).

Los LPS son glucolípidos anfipáticos complejos. Estructuralmente pueden dividirse en tres

dominios: lípido A, oligosacárido núcleo (ON), y antígeno O. El lípido A está constituido

de un disacárido al que están unidos ácidos grasos, los cuáles anclan las moléculas de LPS

a la membrana externa. Una cadena corta de monosacáridos unida al lípido A constituye el

ON. El antígeno O es un polisacárido constituido por unidades de monosacáridos u

oligosacáridos repetidos muy variables, está unido al ON y es el dominio distal de la

molécula de LPS (36).

Los lipopolisacáridos (LPS) están localizados en la membrana externa de la envoltura

celular bacteriana y juegan un papel muy importante en la patogénesis de las infecciones

bacterianas, así como en la interacción con el hospedero y su sistema de defensa.

El LPS es a menudo llamado endotoxina. Este término fue introducido en el siglo XIX para

describir el componente bacteriano responsable de los fenómenos patofisiológicos

asociados con las infecciones por Gramnegativos. El lípido A posee la actividad endotóxica

del LPS, como ha sido demostrado usando lípido A obtenido sintéticamente. Dentro de las

actividades biológicas más relevantes están la potente activación de macrófagos y la

producción de gran cantidad de citoquinas y otros mediadores con múltiples efectos en

diferentes órganos (37).

El mecanismo de acción de las endotoxinas es complejo; en humanos, los LPS se unen a la

proteína unificadora de los lípidos que se encuentran en el suero transfiriendo a la proteína

al CD14 de la superficie de la membrana celular. Estos a su vez lo transfieren a la proteína

MD2, la cual se asocia al “Toll-like receptor-4” (TLT4), provocando que la cascada de

células macrófagas y endoteliales secreten citoquinas pro inflamatorias y óxido nítrico lo

que produce el shock endotóxico. Las proteínas CD14 y TLR4 se encuentran presentes en

varias células del sistema inmunológico incluyendo los macrófagos y células dendríticas.

En los monocitos y macrófagos ocurren tres eventos durante su interacción con los LPS:

1.- Producción de citoquinas incluyendo IL-1, IL-6, IL-8, factor de tumor necrótico (TNF,

por sus siglas en inglés) y el factor de activación de plaquetas. Estos a su vez estimulan la

producción de prostaglandinas y leucotrienos los cuales son poderosos mediadores de

inflamación y shock séptico.

Los lipopolisacáridos (LPS), activan los macrófagos para promover la fagocitosis y la

citotoxicidad. Los macrófagos son estimulados para producir y liberar enzimas lisosomales,

IL- 1 (pirógeno endógeno) y TNF, así como otras citoquinas y mediadores de inflamación.

2. Activación de la cascada de complemento en la que el C3a y C5a causan la liberación de

histamina provocando la vasodilatación y afectando la quimotaxis de los neutrófilos y su

acumulación en el órgano afectado causando inflamación.

3. Activación de la cascada de coagulación donde el factor Hageman o factor de

coagulación XII puede activar varios sistemas humorales que resultan en:

a) Coagulación, trombosis, coagulación intravascular diseminada aguda (ADIC, por sus

siglas en inglés), disminución de plaquetas y varios factores de coagulación, lo que provoca

sangrado interno.

b) Activación de la ruta alterna de complemento provocando inflamación

c) Activación de plasmina causando fibrinólisis y hemorragias

d) Activación de quinina liberando péptidos vasoactivos que causan hipotensión

El efecto neto de este proceso es la inducción de inflamación, coagulación intravascular,

hemorragia y shock. Los LPS también pueden actuar como células B mitógenas,

estimulando la diferenciación policlonal, la multiplicación de las células B y la secreción de

inmunoglobulinas, específicamente IgG e IgM (38).

Figura 1.- Representación esquemática molecular de la estructura del lipopolisacárido.

II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

¿Qué cambios habrá en la expresión del antígeno T y galectina 3 en células MCF-7

estimuladas con lipopolisacáridos (LPS) a 1, 3 y 5 horas, con respecto a las células no

estimuladas?

III. JUSTIFICACIÓN

El cáncer de mama es la neoplasia más frecuente en las mujeres a nivel mundial, aunque

puede presentarse en hombres, la proporción es de 1 caso por 150 mujeres.

La línea celular MCF-7 se utiliza en esta investigación debido a que presenta varios

receptores, entre ellos los de progesterona y estrógeno, que permiten realizar diversos

experimentos con esta población celular. Cabe resaltar que las pruebas en pacientes no se

realizan por cuestiones éticas.

Este trabajo nos permitirá conocer el efecto que tendrá una infección sobre una persona que

desarrolle cáncer de mama o el efecto de una infección bacteriana durante un tratamiento

quimioterapéutico en un paciente con esta neoplasia, mediante el estudio de la expresión

del antígeno-t y galectina-3.

Los lipopolisacáridos (LPS), principales componentes de la pared de bacterias Gram-

negativas, producen la liberación de diversas citoquinas proinflamatorias en algunas células

del sistema inmune del huésped, Estas citoquinas actúan como mediadores ante diversas

agresiones llevando a desórdenes inmunopatológicos cuando son secretados en exceso. El

LPS representa uno de los más potentes inductores de TNF, y en altas concentraciones

causa lesión tisular, coagulación vascular diseminada y shock séptico, llevando incluso a la

muerte. Es por ello que se utilizarán el LPS para la estimulación de células MCF-7 y con

esto aportar nuevos conocimientos de la acción de esta potente endotoxina sobre las células

y además contribuir al conocimiento de los posibles mecanismos moleculares que

desencadenan el cáncer de mama.

Además, éste trabajo contribuye a la ampliación de los conocimientos en el apartado de la

glicobiología tumoral.

IV. OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN

GENERAL

Analizar la expresión de galectina-3 y antígeno T en células MCF-7 estimuladas con

lipopolisacáridos, para comparar su expresión con otro tipo de estímulo.

ESPECÍFICOS

- Identificar el patrón de expresión de galectina-3 y antígeno T en células MCF-7

estimuladas con LPS y no estimuladas, mediante el empleo de las lectinas:

Artocarpus intergrifolia, Amarantus leucocarpus, Penaut aglutinin,

- Conocer la expresión de galectina 3 y antígeno T mediante el empleo de las técnicas

de Inmunofluorescencia y citometría de flujo.

V. HIPÓTESIS

HIPÓTESIS ALTERNATIVA

Hay cambios en la cantidad de la expresión del antígeno T y galectina 3 en las células

MCF-7 cuando son estimuladas con lipopolisacáridos, con respecto a las células no

estimuladas.

HIPÓTESIS NULANo hay cambios en la cantidad de la expresión del antígeno T y galectina 3 en las células

MCF-7 cuando son estimuladas con lipopolisacáridos, con respecto a las células no

estimuladas.

VI. METODOLOGÍA

Materiales, reactivos y equipos a utilizar

- Campana de flujo laminar

- Incubadora con suministro de CO2

- Cronómetro

- Pipetas

- Puntas para pipetas

- Botellas con células MCF-7

- Placas de 16 pozos

- Medio DMEN con Suero Fetal Bovino

- Medio DMEN sin Suero Fetal Bovino

- Lipopolisacáridos [20ng/ml]

- Verseno

- Tripsina

MUESTRALas células MCF-7 que se utilizaron se obtuvieron del Centro de Investigación Facultad de Medicina UNAM-UABJO, las cuales se encuentran sembradas en botellas de 75 cm3 en el medio DMEN adicionado con glutamina y Suero Fetal Bovino al 10%.

PREPARACIÓN DE LAS CÉLULAS MCF-7

Se realiza el proceso de rasurado de las células MCF-7 (siempre y cuando las células presenten confluencia), las cuales se encuentran dentro de las botellas de cultivo; primeramente se saca el medio, posteriormente se le añade a la botella verseno 2 veces dejándolo actuar por un momento y después se le añade tripsina, se mezcla suavemente para lograr el desprendimiento de las células, posteriormente se incuba por 10 minutos.

Después del proceso de incubación se recupera el contenido de la botella donde se encuentran las células MCF-7, pasándolo a un tubo Corning: en seguida se le añade medio con suero fetal bovino a la botella y se guarda en la incubadora con suministro de CO2.

El tubo Corning se centrifuga a 2,000 r.p.m. por 2 minutos, luego se decanta el tubo y se recuperan el sedimento (células MCF-7), al cual se le agrega medio con SFB.

PREPACIÓN DE PLACAS PARA CITOQUÍMICA

Las células MCF-7 se siembran en placas de 12 pozos de fondo plano con la ayuda de una pipeta, encontrándose aproximadamente 200,000 células/pozo, en seguida se añade 1 ml del medio DMEN AL 10% a cada pozo. Se incuba la placa por 24 horas para que las células se peguen.

Deprivado celular. Cumplido ese lapso de tiempo, se le quita el medio con SFB que contienen los pozos, en seguida se lavan con PBS y se les agrega medio DMEN sin SFB, finalmente se guarda la placa. Este procedimiento se realiza de igual manera por 24 horas.

Estimulación, Una vez trascurridas las 24 horas, se le quita el medio DMEN sin SFB y se añade el estímulo que es lipopolisacárido a una concentración de 20 ng/ml, este proceso se realiza a 1, 3 y 5 horas por cada fila, además se deja una fila sin estimulación que son los pozos basales.

Después se fijan con p-formaldehído y se marcan con las lectinas y posteriormente se observan en el microscopio de fluorescencia.

TIPO DE ESTUDIO

Experimental y trasversal

VARIABLES

Id Variable Definicion operacional

Escala Codificación Tipo

TIEMPO Tiempo de estimulación de las céiulas MCF-7

Discretas Valor entero positivo

Explicativa

EXPRESIÓN

ANTÍGENO T

Expresión del antígeno con respecto al tiempo de estimulación (IF y citometría de flujo)

-Cualitativas ordinales

-Numericas

Discretas

Presencia-ausencia

Valor entero positivo

Respuesta

EXPRESIÓN GALECTINA 3

Expresión de la galectina con respecto al tiempo (IF y citometría de flujo)

-Cualitativas ordinales

-Numericas

Discretas

Presencia-ausencia

Valor entero positivo

Respuesta

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La glicosilación en el cáncer sufre cambios, sobre todo en los glicanos. Por lo que no hay todavía una justificación

algunos núcleos se encuentran enmascarados con la adición de otros azucares y una vez expuestos a la superficie, se forman nuevos antígenos que se asocian al cáncer como es el caso del cáncer de mama.

Por lo cual en este tema nos permitirá conocer cómo interactúan las células del cáncer de mama en relación a una persona que tiene ésta enfermedad y que además presenta una infección de tipo bacteriana, como también qué relación hay en cuanto a la expresión del ácido siálico.