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Beobachtung der Apoptose von Saccharomyces Cerevisiae durch FACS-Methode mit DHE- und TUNEL-FrbungNovak Elisabeth MatrNr:0831017 , Rei Heidemarie MatrNr:0830345 , und Hofer Ines MatrNr:0830393Im Rahmen der Lehrveranstaltung EDV - Basiswissen an der Technischen Universitt Graz

www.tugraz.at

In diesem Paper werden die Methoden der TUNEL- und DHE - Methode im Bezug auf den programmierten Zelltod vorgestellt.Weiters werden experimentelle Daten theoretisch und graphisch ausgewertet und die Ergebnisse anschlieend interpretiert. Es wird ein Grenzwert bestimmt und die prozentuelle Aufteilung von toten und lebenden Zellen aufgelistet. Im letzten Abschnitt des Papers werden die Analyseergebnisse in Form von Diagrammen dargestellt und die Bilder der Mikroskopierergebnisse mit den FACS - Analysen verglichen.

Im Laufe dieses Experiments wurde Bckerhefe (Saccharomyces Cerevisiae) angezchtet und mittels verschiedener mikroskopischer Methoden untersucht. Dadurch wurde in einer Zeitspanne von 5 Tagen die Zellalterung und der programmierter Zelltod (Apoptose) beobachtet.MethodenBei der Methode der Durchflusszytometrie (FACS)-Analyse werden markierte Zellen in eine Suspension eingebracht, durch ein dnnes Rohr geleitet und dabei von mehreren Lasern belichtet. Die Auftrennung der Fluoreszenzsignale erfolgt auf verschiedene Detektoren, wodurch die Intensitt der abgegebenen Fluoreszenz gemessen wird. Diese Intensitt wird von einem Computer aufgezeichnet. Die Einteilung, ab wann eine Zelle tot ist kann frei entschieden werden. Auerdem werden unterschiedliche fluoreszierende Farbstoffe eingesetzt. Ein Beispiel fr diese Frbungen sind DHE und TUNEL-Methoden. DHE (Dihydroethidium) ist eine Frbung mit der man reaktive Sauerstoffspezien (z.B.:H2O2) nachweisen kann und somit bestimmen kann ob die Zelle Zellstress hat. Im Fluoreszenzmikroskop erscheinen DHE-positive Zellen rot fluoreszierend. Die TUNEL-Methode ist ein Frbevorgang, den man verwendet um die DNA-Fragmentierung im Zellkern nachzuweisen. Dabei werden DNA-Fragmente durch das Enzym TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) mit fluoreszierenden Nukleotiden markiert. TUNEL-positive Zellen erscheinen grn fluoreszierend. Sie stellen den Anteil der apoptotischen (sterbenden) Zellen dar, die aktiv Selbstmord begehen.ErgebnisseMit den von diesen Methoden erhaltenen Daten wurden vier Histogramme im Excel erstellt: Zwei fr DHE und zwei fr TUNEL, jeweils von Tag 1 und Tag 5 der Versuche. In den Histogrammen von DHE d1 und DHE d5, (siehe Abbildung 1 (DHE d1) und Abbildung 2 (DHE d5)) wurde e7,1 als Grenzwert ausgewhlt, daraus ergab sich, dass am ersten Tag 916 und am fnften Tag 8691 Zellen Zellstress aufweisen. In den Histogrammen von TUNEL d1 und TUNEL d5 (siehe Abbildung 3 (TUNEL d1) und Abbildung 4 (TUNEL d5)) wurde e5,9 als Grenzwert gewhlt, somit wiesen am ersten Tag 2414 und am fnften Tag 8482 Zellen DNA-Fragmentierung auf. Auerdem wurde im Excel eine Signifikanzprfung (TTEST) durchgefhrt, welche Aussage auf einen mglichen Zusammenhang zwischen den Messgren des DHE am Tag 1 und des TUNEL am Tag 1 hinweist. Der Signifikanztest von DHE d1 gegen TUNEL d1 ergab 0,0141. Zustzlich wurden fr Tag 1 und Tag 5 beider Methoden der Mittelwert und der Median ermittelt.

DiskussionAus den berechneten Median kann man erkennen, dass bei TUNEL d1 mehr Extremwerte auerhalb des Grenzwertes liegen und bei DHE d1 weniger. Daher ist der Wert der prozentuellen Verteilung der toten Zellen bei TUNEL d1 grer als bei DHE d1. Aus der Ermittlung der beiden Grenzwerte von DHE und TUNEL kann man folgendes schlieen: Bei DHE d1 und bei DHE d5 kann man ab dem Grenzwert von e7,1 (~1200) das Vorkommen von reaktiven Sauerstoffspezien, und somit Zellstress annehmen. Am ersten Tag sind 3,5% der Zellen tot, am fnften Tag liegt der Prozentsatz von toten Zellen bei 33,4%. Bei TUNEL d1 und TUNEL d5 kann man ab dem Grenzwert von e5,9 (~400) annehmen, dass in dieser Population DNA-Fragmentierung vorliegt. Das bedeutet, dass am ersten Tag 9,2% und am fnften Tag 32,6% der Zellen tot sind.Das Ergebnis des TTests zwischen DHE d1 und TUNEL d1 ergab eine Signifikanz unter 0,05, was bedeutet, dass es zwischen den beiden Stichproben keinen wesentlichen Unterschied zu verzeichnen gibt.Bei Vergleich der DHE-Mikroskopie (siehe Abbildung 5 (DHE d1)) und TUNEL-Mikroskopie (siehe Abbildung 7 (TUNEL d1)) kommt man zu dem Schluss, dass die Resultate nur bedingt vergleichbar sind. Der Grund dafr ist, dass bei der DHE-Methode eine Unterscheidung zwischen nekrotischen und apoptotischen Zelluntergngen nur teilweise mglich ist. Im Gegensatz dazu, kann man bei der TUNEL-Methode auf sichere Apoptose schlieen, da DNA-Fragmentierung vorliegt. Bei Vergleich der prozentuellen Ergebnisse der toten Zellen bei DHE und TUNEL-Methode kann man vermuten, dass bei DHE d5 auch nekrotische Zellen einbezogen wurden. Bei Vergleich der Mikroskopiebilder und der FACS-Analyse, kann man erkennen, dass wie bei den Mikroskopiebildern auch bei den Histogrammen die Anzahl der Toten Zellen bis Tag 5 stark zunimmt. ZusammenfassungDas Paper handelt von verschiedenen Methoden zur Feststellung von Apoptose bei Backhefe (Saccharomyces Cerevisiae) und den Ergebnissen der Experimente. Es wurden Histogramme erstellt und Mikroskopiebilder bearbeitet um die Ergebnisse zu veranschaulichen. Danach wurden die Ergebnisse miteinander verglichen um eine mglichst aussagekrftige Theorie zu entwickeln. Schlielich kommt man zu dem Ergebnis, dass am Tag 5 der Experimente bei der DHE-Methode 33,4% der Zellen tot sind und bei der TUNEL-Methode 32,6% und, dass somit die DHE-Methode ungenauer ist, da bei dieser Methode auch Zellen, welche nur Zellstress aufweisen, aber noch leben, in die Berechnung einbezogen werden.Referenzen

1. www.wikipedia.at2. www.google.at

3. Technische Universitt Graz

Abbildung 1 (DHE d1)

Abbildung 2 (DHE d5)

Abbildung 3 (TUNEL d1)

Abbildung 4 (TUNEL d5)

Abbildung 5 (DHE d1)

Abbildung 6 (DHE d5)

Abbildung 7 (TUNEL d1)

Abbildung 8 (TUNEL d5)PAGE 1