超高速から高分離LC - 株式会社ワイエムシィ超高速から高分離LCまで～誰にも使いやすい2 m YMC-UltraHTカラムのご紹介～ 2008.09.03 11:35~12:25

超高速から高分離LCまで～誰にも使いやすい2 m YMC-UltraHTカラムのご紹介～

2008.09.03 11:35~12:252008分析展新技術説明会

株式会社ワイエムシィ

2

アウトライン

超高速・高分離LCの特徴（メリットとデメリット）

YMC-UltraHT seriesのコンセプト

最適な分離を実現するためのポイント

YMC-UltraHT seriesを用いた高速・高分離アプリケーション

3

超高速・高分離LCとは

高流速／ショートカラム

5 mや3 m粒子の従来サイズカラムに比べて1/5～1/10の分析時間

微粒子化充填剤による高効率化（ van Deemterの法則）

充填剤の微粒子化により高流速条件でも高いカラム効率を維持

超高速LC2 m50 x 2.0 mmI.D.

コンベンショナル LC 5 m150 x 4.6 mmI.D.

同等の分離で

分析時間約1/10溶媒使用量約1/15感度約2倍※

mV

0

50

100

J060223F

mV

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min

0.0 1.0 2.0 3.0 min

0

50

100

26 min/run ×1 mL/min = 26 mL/run

5 L Injection

3 min/run ×0.6 mL/min = 1.8 mL/run

1 L Injection

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 26.0 min

0 J060303B

mV

50

100

カラム長 ×1/3カラム断面積 ×1/5線流速 ×3

※同システムで比較

4

超高速・高分離LCのメリットとデメリット

• 微粒子による高いカラム背圧

• 従来LCが使用困難

• 既存コンベンショナルカラムとは異なる選択性（保持が小さいものが多い）

• 従来LC ⇔超高速LC間のメソッド移行の難しさ

• 分析時間の大幅な短縮

• 分離の向上

• 検出感度の向上

• 溶媒使用量の削減

• 分析メソッド開発の迅速化

• 生産性の向上

DisadvantagesAdvantages

5

高分離能

最小限の圧力損失

分離選択性

ピーク形状

再現性

耐久性

汎用性

新開発のシリカゲル粒子

最密充填

新設計カラム構造

実績ある表面修飾技術

YMC-UltraHT Pro C18優れたピーク形状と高分解能のファーストチョイスODS

YMC-UltraHT Hydrosphere C18水100%移動相でも使用可能な高極性化合物分離用ODS

高速・高分離のメリットを損なうことなく

高圧・非汎用性のデメリットを低減する

ベストバランス

YMCのカラム開発コンセプトとデザイン

6

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Optimum flow rate for 2 m(0.3-0.8 mL/min for 2 mmI.D.)

Column : 50 x 2.0 or 2.1 mmI.D.Eluent : acetonitrile / water

(60/40)Temperature : 25℃Sample : Butyl benzoate

HE

TP (m

m/p

late

s)

Interstitial linear velocity (mm/sec)

YMC 5 m

YMC 3 m

他社 sub-2 m A

YMC 2 m

他社 sub-2 m B

Optimum flow ratefor 5 m

(0.2 mL/min for 2 mmI.D.)

高流速領域においてsub-2 mに匹敵するカラム効率を実現

高速分析時のカラム効率van Deemter curves

＊HETP; カラム長を理論段数で除した値、小さいほどカラム効率up＊Interstitial linear velocity; カラム長を空保持時間(t0)で割って得られる線速度、大きいほど流速up

7

Interstitial linear velocity (mm/sec)

YMC 5 m

YMC 3 m

他社 sub-2 m A

YMC 2 m

他社 sub-2 m B

Col

umn

pres

sure

(MP

a)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

sub-2 mの60%以下のカラム圧力最適流速領域で従来耐圧LCにも十分適用可能

Column : 50 x 2.0 or 2.1 mmI.D.Eluent : acetonitrile / water (60/40)Temperature : 25℃Sample : Butyl benzoate

Optimum flow rate for 2 m(0.3-0.8 mL/min for 2 mmI.D.)

従来LCが適用可能な

圧力領域

従来LCで使用可能なカラム背圧線流速とカラム圧力の関係

8

YMC-UltraHT seriesのラインナップ目的・システムに応じたカラムサイズの選択

○○75 mm

○○50 mm

○○100 mm

－○30 mm

3.0 mm2.0 mmカラム長

カラム内径

溶媒量の削減カラム外拡散の影響低減

SPEED

分離能

50 x 2.0 mmI.D. －超高速LCのスタンダード

カラム長100 mm －精密分離に有用な高分解能カラム

カラム長 30 mm －分析時間の短縮を重視する場合に有効なショートカラム

内径3.0 mm －従来のシステムに適用しやすいサイズ

各カラムサイズの特長

9

最適な分離を実現するためのポイント

System volumeの影響

検出・データ取り込み速度の影響

グラジエント分析におけるdelay volumeの影響

超高速LCメソッドへの移行例

10

system volumeの低減 (1)セル容量が与える影響

スタンダードセルセミミクロセル

N 4 4500 6900

Rs(2/1) 0.90 1.61

内径2 mmカラムを用いる際は

セミミクロセルの使用を

3 min0 1 2

mAU

0

20

40

60

80

(N070608E)

1 2 3

4

3 min0 1 2

mAU

0

50

100

150

(N070608B)

1 23

4A) スタンダードセルセル容量（8 L）システム容量（600 L）

B) セミミクロセルセル容量（2.5 L）システム容量（600 L）

Column : YMC-UltraHT Pro C18 (2 m, 12 nm)System : 従来型LCシステムEluent : acetonitrile / 20mM KH2PO4 (10/90)Flow rate : 0.36 mL/minTemperature : 37℃Detection : UV at 260 nm

セフェム系抗生物質

1.Cephalexin2.Cefaclor3.Cephaloglycin4.Cephaloridine

50 X 2.0 mmI.D.（colume volume = 160 L）

11

system volumeの低減 (2)配管の内径が与える影響

0.10 mm 0.15 mm 0.25 mmN 1 7100 7100 2700

N 2 8100 8000 5500

N 3 8100 8000 6100

Column : YMC-UltraHT Pro C18 (2 m, 12 nm)50×2.0 mmI.D.

System : 超高速LC用Eluent : acetonitrile / water (60/40)Flow rate : 0.4 mL/minTemperature : 37℃Detection : UV at 270 nmInjection vol. : 1 L

Injector－検出器間の配管径は0.15 mm以下に

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 Retention Time

0

100000

200000

Intensity

0

100

200

mV

0.0 1.0 2.0 min

J060825EJ060825HJ060825F

t0

1 2

3

内径 0.25 mm

内径 0.10 mm

内径 0.15 mm

Injector－カラムIN側カラムOUT側－検出器

内径 0.065 mm

t0. Uracil1. Methyl benzoate2. Naphthalene3. Butyl benzoate

12

system volumeの低減 (3)カラムへの接続状態が与える影響

ユニバーサルコネクタ

固定ネジ

固定フェラル

調整ネジ

シーリング

フェラル

（交換可）

・配管はネジ穴に

完全密着

(フェラル先端空隙なし)

・手締め式タイプ

(スパナ不要)

・耐圧70 MPat0. Uracil1. Methyl benzoate2. Naphthalene3. Butyl benzoate

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 Retention Time

0

100000

200000

Intensity

0

100

200

mV

0.0 1.0 2.0 min

t0

1 2

3

F060825GF060825H



フェラル先端のわずかな空隙にも注意が必要

（ごくわずかな空隙でも段数低下を招く）

カラムの接続タイプによって

フェラル先端からの長さが異なる

空隙なし

0.15 mm I.D.

空隙あり

0.15 mm I.D.

Mismatched MaｔchedN 1 6400 7100

N 2 7400 8000

N 3 7500 8000

13

検出・データ取り込み速度の最適化 (1)検出器の設定値

レスポンス値

データ取り込み速度

・ピークを描く速度の設定

・データポイント数は多いほどデータ容量は大きくなる

・1ピークに10 pointsは必要

・過渡応答時定数

・ピークを検出する速度の設定

・レスポンスが短いほど応答は速い（信号追随性がよくなる）

－ピークがシャープになり、ピーク高さが増加する

－ノイズが増大する（S/N比が悪くなる）

14

検出・データ取り込み速度の最適化 (2)レスポンス値がピーク形状に与える影響

0.400 0.410 0.420 0.430 0.440 0.450 Retention Time

0

100000

200000

Inte

nsity

0.03 sec 0.1 sec 0.3 secN 1 7100 6900 5700

N 2 8200 8200 7800

N 3 7800 7800 7600

F060822GF060822HF060822I


0.3 sec

0.1 sec

0.03 secto

12

3

0.0 1.0 2.0 min

0

100

200

mV

レスポンス値は0.1 sec.以下に



Peak 1

15

検出・データ取り込み速度の最適化 (3)データ取り込み速度がピーク形状に与える影響

0.400 0.410 0.420 0.430 0.440 0.450 Retention Time

0

100000

200000

Inte

nsity

100 pts/sec 10 pts/sec 5 pts/secN 1 7100 6800 6800

N 2 8200 8200 8000

N 3 7800 7800 7700

J060824AJ060824BJ060824C


5 points/sec

10 points/sec

100 points/secto

12

3

0.0 1.0 2.0 min

0

100

200

mV

データ取り込み速度は10 points/sec.以上に



Peak 1

16

最適設定におけるシステム間比較

超高速LC用システム従来型LCシステム（セミミクロセル）

超高速LC 従来型LCN 1 7100 4400 （62％）

N 2 8200 7200 （88％）

N 3 7800 7400 （95％）


F060822I

0.0 1.0 2.0 min

0

100

200

mV

to

1 2

3

0.0 1.0 2.0 min

0

100

200

mV

F060823F

to 1

2

3

データ取込速度

：100 points/secレスポンス

：0.03 sec

データ取込速度

：10 points/secレスポンス

：0.05 sec


Eluent : acetonitrile / water (60/40)Flow rate : 0.6 mL/minTemperature : 37℃Detection : UV at 270 nmInjection vol. : 1 L

従来型LCでも十分に高速分析可能（最高のパフォーマンスを得るには超高速LC用システムを）

17

グラジエント条件下のdelay volumeの影響 (1)delay volumeとは？-1

delay volumeとは？－移動相が混合される点からカラムIN側までのシステム容量のことグラジエント遅れ，dwell volumeとも呼ばれる

HPLCシステムの模式図

column

pump A

pump Binjector

delay volume

mixer

18

グラジエント条件下のdelay volumeの影響 (2)delay volumeとは？-2

グラジエント遅れ X 流速＝ delay volume

（min）（mL/min）（mL）

2.5 － 1 X 0.4 ＝ 0.6 mL（600 L）

－設定したグラジエントプログラム

－得られたクロマトグラム（実際のグラジエント）

Eluent : A) waterB) water / acetone (100/0.1)10%B (0-1 min), 10-90%B (1-2 min), 90%B (2-3 min), 90-10%B (3-3.01 min), 10%B (3-7 min)

Flow rate : 0.4 mL/minTemperature : 25℃Detection : UV at 254 nm

%B

0

25

50

75

0 1 2 3 4 5 6 min

mAU

0

20

30

10

2.5 min

19

グラジエント条件下のdelay volumeの影響 (3)delay volumeを考慮する必要性とは？-1

delay volumeの容量分、試料注入時間を遅らせるdelay volume（mL） ÷ 流速（mL/min）＝試料注入を遅らせる時間（min）

0.6 ÷ 0.8 ＝ 0.75

Column : YMC-UltraHT Pro C18 (2 m, 12 nm)50 X 3.0 mmI.D.

Flow rate : 0.8 mL/min

Temperature : 40℃Detection : UV at 254 nmInjection : 1 L (0.1 mg/mL)

Eluent : A) 0.1% HCOOHB) acetonitrile

Gradient : 35-70%B (0-1 min), 70%B (1-2.5 min)

1. Methylparaben2. Ethylparaben3. Propylparaben4. Butylparaben

･･･設定したグラジエントプログラム－実際のグラジエント（カラムIN側）

F080515B

注入

▼

min0 0.5 1.0 1.5 2.00.75 min

F080519A▽

注入

▼

delay volumeの考慮なし

（inj. time調整なし）

delay volumeの考慮あり

（inj. time調整あり）

20

カラムIN側で溶媒の濃度変化が始まる


delay volume考慮なし


delay volume考慮あり

（inj. time調整あり）

カラム

IN OUT

●

●

●

●●

▲

▲

▲▲▲

●

●

●

●●

▲

▲

▲

▲▲▲

●●

●

●

●▲

▲

▲▲

●▲●

▲▲▲

▲●●●

0.75 min Injection

グラジエント条件下における、カラム内の試料および移動相のイメージ図

0 min 0.80 minグラジエントプログラム

経過時間 0.75 min

●▲●

▲▲▲

▲●●●

0 min Injection0 min Program start

0 min Program start

21


delay volumeの考慮なし


delay volumeの考慮あり

（inj. Time調整あり）

delay volumeを考慮しない場合、保持の小さい成分の分離に影響を及ぼす場合がある

delay volumeの容量分、試料注入時間を遅らせるdelay volume（mL） ÷ 流速（mL/min）＝試料注入を遅らせる時間（min）

0.6 ÷ 0.8 ＝ 0.75





Gradient : 35-70%B (0-1 min), 70%B (1-2.5 min)


－実際のグラジエント（カラムIN側）

F080515B

注入

▼

min0 0.5 1.0 1.5 2.00.75 min

F080519A▽

注入

▼

●

●

▲

▲

22

グラジエント条件下のdelay volumeの影響 (6)システム間およびカラム間の違い

超高速LCシステムセミミクロコンベンショナル

0.1-0.2 mL0.4 – 1.0 mL

2 – 3 mm2 – 3 mm4.6 mmカラム内径

0.125 – 0.5 min

0.4 – 0.8 mL/min

0.2 – 1.0 min

1.0 – 2.0 mL/min

従来型HPLCシステム

1.0 – 5.0 minカラムIN側で溶媒の

濃度変化が始まる時間

（delay volume／流速）

システムのdelay volume

0.2 – 0.4 mL/min一般的に使用される流速

delay volumeが大きいほど、また、流速が遅いほど、カラムIN側で溶媒の濃度変化が始まるまでの時間が長くなる（移動相が一定組成のまま流れる時間が長くなる）

23

グラジエント条件下のdelay volumeの影響 (7)異なるシステム間での再現性

delay volume考慮なし（inj. time調整なし）

delay volume考慮あり（inj. time調整あり）

Agilent 1100

delay volume= 0.4 mL

min0 0.5 1.0 1.5 2.0

mAU

0

100

200

300

F080513B

min

mAU

0

100

200

300

F080513F

Injection time0.4 / 0.8= 0.5 min

▼ ▼

▼：注入

島津 10A

delay volume = 0.6 mL

F080515B

min0 0.5 1.0 1.5 2.0

mAU

0

100

200

300

min

0 0.5 1.0 1.5 2.0

0 0.5 1.0 1.5 2.0

mAU

0

100

200

300

F080519A▼ ▼

Injection time0.6/ 0.8= 0.75 min

（＊）試料注入時を0 minにしてクロマトグラムを表示

システム間の再現性不良良


Flow rate : 0.8 nL/min



Gradient : 0-1 min (35-70%B), 1-2.5 min (70%B)


24

超高速LCメソッドへの移行例酸化防止剤分析の超高速化

コンベンショナルLCから超高速LCへの移行例

流速・注入量・グラジエントタイムの算出方法

流速とグラジエントタイムの関係

従来型HPLCシステムでの高速分析

25

酸化防止剤分析の超高速化 (1)コンベンショナル LCから超高速 LCへ

mAU

17 min0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

50

100

150

(N061127A)

mAU

0

20

40

60

80

100

120

(N070406H)

コンベンショナルLC メソッドYMC-Pack Pro C18, 5 m, 150 X 4.6 mmI.D.

超高速LC メソッドYMC-UltraHT Pro C18, 2 m, 50 X 2.0 mmI.D.

1.0 mL/min5 L Inj.

0.8 mL/min1 L Inj.

17 min0 2 4 6 8 10 12 14 16

Eluent : A) water / TFA (100/0.1)B) acetonitrile / methanol / TFA (75/25/0.1)

Temperature : 30℃Detection : UV at 280 nm

酸化防止剤1. n-Propyl gallate (PG)2. 2,4,5-Trihydroxybutyrophenone (THBP)3. tert-Butylhydroquinone (TBHQ)4. Nordihydroguaiaretic acid (NDGA)5. 4-Hydroxymethyl-2,6-di-tert-butylphenol (HMBP)6. n-Octyl gallate (OG)7. n-Dodecyl gallate (DG)

1 2

3

45

67

1.4 min0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

mAU

0

20

40

60

80

100

1201

23

4 5

6

7

分析時間約1/12

溶媒使用量約1/15

（＊）delay volumeの考慮あり

（＊）delay volumeの考慮なし

26

酸化防止剤分析の超高速化 (2)流速・注入量・グラジエントタイムの算出方法

(1.0)2×3.14=3.14

(2.3)2×3.14=16.6

断面積(mm2)

50150 カラム長(mm)

50×2.0 mmI.D. 150×4.6 mmI.D. カラムサイズ

×1/5

流速・注入量※－断面積比により算出

グラジエントタイム－カラム長比で算出

インジェクションタイム（Inj. time）－delay volume / 流速で算出

1 mL/min

5 L Inj.

0.2 mL/min

1 L Inj.

×1/5

グラジエントタイム

×1/3

Φ4.6

Φ2.0 50 mm

150 mm

×1/3

※注入量：サンプル溶液が高濃度、溶出力が高い場合はカラム容積比で算出

27

酸化防止剤分析の超高速化 (3)カラムサイズに合わせたメソッド移行

×1/5

×1/3

短時間で同等の分離が得られる

17 min0 2 4 6 8 10 12 14 16

mAU

0

50

100

150

(N061127A)

YMC-Pack Pro C18, 5 m150 X 4.6 mmI.D.

1 2

34

5

67

5.7 min0 1 2 3 4 5

mAU

0

20

40

60

80

120

(N070406E)

100

YMC-UltraHT Pro C18, 2 m50 X 2.0 mmI.D.

1

23

45

6

7

1 mL/min

5 L Inj.

0.2 mL/min

1 L Inj.

45-70%B (0-9 min)70-95%B (9-12 min)95%B (12-17 min)

Inj. time 0 min

45-70%B (0-3 min)70-95%B (3-4 min)95%B (4-5.7 min)

Inj. time 0.7 min(delay volume = 0.14 mL)

28

酸化防止剤分析の超高速化 (4)流速とグラジエントタイム

0 1

mAU

0

40

80

(N070406G)

120

0 1 1.4 min

mAU

0

40

80

(N070406H)

120

0 1

流速に反比例させてグラジエントタイムを短縮することにより高速グラジエント分析が可能

1

23

4 5

6

7

1

23

4 5

6

7

×1/2

×1/3

×1/4

0.2 mL/min

×4

×3

×20.4 mL/min

0.6 mL/min

0.8 mL/min

2

mAU

0

40

80

(N070416E)

120 1

23

45

6

7

2.9 min

1.9 min

45-70%B (0-3 min)70-95%B (3-4 min)95%B (4-5.7 min)

Inj. time 0.7 min(delay volume = 0.14 mL)

45-70%B (0-1.5 min)70-95%B (1.5-2 min)95%B (2-2.9 min)

Inj. time 0.35 min

45-70%B (0-1 min)70-95%B (1-1.33 min)95%B (1.33-1.9 min)

Inj. time 0.23 min

45-70%B (0-0.75 min)70-95%B (0.75-1 min)95%B (1-1.4 min)

Inj. time 0.18 min

YMC-UltraHT Pro C18, 2 m, 50 X 2.0 mmI.D

0 1 2 3 4 5

mAU

0

40

80

120

(N070406E)

1

23

45

67

5.7 min

4.5-9.5 MPa

9.1-19.0 MPa

13.6-28.2 MPa

18.2-37.3 MPa

29

1. n-Propyl gallate (PG)2. 2,4,5-Trihydroxybutyrophenone (THBP)3. tert-Butylhydroquinone (TBHQ)4. Nordihydroguaiaretic acid (NDGA)5. 4-Hydroxymethyl-2,6-di-tert-butylphenol (HMBP)6. n-Octyl gallate (OG)7. n-Dodecyl gallate (DG)

2 min0 0.5 1 1.5

(N070412G)

1 23

4 5

6

7

(N070412C)

12

3

45

6

7

(N070411K)

12

34 5

6

7

大幅なピーク形状・

分離の改善

低保持成分のピーク形状改善

溶出時間の高速化

System : Agilent 1100Column : YMC-UltraHT Pro C18, 50 x 2 mmI.D. (Column Vol. 160 L)

A) 標準仕様スタンダードセル（14 L）システム容量（400 L）

B) セルの低容量化セミミクロセル（5 L）システム容量（400 L）

C) セル・インジェクタ・配管の低容量化

セミミクロセル（5 L）システム容量（160 L）

N1=900

N1=2500

N1=3600

Rs(5, 6)=1.1

Rs(5, 6)=2.7

Rs(5, 6)=2.6

酸化防止剤分析の超高速化 (5)従来型HPLCシステムを用いた場合

Eluent : A) water / TFA (100/0.1)B) acetonitrile / methanol / TFA (75/25/0.1)45-70%B (0-1 min), 70-95%B (1-1.33 min), 95%B (1.33-2 min)


Injection : 1 LInj. time : A) 0.67 min

B) 0.67 minC) 0.3 min

30

system volumeを低減する（試料拡散の低減）（特に内径2 mmのカラムを用いる場合）

検出・データ取り込み速度を最適化する

（レスポンス値：0.1 sec. 以下，データ取り込み速度：10 points/sec. 以上）

グラジエント分析では必要に応じてdelay volumeを考慮する（ダウンサイジング，異なるシステム間の再現性を得るには必要）

超高速LC分析で最適な結果を得るためにまとめ

31

高速・高分離アプリケーションの紹介

YMC-UltraHT series の紹介

YMC-UltraHT seriesアプリケーション

32

Hydrosphere C18 Pro C18 Pro C18 RS

炭素含有率約12％約16％約22％

結合様式モノメリックモノメリックポリメリック

エンド

キャッピング独自の E . C .技術により残存シラノール基を最小限に抑制

特長高極性化合物の分離に最適

水100%移動相で使用可能

標準的な疎水性のODS

広範囲の化合物に適用

疎水性の大きな表面構造

優れた耐酸・耐アルカリ性

（pH1～10）

ProシリーズODSの特長

粒子径 2, 3, 5 m 3, 5 m2, 3, 5, 10 m

YMC-UltraHT seriesのラインナップ分離選択性の異なる2種類のODS

33

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0

0

100

200

mAU

15.0 minN060811I

45.0 min0 5 10 15 20 25 30 35 40

mAU

0

40

80

(06082204.D)

5 m YMC-Pack Pro C18150 x 2.0 mmI.D.

0%B (0-5 min)0-100%B (5-40 min)100%B (40-45 min)

0%B (0-1.65 min)0-100%B (1.65-13.35 min)100%B (13.35-15 min)

2 m YMC-UltraHT Pro C1850 x 2.0 mmI.D.

カラム長（150 mm→ 50 mm）に比例させグラジェントタイムを1/3に

複雑なペプチドマッピングにおいても溶出順・分離を変えることなく2 mに移行可能

Eluent : A) acetonitrile / water / TFA (10/90/0.1)B) acetonitrile / water / TFA (35/65/0.1)


Cytochrome c トリプシン消化物の分析

従来LCからの容易なメソッド移行粒子間で同一の選択性

34

Tf 5 = 1.13

コンベンショナルLC メソッド5 m YMC-Pack Pro C18150 x 4.6 mmI.D.

超高速 LCメソッド2 m YMC-UltraHT Pro C1850 x 2.0 mmI.D.

Tf 5 = 1.07

1.0 mL/min 5 L Inj.8.5 MPa

0.6 mL/min1 L Inj.30 MPa

12

2.0 0.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 min

0

20

40

60

mV

34

5

F060315F

1

23

4

5

0.2 0.0 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 min

0

20

40

60

mV

F060315A

アルカロイドの分析 (1)コンベンショナル LC から超高速 LCへ

塩基性化合物も移動相を変更することなく、容易にメソッド移行可能

Eluent : 20 mM CH3COOH-CH3COONH4 (pH 4.9) / acetonitrile (80/20)Temperature : 40℃Detection : UV at 220 nm

1. Scopolamine2. Atropine3. Cinchonine4. Quinine5. Dihydroquinine

35

12 3

45

0 1 2 min

0

20

40

60

mV

F060315A

2 m YMC-UltraHT Pro C18, 50 x 2.0 mmI.D.

sub-2 m Brand I7, 50 x 2.1 mmI.D.

sub-2 m Brand L4, 50 x 2.1 mmI.D.

N 5 = 106,000 /mTf 5 = 1.0730 MPa

N 5 = 89,000 /mTf 5 = 3.9950 MPa

N 5 = 78,000 /mTf 5 = 2.3540 MPa

アルカロイドの分析 (2)高分離を可能にする優れたピーク形状 (他社比較)

F060316D

12

3

45

0 1 2 min

0

20

40

60

mV

F060316E

12 3

45

0 1 2 min

0

20

40

60

mV

36

YMC-UltraHT seriesのラインナップ目的・システムに応じたカラムサイズの選択

○○75 mm

○○50 mm

○○100 mm

－○30 mm

3.0 mm2.0 mmカラム長

カラム内径

溶媒量の削減カラム外拡散の影響低減

SPEED

分離能

50 x 2.0 mmI.D. －超高速LCのスタンダード

カラム長100 mm －精密分離に有用な高分解能カラム

カラム長 30 mm －分析時間の短縮を重視する場合に有効なショートカラム

内径3.0 mm －従来のシステムに適用しやすいサイズ

各カラムサイズの特長

37

ウコンサプリメント中のクルクミン分析高分離分析に有効な100 mm長カラム

Eluent : acetonitrile / water / formic acid (50/50/0.1)Flow rate : 0.4 mL/minTemperature : 40℃Detection : UV at 250 nmInjection : 1 LSample : Tablets (6.9 mg/mL)

ウコンサプリメント1. Curcumin 3 (Bisdemethoxycurcumin) 2. Curcumin 2 (Demethoxycurcumin) 3. Curcumin 1 (Curcumin)

4 min0 1 2 3

mAU

0

10

20

30

(N070729S)

2 min0 0.5 1 1.5

mAU

0

10

20

30

(N0870727S)

2 min0 0.5 1 1.5

mAU

0

10

20

30

(N070731S)

2 min0 0.5 1 1.5

mAU

0

10

20

30

(N070730S)

YMC-Pack Pro C1850 X 2.0 mmI.D., 5 m

YMC-Pack Pro C1850 X 2.0 mmI.D., 3 m

YMC-UltraHT Pro C1850 X 2.0 mmI.D., 2 m

YMC-UltraHT Pro C18100 X 2.0 mmI.D., 2 m

1 2

3

1 2

3

1 23

1 2

3

ピーク間の不純物を検出

不純物をベースライン分離

粒子サイズを2 mに

カラムサイズを100 mmに

5 m、3 mではピーク間の不純物は検出できない

4.7 MPa

8.0 MPa

13.9 MPa

24.8 MPa

38

従来型LCに適用しやすい内径3 mmカラム

超高速LC用システム（sys. vol. ＝ 140 L）

従来型LCシステム（標準分析用）（sys. vol. ＝ 600 L）

Column : YMC-UltraHT Pro C18 (2 m, 12 nm)Eluent : acetonitrile / 20mM KH2PO4 (10/90)Temperature : 37℃Detection : UV at 260 nm

0 1 2 3 min

mAU

0

20

40

60

80

(N070606B)

3 min0 1 2

mAU

0

20

40

60

80

(N070608E)

50 x 3.0 mmI.D. (col. vol. = 350 L)50 x 2.0 mmI.D. (col. vol. = 160 L)Flow rate 0.36 mL/minInjection 1 LPressure 16.2 MPa

セフェム系抗生物質

1.Cephalexin2.Cefaclor3.Cephaloglycin4.Cephaloridine

3 min0 1 2

mAU

01020304050

(N070607Q)

12

3

4

2 3

4

1 2 3

4

3 min0 1 2

mAU

0

50

100

150

(N070606E)

1 2 3

4

3 min0 1 2

mAU

0

50

100

150

(N070608B)

1 23

4

N(4) 7700Rs(2/1) 2.32

N(4) 7600Rs(2/1) 2.20

N(4) 7800Rs(2/1) 2.21

N(4) 6900Rs(2/1) 1.61

N(4) 6800Rs(2/1) 1.61

N(4) 4500Rs(2/1) 0.90

最適な

組み合わせ

適した

組み合わせ

Flow rate 0.8 mL/minInjection 2 LPressure 18.6 MPa

3 min0 1 2

mAU

01020304050

(N070612B)

23

4

1

1

従来型LCシステム（セミミクロセル使用）（sys. vol. ＝ 600 L）

39

YMC-UltraHT seriesアプリケーション

農薬の一斉分析

・LC/MSを用いた高速分析例

アロプリノール代謝物

・高極性化合物（核酸成分）の超高速分析例

ジルチアゼムのin vitro代謝物・迅速な分析メソッド開発例

プロプラノロールのin vitro代謝物・高～低極性化合物群の一斉分析

40

農薬の一斉分析 (1)

分析条件Column :YMC-Pack Pro C18, YMC-UltraHT Pro C18Elunt : A) 5 mM CH3COONH4 in water,

B) 5 mM CH3COONH4 in methanolTemprature : ambientDetection : API5000, ESI, Positive, MRMInjection : 3 L (10 ng/mL)Sample : Pesticide Mixture Standard Solution PL-7-2,

manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.

1. Thiamethoxam (Q1/Q3 : 292.3/211.3) 14. Chromafenozide (Q1/Q3 : 395.4/175.1)2. Clothianidin (Q1/Q3 : 250.3/169.1) 15. Butafenacil (Q1/Q3 : 492.1/331.1)3. Chloridazon (Q1/Q3 : 222.3/77.0) 16. Simeconazole (Q1/Q3 : 249.3/70.1)4. Thiacloprid (Q1/Q3 : 253.3/126.0) 17. Cyazofamid (Q1/Q3 : 325.2/108.0)5. Thiabendazole (Q1/Q3 : 202.3/175.2) 18. Naproanilide (Q1/Q3 : 292.3/171.3)6. Azamethiphos (Q1/Q3 : 325.2/183.0) 19. Fenoxycarb (Q1/Q3 : 302.3/88.1)7. Dimethirimol (Q1/Q3 : 210.4/71.1) 20. Anilofos (Q1/Q3 : 368.2/199.1)8. Isoxaflutole (Q1/Q3 : 360.2/251.1) 21. Cyflufenamid (Q1/Q3 : 431.3/295.2)9. Pyriftalid (Q1/Q3 : 319.3/139.1) 22. Pyrazolynate (Q1/Q3 : 439.1/91.0)

10. (E)-Ferimzone (Q1/Q3 : 255.4/91.1) 23. Indoxacarb (Q1/Q3 : 528.1/203.2)11. (Z)-Ferimzone (Q1/Q3 : 255.4/91.1) 24. Benzofenap (Q1/Q3 : 431.2/105.1)12. Methoxyfenozide (Q1/Q3 : 369.4/149.3) 25. Furathiocarb (Q1/Q3 : 383.3/195.2)13. Iprovalicarb (Q1/Q3 : 321.4/119.3) 26. Cloquintocet-mexyl (Q1/Q3 : 336.3/238.2)

41

農薬の一斉分析 (2)LC/MSによる高速分離例

YMC-Pack Pro C18, 3 m, 150 X 2.0 mmI.D.

YMC-UltraHT Pro C18, 2 m, 75 X 2.0 mmI.D.

同等の分離で分析時間1/2にCourtesy of J.Watanabe, TAKARA BIO INC.

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 min

1

2

3

45

6

7

8 9

10,11

12

13,14

15

1617

18

19

20

2122

23

24

25

26

１ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 min

1

2

3

45

67

8 9

10,11

12

13

15

1617

18

19

20

2122

23

24

25

26

14

Gradient :15-40%B (0-1 min), 40%B (1-3.5 min), 40-50%B (3.5-6 min), 50-55%B (6-8 min), 55-95%B (8-17.5 min), 95%B (17.5-22 min)


Gradient : 15-40%B (0-0.5 min), 40%B (0.5-1.75 min), 40-50%B (1.75-3 min), 50-55%B (3-4 min), 55-95%B (4-8.75 min), 95%B (8.75-11 min)


42

コンベンショナルLC メソッドHydrosphere C18, 5 m, 150 X 4.6 mmI.D.

超高速LC メソッドYMC-UltraHT Hydrosphere C18, 2 m, 50 X 2.0 mmI.D.

1.0 mL/min7.5 L Inj.8.6 MPa

0.6 mL/min0.5 L Inj.24.6 MPa

Temperature : 37℃Detection : UV at 254 nm

分析時間約1/9

溶媒使用量約1/15

0 2 4 6 8 10 12 min

mAU

0

200

400

1

2

3

45

(F070822AE)

mAU

0

40

80

1.00 0.5 1.4 min

1

2

3

45

0 2 4 6 8 10 12 min

mAU

0

40

80

2. HypoxanthineN

NH

N

NH

O

3. XanthineNH

NH

N

NH

O

O

1. Uric acidNH

NH

NH

NH

O

O

O

4.Oxipurinol

N

N

NH

N

OH

OH

5.Allopurinol(痛風治療薬）

N

N

NH

N

OH

アロプリノール代謝物の分析 (1)高極性化合物（核酸成分）分析の超高速化

Eluent : 10mM CH3COOH-CH3COONH4 (pH 4.5)

高極性化合物用も容易に超高速分析へメソッド移行可能

43

アロプリノール代謝物の分析 (2)水100％移動相条件下での優れた再現性

Temperature : 37℃Detection : UV at 254 nmInjection : 0.5 L

保持安定性テスト

0.6 mL/minで分析（青）↓

0.2 mL/minで30 min通液（低圧条件）

↓

0.6 mL/minで分析（赤）↓

送液を停止し30 min静置（圧力：0）↓

0.6 mL/minで分析（緑）

標準的ODS、他社高極性用ODSでは使用困難な水100%移動相で安定して分析可能

1. Uric acid2. Hypoxanthine3. Xanthine4. Oxipurinol5. Allopurinol

YMC-UltraHT Hydrosphere C182 m, 50×2.0 mmI.D.

24.6 MPa (0.6 mL/min)

7.9 MPa (0.2 mL/min)

Brand G2 (標準的ODS)2.5 m, 50×2.0 mmI.D.

20.2 MPa (0.6 mL/min)

6.8 MPa (0.2 mL/min)

Brand I11 (高極性化合物用ODS)1.8 m, 50×2.1 mmI.D.

32.4 MPa (0.6 mL/min)

10.9 MPa (0.2 mL/min)

Eluent : 10mM CH3COOH-CH3COONH4 (pH 4.5)

0

40

ｍAU

0

40

ｍAU

min0 0.4 0.8 1.2

0

40

ｍAU

99%

62%

87%

94%

100%

98%

44

アロプリノール代謝物の分析 (3)Hydrosphere C18 vs市販高極性化合物用カラム

市販高極性化合物用sub-2 mカラムの中でも優れた保持能と分離選択性

sub-2 m高極性化合物用 ODS (Brand M3)

2.0 min1.00

mAU

0

5

10

(F070821Q)

2

3

45

1

2.0 min1.00

mAU

0

5

10

(F070822F)

12

3

4

5

2.0 min1.00

mAU

0

5

10

(F070821F)

2

3 , 4

5

1

sub-2 m高極性化合物用 (not ODS)(Brand L5)

2 m YMC-UltraHT Hydrosphere C18

1. Uric acid2. Hypoxanthine3. Xanthine4. Oxipurinol5. Allopurinol

Sample : 健常者血清（標準品添加）Eluent : 10mM CH3COOH-CH3COONH4 (pH 4.5)

45

ジルチアゼムのin vitro代謝物 (1)溶離液条件の選択

HCOOH(pH 2.8)

HCOOH-HCOONH4

(pH 4.6)

HCOONH4

(pH 6.4)

● ●

● ●

● ●

20 mM buffer / methanol 20 mM buffer / acetonitrile

4 peaks

4 peaks

7 peaks

5 peaks

7 peaks

3 peaks

: 未変化体（diltiazem）

●

: 代謝物

20 mM HCOONH4 / methanol で分離達成の可能性あり

Column : YMC-UltraHT Hydrosphere C18(2 m, 12 nm)

50 X 2.0 mmI.D.Eluent : A) 20 mM buffer

B) organic solvent0-90%B (0-3 min)

Flow rate : 0.4 mL/minTemperature : 37℃Detection : UV at 240 nmSample : metabolites of diltiazem in vitroInjection : 1 L

3 min 3 min

46

ジルチアゼムのin vitro代謝物 (2)グラジエント条件の最適化


●

▲ : 代謝物

Column : YMC-UltraHT Hydrosphere C18 (2 m, 12 nm) 50 X 2.0 mmI.D.

Eluent : A) 20 mM HCOONH4

B) methanol


グラジエント条件の最適化により、代謝物と推定される9ピークの検出が可能に

選択した溶離液条件下で、グラジエント条件検討

0-90%B (0-3 min)

25%B (0-0.5 min),25-80%B (0.5-3.5 min),80%B (3.5-4 min)

9 peaks

7 peaks

47

ジルチアゼムのin vitro代謝物 (3)超高速 LC vs コンベンショナルLC


●

▲ : 代謝物Eluent : A) 20 mM HCOONH4

B) methanolTemperature : 37℃Detection : UV at 240 nmSample : metabolites of diltiazem in vitro

YMC-UltraHTカラムを用いることにより、１分析あたり4分にまでの時間短縮が可能に

Gradient : 25%B (0-0.5 min),25-80%B (0.5-3.5 min),80%B (3.5-4 min)

Flow rate : 0.4 mL/minInjection : 1 L

Gradient : 25%B (0-3 min),25-80%B (3-21 min),80%B (21-24 min)

Flow rate : 0.2 mL/minInjection : 3 L

YMC-UltraHT Hydrosphere C18, 2 m, 50 X 2.0mmI.D.

4 min

24 min

超高速LCメソッド

コンベンショナルLCメソッドHydrosphere C18, 5 m, 150 X 2.0mmI.D.

48

ジルチアゼムのin vitro代謝物 (4)市販超高速LC用カラムとの比較


●

▲ : 代謝物

YMC-UltraHT Hydrosphere C18

標準的ODS（Brand O1）

Column : 50 X 2.0 mmI.D. or 50 X 2.1 mmI.D.Eluent : A) 20 mM HCOONH4

B) methanol25%B (0-0.5 min), 25-80%B (0.5-3.5 min), 80%B (3.5-4 min)


高極性化合物用ODS（Brand I11）

9 peaks

6 peaks

6 peaks

4 min

市販の超高速LC用カラムと比較して最も高い分離能を示す

49

Column : 100 X 2.0 mmI.D. or 100 X 2.1 mmI.D.Flow rate : 0.2 mL/minDetection : UV at 220 nmTemperature : 37℃Injection : 1 LInj. time : 0.7 min(delay volume = 0.14 mL)

●未変化体(propranolol）

▲代謝物

sub-2 mBrand I7

21.6-32.0 MPa

sub-2 mBrand M2

14.1-24.5 MPa

YMC-UltraHTHydrosphere C18

14.1-22.5 MPa

mAU

0

4

8

12

5 min0 1 2 3 4

▲ ●

mAU

0

4

8

12

●

▲

mAU

0

4

8

12

●

▲

F080206A

F080208D

F080205E

高極性の代謝物は強く保持し、疎水性の未変化体は早く溶出

極性の幅が広い化合物群のバランスの良い分離

プロプラノロールのin vitro代謝物 (1)ヒト肝マイクロソームによる代謝物一斉分析

Eluent : 20mM HCOOH-HCOONH4 (pH 4.6) / MeOHGradient : 5% MeOH (0-1 min), 5-100% MeOH (1-3 min), 100% MeOH (3-5 min)

50

Column : YMC-UltraHT Hydrosphere C18100 X 2.0 mmI.D.

Eluent : A) 20mM HCOOH-HCOONH4 (pH 4.6)B) methanol

Gradient : 5%B (0-1 min), 5-100%B (1-3 min),100%B (3-5 min) at 0.2 mL/min

: 5%B (0-0.5 min), 5-100%B (0.5-1.5 min),100%B (1.5-2.5 min) at 0.4 mL/min

Detection : UV at 220 nmTemperature : 37℃Injection : 1 LInj. time : 0.7 min at 0.2 mL/min

0.35 min at 0.4 mL/min(delay volume = 0.14 mL)

● 未変化体 (Propranolol)

▲ 代謝物

流量を2倍にしても分離を損なうことなく高速分析が可能

0.2 mL/min14.1-22.5 MPa

mAU

0

4

8

12

5 min0 1 2 3 4

▲ ●

F080205E

▲ ●

F080205A

mAU

0

4

8

12

2.5 min0 1 2

0.4 mL/min27.1-45.3 MPa

プロプラノロールのin vitro代謝物 (2)高～低極性化合物の短時間一斉分析に最適

51

Eluent : acetonitrile / water (60/40)Flow rate : 0.6 mL/minTemperature : 25℃Detection : UV at 270 nmInjection vol. : 1 L


YMCステンレス製プレカラムフィルタ2 m YMC-UltraHTカラムの保護に

プレカラムフィルタ接続前（メインカラムのみ）プレカラムフィルタ接続後

プレカラムフィルタ接続による

カラム効率の低下なし(101%)80007900N3

(101%)80007900N2

(100%)56005600N1

接続後接続前

UltraHT Pro C18, 2 m, 50 X 2.0 mmI.D.使用時の比較

ステンレス製プレカラムフィルタ

0.5 m フィルタ

ステンレス製プレカラムフィルタ

・カラム圧力上昇の原因となる、

試料や溶媒中の微細な不溶物をトラップ

・デッドボリュームを最小限に抑えた構造

・フィルタ孔径 2 m0.5 m （NEW）

（YMC-UltraHTカラムには0.5 mをご使用下さい）

t0 12

3t0 1 2

3

23.9 MPa 24.2 MPa

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均一な2 m多孔性高純度シリカゲル基材と最密充填された新設計カラム

sub-2 mと同等のカラム効率を60%以下の圧力損失で達成

2, 3, 5 m が同じ分離選択性を示すため従来LC⇔超高速LC間で移動相を

変更する必要がなくメソッド移行が容易

ファーストチョイスカラムに最適なPro C18と、高極性化合物の保持・

分離の改善に有効なHydrosphere C18をラインナップ

創薬初期のスクリーニングをはじめ、農薬、食品分野など様々な分析の

ハイスループット化に威力を発揮

YMCYMC--UltraHT seriesUltraHT seriesUltra-High Throughput

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超高速から高分離LC - 株式会社ワイエムシィ超高速から高分離LCまで ～誰にも使いやすい2 m YMC-UltraHTカラムのご紹介～ 2008.09.03 11:35~12:25

超高速から高分離LC - 株式会社ワイエムシィ超高速から高分離LCまで～誰にも使いやすい2 m YMC-UltraHTカラムのご紹介～ 2008.09.03 11:35~12:25