8
Effects of Various Environmental Conditions on the Transformation of Chlorinated Solvents by Methanosarcina thermophila Cell Exudates Jenny L. Baeseman, Paige J. Novak Department of Civil Engineering, University of Minnesota, 122 Civil Engineering Building, 500 Pillsbury Drive S.E., Minneapolis, MN 55455-0220, telephone: 612-626-9846; fax: 612-626-7750; e-mail: [email protected] Received 20 March 2001; accepted 25 June 2001 Abstract: Several microbiologically produced biomole- cules have been shown to degrade chlorinated contam- inants found in groundwater systems. It was discovered that the cell-free exudates of the methanogen Methano- sarcina thermophila were capable of carbon tetrachloride CT) and chloroform CF) degradation. Characterization of the exudates suggested that the active agents were porphorinogen-type molecules, possibly containing zinc. This research was performed to determine if the exu- dates from M. thermophila could be used for remediation purposes. The cell exudates were found to be capable of degrading CT, CF, tetrachloroethene, trichloroethene, and 1,1,1-trichloroethane. CT degradation was used to gauge exudate activity under a variety of conditions that would be encountered in the environment. The cell exu- dates were active when incubated in two types of soil matrices and at temperatures ranging from 4 to 23°C. Over a 35-day period approximately 10.2 lmoles of CT were degraded by M. thermophila exudates. To test the hypothesis that the exudates contained either a zinc porphorinogen or a quinone, experiments were per- formed with zinc 5,10,15,20-tetra 4-pyridyl)-21 H, 23 H- porphine tetrakis, protoporphyrin IX zinc, and juglone. The two zinc porphyrins were capable of mediating CT degradation at rates comparable to those observed with the M. thermophila exudates; however, juglone was only capable of very slow CT transformation. The electron- transfer activity of the M. thermophila cell exudates was therefore more consistent with the activity of porphori- nogens rather than quinones. Finally, in two enrichment cultures established from aquifer material and marine sediment, the possibility of excreted agents capable of degrading CT was evident. ã 2001 John Wiley & Sons, Inc. Biotechnol Bioeng 75: 634 641, 2001. Keywords: methanogen; excreted biological molecules; Methanosarcina; dehalogenation; bioremediation INTRODUCTION Due to improper disposal and accidental spills, chlori- nated solvents have become common environmental contaminants. Carbon tetrachloride CT), chloroform CF), tetrachloroethene PCE), trichloroethene TCE), and 1,1,1-trichloroethane 1,1,1-TCA) are some of the most common chlorinated solvents found in ground- water U.S. Environmental Protection Agency, 1996). These chemicals are toxic and many are suspected car- cinogens U.S. Environmental Protection Agency, 2001). Substantial research has been conducted to ®nd a solution to this contamination problem. Many of the remediation technologies that have been developed have limitations including long clean-up times, diculty stimulating and controlling the in situ growth of de- grading microbes, and high construction and operating costs U.S. Environmental Protection Agency, 1996). The need still exists for additional methods to remove these compounds quickly and inexpensively. Naturally occurring microorganisms have been shown to degrade chlorinated solvents in the laboratory Chapelle, 1993; Sutherland, 1997). Nevertheless, in the environment the eectiveness of the biological degrada- tion of chlorinated solvents is often limited by microbial competition, aquifer temperature, the availability of nutrients, and other factors impacting the growth and activity of microbes Chapelle, 1993; Sutherland, 1997). An alternative to maintaining and stimulating microbes in situ is the injection of microbiologically produced cofactors that are capable of dechlorinating these com- pounds. Researchers have found several cofactors heme, vitamin B 12 , cofactor F 430 ) that can degrade CT, CF, and TCE Burris et al., 1996; Buschman et al., 1999; Chiu and Reinhard, 1996; Gantzer and Wackett, 1991; Lin et al., 1989; Marks et al., 1989; Mazumder et al.,1987; Mowder et al., 2000; Public Health Laboratory Service Board, 1989; Zou et al., 2000). The Public Health Laboratory Service Board of the United Kingdom has patented the use of vitamin B 12 as a remediation tool to degrade solvents Public Health Laboratory Service Board, 1989). This cofactor has been shown to eectively degrade CT to a variety of end Correspondence to: P. Novak Contract grant sponsor: Water Resources Center, University of Minnesota ã 2001 John Wiley & Sons, Inc. DOI 10.1002/bit.10029

Effects of various environmental conditions on the transformation of chlorinated solvents by Methanosarcina thermophila cell exudates

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Effects of various environmental conditions on the transformation of chlorinated solvents by Methanosarcina thermophila cell exudates

������� �� ����� � ��� �� ���� ����� � � ��� � ������� ������� ��� ����� �� �� ����������������� ���� ���� �������

�� � �� ����� � ���� �� ��!

���������� �� �� ������������ ��� ������ ��������� ��� �� ������������� ��������� ��� ��������� ��� � � � � ������������! ��"��#����� �����$��% &��#&�&#'("&) �*% &��#&�&#++��)�#����% � �,���-�. ��� ���

/�.�� �� �� ���.$ ����) �..����� �� 0��� ����

"������ ������� ������� ���� ������� ����������� ���� ���� ����� �� �� ���� ��������� ����������� ����� � ���������� �������� �� ��� ������������ ��� �������� �������� �� ��� ������� �� ���$��#���.��� �$����$��� ���� ������ �� ����� ��������������� ��� ��������� �� � �� �������� ��������!������ ��� �������� �� ����� ���� ��� ���� � ���� ������������� ������� ��������" ������� ������ !����� ������� ��� ��������� �� �������� � ��� ��������� ���� � �$����$��� ���� �� ���� ��� ������������������ ��� ��� �������� ���� ����� �� �� ������ ���� ���� ��" � " ����������������" �������������"��� #"#"#��������������� �� �� ������� ��� ���� �� �� � ������� ����� ����� � ������ �� ������� ��������� �� ���������� � ��� ����������� ��� ��� ��������� ���� ���� ���� ������� � ��� ����� �� ��������� ��� �� ������������ ��� � ���� $ �� %&���'��� � &(���� ����� ������������ #)�% ������ �� ������ �� ����� �� � �$����$��� ��������� �� ���� ������������ ���� ��� �������� ������� ����� � !���������� �� �� � *�����" ���������� ���� ���������� ��� !� ("#)"#("%)������ �$���������%# +" %& +�������� �����,�" ������������� �- !�" ��� .� �������� ��� !� ��������� ���� ������ �� ������ ���� ������� �� ����� ��������� �� ����� �������� ������ � �$����$��� ��������/ �������" .� ���� ��� ���������� �� ���� ���� �� �������������� ��� ���������������� ����� �� ��� � �$����$��� ��� �������� ������������ ���� �������� ��� ��� ����� �� ���������� ��� ������ ���� *������� �����" � ��� ��������������� ���������� ���� �*���� ������� ��� ������������" ��� �������� �� ������� � ���� ������ ���� ���� �� ��� ������� � %))# 0��� 1��� 2 ����" �������.$�� ����� #$% 3&$�3$#" %))#�&��'���% ������� ��/ ������� ���� �� ��������/���$�����.���) ������ ������/ �����������

( �)*+,��(*

��� �� ������ ������ �� �������� ��� �� �� ������� �� ����� ���� ������ ������ �����������

������������� ����� ������ ��� ����� �� ���������� ������ �������� ������ ���� �������� �������� ���������� �������� ����������� �� ���� �� ������� ������ �� ������ �� ����� ���� �� ����!��� �"�#� ����������� ��������� � ���$� �%%&������� ������� � �� ��'�� �� ���$ �� �������� ������� ��� �"�#� ����������� ��������� � ���$�())��� #��������� ������ ��� ���� ������� �� *� ��� ����� �� ���� ������������� ��� ��� +��$ �� ������������ ������ � ��� ���� ���� ���� ��� ��� ���� ���������� ��� ��� �� � ������ ������ �,�� �$����� ���� �� ����� �� ��� �� ���� �!�� �� �� ��� �������� �� �� � ����������� �� ������� ����� �"�#� ����������� ��������� � ���$� �%%&����� ��� ��� �'���� �� ������� ������ �� ���������� �������� -���. $ �� ���'������� $�

/���� $ ������ ����� ������ ���� ���� ���!��� � �� �� ������ �� ����� �� ��� ������$������ �� �%%01 #���� ��� �%%2�� /������ ���� �� ������������� ��� �3���������� �� ��� ��� � ��� � ������� �� �� ������ �� ����� �� ����� ����� �$ ������� ������������ �-���� ���������� ��� ���� ��� ��$ ����������� �� ���� ������ �������� ��� �!�� ���������$ �� ������� ������ �� �%%01 #���� ��� �%%2���� � �������� �� ���������� �� ����� ���� ��������� ���� �� ��� ��4������ �� ������� � ��� $ ������������� ���� �� ����� � �� ��� ������� ����� ���������� 5�������� ���� ���� ����� �������� ������������� 6�(� ������� �70)� ���� ��� � �� ��� ��� ����� �6��� �� � �� �%%&1 6������� �� � �� �%%%1 ���� ��5������ �%%&1 8���9� �� :��.���� �%%�1 ;�� �� � ���%<%1 +�.� �� � �� �%<%1 +�9��� �� � ���%<21 +�!��� � �� ()))1 ��� �� =�� �� ;������$ #����� 6����%<%1 >�� �� � �� ()))��

��� ��� �� =�� �� ;������$ #����� 6�� �� ���"���� ?�� �� ��� ������� ��� ��� �� ������� 6�( ��� ��������� ��� �� � �� �� ����� ���� �� =�� ��;������$ #����� 6��� �%<%�� ���� ������� ��� �������!� �� �3������ $ � �� �� �� � �����$ �� ��

������������� �� �� /���.

������� ��� ������@ :��� 5������� ������ "�������$ ��

+��������

� %))# 0��� 1��� 2 ����" ���4'� #)�#))%5���#))%6

Page 2: Effects of various environmental conditions on the transformation of chlorinated solvents by Methanosarcina thermophila cell exudates

������� ������ �� ��� ������� ������ �;�!���� � �� �%%&�� #��� ��������� ������ ���� ��� ���*�� �$ �� ����� �� ������� �!�� �� �������$!����� �� �-�����

5�������� �� #����� "�������$ �� +���� ��#���� "�������$ �� �'��������� !��� ��� ������ ����� ������� � ���� ����� ?� �� ��� ��������� �� ��� ����������� ���� ��$��� �� � �� �%%2�� ���� ������� � ����� �'����� � �� ��� � �����*� �$ ;�� ����!�.�� ��%%%� �� �$�����(�&�������������'$ ��������� �'���� ����� ��� � ��� ���� ���!� �� � ���� �� ����� ��'��� !��� �������� ��� �� ���� ����� �������� ����������� �� ��� ���.�!� ����!�$�

/���. �� ��!�.�� ��%%<� � �� ���� ���� ��� �� �'����� �� ��� ������� �� ������������ ����������� !�� ������ �� ��� � ������ �� �� �� ���#�� -��������� �� ��� � �������� ����������� !������� ��� ��� � ������ �� �� �$ ��� �'������/���. �� � �� �%%<�� ������� ������ ����������� ���� � ����� ������ �������$ !�� ����� �� �����) .�� �� ��� � !�� �� ������� �� !�� ��� ���������� � �� ������� �?���� �� � �� ())��� :��� ��� �� �'����� !�� * ��� ���� � � �) .�� * �� ������������ �� � ��< �� ���� �2 �������� ���� �� �))�� �� AB)� �� ��� �� �� !����� < ����� ������2 �������� !�� ��� � ���� ���� ���� �� ���� ������ � ����� ���� ��� ��� ��< �� ���� ����� ��� ����� �� �������� � ����� ��� � �� ���� �� 9���� ������ ��� ��� �� ������� �$ ?���� �� ��!�.���())�� �� ���� ���� ��� ������ � ����� ������ � ������ ��� �� ���������� �'����� !�� �������� ����$�� �� ��� ��� �������� $ ��� ��� � ���� 9�������������� �������� ���

6������ ��� ������ � ���� �� ��� �� �����������'����� �������� �� � ������������ �������� �� �������� � ���� �� ��� �� ���� ���� �������� ��� ��� �� ���� �� �� ��� ������ ��� �������� ������������ �� -���������������� �� ��� ��� /�!��� ��?� �� �()))� ������� ���� � -���������������� �� ��� �� ����-������� !�� �'���� �$ ����������� �������� ����� +5�� �� ��������� �� �� � ������������ �� �!��� C������� ���� � �� ���� ���!� ������������ �� ��� � ������� �������� ��� �� � �� � ���%%<�� :��� 4� ��� !�� �������� !��� �$� ���� *� �� ��� �� . � ����� ���� �������4� ����������� !�� ������� !���� �����-���� $ ������� ��� ������������ �� �� ��� �� � �� � �� �%%<�� ����� �������� �$ �������4� ��� !�� ��� �������

� ���� � ��� ��� �� ������� 6�( �� �$�����(�&�������������'$ ���� �� �� ������ �� ���� ����������� ������� ��$��� �� � �� �%%21 ;�� �� � �� �%%%�� �������� ��$ �� ���� ���� ������� � ��� $ ���������� ��� �� ���� ��$ ���� �3���� ����*�� �� ���������� !����� ����� ������� ������ ��� � ���� �������� ��� �� �� ��������� � -�������� ��� ������������ ��� �������$ �� ��� �� �'����� �� ������������ ��� ��������� �.� $ �� �� ��������� ��

��� ����������� D� ��� �� ���������� �� �� �.� $ ������� �'����� !�� �� �� �� �� �����*� �������� � �� ��� !�. ���� ��� ���� ������ !��� ��� ���� ����� ?� �� �$�����(�&�������������'$ �����6������ ���� �� ����� ������ � ���� �� ��� �� ����������� �'����� �?���� �� � �� ())��� �� �� ������ � ������� ������� ���*� ���������� ��� ��� �'�����!� ������ �3���� $ ���� ��� !�� � �� �'�������������� ��� ������ ������� ��� ������ �� ��������� ��� ������ �� ������ ����������� �������� ��� ��� ������� �������$ �� ��� !�� � �� �'������� �� � ���$�� ��� �.� ���� �� ��� ���� ������ ��9��� �������� ��� � -������� �� ��� ������ � ������ ������ ���������

-"��)("�� " + -��.*+�

*� ��� /�'�� �� ����� �

� ����. �� ��� �� �� ���������� !�� ������� ����������� #��� �� ��� +�.�� �������� ��� �� ������ !�� �� ��� ��������� $ �� B)�� �� �������������� ��� �� �!�� ��� ��� �� +� ��C !����+� ����� 6���� +���@ )�))7< /�� (�&=(E1 )�)�) ���/=7�(� �#E7�(�&=(E� (�B) /��E01 �(& /=7� 1)�%)B ?=(�E71 ���0 ?(=�E71 )�B) $���� �'����1)�B �$���� ��$ ����1 )�(B /�(#�%=(E1 )�(B ;��$������ �$��� ���1 )�))� ���9���1 �) �;:� ��F������ �� ����� �:� �� �� � �� �%&0�1 �) �; ��������� ����� �:� �� �� � �� �%&0�1 02�2 �; ����� DD �� ������ �/���. �� � �� �%%<�1 �� 7 �; ������� � �� �������� $ ������ �/���. �� � �� �%%<�� ��� ����� !���4���� �� �= &�B !��� � + =� �� ������� �����7)��; ���� ���� �� ����� !��� ���$ ���� �������� �� ����� ����

�!� �������� ��������� �� ����� ��� �� ��� ������� ������� �-���� ������ �� ��� ���� ��� ���������� � ��� #�� ��� � =��� �������� !�� � ������ ��� ����� �� ��� ���� ������� �� ��� ��������� �� ��� �� �!�� ��� ��� +� ��C !����@ )�))� ���9���1 )�B%� /=7=�E01 )�B&2 + 6(�&=(E1)�B7) ?=�E01 )�()) ?=(�E71 )��)) ?=(�E7�(�=(E1 )�)<) �/=7�(=�E7� )�()) $���� �'����1 )�)))B� /=7GE01 �� 7 �; �� � ���� ����� �� ����� �07� H; ��6(1 (�B � H; ?D1 )�<0 � H; >�6(1 )�B � H;=06E01 )�B � H; /�(+�E7�(=(E1 )�BB � H; +�61)�7& � H; /�6(1 )�7& � H; ��6(�� ��� ����� !������ !��� )�0 /�(#�%=(E �� �4���� �� �= 2�(!��� 7)�=0�E7� ��� ����� �� ��� #�� ��� � �� ����������� �� ��� �� �!�� ��� ��� �� +� ��C !����@ )�� + � (�&=(E1 )�� ��� (�&=(E1 0�) /�(�E01 )�B /=7� 1 )�& /�(=�E71 )��)(B �=0�EE/�1 )��(B ;��$������ �$��� ���1 )�� �; �� %%�<B� �������� ���1)�B ?=�E01 )�2B + #E7�2=(E1 �) �; ������� ��� ����� �:� �� �� � �� �%&0�1 �) �; :� ��F� ����� �� ������ �:� �� �� � �� �%&0�1 �� )�))� ���9���� �������� !�� �4���� �� �= 2�)�

789�9:8; 8;4 ;'<8=� �>8;� '>:8��'; ' �+?'>�;8�94 �'?<9;�� 7@ �9?? 9-A48�9� 3&(

Page 3: Effects of various environmental conditions on the transformation of chlorinated solvents by Methanosarcina thermophila cell exudates

��0���� �� ��������

� ������� ����. �� ����� �� ���� ������� ���� ������� ���� �� ���������� !�� ���� ��� !������ ������� ������ !�� ��������� $ ������#������ �-����� ����. �� ������ �� ����� ��������!�� � �� ��� �$ ��� 0 �; �� ������� ���$ �� ��� ��� ���� ���� � ��������� �#� ��� #��;����� +E� �� 0<��; ���� ���� �� ��������� () �;+� ��C !���� ��� �-����� ����. �� ������ !�� ��� ���� �� ���� �'���������� ���������� !�� �!� �� ��� ��������$ �����

�� ���� * ��� ���� � )�((��� �� $������ �������#� * ��� �+� ����� �� �� ��������( ����� ���$�8��� ;�.�� +D�� � ����� ������ ����� �� ��� * ����!�� ������ �� ��� �������� ����� �� ����������������� !�� ��������� ���� ���� �'������������ * ���� !�� �4���� �� � �= �� <�B� ���� �� ������ �� �� ?���� �� ��!�.�� �())��� ������� �; ����� * ���� !�� �� �� ((��; �������� �������� ���� � �� ��� � !��� ��I��� ��� ���� �������� ����������� �� ��� ��� � �������� �� %2� /(H0� =( ������������� ������ �� ��� ����� �� � ��� � !�� ��������� ������� $ �� ��� ��������� �(0��� �� ��������� �� ��� �'�������� �'���� !��� ����� � ��� �!�� ����� �� ��� ������ +���� ����� � !�� ������ �� ������ ��� �� ��� �� �� ������� ��� �� ���� �9������ ��� ��� �� ��� ����� ������� !��������� �$ �� ������� ���$ �8�� ��� �����

���������� ������ ����������� ��� ��� ���� ������ ��������� !�� �� ��� ��� �-����� ����. ��� ������ �� ������� ��� � �� �� �� ��� �'�������� ������� ������������� �� !�� )�)02B ��� �� �� �)�0<� H;�� )�)2B ��� �� �� �)�B% � H;�� (�2 ��� �� ����(%�B( � H;�� 7�)B ��� �� ��� �0B�� � H;�� �� )�)B(B��� �� ��������� �)�7& � H;��

������� ��� �� !�� ��� �� � ��� ������� �������� �'���� �������$ �� �� ��� ���� � ������ ����������� $ ����� �?���� �� � �� ())��� G�� � !�� ��������� �� (0� �)� � 7�� �� ��� ������ �� ��� �'��������� ��� ����� ����� !�� �������� �� (0��� ��!�� �� �)�)02B ��� ��� �� ���� ��� �� ���� ��� �'��������� #����� !�� �� �� ��� ���� �����������

���� ������ ���� ��� �� ��� ��� ���� ������� �� ���� �� B �� �� ��� ��� ���.� �� B))�� �� 0)��� �� ����� � ���� ������ !�� �� �� �������((��; �������� �������� � ��� �� D� ���� �'��������� $ �) �; �� ��� * ���� � ����� !�� �� �� ����������� � ��� �� ��� *�� �= �� ��� ��� �� ������ * ���� ��'��� !�� �4���� �� �= <�B �� ���.�� ��

� ;�� ;��� ������ �� ��� 5����� �� ��� ������ ����� �'������� ���) ���� �� !�� �� �)�)2B ��� ���)�2& � H;� �� �� �� ��� �'��������

���������� ������� �� !�� �� �)�0 ��� ���0�)7 � H;� �� * ���� ���� �� ���$ �$ �� 0B �$�� ����� � ������ �� �� !�� �� �� ��� ����� ����� ��� �$ � �� ������� �� ��� ��� ����� =����������� �� !�� ��.�� �� �� �� �� ���������� �B���� 7 �� �� (7 � ���� ���� �� �������

������ !��� ���� * ���� �� * ���� ���� !������ �� �)�� �� �� <������ ���� !�� �� �� ((��; �������� � ��� �� ��� �� ��� � ������� �� �������������� �� ��� �� ������ ��� �� ��� * ������ ���� ���������� !�� B02 � H; �� ��� <������ � ���� ��� BB< � H; �� ��� ���� ���� �� ���� �� ���� ���� ���-������$ �� �� � �� ���� ���� � !��� * ��� !�� ��������� $ �-�� � �� �� �� ������� �.� $ ���� ��� ������������� �� ������ � ���� �� ��� �'����� !�� � �� ��$���� �� �� �)�)02B ��� ��� !�� �� �� �� �� ����'��������

"�� ��������� � ��� >��� B��)��B�()����� �7��$��$ ��(� =� (0 =�������� ����.�� ��� � ���� ������������� �� �(�B � 9���H�;� �� ��������$�� DJ 9������ � ���� ������������ �� �(�B � 9���H�;� �� ����+� !��.��� :D� !�� ���� �� �� ��������� ��3��)�%)B ?=(�E7� ���0 ?(=�E7 �� ��� �� +� ��C!����� ���� !��� ��B H; ;��$������ �$��� ������ �4���� �� � �= �� %�)� � ���� � �� ��� ����� $���*� �� �'����� ��������� � ����� ��� � �� 9������ � ���� ������������ �� �(�B � 9���H�;� ?���� ��� �� ())�� !�� ���� !��� ��B H; ;��$������ �$���� ��� �� �4���� �� � �= �� %�)� �� ���� �� ��������� ����� � ������� �� � ���� �� ��� �!� ����$���� ������ �� ��� ����� $ ���*� �� �'����� ������ ������ !�� �� �� ((��; �������� � ��� ����������� ��3� ��� ��� ����� �� � �= �� %�)� !�� ������ �� � ���� � ������ �� ���� �� � �� ����� ����� ��� !�� �� �)�)02B ��� ��� �� ���� ���� � �� �� ������ �������$ !�� ������ ��� �����

# ����� � ��� K� ��� ��� � ������������ �� ()) �+�!�� �� �� ��������� ��3� �)�%)B ?=(�E7� ���0 ?(=�E7 �� ��� �� +� ��C !����� ���� !��� )�(B H; ;��$������ �$��� ���� �� �4���� �� � �= �� <�B�������� �; �� ��� �� ����� ��� ��� ������ !�� �� ��((��; �������� � ��� �� ��������� ��3� ��� ��� ������� � �= �� <�B� !�� ����� �� � ���� � ������ ������ �� � �� ����� ����� � �� !�� �� �)�)02B��� ��� �� ���� ���� � �� � ������ �������$ !�������� ��� �����

3&3 7�'�9�+;'?'B@ 8;4 7�'9;B�;99>�;B" <'?� C(" ;'� 3" 49�9:79> %)" %))#

Page 4: Effects of various environmental conditions on the transformation of chlorinated solvents by Methanosarcina thermophila cell exudates

$��� � � ���� ��� �!� ��������� �� ���� ������������ �� #�� ��� �� !�� ���� * ��� ���� �)�((��� ��# * ��� �� ��� * ���� !�� ��� $9� �� ��� ������ �������$� �� !�� �� �� ��� ���� �������� �)�)7B ��� ��� )�7& � H;� �� #�� ��� � �)�)&��� ��� )�&� � H;� �� �'����� �� �� �� ��� �'���������

1������.�� ���$��

��� �� �� ��������� !�� ������ ���� � ��������� �������� � ���� � �� � 8� �� ��� �����*���$����� � �������� �� ���� �� ���� �'��������� ������ ���� �� ��� !�� � �� ������ �$ 8� ���� ����� ��4������ �� �'�������� ���� �-��� ����������� ��������� ���� ��� ��� �� ���������� �$ ����������� �������� � ���� ���������� ��� ����'��� �������$ �'���������� #����� �� ��� ���������� �'������� !�� �� �� (0� �)� �� 7���

% �������� ������ ��� ��� �� ��������� !�������� !��� � ��.�� 2))) �������� �������� ��+����� E=� ���� � �� � 8� �=�! �������.� &<%)��� � � ��� ��� �-����� !��� � ����� ����� ������������ ������� ��� ������ �� ��4���� ����������� !�� ��� �� (B) �� (()��� ��������� $� =��������� ���� �(B) �;� !�� �!� ��� ��� � �$ ��� ��������� �� ��� �� �� ���� !�� ())@�� � 0)�� � )�0(��� �)�(B��� =��B ���� �$ �� ��� !�� ��� �� ���� ���������� �� �� ���� ��������� �� 0B��� =� �������� ��� !�� ��������� �� �� ������ I�! ��� �� B�)�;H��� �� ���� �� � I�! �� )�� �;H��� ���� ������� G�� � !�� �������� �� ��� �������� �������� ����� � �� ���� ���� � �$� +���� �������� ����� !�� ������� �� �� &��B � �)�2 ��� � &�)) ��)�& ��� � 0�2 � �)�7 ��� � �� ��7� � �)�B ��� ����� �� ��� ��������� ���+� �� ���������� ���������� $ �+���� �)0)�� ������� ��� �� =�� �������������� �%%<��

��� �� &�'���� ������ ��� $��� �� �� �� ��!�� ������ �� � 8� �=�! �������.� &<%)��-����� !��� � ����� ��� ������ �� ��4���� ����������� !�� ��� �� (() �� ())��� ��������� $� �����4������ �� �� ���� !�� 2)@�� � 0)�� � )�0(��� � )�(B��� ���� �$ �� ��� �=��B� !�� ��� �� ������� ��������� �� �� ���� ��������� �� 7)��� =���������4������ �� ���� !�� �)) �;� =� ��� ����� ��� !���� �� � I�! ��� �� B �;H���� +���� �������� �����!�� 0�0) � �)�& ��� � ��(0 � �)�7 ��� � (�BB � �)�0

��� �� ��� ��� �� ��+ ��������� $�

��� $��� �� ��� �� ��� !�� ������ �� �=�! �������.� &<%) 8� �-����� !��� � ����� ��������� �� ��4���� ���������� !�� ��� �� (B) ��

(()��� ��������� $� ��� ��4������ �� �� ���� !�� ��� ���))@�� � 0)�� � )�0(��� � )�(B��� ���� �$ �� ����=��B� !�� ��� �� ������� �������� �� �� ������������� �� 7B��� =������� ��4������ �� ���� !���)) �;� =� ��� ����� ��� !�� �� �� � I�! ��� �� B�;H���� +���� �������� ����� !�� 0�0) � �)�& ��� �� ��(0 � �)�7 ��� �� ��� �� ���� ��������� $�

+� " �����

�� ������ ���� !�� *�����@ �'H�L�.�'�!��� �' �� ��� ������������ �� ��� ������� �� ��������� . �� ��� *����� ��� ���,������ �� � �� �������� ��� ���,������ !�� ���� �$ �������� ���� ��� �� ��� ���� ��� ��� �� ��� ����� �-������� ���'H�)�L�.��� ��� *�� ������ ������������ !����� �� ��� ������ ������������ �� ��� ������� ���������� �)�

#��������� �� ��*����� !�� ������� �� ��� %B����*���� ������ ���� � �!����� ������ ������������ �� G�� 6� �� �%%0��

)��,��� " + +(��,��(*

��� � ������ ��4������ �� ���� !�. �� �� ��� ��� �� �'����� ��� �� ���������� �� �� �� ���� ��������������� � $ �� � ��� �� ������ ������������� ��� ����� !� ���� .��! ��� ����� ��� �������$ �� ������'����� ��� ��������� �.� $ �� �� ��������� �������

����� ��� ����� � +������ �

�'�������� !�� ������ �� ������� !����� ����'����� !�� ����� � �� � ��� ����� ������ ���!��� ������������� ��� ��� ���� ���� ����������� !�� � �� �$ ��� �� * ����� �������� ������ ��� ���,������ �� ����� �� ��� � D� ��!�� � �� ��� ���� ��� $� �� �� ��������� !��� �� � �� ��� $� �� ��� �� ��� !�� � ����� � �! $� ���� ���!� ���� ������ � ���� �� ��� �'������ �� ����� � �� � ��� � � -��������� �� �� ������� ������� �� � � ����� $ ���� ���� �� �����

����� �� �� ������ ��� ���,������ �� ����� �� ������ ����

��������� !��� �� ���������� �� �'������

������*�� �� ��� ��������� �����

������� �� ���� +����

�� ��72) � )�(<)� )�)(2 � )�)�)

�� )��)2 � )�)0) )�))( � )�))�

��� )�))B � )�))� )�))) � )�))�

��� )�))0 � )�))� )�))� � )�)))

��������� )��7% � )�))2 )�))) � )�))(

�� ��� �!����� %BM ���*���� ������

789�9:8; 8;4 ;'<8=� �>8;� '>:8��'; ' �+?'>�;8�94 �'?<9;�� 7@ �9?? 9-A48�9� 3&C

Page 5: Effects of various environmental conditions on the transformation of chlorinated solvents by Methanosarcina thermophila cell exudates

:��� �� !�� � ��� ��� ������� �� �� �<�B2��� ��� ������ �� ������������� !�� ���� �� ��� $� ��� ��+ !�� ��� ������ �� ����� ��� � ������� �� �� � ��� ��� � ������ �$ ��� �� �'������ � ��� ����� ��� ����� �������� ������6��.�!� ������ �� ��� �� ��������� !�� ������� $ �'������ ���� �� ���� ���� ��� �'����� ��$� �� ����� *�� ������������ !������ ��� ������ ������ �� .��!� ������������ � ���� � ��� !�. ������ ������� �� ����$ �����

���0����

5������ ������� $ ������� �� ��� �� �'����� ���� ���������� ���!� ���� ���$ !�� ������ �� ����������� �� �� ��� 0B �� &B�� �?���� �� � �� ())���6������ �! ���������� ��� �� � ������ ����� ����� ��� �� ������������� ��� ������ �� �! ����������� �� ��� �������$ �� ��� �'����� !�� ������ �� ��� ���!� �� � ������ �� (0� �)� �� 7��� �� !������ ��� $ � �� !����� < ���� �� � ���� ������������ � ��'���� �� )�))0 ��� �� �� �� !������ ��� ��� (0�� * ���� �$������ !���� !�� ������-���� $ � ��� /� ��+ !�� ������ �� ��$ �� ����$������ ����� ��� �� �� ������ � $ �'����� �� ��������� �� ���������� �� !���� ������������ ��$ �� ����� �$ �� ���������� !���� � �!� ������� �!�� �� � ������ �����

���� -���

D� ��� �� �'����� �� �� �� ��� �� � ��������������� � $� ��� ��I����� �� ��� ����� �� �� ��� � ������� �������$ ���� �� .��!�� �� �� ( ���!� ��� �� ������ �� �� ��� ���� �� �!� ��� ���� ��� �� !��� �� !����� (�(B ���� �� ��� �� ���� ����� ������ �� ��� �-���� ������ ��� ���� ������� � ������� B� � ���� ������� �� ���� �� ��� *�� (�(B���� ��� � ��'���� �� ����'����� $ )�))% ��� �� ��

���� �$������ �� !�� �����-���� $ � ��� +����� �� ��� � �-���� ������ !�� ��� �� � �� ���������� �� ������ �� �������� �� � ���� ����� ������� ������� �� ���� ������ � ������� ��� ����������� ���� �� ����������� $9� ��������� �� � ����� ��� �� ����� ����� � ��� � ��'���� ���� 7 ���� ��)�)�( ��� ���� ��� � ��� �����-���� $ � ��� ��+!�� ��� ������ �� ��$ �� ��� �$������ D� ��� �� � �� $���� ��� ����� ��� �� ���� ��� ������� �� ��� ��-���� ������ � ��� ������ ��� � ������ ������ ��� ������ � ���� �� ��� * �����

+������ �0����

�� ������� �� ��� ������ ���������� !����� ��� * ������������� �� ��� ���� $��� � !����� ���$ �� � *���������������� �������$� � �� ���� � ������ ���$!�� �������� �� �� 0 ���!� ���� ���� ���� 0B �$��� ������ �� �������� )�0 ��� � �� �� !�� ����� ��� $ � �� !����� (7 ����� �� �����������!�� � �� ��� 7 ���� ���� ������� D� ��� �� �������� � ���� � � ������ � ��� ����� ��� �� !��

���� � D����� �� �! ���������� �� �� � ������ �$ ��

���������� �� �'������ #$��� � �� �� �� �!�@� * ���� �� (0��� �* ���� �� �)��� � * ���� �� 7��� � ����� �� $ �� (0��� � �����

�� $ �� �)��� �� � ����� �� $ �� 7���

���� �� �� �� ������ �� � ��� ����'� #$��� � �� �� �� �!�@ �

* ���� �� � �������������� ���� � ����� �� � ��������������

���� � * ���� �� ���� ������ ���� �� � ����� �� ����

������ ����

���� �� ������������ �� �� � ������ �������$ �� �� ������

����� �� �'������ #$��� � �� �� �� �!�@ � * ����1 ���� ��� ��

����� �� $�

3&D 7�'�9�+;'?'B@ 8;4 7�'9;B�;99>�;B" <'?� C(" ;'� 3" 49�9:79> %)" %))#

Page 6: Effects of various environmental conditions on the transformation of chlorinated solvents by Methanosarcina thermophila cell exudates

� �� ���� ���� 7���� �������� ��� ��� ����� ����� �'�������� !���� �������� ���� � ������ ����!�� ������� �� ���� �'�����

�� �� 7 ���!� ��� �� �������� ������ �� ��� �� ������ �������$ �'�������� D����� $� ��� ������� ��� �� ���� !�� �������� �� �� !�� �� �� �B��� ����$ �$ �0 �� �� �������� ��� �� !�� ��������!���$���� ���� ���� �� ������� �� �� � !�$�� �� �� �� �! �������� ������ � ���� �� ��+ !��������� ��� ����� �� ���� ������ �� �������� �������������� ������ �� ������ $ ��� ��� D� �� ������ ����� ����� � ���� �� ������ �� ��� �� �'������ ������� �������� �� �� ��� ��� �� ���������� �� ���������� �� ������ ���� �������� �� �� �����������

D� ��� 0B��$ ���� �� ��� �'������� ����'����� $�)�( ��� �� �� �� !�� � ��� ���� �-����� �� �����'����� $ �)B � H; � �� �� 0B �$� �� �����'����� $ 0�� � H; � �� ���� �$� �$������ ������� �� *� !�� ������ �)�(B H; �� ����� �� ����$���� �� ���� ��� ��� ������� � ���� �� ��� �'������� D� ��� �� � �� �� *� ������� �� �� ������ �!� � ������H�� �� � �!� �� �� �� �$������ ��������� �� ������ ��� � �����H�� �� �� ����� � �� ������ ��� ������ � ���� �� ��� �� �'���� ���� ���� ����� �������� ������ ���� �������� �� � ��������������$ �� ����'����� $ (2�B ��� �� �� �� �� ��� �6��� �� ��� ��� ��$ �� ��� �� �'����� �� ������ $�� �3������ $ � �� �� � ������������� �� ��� ����� �$���� $ � �! I�! ��� �� ���!���� �� �� �.� $���� ����� �� �'����� ��� ����� �� �3��������������� ����� $ �� ���������� �� !���� ��� �-������ ����� �-��� �� ������� ���� ���� ���� �� . �������� ����� ����� � ���� ������ � �� *�� ������� � �� �������

������� �� ����� � +������ "�������

D� ����� �� �'����� �� �� �� ��� �� � ������������ � �� �� �������� �� .��! ��! ���� � ������� �� ������ �������$� �� ������ ��� �3��� �� ���� �� � ����* ���� ���� � �� �� < ������� ���� � ����� ���)��� !�� ��� $9� �� �� � ������ �������$� ��� �DD ���!� ��� *����� � ������ ��� ���,������ ����� �!� ���� ��� � ���� � ��� ������������ �� ��������� � ���� �� ��� * ���� �� �� ��� ���� ���� �'��� $��� ���� �� ��� �!� ���� ��� �� �� �������� �� ���� ������� �'����� �� ��� ��$ ������ ���� � �� ���� ������ �� ��� < ������� ���� � �� � �!� � ������� ��� ���,����� ���� ��� ���� ���� �1 ������� ������ !�� ��� ����� � �� ������� �'���� $ ��� ������������ ������������ �%&� �� ��� �� !�� � ������ B�(B ������ �� �������� ��� �� !�� ��� $ �!���� !�� �� �� �)�)(( ��� �� �� ��� < ������� ���� ������� )�))% ��� � �� ��� ���� ���� ��� �� � ����� $ �� ���� ���� �� �� ��+ !�� ��� ������� D� �������� � ���� ��� ���� ��� ������ � ���� �� ��� �'�������� ���. �!�� � ���� � �� �� � �� �.� $ ���� ��$ �� ���� � ����� �� �-��� ����� � ����� � ��� ���������$ ������

���� �� �� ������������ ��* � �� ��� �� � ������ �������$ �'������� !��� �� ���������� �� �'������ #$��� � �� �� �� �!�@ �

* ����1 ���� ��� �� ����� �� $�

����� ��� #��� � �3���� �� �� � ������ ��� ���,������ !���

�� ���������� �� �'������

�'���� 6���� ��� �

� �

�� ������*�� ��

��� ��������� �����

���� ��72) � )�(<)�

< ������ )�702 � )�)0B

+���� )�)(2 � )�)(B

����� �!� ��� %B� ���*���� ������

789�9:8; 8;4 ;'<8=� �>8;� '>:8��'; ' �+?'>�;8�94 �'?<9;�� 7@ �9?? 9-A48�9� 3&6

Page 7: Effects of various environmental conditions on the transformation of chlorinated solvents by Methanosarcina thermophila cell exudates

1� � ��0��� �����

�'�������� !�� ������ !��� 9��� ����$��� ��� ���$ !����� ���� �� ��� �� !�� ����� � �� ��� ��� ������ ������ ������ !��� ��� �� �'�������� �� ����������� ������� ������ !��� ����� �� �'����� ��������� ���� !��� ����� $ ���*� �� ���< �� ���� �2 �������� ���� �� �))� � �� �B)� ����� �� �� �� < ���� �?���� �� � �� ())��� 6��� ������ � ����� ���� ��� ��� ��< �� ���� ����� ��������!�� ��� � ���� ���� ���� ��� � �� ��� ��� � ����� �� �������� � ����� ��� � �� 9���� ��� ����� ����� ���� �� ��������� 9��� ������������� �� �� ((����� ��� ������������ ������ �� ���������� ������ ����� � �?���� �� � �� ())��� ����� ��� �!���� � ���� �� ���������� �� � 9��� ��������������!�� ������� �� ��� �� � �������� ����� �� ����'�������� !��� ��� 9��� ����$���� ��� �� � ������� ��� ���,����� �� ��� %B� ���*���� ������ � ����� �������� ����� !�� )�<�2 � )��)7 ���� !��� %<�%��� ��� �� �� � �� ���� &�(B ����� ��� ��� ������ ��� ���,������ �� ��� �$����� ��������� 9��� B��)��B�()����� �7��$�$ ��(� =� (0 =������������.�� �� ��������$�� DJ 9��� !�� )�&(� � )�)7��� )��7B � )�)(& ���� ��������� $� !��� %&�<� ��B&��� �� ��� �� �� � �� ���� &�(B ����� ����� ��� ��� �� ��� ��3� ����� !�� ������ � !��� �*����� � ������ ��� ���,����� �� )�))% � )�))0��� �7�<� ��� ���� &�(B ������ D� � �$����� ��$ ��� ��� !�� ���� ��)�))� ��� ��� ��$ �� ���� !�������-���� $ � �� �� ��� �$����� ��������� �����9��� ����$��� � ��� ����� $ ���*� �� �'������� ���� � ���� �� ������ $ ��� ���� �� ��� ���� �������� � 9��� �������� �� �� ��� � ������ �� �� ������ ������������ �$ ����� ���������� �� �'�������� ��� ����$ ���� 9��� ����$��� ��� ���������� ������� ��� �������� �������� �� ���� ���������� !�������� ������ !��� ��� �� �'������

����� � �����

� ���� � 9��� �������� ��� ��� �� ������ �� ����� �'����� �� �� ����������� �� �� � �� ������ � �������� �� ��� ��� ���� �� -�������� ��� �� ��� �������� � ����� ������ ������� �� ��� �'������ ��������� �� ���� !�� �.� $� ��� ��� -������ 4� ���!�� ������� ��� �� � �$���� ���� � �� ���� ������ ����� 9��� ����$�� ������� K� ���� �������� ���������4� ��� ��� ���������� !��� �� *� �� � �� .�������� �� ����� � �� � �! �� ������������� !��� ������ *����� � ������ ��� ���,����� �� (�(< ��)�7 ��� ��� �� � �� � �� �%%<�� /������ ���� �� !�� ���.��!� !����� 4� ��� !�� �� ����� � �� ��� ����� � ������ �� �= <�B !��� �$������ �� ��� �� . ��������� D� ���� �'������� ��� �� � ������ ������,����� �� ��� �$����� ��������� 4� ��� ����!��� �$������ �)�))2 � )�))< ���� !�� ��� �� ��*���� $

�3���� ��� ��� �� � ������ ��� ���,����� �� ����$����� ��������� ��3� ���� !��� �$������ �)�))0 �)�))B ����� �������� � ���� � -������� ��$ �� ����� �� �� �'���� � � � ����� ������ �� �� ���� ��������� ���� �� ��� ��� ����� �.� $ ���� ���� �� ���� �� �� �������� � �� ��� ��$ ��� � ������ ���� �$ �� ���������� �� �'������

*��� �������

����� ������ �� �'����� !�� ������� ��� � ����� ��� �� �� ����������� � �������� �� ������� ������ �� ��� ����� $ ������ �� ��� ���������� � ���� ���� �� �'����� ��� �� ���������� ��� ���� $ ��������� �� �� �� ��� ��������� �� ��� �������� �������� � ����� �� �� ������ � ���� ���� � �������!���� ���� ����� $ �� ��������� ����������������� ���� � ������ �� ����� ��� � DDD ���!� ��� ��� ������ ��� ���,������ �� ��� * ���� ��� ��� �!���������� �� ����� ��� �� �'����� ��� ���� ������� ������� ��������� �� ��� �� ��� #�� ��� �=��� ��������� �� ��� !�� �� � �� ������ ��������������� � ���� � ������ * ���� !�� �� � ��� �� �� �� ��� $ �� ��� �� ���������� �'������D� ��� ���� ������� �� #�� ��� � =��� ���������� �� ���� 0B� �� �)�� ��������� $� �� ��� ���� !�� � �� �� ��� !���� !�� �����-���� $ �� ��� /� ��+ !�� ������ �� � ����� �� ��������������� �� �� � ������� $ ������ �'���������� �� ����� ������ !�� ������ �� ��� * ��������������� ���� �� ��� ���� �� ����� �!� ���� ��������'���� � � � ����� ������ ������� !�� �.� $������ �� ������ �� ��� � ������ �� ���

�* ��,�(* �

��� ��� �� ��� �� �'����� ��� �� ���������� ���� ������ �� ���� ��������� ������ ������� �6������ ��� ������ � ���� �� ��� �'����� ����������������� $ �� ����� ������� �� �� ��� �������$ �������� �� ����� ��� ����� ������ �� ����� ����� �������� ���$ �� ��� ��� ��� ��������� !��� �������������� ���� �� � � �� �� ������� �� � �������� � ���$� ����� �� �'����� !�� �3������ ��

����� ���� �� � ������ ��� ���,������ ��� ��'� �� ��� ��

�'������

���������

�� ��� #����

�� ������*�� �� ��� ��������� �����

�� ���� +����

���� �������

�-���� ������

)�)<2 � )�) �)� )�)�& � )�))7

#�� ��� � =���

�������

)��(( � )�)�0 )�))< � )�))(

�� ��� �!����� %B� ���*���� ������

3$) 7�'�9�+;'?'B@ 8;4 7�'9;B�;99>�;B" <'?� C(" ;'� 3" 49�9:79> %)" %))#

Page 8: Effects of various environmental conditions on the transformation of chlorinated solvents by Methanosarcina thermophila cell exudates

� ��� ����� �� ������ ��������� ��� ��� ��� ��� ���� ���� �� ���������� ;�! ������������ ��� ������� �� ��� ����� �� � ��� ���� � ������� �������$� �� �� � ������������� �� �� !�������� $ � �� �$ ��� � ����� ������ ������������� �� ��� �'������ ����� �������� �� ������ � $������� !��� �������� ���� �� ��� �� � �������������� ����� $�

��� �������$ ������ �� ��� �� �'����� !�� ����������!��� ��� �� � ������ �������$ �� �!� 9��� ����$����9��� B��)��B�()����� �7��$�$ ��(� =� (0 =������������.�� �� ��������$�� DJ 9���� ��� �� � ������� ���� !�� ��� ���������� !��� ��� �������$ ������!��� ��� ��� -������ 4� ���� ���� �� ������� !�.�?���� �� � �� ())�� �� ���� ���� ��� ������ � ���� �� ����� ���������� �'����� �� �������� ���� ��������� $ ��� ��� ���� 9��� �������� ����

��� ��� �� ������� ��� �� ��� ���� ��� �� ����������� �� �'����� �� ����� � �� � ��� �� ������� �� ����� ��� ���!��� ����������/������ ���� � �� �� ���$ �� ���� �� �� $ ���������� ������� �������� �� ��� ������ � ���� �� �� ����� ����������� �$����� �� ��������� �� �� ������ � �������$ !� �� ��� !��� ���!���� D� ���� �� ��� ����� �!�$ �� ����� �9� ����� ������ � ����� ������ ��������� ��� ���� �� � ����������� � ��� ��$ �� �������$� D��� � �� ������ � ���� ���$ !� ��� �� ����� � ��������� � �������� �� !���� ���� ��� � ��$ ��� �� ��� ��� �� �3������ ���������� ���� $� ���� ���� ��� . ������� �� �-��� �� �������$� �� ��� ����������� �� �'��9� �-���� �� ��������� ��� ������ �� �������� !�� �� �-����

D� �����$� ��� ��� �� ��� �� �'����� �� �� ����������� �� � ��������� ������ � $ �� �� �������� ����� �� ������� �� !����� ����� ������� ��������� ������ ���� ������� 6�( �� �$�����(�&�������������'$ ���� �� �� ���� ��������� ����� ����� ���� ���� ���� �$�� �� ��������� � �������� ��� ���� ����� �3������ $ �� ��$ ������ ��� !�� $ ����� ��� ����� ��� � �� � �� ()))1 +�!� �� � �� ()))��

:� ����. ;��$ ����� �� 6� ��� � ?������� +�/�� �

�� 6$��� 6�!�� �� ���� �� ��� � �� ��������

)���� ���

������� ��� �� =�� �� ������������ �%%<� #���� ������ �� ���

�'��������� �� !��� �� !����!���� ()�� �� 6� �����@ "����

6��. �����

6��� �� �� ���$� �� #���� +� 5����� ;� �%%&� 5������� ��

�� �������� �� ������ �����$ ��� �� ���� �����$ ��� �����

$9� �$ ������� 6�( �� ���� ������ �� ����� ������ �$������

������ �� ������ 0)@0)72N0)B(�

6�������� K� �� �� :� #��!�9������ 5�� �%%%� D�� ����$�� ��

�$������ ������ ������� �� ��� �� $�� � ����� �������� ��

���� ������ �-����� �� �����@ ����� ��� $��� �� �����������

������������� ������ �� ������ 00@�)�BN�)()�

����� � �=� �%%0� 8���!��� ������� � $ �� ���������$�

/�! O�.@ K��� :� �$ P #���� � 7(7�

���� ��� 5����� +� �%%&� ������������ �� ����� ������ ���

�$ ���� ������� 6�( �� �-����� �$������ �� ������ ������ ��

������ 0)@�<<(N�<<%�

�$��� +� ������ #� ���4� K� �� � �#� ?�!.� E� 6��� ��� +�

�%%2� ��� ������ �� ����� ��������� �� ������� �� �-����

����������� !��� ����� ������ ���� D�@ D������ �� �������

������������� �� ������ E=@ 6���� � ����� � B)2NB�(�

����� ;�� G�� 6� � 8� �%%0� 6������������@ � ������ � $ �� ���

��� �� ��������� /�! O�.@ K��� :� �$ P #����

8���9� �K� :��.��� ;�� �%%�� 5������� ��� �������� �$ �������

�������������� ����9$���� ������ �� ������ (B@2�BN2((�

?���� 6:� 6������� K;� /���. �K� ())�� D������ ����� �� �� �'��

���� ������ �� ����� ������ ��� �� �� ����� � �������

(�������7 (����� 27@�(N�2�

;�� ��=� ;�!�� ��� ���9��9$��.� �� ��!�� 5;� �%%%� D����*���

���� �� �� �'���� � � ���� $�� �� ����� ������ ��� ��� ��

������� ��� ��� ������� � ���� ����� ?� �� �$�����(�&�

������������'$ ����� (����� (������ )�� ���� � (& @B&(NB&&�

;�!�� �� +�� +� 6�!� �� �%%&� ���������� ����� ��� $��� ��

����� ������ ��� ��� � ������� ���� $9� �$ ���� � ����� ��

��� ������� �� ���� � �������� �DDD� ����� � ����� ������ ��

������ 0)@(%(N0))�

;�� �8� /����� /� +�9��� �?� /� �� #� �%<%� D�I����� �� ��(Q�

/�(Q� �� ��(Q �� ��� �������� �� �����$� �� �$ �������

������ *��+���� %��� ���� (���� 0)@�%&N())�

+�.� �#� � ���� K�� +�� � �� �%<%� ���� � ������� �� ����� �$

� �����$ �� ����$��� �� ������ %��� ������ ���� BB@�(B<N

�(&��

+�9��� �?� /����� /� ��.�9�.� #� /� �� #� �%<2� �������� ��

�'���� � � ������� 6��( �������� ��� ������� �$ ���

���������� *��+���� %��� ���� (���� (&@B��NB�&�

+�!� �#� ; �!� $� �� ����� #� ;��� � #� 6�!� #� +� � ?�

8��� �� 8���� ?� ��;�� 8� ()))� ��� ����������� ��

D� ���� ������� 6�(����� $9� ������� ��� ��������� D�@ ��$����

�� ����� ������-��� �� ������ E=@ 6���� � ����� � B)2N

B�(�

/�!��� �?� ?� �� 5� ()))� � � � �� �'���� -������� �� �'���

�� � � � ����� ������� ,� �� 7)B@%7N%2�

/���. �K� ����� � ;� ��.�� 8�� �%%<� 5��� ��� �������� �� �����

������ ��� �� �� ����� �$ �'���� � � � ���� �� �� ���� ��

������������ ����������� ������ �� ������ 0(@0�0(N0�0&�

�� �� � K�� 6�������� K� �� �� :� #��!�9������ 5�� �%%<� D��

����$�� �� �������4� ��� ������ ������� �� �� $�� ��

����� �������� �� ������� �� ���� ������ �-����� �� ������

������ �� ������ 0(@(70�N(702�

��� �� =�� �� ;������$ #����� 6��� �%<%� "�� �� ���� ��� ���

���� �'�� �� ��� � �������� "? ������ ��� %)(7(7%�&�

#���� �� ##� �%%2� 5��������� �� ������ ��� � ��������� /�!

O�.@ ;�!�� ��� ������ � 0&(�

"�#� ����������� ��������� � ���$� %%&� � ����� �� ��� ������F�

!���� �����@ ��.��� �� ������ � $ ����� 5���� /�� ��� B7(�

5�%&�))B� ������ � $ D��������� E,��� :����� ���� ���

"�#� ����������� ��������� � ���$� ()))� /������ #������

���������� ������� ����� ����@HH!!!����� ��H�������

:� �� ��� :� �� +K� :� �� 5#� �%&0� �������� �� ������� �$

������� �'������ # (�� ���� (0<@(<<(�

>�� #� #����� =�� �� ���� K�� ()))� ����� ������ ��� � ��

�����@ �3��� �� ������� �!�� �������� �� ������� 6�( ����

����� ������ �� ������ 07@�2B�N�2B2�

789�9:8; 8;4 ;'<8=� �>8;� '>:8��'; ' �+?'>�;8�94 �'?<9;�� 7@ �9?? 9-A48�9� 3$#