表 达 HBx 的 肝 前 体 细 胞 经 肝 内 移 植 小 鼠 模型 的 构 建钟沁1,2，张超1,2, 何雪梅1 ， 2 ，胡代曦12 ，张锡峰12, 黄佳祎1 ， 3 ，冯涛1,2*

1.重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心，重庆，400016

2.重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物研究中心，重庆，400016

3.重庆医科大学基础医学院病理生理学教研室，重庆，400016

[ 摘 要 ] 目 的 ： 构 建 表 达 乙 肝 病 毒 X 基 因

（ HBx ） 的 肝 前 体 细 胞 ， 并 经 小 鼠 门 静 脉 注 射

建 立 肝 内 移 植 模 型 ， 为 进 一 步 研 究 HBx 对 肝 前

体 细 胞 的 作 用 和 影 响 及 其 在 原 发 性 肝 癌

（ HCC ） 发 病 机 制 中 的 作 用 奠 定 了 基 础 。 方 法 ：

将 表 达 绿 色 荧 光 的 重 组 腺 病 毒 分 别 转 染 小 鼠 肝

前 体 细 胞 ， 再 经 小 鼠 门 静 脉 注 射 后 取 肝 组 织 ，

观 察 绿 色 荧 光 蛋 白 表 达 情 况 ， 免 疫 组 织 化 学 法

观 察 HBx 阳 性 染 色 ， Western blot 法 和 实 时 定 量 PCR(

收稿日期： 接受日期：基 金 项 目 ： 国 家 自 然 科 学 基 金 （ 81071770 ， 81201679 ） .Supported by Natural Science

Foundation of China(81071770，81201679)

作者简介：钟沁（1988-），女，贵州贵阳人，硕士研究生 Tel: 18883147623; E-mail:yanyan_where@sina.cn

*通讯作者(Corresponding author), 冯涛，E-mail: fengtao9_9@yahoo.com

Real-time PCR) 法 分 别 检 测 HBx 在 蛋 白 质 及 mRNA 水 平

的 表 达 。 结 果 ： 成 功 构 建 了 表 达 HBx 并 靶 向 针

对 肝 前 体 细 胞 的 小 鼠 模 型 ， 免 疫 组 化 法 、 RT-

PCR 法 及 Western blot 法 均 检 测 到 HBx 转 染 组 目 的

基 因 及 蛋 白 的 特 异 性 表 达 ， 与 对 照 组 相 比 结 果

具 有 统 计 学 差 异 。 结 论 ： 成 功 构 建 了 表 达 HBx

并 靶 向 针 对 肝 前 体 细 胞 的 小 鼠 模 型 ， 其 具 有 稳

定 性 及 较 强 的 可 操 作 性 ， 这 不 仅 对 探 讨 原 发 性

肝 癌 的 发 生 机 制 奠 定 了 基 础 ， 也 为 肿 瘤 动 物 模

型 的 构 建 提 供 了 新 的 思 路 。 [ 关 键 词 ] 乙 型 肝 炎 病 毒 X 蛋 白 ； 肝 前 体 细 胞 ；

绿 色 荧 光 蛋 白 ； 门 静 脉 ； 小 鼠 模 型[ 中 国 分 类 号 ] R-332 ； R575

Establishment of mouse models via Intrahepatic transplantation of

Progenitor Cells Expressing Hepatitis B Virus X

Zhong Qin1,2,Zhang Chao1,2,He Xuemei1,2， Hu Daixi12,Zhang Xifeng1,2,Huang

Jiayi1,3,Feng Tao1,2

1 ． Research Center of Molecular Medicine and Cancer ， Chongqing 400016 ，China;

2 ． Department of Pathophysiology, College of Basic Medicine, Chongqing 400016 ，China;

3 ． Department Pathophy Siology College of Basic Medicine, Chongqing 400016, China

Abstract Objective:To eastablish Hepatic progenitor cells(HPCs) expessiong Hepatitis B

virus X(HBx） and develop a mouse modles Via the portal vein injection of the cells.It

can provided a platform to study the effect of HBx on HPCs and the mechanisms of

Hepatocellular carcinoma(HCC). Methods:recombinant adenovirus were transfected into 14-19

cells;mice were received a injection of the cells via portal vein.The expression of HBx

and GFP in liver tissues were detected by immunohistochemistry technique and frozen

section .The expression levels of HBx mRNA and HBx prteins were measured by PCR

and Western blotting.Results:Compared with the controls,the expression of HBx in liver section

or at mRNA and protein levels was positive. Conclusion:The established mice model allows

the HBx aimed at HPCs directly,it has good stability and maneuverability, and it help to

dissect the effect of HBx on HPCs.

Key words HBx; Hepatic progenitor cells;green fluorescent;proteinPortal vein;Mouse

model

原 发 性 肝 癌 （ Hepatocellular carcinoma,HCC ） 是 世

界 范 围 内 重 大 恶 性 疾 病 之 一 ， 而 乙 型 肝 炎 病 毒

（ （ Hepatitis B virus ， HBV ） 是 其 发 病 的 首 要 因 素[1] 。 由 HBV 编 码 的 乙 型 肝 炎 病 毒 X 蛋 白 （ Hepatitis

B virus X ， HBx ） , 通 过 多 种 复 杂 的 途 径 与 HBV 相

关 性 肝 癌 的 发 生 、 发 展 有 着 密 切 的 联 系 [2-3] ， 但

其 具 体 机 制 还 不 是 很 清 楚 。 肝 前 体 细 胞

（ hepatic progenitor cells ， HPCs), 是 一 类 存 在 于 肝 组 织

内 具 有 干 细 胞 特 性 的 细 胞 ， 在 肝 损 伤 过 程 中 及

特 定 环 境 因 素 下 常 伴 有 肝 前 体 细 胞 的 增 殖 ， 其

甚 至 能 向 肝 细 胞 癌 方 向 发 展 , 近 年 来 研 究 显 示

肝 干 细 胞 可 能 是 肝 癌 发 生 的 起 始 细 胞 ， 其 可 能

与 肝 干 细 胞 分 化 受 阻 有 关 [4-6] 。 本 课 题 组 前 期 相

关 研 究 成 果 显 示 ， HBx 能 抑 制 小 鼠 胚 胎 干 细 胞

的 凋 亡 ， 通 过 调 控 信 号 通 路 影 响 肝 前 体 细 胞 的

增 殖 、 分 化 ， 并 能 诱 导 肝 前 体 细 胞 上 皮 - 间 质

转 化 （ Epithelialmess enhymaltran- sition,EMT ） 、 增 强 其

迁 移 能 力 等 [7-10], 因 此 推 测 HBX 可 能 通 过 对 肝 干 细

胞 的 调 控 在 肝 癌 发 生 、 发 展 中 起 着 一 定 的 作 用 ，

但 具 体 机 制 还 不 清 楚 ， 关 于 其 作 用 机 制 的 研 究

常 限 于 细 胞 水 平 及 转 基 因 模 型 中 ， 本 实 验 通 过

体 外 构 建 表 达 乙 肝 病 毒 X 基 因 的 肝 前 体 细 胞 ，

再 经 门 静 脉 移 植 到 小 鼠 体 内 ， 利 用 绿 色 蛋 白 作

为 示 踪 剂 ， 既 打 破 了 体 外 细 胞 实 验 的 局 限 性 ，

也 使 模 型 的 构 建 更 具 有 操 作 性 、 重 复 性 、 针 对

性 ， 为 进 一 步 探 讨 HBx 对 肝 前 体 细 胞 的 影 响 及

其 在 肝 癌 机 制 中 的 作 用 奠 定 了 基 础 。1 材 料 与 主 要 试 剂1.1 材 料 小 鼠 肝 前 体 细 胞 株 14-19 由 美 国 芝 加 哥

分 子 肿 瘤 研 究 中 心 馈 赠 ； 人 胚 肾 上 皮 细 胞 系

293T 细 胞 、 Ad-GFP 腺 病 毒 及 Ad-HBx-GFP由 本 教 研 室

冯 涛 教 授 构 建 并 保 存 ； 无 特 殊 病 原 体 (specific-

pathogen free,SPF)级 昆 明 小 鼠 ， 雄 性 ， 8～ 12 周 龄

（ 20g ～ 30g ） ， 由 重 庆 医 科 大 学 动 物 中 心 提 供 。

1.2 主 要 试 剂 总 RNA 提 取 试 剂 盒 、 RT-PCR试 剂 盒

及 实 时 荧 光 定 量 试 剂 盒 SYBR®Premix Ex TaqTM( Tli

RNaseH Plus) 购 自 大 连 宝 生 物 公 司 ； PCR 引 物 由 上

海 生 工 生 物 有 限 公 司 合 成 ； DMEM 培 养 基 、 胎 牛

血 清 、 胰 蛋 白 酶 等 购 自 Gbico; 小 鼠 抗 HBV 病 毒 X

抗 体 购 自 CHEMICON Interna-tional 公 司 ; 兔 抗 小 鼠 β-

actin 、 HRP 标 记 的 山 羊 抗 鼠 IgG 、 免 疫 组 化 SP 及

DAB 染 色 试 剂 盒 等 均 购 自 北 京 中 杉 金 桥 公 司 ；

HRP 标 记 的 山 羊 抗 兔 IgG购 自 Proteintech 公 司 ； BCA

蛋 白 浓 度 测 定 试 剂 盒 购 自 北 京 鼎 国 昌 盛 技 术 有

限 公 司 。2 方 法2.1 细 胞 培 养 及 转 染 复 苏 293T细 胞 及 14-19 细 胞 ，

用 含 10% 胎 牛 血 清 的 DMEM 培 养 ， 并 置 于

37℃ 、 5%CO2 、 饱 和 湿 度 孵 育 箱 内 ， 待 贴 壁 后 正

常 换 液 、 传 代 。 在 扩 增 病 毒 前 ， 将 293T细 胞 以

5×106密 度 均 匀 铺 板 于 100cm2 培 养 皿 内 ， 待 细 胞

贴 壁 、 变 形 后 分 别 加 入 0.5μ Ｌ Ad-GFP 及 Ad-HBx-GFP

的 原 病 毒 保 存 液 ， 于 24h 、 48h 、 72 小 时 观 察 ，

待 细 胞 感 染 率 达 90% 以 上 收 取 病 毒 液 ， 离 心

300×g 5分 钟 ， 重 悬 并 反 复 冻 融 3次 （ -200℃～

37℃ ） ， 台 式 离 心 机 离 心 （ 最 大 速 率 ） 、 收 集

上 清 分 装 置 于 -80℃ 保 存 备 用 。 反 复 扩 增 多 次 后

将 获 得 的 病 毒 液 先 进 行 细 胞 感 染 预 实 验 ， 将 14-

19 细 胞 以 3×103 个 / 孔 接 种 于 96 孔 板 内 ， 倍 比 稀

释 病 毒 液 并 同 量 滴 加 于 96 孔 板 ， 分 别 于

24h 、 48h 、 72h 观 察 细 胞 感 染 率 。 待 细 胞 融 合

率 达 70% 左 右 计 数 细 胞 ， 并 按 细 胞 感 染 预 实 验

确 定 的 病 毒 液 浓 度 分 别 感 染 14-19 细 胞 ， 感 染 48

小 时 后 ， 离 心 300×g 5分 钟 ， 以 5×105/200μl 浓 度 重

悬 细 胞 ， 备 用 于 动 物 实 验 。2.2 动 物 模 型 构 建 及 分 组 实 验 动 物 分 三 组 ， 分

别 门 静 脉 注 射 转 染 Ad-GFP 的 14-19 细 胞 （ 14-19/Ad-

GFP 组 ） 、 转 染 Ad-HBx-GFP 的 14-19 细 胞 （ 14-19/HBx

组 ） 及 生 理 盐 水 （ 生 理 盐 水 组 ） ， 每 只 注 射 量

均 为 5×105/200μl 。 小 鼠 术 前 禁 食 12h ， 称 重 、 麻

醉 ， 待 小 鼠 昏 迷 无 肌 张 力 后 消 毒 、 备 皮 ， 剑 突

下 做 长 约 2cm 的 纵 行 切 口 ， 依 次 切 开 小 鼠 皮 肤 、

肌 肉 、 腹 膜 ， 显 露 肝 脏 后 ， 用 浸 润 生 理 盐 水 的

棉 签 向 右 向 头 侧 翻 起 小 鼠 肝 脏 并 显 露 肝 门 区 ，

小 心 分 离 门 静 脉 的 分 支 ， 充 分 暴 露 并 确 认 门 静

脉 后 血 管 夹 夹 闭 门 静 脉 远 端 ， 于 近 端 以 细 针 头

缓 慢 注 射 ， 完 毕 后 棉 签 止 血 取 下 血 管 夹 ， 待 确

定 无 出 血 后 依 次 关 闭 腹 腔 、 缝 合 ， 术 后 生 理 盐

水 、 葡 萄 糖 补 液 ， 第 7天 取 小 鼠 新 鲜 肝 组 织 ，

部 分 立 即 做 冰 冻 切 片 ， 部 分 石 蜡 包 埋 ， 剩 余 保

存 于 － 80℃备 用 。2.3 观 察 绿 色 荧 光 蛋 白 表 达 情 况 取 3 组 模 型 的

新 鲜 肝 脏 组 织 ， 大 小 为 0.5cm×0.5cm×0.5cm ， 用 OTC

胶 包 埋 后 放 于 样 品 托 盘 上 并 置 于 恒 温 冰 冻 切 片

机 内 ， 温 度 为 － 11℃ ， 30min 后 连 续 切 片 8μm ， 载

玻 片 附 贴 肝 组 织 切 片 ， 晾 干 后 立 即 荧 光 显 微 镜

下 观 察 。2.4 免 疫 组 化 法 检 测 小 鼠 肝 组 织 HBx 阳 性 反 应

固 定 小 鼠 肝 组 织 、 石 蜡 包 埋 、 切 片 、 脱 蜡 后 按

说 明 书 操 作 进 行 SP 免 疫 组 化 、 DAB 显 色 、 封 片

后 保 存 ， 按 分 组 每 组 又 以 PBS 代 替 一 抗 添 加 对

照 组 ， 于 显 微 镜 下 观 察 每 张 切 片 阳 性 染 色 情 况 。2.5 检 测 小 鼠 肝 组 织 内 HBx 蛋 白 和 mRNA水 平 表 达

情 况 (1) 采 用 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 各 组 HBx

mRNA 表 达 ： 取 适 量 大 小 肝 脏 组 织 ， 液 氮 研 磨 后

冰 上 匀 浆 器 匀 浆 ， 按 RNA 提 取 说 明 书 提 取 RNA 。

测 浓 度 后 反 转 录 制 备 cDNA 进 行 荧 光 定 量 PCR ，

采 用 10μl 反 应 体 系 如 下 ： SYBR Premix ExTaqTMⅡ 5μl ， 上 、

下 游 引 物 各 0.4μl（ 10μmol/L ） , 模 板 1μl ， 无 菌 双 蒸

水 补 齐 10μl 。 反 应 条 件 依 次 为 ：

95℃ 、 94℃ 、 65℃ 、 72℃ 分 别 反 应

5min、 15s 、 30s 、 30s ， 40 个 循 环 ， 95℃保 温 1min

后 制 作 溶 解 曲 线 ， 检 测 引 物 的 特 异 性 ， 采 用 2-

ΔΔCt 法 分 析 基 因 相 对 表 达 ， 实 验 重 复 三 次 。

（ 2 ） 蛋 白 质 印 迹 分 析 各 组 肝 组 织 HBx 蛋 白 ： 取

黄 豆 大 小 肝 组 织 ， 液 氮 研 磨 后 冰 上 匀 浆 器 匀 浆

加 入 预 先 混 合 的 蛋 白 裂 解 液 和

PMSF （ 100:1 ） ， 1380×g 离 心 5min收 取 上 清 ， 用

BCA 法 测 定 蛋 白 浓 度 ， 加 SDS 上 样 缓 冲 液 ，

100℃ 煮 沸 5min ， 根 据 待 测 目 的 蛋 白 分 子 量 配 制

SDS-PAGE胶 ， 每 组 各 取 60μg蛋 白 上 样 量 ， 电 泳 分

离 后 ， 电 转 至 硝 酸 纤 维 素 膜 上 ， 经 封 闭 液 室 温

封 闭 2 小 时 ， 一 抗 4℃ 冰 箱 摇 床 孵 育 过 夜 ， PBS

洗 8min×3 次 ， 加 入 对 应 的 二 抗 室 温 孵 育 2 小时，PBS洗15min×3 次，ECL法显影检测。

基因

上 引 物 （ 5’-3') 下 引 物 （ 5’-3’ ）

GAPDH

ACCCAGAAGACTGTGGATGG ACCCAGAAGACTGTGGATGG

HBx CCCAACTCCTCGTTCACGGTGGTCTC

GAGACCACCGTGAACGAGGAGTTGGG

2.6 统 计 学 方 法 所 得 数 据 采 用 SPSS17.0 统 计 软

件 进 行 统 计 处 理 ， 采 用 配 对 t 检 验 进 行 组 间 的

比 较 ， P＜ 0.05 为 差 异 具 有 统 计 学 意 义 。3 结 果

3.1 转 染 细 胞 的 构 建 分 别 成 功 构 建 了 表 达 Ad-

HBx-GFP 及 Ad-GFP 的 14-19 细 胞 （ 图 1 ） 。 Ad-HBx-GFP Ad-GFP

图1 荧光显微镜观察重组腺病毒Ad-HBX-GFP 及Ad-GFP 对14-19 细胞的感染效率

Fig 1 Infection efficiency of 14-19 cells by Ad-HBx-GFP and Ad-GFP observed by

fluorescence microscopy

荧光显微镜×200Original magnification ×200

3.2 观 察 小 鼠 肝 组 织 绿 色 荧 光 表 达 情 况 荧 光

镜 下 观 察 新 鲜 肝 脏 组 织 冰 冻 切 片 如 图 显 示 ， 14-

19/Ad-HBx-GFP 组 及 14-19/Ad-GFP 组 均 显 示 了 大 量 绿 色

荧 光 ， 以 中 央 静 脉 周 围 较 为 强 烈 ， 且 多 位 于 细

胞 膜 上 ， 而 对 照 组 则 无 绿 色 荧 光 表 达 ， 结 果 表

明 细 胞 经 小 鼠 门 静 脉 注 射 后 ， 最 终 能 到 达 小 鼠

的 肝 脏 内 且 具 有 较 高 的 表 达 量 （ 图 2 ） 。

注射Ad-HBx-GFP/14-19 注射Ad-GFP /14-19 注射生理盐水

第7 天The seventh day

图2 荧光显微镜观察注射Ad-HBx-GFP/14-19 细胞、Ad-GFP/14-19 细胞及生理盐水后肝冰冻组织的绿色荧光的表达

Fig 2 expression of frozen liver tissue sctions after injection with Ad-HBx-GFP/14-19 、Ad-

GFP/14-19 and physiological saline observed by fluorescence microscopy

荧光显微镜×200Original magnification ×200

3.3 免 疫 组 化 法 观 察 小 鼠 肝 组 织 HBx 阳 性 染 色 情

况 及 其 定 位 石 蜡 切 片 免 疫 组 化 结 果 显

示 14-19/Ad-HBx-GFP 组 染 色 呈 阳 性 ， 14-19/Ad-GFP 组 及

空 白 对 照 组 染 色 均 未 见 阳 性 表 达 ， 如 图 中 箭 头

所 示 ， 阳 性 染 色 和 绿 色 荧 光 表 达 位 置 一 致 多 位

于 中 央 静 脉 周 围 ， 但 细 胞 膜 上 及 细 胞 质 内 均 可

见 ， 以 细 胞 质 内 较 多 （ 图 3 ） 。 注射Ad-HBx-GFP/14-19 注射Ad-GFP /14-19 注射生理盐水

第 7天The seventh day

图3 免疫组化法分析肝组织HBx 阳性表达情况Fig 3 Analysis of HBx-positive in liver tissues by immunohistochemistry technique

荧光显微镜×200

Original magnification ×200

3.4 小 鼠 肝 组 织 中 HBx 蛋 白 及 mRNA表 达 情 况 的 鉴

定 以 GAPDH 为 内 参 进 行 Real-time PCR ， 结 果 显 示

14-19/Ad-HBx-GFP 组 的 mRNA 转 录 水 平 明 显 高

于 14-19/Ad-GFP组 及 空 白 对 照 组 （ P 均 <0.05 ） ; 免 疫

印 迹 反 应 结 果 显 示 14-19/Ad-HBx组 有 特 异 性 HBx 蛋

白 表 达 ， 14-19/Ad-GFP 组 及 空 白 对 照 组 则 无 （ P 均

<0.05 ）， 以 上 表 明 14-19 细 胞 经 小 鼠 门 静 脉 注 射

后 ， 最 终 到 达 了 小 鼠 肝 脏 组 织 ， 并 成 功 表 达 了

HBx （ 图 4 ） 。

00.20.40.60.8

11.21.41.6

HBx

Ad-HBx-GFP/14-19Ad-GFP/14-19生理盐水

相对

表达

量7

第天

图A

图B

00.010.020.030.040.050.060.070.080.090.1

HBx

Ad-HBx-GFP/14-19Ad-GFP/14-19生理盐水

相对

表达

量7

第天

图C 图5 Real-time PCR （图A ）和western blot 法注射（图B.C）检测Ad-HBx-GFP/14-

19、 Ad-GFP/14-19 及生理盐水后小鼠肝组织HBx 的表达 Fig 5 Real-time PCR （A ）and western blot （B.C ）analysis the expression of liver

tissues after injection with Ad-HBx-GFP/14-19 、 Ad-GFP/14-19 and physiological saline

4 讨 论HBx 与 HBV 相 关 性 原 发 性 肝 癌 （ HCC ） 的 发 生

有 着 紧 密 的 联 系 ， 其 可 通 过 多 种 途 径 促 进 肝 癌

的 发 生 发 展 [11] 。 越 来 越 多 的 研 究 显 示 肝 干 细 胞

可 能 是 肝 癌 发 生 的 起 始 细 胞 [12] 。 本 课 题 组 的 前

期 研 究 中 已 构 建 了 重 组 腺 病 毒 Ad-HBX-GFP 及 Ad-

GFP ， 且 成 功 分 离 了 小 鼠 的 肝 前 体 细 胞 ， 其 相

关 成 果 显 示 HBx 能 对 肝 前 体 细 胞 起 到 调 控 作 用 [5-

8] 。 但 过 去 的 相 关 研 究 大 多 局 限 于 体 外 细 胞 实

验 ， 其 由 于 培 养 条 件 及 表 达 系 统 的 不 同 对 结 果

的 分 析 有 着 不 同 程 度 的 影 响 ， 而 转 基 因 动 物 虽

可 以 运 用 组 织 特 异 性 使 基 因 在 特 定 组 织 表 达 ，

但 不 能 特 异 性 靶 向 干 细 胞 [13-14] 。本 研 究 首 先 在 体 外 构 建 了 表 达 HBx 的 肝 前 体

细 胞 ， 使 HBx 能 靶 向 针 对 肝 前 体 细 胞 ， 再 经 小

鼠 门 静 脉 注 射 后 移 植 到 小 鼠 体 内 ， 并 利 用 绿 色

荧 光 蛋 白 作 为 失 踪 剂 ， 其 生 长 微 环 境 更 接 近 体

内 的 发 病 模 式 ， 这 为 相 关 方 面 的 进 一 步 深 入 研

究 提 供 了 基 础 。 但 在 体 内 HBx 对 肝 前 体 细 胞 的

作 用 和 影 响 是 否 能 与 体 外 研 究 所 显 示 的 结 果 保

持 一 致 ， 其 如 何 对 肝 前 体 细 胞 进 行 调 控 并 影 响

正 常 的 肝 细 胞 ， 在 肝 癌 的 发 生 、 发 展 中 具 体 的

机 制 又 是 什 么 ， 都 需 要 进 一 步 去 探 究 。5 参 考 文 献[1]Liu WC, Liu QY. Molecular mechanisms of gender disparity in hepatitis B

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