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中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（３）：８９～９４

蚯蚓体内一组脱氧核糖核酸酶的酶学性质研究

刘志贞１　樊慧杰１　康慧芳１　姚建强１　杨利军１　牛　勃１，２（１山西医科大学基础医学院　太原 ０３０００１　２首都儿科研究所　北京１０００２０）

摘要　目的：研究一组新型蚯蚓脱氧核糖核酸酶（ｅａｒｔｈｗｏｒｍｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＥＷＤｓ）的主要生化性质。方法：采用ＳＤＳＰＡＧＥ、ＭＡＬＤＩＴＯＦ、紫外分光光度方法。结果：确定了ＥＷＤ１，ＥＷＤ２、ＥＷＤ３（总称为：ＥＷＤｓ）的分子量分别为１５７．２ｋＤａ，６９．１ｋＤａ和６３．５ｋＤａ。３７℃，ｐＨ４．６以小牛胸腺ＤＮＡ为底物时，ＥＷＤｓ的Ｋｍ值分别为１．５８ｍｇ／ｍｌ，３．９５ｍｇ／ｍｌ，１．５２ｍｇ／ｍｌ；Ｖｍａｘ分别为５．３６ｍｇ／（ｍｌ·ｍｉｎ），２．８７ｍｇ／（ｍｌ·ｍｉｎ），４．８９ｍｇ／（ｍｌ·ｍｉｎ）。ＥＷＤｓ在５５℃保温１０ｍｉｎ，酶活性完全丧失，在４０℃以下酶活性都比较稳定。这３种脱氧核糖核酸酶最适ｐＨ值分别是５．２，４．４，４．８，酸性条件下较稳定。Ｍｎ２＋，Ｃａ２＋是蚯蚓组织脱氧核糖核酸酶ＥＷＤ１，ＥＷＤ２，ＥＷＤ３的抑制剂，Ｍｇ

２＋对ＥＷＤ３有较明显的抑制作用。结论：蚯蚓组织中发现的脱氧核糖核酸酶ＥＷＤｓ具有独特的酶学特征，不同于已经发现的ＤＮａｓｅⅠ和ＤＮａｓｅⅡ，是种新型的脱氧核糖核酸酶，但其作用机理和分类有待于进一步的研究和归类。

关键词　蚯蚓脱氧核糖核酸酶　分子量　酶学性质中图分类号　Ｑ８１９

收稿日期：２００７０８１５　　修回日期：２００７１０１２ 国家自然科学基金（３０４７２２５１），山西省青年科技研究基金（２００５１０４４），资助项目通讯作者，电子信箱：ｎｉｕｂ２００４＠１２６．ｃｏｍ

　　蚯蚓，又名地龙，无脊椎动物，环节动物门，寡毛

纲。我国医学对地龙的药用记载与研究已有４０００余

年的历史。随着对蚯蚓药用价值及药用活性成分的深

入研究，发现蚯蚓体内含有丰富的药用蛋白质活性成分。

国内外发现并分离纯化出多种蚯蚓组织有效成分，主要

有蚯蚓溶栓酶、蚓激酶、胆碱酯酶、过氧化氢酶等［１］。

　　我们从蚯蚓组织中分离得到一组能杀灭病毒的具

有核酸酶活性的成分，其可降解各种来源的核酸物质，

推测是通过降解病毒的遗传物质来达到抗病毒作用。

通过进一步的分离纯化，我们得到了３种脱氧核糖核

酸酶，命名为ＥＷＤｓ（ＥＷＤ１，ＥＷＤ２，ＥＷＤ３）。本文主要

研究这３种蚯蚓脱氧核糖核酸酶的特征性常数及影响

酶活性的因素等，为进一步研究开发提供实验依据。

１　材料与方法

１．１　材料与试剂

　　实验样品：３种蚯蚓组织脱氧核糖核酸酶（ＥＷＤ１、

ＥＷＤ２、ＥＷＤ３），本室纯化所得。蚯蚓：赤子爱胜蚓

（Ｅｉｓｅｎｉａｆｏｅｔｉｄａ），购自北京双桥农场蚯蚓养殖基地。

低分子量蛋白质标准（ＬｏｗＭｏｌｅｃｕｌａｒＭａｒｋｅｒ），购自

ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；小牛胸腺 ＤＮＡ，丝氨酸蛋白酶抑

制剂（ＰＭＳＦ），购自Ｓｉｇｍａ公司；其它试剂均为分析纯。

１．２　主要仪器

　　高速低温离心机，Ｈｉｔａｃｈｉ，２０ＰＲ５２日本；ＬＣＱ

ＤＥＣＡＸＰＰＬＵＳＥＳＩＩＴＭＳ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ；微型凝胶

电泳装置，Ｔｈｅｒｍｏ。

１．３　方　法

１．３．１　ＥＷＤｓ分离纯化　新鲜洗净的蚯蚓经组织匀

浆，加入 １．５倍体积 ｐＨ４．６ＮａＡｃ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）缓冲液

（包含１７．４μｇ／ｍｌＰＭＳＦ），４℃过夜抽提，离心后上清加

入１５％预冷丙酮沉淀，再次离心所得上清中追加预冷

丙酮至终浓度为５０％，离心收集沉淀，真空干燥得粗提

物蛋白粉。粗提物蛋白粉用上样缓冲液复溶后上样至

ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ层析柱（１．６ｃｍ×３０ｃｍ），用

ＮａＡｃ缓冲液盐梯度洗脱，分部收集，经过琼脂糖凝胶

法进行活性测定。收集活性蛋白质洗脱峰上样至ＣＭ

ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ层析柱（１．６ｃｍ×３０ｃｍ），用ＮａＡｃ缓

冲液盐梯度洗脱，分部收集。活性洗脱成分经超滤浓

中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２８Ｎｏ．３２００８

缩后，作为酶纯品用于后续研究。以上操作非特殊说

明均在０～４℃进行。

１．３．２　ＥＷＤｓ酶活性测定（紫外分光光度法）　３７℃条

件下，在３ｍｌ小牛胸腺 ＤＮＡ（４ｇ／Ｌ）反应底物体系中分

别加入ＥＷＤｓ酶纯品１ｍｌ，迅速混匀，在３分钟内测定

混合液ＯＤ２６０变化。ＤＮＡ酶活力单位定义为：３７℃，规

定条件下每分钟降解小牛胸腺 ＤＮＡ使２６０ｎｍ处吸光

值变化０．００１所需要的酶量定义为一个活力单位（Ｕ）。

计算公式为：酶活力（Ｕ／ｍｌ）＝ΔＯＤ２６０（３ｍｉｎ）／（３×

０．００１）。

１．３．３　分子量测定　（１）ＳＤＳＰＡＧＥ法 参照文献方

法［２］。（２）ＭＡＬＤＩＴＯＦ质谱分析法 参照文献方法［３］，

由国家人类基因组北方研究中心协助完成。

１．３．４　ＥＷＤｓ酶动力学常数测定　在温度为３７℃，ｐＨ

为４．６的条件下，ＥＷＤｓ与一系列浓度的底物（小牛胸

腺ＤＮＡ）反应，运用紫外分光光度法得其反应初速度，

由底物浓度的倒数１／［Ｓ］为横坐标，反应速度的倒数

１／Ｖ为纵坐标作双倒数图可求得酶动力学常数 Ｋｍ和

Ｖｍａｘ［４］。

１．３．５　ＥＷＤｓ温度稳定性测定　在 ｐＨ４．６的条件下，

分别将３种酶液在不同温度中保温１０ｍｉｎ，恢复到３７℃

后测定各管残余酶活力，以３７℃保温处理的酶液活力

为１００％ ，获得温度—稳定性曲线。

１．３．６　ＥＷＤｓ最适 ｐＨ及 ｐＨ稳定性测定　在３７℃的

条件下，不同的ｐＨ反应体系中分别测定ＥＷＤｓ的酶活

力，以小牛胸腺 ＤＮＡ为底物，以紫外分光光度法测定

酶活性。得到其反应的最适ｐＨ。分别将３种酶在不同

的ｐＨ缓冲液中保持１０ｍｉｎ后恢复为最适ｐＨ各自测定

残余酶活力，以最适ｐＨ处理的酶液活力为１００％，获得

ｐＨ稳定性结果。

１．３．７　金属离子对 ＥＷＤｓ酶活性的影响　反应体系

中加入氯化物形式二价阳离子（Ｍｇ２＋，Ｍｎ２＋，Ｃａ２＋）使

其终浓度为５ｍｍｏｌ／Ｌ，测定 ＥＷＤｓ酶活性改变，与不加

相应离子的测活体系进行比较。

２　结　果

２．１　ＰＡＧＥ电泳结果（图１）

２．２　分子量测定结果

２．２．１　ＳＤＳＰＡＧＥ法测定分子量的结果

　　ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分离后，分别计算 ＥＷＤ１，ＥＷＤ２，

图１　ＥＷＤｓ的１０％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

Ｆｉｇ．１　１０％ ＰＡＧＥｏｆＥＷＤｓ１：ＥＷＤ２２：ＥＷＤ１３：ＥＷＤ３

ＥＷＤ３的迁移率，对照标准曲线得出分子量。ＥＷＤ１有

两个亚基，大亚基分子量８１ｋＤａ，小亚基分子量５５ｋＤａ，

合计１３６ｋＤａ；ＥＷＤ２的分子量为６２ｋＤａ；ＥＷＤ３的分子

量为５８ｋＤａ（图２）。

图２　ＥＷＤｓ的１０％变性聚丙烯酰胺

弹片胶电泳结果

Ｆｉｇ．２　１０％ＳＤＳＰＡＧＥｏｆＥＷＤｓ１：ｍａｒｋｅｒ；２：ＥＷＤ３；３：ＥＷＤ２；４：ＥＷＤ１

２．２．２　质谱测定分子量的结果　上面图中横坐标显

示质量电荷比（ｍ／ｚ），图３中６１９０８．３２２和９５２８５．０６６

的峰是ＥＷＤ１两个亚基分子的单电荷峰，３２９３２．４３７和

４６８１３．３３１的峰是上述两个亚基的双电荷峰。ＥＷＤ１是

６１９０７．３２２Ｄａ和 ９５２８４．０６６Ｄａ的合计，分子量为

１５７１９３．３８８Ｄａ。从图 ４中得出 ＥＷＤ２ 的分子量为

６９０７４．７４１Ｄａ，推测为单亚基蛋白质。图５显示 ＥＷＤ３的分子量为６３４６１．３５Ｄａ，推测为单亚基蛋白质。经质

谱（ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ）法测定 ＥＷＤ１，ＥＷＤ２，ＥＷＤ３的分

子量分别为：１５７．２ｋＤａ，６９．１ｋＤａ和６３．５ｋＤａ。

２．３　ＥＷＤｓ的最大反应速度及米氏常数

　　以小牛胸腺 ＤＮＡ为底物时，蚯蚓组织脱氧核糖核

酸酶 ＥＷＤ１，ＥＷＤ２，ＥＷＤ３的 Ｋｍ值分别为：１．５８ｍｇ／

ｍｌ，３．９５ｍｇ／ｍｌ，１．５２ｍｇ／ｍｌ。Ｖｍａｘ分别为５．３６ｍｇ／（ｍｌ

·ｍｉｎ），２．８７ｍｇ／（ｍｌ·ｍｉｎ），４．８９ｍｇ／（ｍｌ·ｍｉｎ）。

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２００８，２８（３） 樊慧杰 等：蚯蚓体内一组脱氧核糖核酸酶的酶学性质研究

图３　ＥＷＤ１的分子量质谱结果

Ｆｉｇ．３　ＭＡＬＤＩＴＯＦｍａｓｓｓｐｅｃｔｒａｏｆＥＷＤ１

图４　ＥＷＤ２的分子量质谱结果

Ｆｉｇ．４　ＭＡＬＤＩＴＯＦｍａｓｓｓｐｅｃｔｒａｏｆＥＷＤ２

图５　ＥＷＤ３的分子量质谱结果

Ｆｉｇ．５　ＭＡＬＤＩＴＯＦｍａｓｓｓｐｅｃｔｒａｏｆＥＷＤ３

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中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２８Ｎｏ．３２００８

２．４　ＥＷＤｓ温度稳定性

图６　ＥＷＤｓ的温度稳定性

Ｆｉｇ．６　ＥＷＤｓｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓａｔｖａｒｉｏｕｓｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ

　　结果表明 ＥＷＤｓ在大于５５℃的时候酶活性均为

０，完全丧失。ＥＷＤｓ在不超过４０℃的范围内酶活性较

稳定。蚯蚓组织脱氧核糖核酸酶（ＥＷＤｓ）对温度较

敏感。

２．５　ＥＷＤｓ最适ｐＨ及ｐＨ稳定性结果（图７，８）

图７　不同ｐＨ值对ＥＷＤｓ活性的影响

Ｆｉｇ．７　ＥｆｆｅｃｔｏｆｐＨｏｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＥＷＤｓ

　　如图７所示，ＥＷＤＳ的最适 ｐＨ分别为５．２，４．２，

４．８，都偏酸性。从图８可得ＥＷＤ１的ｐＨ稳定性最强，

ｐＨ３．０～９．０保持 １０ｍｉｎ后均有活性，ＥＷＤ２在 ｐＨ≤

３．０，≥７检测不出酶活性。ＥＷＤ３在 ｐＨ≤３．０，≥６．０

检测不出酶活性。这３种ＤＮＡ酶均在酸性条件下稳定

性较强。

２．６　金属离子对ＥＷＤｓ活性的影响（图９）

　　如图示，Ｍｎ２＋是 ＥＷＤ１，ＥＷＤ２，ＥＷＤ３的抑制剂，

Ｃａ２＋也表现出对 ＥＷＤ１，ＥＷＤ２，ＥＷＤ３明显的抑制作

用，Ｍｇ２＋对ＥＷＤ３有较明显的抑制作用；３种离子均未

图８　ＥＷＤｓ的ｐＨ稳定性

Ｆｉｇ．８　ＥＷＤｓｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓａｔｖａｒｉｏｕｓｐＨ

图９　金属离子对ＥＷＤｓ活性的影响

Ｆｉｇ．９　ＥｆｆｅｃｔｏｆｍｅｔａｌｉｏｎｏｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＥＷＤｓ

表现出对ＥＷＤｓ的激活作用。

３　讨　论

　　脱氧核糖核酸酶已在多种动物体内发现，其具有

降解ＤＮＡ的作用，在核苷酸代谢、维持体内 ＤＮＡ生理

性浓度及降解异源核酸物质方面均有重要意义。

ＤＮａｓｅⅠ是最早发现的脱氧核糖核酸酶类，是该家族中

最主要的成员之一，其活性依赖二价金属阳离子存

在［５］。ＤＮａｓｅⅡ是一种酸性核酸内切酶，其活性不依赖

金属离子的存在，它可水解ＤＮＡ为３′磷酸的寡核苷酸

片断［６］。ＤＮａｓｅⅡ存在于各种哺乳动物的组织中［７］。

尽管来自各种不同种属和组织的 ＤＮａｓｅⅡ酶学性质非常相似，但这些酶的化学性质并不完全一样（如分子

量、亚基结构）。

　　本文主要研究了从蚯蚓组织中分离出来三种脱氧

核糖核酸酶的一些生化性质，采用两种不同的方法测

定了ＥＷＤ１，ＥＷＤ２，ＥＷＤ３的分子量，对分子量的测定ＳＤＳＰＡＧＥ结果小于质谱的测定结果。质谱测定分子

量相对精确［８］，本研究结合 ＳＤＳＰＡＧＥ以质谱测定的分子量结果为准，分别为：１５７．２ｋＤａ，６９．１ｋＤａ，６３．５

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２００８，２８（３） 樊慧杰 等：蚯蚓体内一组脱氧核糖核酸酶的酶学性质研究

ｋＤａ。ＳＤＳＰＡＧＥ和 ＭＡＤＬＴＴＯＦ的结果均表明，ＥＷＤ１由两条肽链组成，ＥＷＤ２，ＥＷＤ３属于单亚基蛋白质。分

子量的研究结果表明，ＥＷＤｓ分子量远远大于 ＤＮａｓｅ

Ｉ，ＤＮａｓｅⅡ。

　　Ｋｍ值是酶的特征性常数，测定 Ｋｍ值是研究酶的

一种重要的方法。Ｋｍ值表示酶与底物的亲和力，Ｋｍ

小，说明酶与底物的亲和力强。本实验测得 ＥＷＤ１，

ＥＷＤ２，ＥＷＤ３的Ｋｍ值分别为：１．５８ｍｇ／ｍｌ，３．９５ｍｇ／ｍｌ，

１．５２ｍｇ／ｍｌ。表明ＥＷＤ３与底物亲和力最强。

　　ＥＷＤｓ的最适ｐＨ比较偏酸，除ＥＷＤ１外，其他两种

ＥＷＤｓ在ｐＨ３．０以下和６．０以上几乎没有活性，只有

ＥＷＤ１在ｐＨ３．０以下和６．０以上仍具有活性。这几种

酶与已发现的ＤＮａｓｅＩ，ＤＮａｓｅⅡ不同，属新型的脱氧核

糖核酸酶。

　　研究的结果与已知的 ＤＮａｓｅＩ，ＤＮａｓｅⅡ的主要性

质总结见Ｔａｂｌｅ１。

表１　ＥＷＤｓ，ＤＮａｓｅⅠ和ＤＮａｓｅⅡ 的生化性质的比较

Ｔａｂｌｅ１　ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＥＷＤｓ，ＤＮａｓｅⅠ ａｎｄＤＮａｓｅⅡ

ｎａｍｅ ＤＮａｓｅＩ ＤＮａｓｅⅡ ＥＷＤ１ ＥＷＤ２ ＥＷＤ３ｓｏｕｒｃｅ蚯蚓 蚯蚓 蚯蚓ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ ３１～４２ｋＤａ ２６．５～４５ｋＤａ １５７．２ｋＤａ ６９．１ｋＤａ ６３．５ｋＤａｏｐｔｉｍｕｍｐＨ ７．０（６．５～８．０） ５．０（３．５～６．５） ５．２（４．８～５．６） ４．２（４．０～４．８） ４．８（４．０～５．２）ｉｎｈｉｂｉｔｅｒ ＥＤＴＡ，Ｇ－ａｃｔｉｎ Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋，Ｍｎ２ Ｍｎ２＋，Ｃａ２＋ Ｍｎ２＋，Ｃａ２＋ Ｍｎ２＋，Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋

ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋ ＥＤＴＡ

　　这些研究结果提供的参数尚无法确定 ＥＷＤｓ的脱

氧核糖核酸酶分类。因此，有待于进一步深入研究。

但这些数据为证实它们是一类新的蛋白质提供了进一

步的佐证，开阔了对脱氧核糖核酸酶的研究，也为研究

开发提供可靠的实验依据。

参考文献

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ｏｆｔｈｅｃＤＮＡｅｎｃｏｄｉｎｇｈｕｍａｎｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩ．ＪＢｉｏｌ

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ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩ（ＤＮａｓｅ ＩＩ） ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ： ａ ｎｏｖｅｌ

ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ，ｇｅｎｅｔｉｃ

ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙａｎｄｂｒｏａｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｍｏｎｇｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｂｏｄｙ

ｆｌｕｉｄｓ．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，１９９２，１１１９（２）：１８５～１９３

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Ｊｏｕｒｎａｌ（ＥｎｇｌｉｓｈＥｄｉｔｉｏｎ），１９９９，３１（１）：３１～３５

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中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２８Ｎｏ．３２００８

ＳｔｕｄｙｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａＧｒｏｕｐｏｆＥａｒｔｈｗｏｒｍＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ

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（１ＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ　０３０００１，Ｃｈｉｎａ）（２Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌＡｔｔａｃｈｅｄｔｏｔｈｅＣａｐｉｔａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰａｅｄｉａｔｒｉｃｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００２０，Ｃｈｉｎａ）

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｍａｉｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｅａｒｔｈｗｏｒｍｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＥＷＤｓ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＳＤＳＰＡＧＥａｎｄＭＡＤＬＴＴＯＦｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｔｈｅｓｔｕｄｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｓｏｆＥＷＤｓ（ＥＷＤ１，ＥＷＤ２ａｎｄＥＷＤ３）ｗｅｒｅ１５７．２ｋＤａ，６９．１ｋＤａａｎｄ６３．５ｋＤａｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆ３７℃，ｐＨ４．６ａｎｄｔａｋｅｃａｌｆｔｈｙｍｕｓＤＮＡａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ｔｈｅＫｍｖａｌｕｅｓｏｆＥＷＤｓｗｅｒｅ１．５８ｍｇ／ｍｌ，３．９５ｍｇ／ｍｌ，１．５２ｍｇ／ｍｌａｎｄｔｈｅＶｍａｘｗｅｒｅ５．３６ｍｇ／（ｍｌ·ｍｉｎ），２．８７ｍｇ／（ｍｌ·ｍｉｎ）ａｎｄ４．８９ｍｇ／（ｍｌ·ｍｉｎ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅＥＷＤｓｗｅｒｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｗｈｉｃｈｄｉｄｎ’ｔｓｈｏｗａｎｙａｃｔｉｖｉｔｙｗｈｅｎｔｈｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｒｉｓｅｓｔｏ５５℃ ｆｏｒ１０ｍｉｎａｎｄｓｈｏｗｅｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｂｅｌｏｗ４０℃．ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍｐＨｗｅｒｅ５．２，４．４，４．８，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｎ２＋，Ｃａ２＋ｗｅｒｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆＥＷＤｓ，ａｎｄＭｇ２＋ｈａｄｎｅｇａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｎＥＷＤ３ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＥＷＤｓｈａｓｕｎｉｑｕｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｗｈｉｃｈａｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒｏｍＤＮａｓｅｓｋｎｏｗｎｂｅｆｏｒｅ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ｅａｒｔｈｗｏｒｍｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒ

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