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Ein neues System zur (öko-)effizienten Synthese von kleinen, chiralen

Alkoholen

Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der RWTH Aachen University zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation vorgelegt von

Master of Science Biotechnologie Dominik Benjamin Spickermann

aus Waiblingen

Berichter: Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Ulrich Schwaneberg Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Lothar Elling

Tag der mündlichen Prüfung: 13.04.2016

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Universitätsbibliothek online

verfügbar.

Angefertigt bei der evocatal GmbH (Monheim) in Kooperation mit dem

Lehrstuhl für Biotechnologie an der RWTH Aachen University (Prof. Dr. rer.

nat. Ulrich Schwaneberg).

Zum Schutz der proprietären Gensequenzen (evocatal GmbH) werden einige

Enzyme nur durch ihre Katalognummern bezeichnet.

“If you take care of your microbial friends, they will take care of your future.”

David Perlman`s “Laws of Applied Microbiology”1

Mein Dank gilt - in besonderer Weise Herrn Prof. Dr. rer. nat. Ulrich Schwaneberg für die freundliche Übernahme des Referates sowie Herrn Prof. Dr. rer. nat. Lothar Elling für die freundliche Übernahme des Korreferates dieser Arbeit. - Herrn Dr. Thorsten Eggert für den Arbeitsplatz und die freundliche Überlassung dieses spannenden Themas. - Herrn Dr. Christian Leggewie für die wissenschaftliche Leitung dieser Arbeit, anregende Diskussionen und hilfreiche Ratschläge. - in besonderer Weise Frau Dr. Andrea Weckbecker für das freundschaftliche Arbeitsverhältnis, das während ihrer kompetenten wissenschaftlichen Betreuung dieser Arbeit entstand. - Herrn Dr. Frank Hollmann und Frau Dr. Selin Kara für die spannende und erfolgreiche Zusammenarbeit im Bereich der Cofaktor-Regenerierung. - Herrn Dr. Christian Degering für seine stete Hilfsbereitschaft bei der Lösung wissenschaftlicher Probleme. - Frau Daniela Christensen für ihre stete Hilfsbereitschaft bei der Lösung (nicht nur) wissenschaftlicher Probleme. Weiterhin danke ich dem gesamten evocatal-Team für die angenehme Arbeitsatmosphäre, die einen nicht unerheblichen Teil zum Erfolg dieses Projekts beigetragen hat, dabei insbesondere - Frau Dr. Stefanie Kind, Herrn Dr. Simon Eßer und Herrn Dr. Sascha Hausmann, die nie müde wurden, mir bei Problemen jeglicher Art weiterzuhelfen. - Herrn Jan Salmon und Herrn Bernd Beckers für den mentalen Beistand während dieser Arbeit. Abschließend danke ich Frau Brigitte Spickermann, Frau Dr. Andrea Weckbecker und Herrn Dr. Christian Degering für die Durchsicht des Manuskriptes dieser Arbeit.

Veröffentlichungen im Rahmen der Promotion Spickermann, D., Kara, S., Barackov, I., Hollmann, F., Schwaneberg, U., Duenkelmann, P., Leggewie, C. (2014). Alcohol dehydrogenase stabilization by additives under industrially relevant reaction conditions. J. Mol. Catal. B: Enzym., 103, 24-8, DOI: 10.1016/ j.molcatb.2013.11.015 Kara, S., Spickermann, D., Weckbecker, A., Leggewie, C., Arends, I. W. C. E., Hollmann, F. (2014). Bioreductions Catalysed by an Alcohol Dehydrogenase in Non-aqueous Media. ChemCatChem, 6(4), 973-6, DOI: 10.1002/cctc.201300841 Kara, S., Spickermann, D., Schrittwieser, J. H., Leggewie, C., van Berkel, W. J. H., Arends, I. W. C. E., Hollmann, F. (2013). More efficient redox biocatalysis by utilizing 1,4-butanediol as a ‘smart cosubstrate’. Green Chem., 15, 330, DOI: 10.1039/C2GC36797A Kara, S., Spickermann, D., Schrittwieser, J. H., Weckbecker, A., Leggewie, C., Arends, I. W. C. E., Hollmann, F. (2013). Access to Lactone Building Blocks via Horse Liver Alcohol Dehydrogenase - Catalysed Oxidative Lactonization. ACS Catal., 3(11), 2436-9, DOI: 10.1021/cs400535c Weitere Veröffentlichungen Spickermann, D., Hausmann, S., Eßer, S., Weckbecker, A., Leggewie, C., Eggert, T., Christensen, D. (2014). Variants of the Parvibaculum lavamentivorans short-chain alcohol dehydrogenase. Application No./Patent No. WO/2014/053558 Spickermann, D., Hausmann, S., Degering, C., Schwaneberg, U., Leggewie, C. (2014). Engineering of highly selective variants of Parvibaculum lavamentivorans alcohol dehydrogenase. ChemBioChem., 15(14), 2050-2, DOI: 10.1002/cbic.201402216 Tagungsbeiträge im Rahmen der Promotion Spickermann, D., Kara, S., Hollmann, F., Hausmann, S., Eggert, T., Puls, M., Leggewie, C.: Innovative approaches for the enzymatic synthesis of short-chain and cyclic chiral alcohols. DECHEMA-Jahrestagung, September 10th – 13th, 2012, Karlsruhe, Germany Spickermann, D., Kara, S., Hollmann, F., Hausmann, S., Eggert, T., Puls, M., Leggewie, C.: Innovative approaches for the enzymatic synthesis of short-chain and cyclic chiral alcohols. Gordon Conference, July 8th – 13th, 2012, Smithfield, USA Kara, S., Spickermann, D., Schrittwieser, J. H., Leggewie, C., van Berkel, W. J. H., Arends, I. W. C. E., Hollmann, F.: Overcoming the thermodynamic challenge in redox biocatalysis with ‘smart cosubstrates’. Biotrans Conference, July 21st – 25th, 2013, Manchester, United Kingdom Kara, S., Spickermann, D., Schrittwieser, J. H., Leggewie, C., van Berkel, W. J. H., Arends, I. W. C. E., Hollmann, F.: More efficient redox biocatalysis by utilising 1,4-butanediol as a smart cosubstrate. NCCC Conference, March 11th – 13th, 2013, Noordwijkerhout, Netherlands

Kara, S., Spickermann, D., Leggewie, C., Zuhse, R., Arends, I. W. C. E., Hollmann, F.: A Novel Eco-Efficient Approach for Biocatalytic Reductions: “smart cosubstrates”. BioCat Conference, September 2nd – 6th, 2012, Hamburg, Germany Kara, S., Spickermann, D., Leggewie, C., Arends, I. W. C. E., Hollmann, F.: Eco-efficient synthesis of chiral alcohols by combining biocatalysis with “smart cosubstrates“. DECHEMA-VAAM-Section Biotransformations, April 24th – 25th, 2012, Frankfurt, Germany Kara, S., Spickermann, D., Leggewie, C., Arends, I. W. C. E., Hollmann, F.: Eco-efficient synthesis of chiral alcohols by combining biocatalysis with “smart cosubstrates“. NCCC Conference, March 5th – 7th, 2012, Noordwijkerhout, Netherlands Puls, M., Duenkelmann, P., Spickermann, D., Leggewie, C.: Pushing the Limits - Innovative Biocatalysis by Engineered Enzymes and Use of “smart cosubstrates”. Zing Conference Biocatalysis, December 4th – 7th, 2012, Xcaret, Mexico

Inhaltsverzeichnis

I

1. Einleitung .............................................................................................................................. 1

1.1 Biokatalyse in der chemischen Industrie ...................................................................... 1

1.2 Alkoholdehydrogenasen (ADHs) ................................................................................... 3

1.3 Alkohole in der Industrie ............................................................................................... 5

1.4 Biologische Verfahren zur Gewinnung enantiomerenreiner Alkohole ..................... 5 1.4.1 „Chirale Pools“ ...................................................................................................................................... 6

1.4.2 Fermentation .......................................................................................................................................... 6 1.4.3 Asymmetrische Reduktion prochiraler Ketone ..................................................................................... 6

1.4.4 Kinetische Racematspaltung ................................................................................................................. 6

1.4.5 Vorteile enzymatischer Verfahren ......................................................................................................... 7

1.5 Chemische Methoden zur Synthese von Alkoholen ..................................................... 7

1.5.1 Nukleophile Substitution aus Halogenalkanen ...................................................................................... 7

1.5.2 Reduktion von Carbonylverbindungen .................................................................................................. 8

1.5.3 Reaktion metallorganischer Verbindungen (Grignard-Reaktion) .......................................................... 8 1.5.4 Aldolreaktion ......................................................................................................................................... 8 1.5.5 Vorteile klassisch-chemischer Verfahren .............................................................................................. 9

1.6 Cofaktor-Regenerierung ................................................................................................ 9

1.7 Identifizierung und Entwicklung neuer Enzyme ....................................................... 11

1.7.1 Metagenombanken .............................................................................................................................. 11

1.7.2 Entdeckung neuer Mikroorganismen................................................................................................... 12

1.7.3 Gentechnische Veränderung bereits bekannter Enzyme (Enzyme Engineering) ................................. 12

1.8 Zielsetzung der Arbeit .................................................................................................. 15

2. Material und Methoden....................................................................................................... 18

2.1 Materialien .................................................................................................................... 18

2.1.1 Geräte .................................................................................................................................................. 18 2.1.2 Chemikalien ........................................................................................................................................ 18

2.2 Mikrobiologische Methoden ........................................................................................ 19 2.2.1 Mikroorganismen und Vektoren .......................................................................................................... 19

2.2.2 Oligonukleotide ................................................................................................................................... 20

2.2.3 Medien ................................................................................................................................................. 21 2.2.4 Isolierung von Nukleinsäuren .............................................................................................................. 22

2.2.5 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren ................................................................................................. 22

2.2.6 in vitro-Rekombination von Nukleinsäuren ........................................................................................ 22 2.2.7 Amplifikation von Nukleinsäuren durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ...................................... 22 2.2.8 QuikChange-Mutagenese .................................................................................................................... 23

2.2.9 Sättigungsmutagenese ......................................................................................................................... 23

2.2.10 Ungerichtete Mutagenese mittels epPCR .......................................................................................... 23

2.2.11 DNA-Sequenzierungen...................................................................................................................... 24

2.2.12 Transformation von Bakterienzellen mit Plasmid-DNA durch Hitzeschock ..................................... 24 2.2.13 Transformation von Bakterienzellen mit Plasmid-DNA durch Elektroporation ............................... 24 2.2.14 Kultivierung von Bakterien und Proteinexpression ........................................................................... 25

2.2.15 Zellaufschluss/ Rohextraktgewinnung .............................................................................................. 25

2.2.16 Lagerung von Proteinlösungen .......................................................................................................... 26

2.2.17 Anzucht und Expression im Hochdurchsatzverfahren ....................................................................... 26

2.3 Biochemische Methoden............................................................................................... 27 2.3.1 ADH evo-040 Aktivitätsassay ............................................................................................................. 27

2.3.2 Hochdurchsatz-Screening von Variantenbibliotheken ........................................................................ 28 2.3.3 Quantitative Proteinmessungen ........................................................................................................... 28

2.3.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ........................................................................ 29 2.3.5 Gaschromatographische Umsatz- und ee-Bestimmung ....................................................................... 29

2.3.6 Computerprogramme ........................................................................................................................... 30

Inhaltsverzeichnis

II

3. Ergebnisse Teil 1: Entwicklung eines Prozesses zur biokatalytischen Darstellung von (S)-2-Butanol ........................................................................................................................... 31

3.1 Identifizierung einer geeigneten Alkoholdehydrogenase (ADH) ............................. 31

3.1.1 Etablierung einer analytischen Methode zum Nachweis von 2-Butanon und der quantitativen Analyse der Stereoisomeren des 2-Butanols .............................................................................................................. 31

3.1.2 Identifizierung von Alkoholdehydrogenasen, die 2-Butanon als Substrat akzeptieren ....................... 32 3.1.3 Ermittlung der Enantioselektivitäten der aktiven Alkoholdehydrogenasen ........................................ 34 3.1.4 Screening nach lösemittelstabilen Alkoholdehydrogenasen ................................................................ 35

3.2 Produktracemisierung.................................................................................................. 37 3.2.1 Untersuchung der Produktstabilität ..................................................................................................... 37

3.2.2 Einfluss der Reaktionstemperatur auf die Produktracemisierung ........................................................ 37 3.2.3 Einfluss des pH-Wertes auf die Produktracemisierung ....................................................................... 38 3.2.4 Führt eine Schädigung der Strukturintegrität des Enzyms zur Erniedrigung der Selektivität? ........... 39 3.2.5 Einfluss des Cosubstrates auf die Produktracemisierung .................................................................... 40 3.2.6 Läuft die Rückoxidation des 2-Butanols enantioselektiv ab? .............................................................. 41

3.3 Festlegung eines geeigneten Ausgangsenzyms für die Prozessentwicklung ............ 42

3.4 Nähere Untersuchung der Lösemittelstabilität der ADH evo-040 ........................... 42

3.5 Enzymstabilisierung in organischem Lösemittel mit Hilfe von Additiven .............. 43 3.5.1 Stabilisierung der ADH evo-030 ......................................................................................................... 45

3.5.2 Stabilisierung der ADH evo-040 ......................................................................................................... 46

3.5.3 Stabilisierung der LB-ADH ................................................................................................................. 46



3.5.6 Up-scaling und Validierung der Ergebnisse ........................................................................................ 47

3.6 Bestimmung der optimalen Substratbeladung (2-Butanon) für die ADH evo-040 48

3.7 Bestimmung des pH-Optimums für die ADH evo-040 .............................................. 50

3.8 Zugabereihenfolge der organischen Komponenten................................................... 50

3.9 Einsatz von “smart cosubstrates” zur Erhöhung der Prozesseffizienz ................... 52

3.10 Prozess Up-scaling ...................................................................................................... 55

3.10.1 Produktion des Biokatalysators ......................................................................................................... 55

3.10.2 Durchführung der Biotransformation bis 4 Liter ............................................................................... 57

3.11 Produktaufreinigung .................................................................................................. 58 3.11.1 Produkttrocknung über ein Molekularsieb ........................................................................................ 58

3.11.2 Produkttrocknung mittels Azeotroprektifikation ............................................................................... 58

3.11.3 Produktaufreinigung mittels Destillation ........................................................................................... 58

Ergebnisse Teil 2: Enzymoptimierung durch Verfahren des Protein Engineerings ............ 60

3.12 Rationales Proteindesign durch den Einbau von Disulfidbrücken ........................ 60 3.12.1 Produktion der Enzymvarianten ........................................................................................................ 60

3.12.2 Untersuchung der Hitzestabilität der Disulfidvarianten .................................................................... 62 3.12.3 Kinetische Parameter der Disulfidvarianten ...................................................................................... 63

3.13 Semi-rationales Proteindesign mittels „Bio-Prodict 3DM“ ..................................... 64 3.13.1 Produktion der Enzymvarianten ........................................................................................................ 64

3.13.2 Untersuchung der Hitzestabilität der 3DM-Varianten ....................................................................... 67 3.13.3 Kinetische Parameter der 3DM-Varianten ........................................................................................ 68

3.13.4 Einsatz der 3DM-Varianten im (S)-2-Butanol Prozess ...................................................................... 69

3.14 Zufallsmutagenese mittels epPCR ............................................................................ 71 3.14.1 Entwicklung der Enzymvarianten ..................................................................................................... 71

3.14.2 Untersuchung der Hitzestabilität der Varianten aus der Zufallsmutagenese ..................................... 73 3.14.3 Kinetische Parameter der Varianten aus der Zufallsmutagenese ....................................................... 75 3.14.4 Einsatz der Varianten aus der Zufallsmutagenese im (S)-2-Butanol Prozess .................................... 76

Inhaltsverzeichnis

III

4. Diskussion ............................................................................................................................ 79

4.1 Identifizierung eines geeigneten Biokatalysators....................................................... 80

4.2 Produktracemisierung.................................................................................................. 82

4.3 Enzymstabilisierung in organischem Lösemittel ....................................................... 87

4.4 Prozessentwicklung ...................................................................................................... 90 4.4.1 Lösemittelstabilität der evo-040 .......................................................................................................... 92

4.4.2 Substratbeladung ................................................................................................................................. 93

4.4.3 Zugabereihenfolge der organischen Komponenten ............................................................................. 93 4.4.4 Bestimmung des pH-Optimums .......................................................................................................... 94

4.4.5 „smart cosubstrates“ ............................................................................................................................ 94

4.4.6 Prozess Up-scaling .............................................................................................................................. 95 4.4.7 Produktaufreinigung ............................................................................................................................ 96

4.5 Enzymoptimierung ....................................................................................................... 97 4.5.1 Rationales Proteindesign durch den Einbau von Disulfidbrücken ...................................................... 99

4.5.2 Semi-Rationales Proteindesign mittels „Bio-Prodict 3DM“ ............................................................. 101

4.5.3 Zufallsmutagenese mittels epPCR ..................................................................................................... 102

4.5.4 Interpretation der Mutationen ............................................................................................................ 106

Zusammenfassung................................................................................................................. 111

Summary ................................................................................................................................ 113

Literaturverzeichnis ............................................................................................................... 115

Anhang................................................................................................................................... 135

Inhaltsverzeichnis

IV

Abbildungen und Tabellen

V

Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen

Abb. 1: Verteilung von Umsatz und F&E-Ausgaben dedizierter Biotechnologie-Unternehmen 2014 ............................................................................................................................................ 2

Abb. 2: Schematische Darstellung einer ADH-katalysierten Reduktionsreaktion. ................... 3

Abb. 3: Möglicher Übergangszustand im Reaktionsmechanismus der SDR-ADH aus Drosophila lebanonensis ............................................................................................................ 4 Abb. 4: Reaktionen der alkoholischen Funktion ........................................................................ 5 Abb. 5: Asymmetrische Reduktion mittels einer enantioselektiven ADH ................................. 6

Abb. 6: Kinetische Racematspaltung mittels einer enantioselektiven ADH. ............................. 7

Abb. 7: Beispiele zur Gewinnung von alkoholischen Verbindungen mittels nukleophiler Substitution ................................................................................................................................. 7

Abb. 8: A) 1,2-Diamin-Ruthenium(II)-Cl2-BINAP-Katalysator B) ein Oxazaborolidin. ......... 8

Abb. 9: Prinzip der Cofaktor-Regenerierung. .......................................................................... 10 Abb. 10: Schematische Darstellung der Cofaktor-Regenerierung mittels FDH ...................... 10

Abb. 11: Schematische Darstellung der Cofaktor-Regenerierung mittels G(-6-P-)DH-Reaktion .................................................................................................................................................. 11

Abb. 12: Gaschromato-graphische Analyse der Reaktionskomponenten. ............................... 32

Abb. 13: Analyse der Produktstabilität. ................................................................................... 37 Abb. 14: Einfluss der Cosubstrat-konzentration auf die Produkt-racemisierung. .................... 40

Abb. 15: Selektive Umsetzung von 2-Butanol in Abhängigkeit von seiner Stereo-konfiguration. ........................................................................................................................... 42

Abb. 16: Verhalten des Enzyms evo-040 bei unterschiedlichen Lösemittelbeladungen. ........ 43

Abb. 17: Umsatz von 2-Butanon im 50 ml Up-scaling Ansatz, erzielt durch die Sorbitol-stabilisierte evo-040 und das unstabilisierte Enzym (Referenz) .............................................. 48 Abb. 18: Bestimmung der optimalen Substrat-beladung (2-Butanon) für die ADH evo-040. 49

Abb. 19: Bestimmung des pH-Optimums für die ADH evo-040. ............................................ 50

Abb. 20: Auswirkung der Zugabereihenfolge der Reaktionskomponenten auf den Verlauf der Biokonversion. ......................................................................................................................... 52

Abb. 21: Prognostizierter Oxidationsmechanismus vom α,ω-Diol zum entsprechenden Lactonprodukt .......................................................................................................................... 53

Abb. 22: Screening von ADHs zur Oxidation von 1,4-Butandiol. .......................................... 53

Abb. 23: Substratumsatz nach 72 Stunden in der HL-ADH katalysierten Reduktion von Zimtaldehyd in Gegenwart von 0,5 Äquivalenten 1,4-BD (1,4-Butandiol) oder 0,5 – 5 Äquivalenten Isopropanol. ....................................................................................................... 54

Abb. 24: Expression der ADH evo-040 für die Biotransformation. ........................................ 56

Abb. 25: Verlauf der Bioreduktion von 2-Butanon im 1000 ml Maßstab ............................... 57

Abb. 26: Evaluierung der idealen QuikChange-Bedingungen zur Generierung der Disulfidvarianten. ..................................................................................................................... 61

Abb. 27: SDS-Gelelektrophorese der löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen der Disulfidmutanten. ..................................................................................................................... 62

Abb. 28: Untersuchung der Temperaturstabilität der Disulfidvarianten. ................................. 63

Abb. 29: Bestimmung von Km und Vmax der Disulfidvarianten SSB5 und SSB6. ............... 64

Abb. 30: SDS-Gelelektrophorese der löslichen Proteinfraktionen einiger 3DM-Enzymvarianten. ....................................................................................................................... 67

Abb. 31: Untersuchung der Temperaturstabilität der 3DM-Varianten. ................................... 68

Abb. 32: Bestimmung von Km und Vmax der 3DM-Varianten. ............................................. 69

Abb. 33: Umsatzverläufe der 3DM-Varianten in einem wasserreichen Prozess zur Dar-stellung von 2-Butanol. ............................................................................................................ 70

Abb. 34: Einsatz der 3DM-Varianten im wasserarmen Reaktionsprozess. ............................. 71


VI

Abb. 35: Screening-Ergebnisse der besten Varianten aus der Zufallsmutagenese. ................. 73

Abb. 36: SDS-Gelelektrophorese der löslichen Proteinfraktionen von Enzymvarianten aus der Zufallsmutagenese. ................................................................................................................... 74

Abb. 37: Untersuchung der Temperaturstabilität der Varianten aus der Zufallsmutagenese. . 75

Abb. 38: Bestimmung von Km und Vmax der Varianten aus der Zufallsmutagenese. ........... 76

Abb. 39: Umsatzverläufe der Varianten aus der Zufallsmutagenese im wasserreichen Prozess zur Darstellung von 2-Butanol. ................................................................................................ 77 Abb. 40: Einsatz der Varianten aus der Zufallsmutagenese im wasserarmen Reaktions-prozess. ..................................................................................................................................... 78

Abb. 41: Schematische Darstellung des Reaktionsweges einer ADH-katalysierten Substratreduktion sowie des beschriebenen Racemisierungseffekts nach Yang et al ............. 83 Abb. 42: Hypothetisches Verfahren zur dynamisch-kinetischen Racematspaltung nach Martín-Matute et al. ................................................................................................................. 91 Abb. 43: Schematische Übereinanderlegung des Proteinrückgrats der beiden erstellten Homologiemodelle von evo-040. ........................................................................................... 100 Abb. 44: Charakterisierung von 50 Sequenzen der ADH-Mutanten. .................................... 104

Abb. 45: Schematische Darstellung der 14 Mutationspositionen, die zu veränderten Eigenschaften des Enzyms führten. ....................................................................................... 108 Tab. 1: Beispiele industriell genutzter ADHs zur Produktion von chiralen Alkoholen ............. 4

Tab. 2: Verwendete Mikroorganismen ..................................................................................... 19 Tab. 3: Verwendete Vektoren .................................................................................................. 19 Tab. 4: Verwendete Oligonukleotide. ...................................................................................... 20 Tab. 5: Protokoll zur Durchführung der epPCR. ..................................................................... 24 Tab. 6: Verwendete Computerprogramme. .............................................................................. 30 Tab. 7: Übersicht über die im Initial-Screening aktiven Enzyme nach 24 Stunden Reaktionsdauer. ........................................................................................................................ 33

Tab. 8: Übersicht über die Aktivitäten der eingesetzten Enzympräparate. .............................. 34

Tab. 9: Übersicht über die Enantiomerenreinheiten der ADH-Reaktionen nach 24 Stunden. . 35

Tab. 10: Bewertung der Lösemitteltoleranz der ausgewählten ADHs. .................................... 36

Tab. 11: Enantiomerenreinheit am thermodynamischen Gleichgewicht bei unterschiedlichen Reaktionstemperaturen. ............................................................................................................ 38

Tab. 12: Enantiomerenreinheit in Abhängigkeit vom pH-Wert der Reaktionslösung. ............ 39

Tab. 13: Einfluss einer strukturschädigenden Vorinkubation auf die Selektivität der ADH evo-270. ........................................................................................................................................... 39

Tab. 14: Additive, die auf ihren stabilisierenden Effekt auf ADHs untersucht wurden .......... 44

Tab. 15: Konzentrationen, in denen die Additive im ersten Screening-Ansatz eingesetzt wurden. ..................................................................................................................................... 45

Tab. 16: Einfluss der effektivsten Additive auf den relativen Substratumsatz der ADHs. ...... 47

Tab. 17: Substratumsatz der ADH evo-040 bei der Reduktion von 2-Butanon (2,3 M) durch Einsatz verschiedener Cosubstrate. .......................................................................................... 55 Tab. 18: Destillationsprotokoll der Aufreinigung von 320 ml Reaktionslösung (mit 500 ml Cyclohexan vesetzt) ................................................................................................................. 59

Tab. 19: Disulfidvarianten, die zur Konstruktion ausgewählt wurden .................................... 61

Tab. 20: Die von „Bio-Prodict 3DM“ zur Sättigung vorgeschlagenen Positionen. ................. 65

Tab. 21: Ergebnisse der beiden Screenings der 3DM-Varianten. ............................................ 66

Tab. 22: Anteil der inaktiven Enzymvarianten je 3DM-Position ............................................. 66 Tab. 23: Bestimmung von Km und Vmax der 3DM-Varianten. .............................................. 68


VII

Tab. 24: Bestimmung von Km und Vmax der Varianten aus der Zufallsmutagenese. ............ 76

Tab. 25: Mischverhältnisse und daraus resultierende Siedepunkte der Reaktionskomponenten .................................................................................................................................................. 92

Tab. 26: Übersicht über die Mutationen in den ADH evo-040 Varianten. ............................ 107


VIII

Abkürzungen

IX

Abkürzungen

Im Folgenden sind die in dieser Arbeit verwendeten Abkürzungen aufgeführt. Aminosäuren

wurden nach dem gebräuchlichen Ein- oder Drei- Buchstabencode abgekürzt.

λ Wellenlänge

A. dest. Aqua destillata

ADH Alkoholdehydrogenase

AS Aminosäure

Abb. Abbildung

Amp Ampicillin

ATP Adenosintriphosphat

bp Basenpaar(e)

°C Grad Celsius

CBBG Coomassie-Brilliant-Blue G-250

C-Terminus Carboxyterminus

Da Dalton

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynucleosid-triphosphat

DWP Deepwell-Mikrotiterplatte, 96 x 2 ml

DTT Dithiothreitol

EC enzyme code (internat. Konvention)

EDTA Ethylendinitrilotetraacetat

ee enantiomeric excess (Enantiomerenüberschuss)

epPCR error prone polymerase chain reaction (fehlerhafte PCR)

EtOH Ethanol

FID Flammenionisationsdetektor

F&E Forschung und Entwicklung

g normale Erdbeschleunigung

g Gramm

GZE Ganzzellextrakt

h Stunde(n)

HTS Hochdurchsatz-Screening (high-throughput screening)

IPC in-process control (In-Prozess Kontrolle)

Abkürzungen

X

iPrOH 2-Propanol

IPTG Isopropyl-β-thiogalactosid

kb Kilobasen

kDa Kilodalton

l Liter

log P log (Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizient)

Lsg. Lösung

LV Leervektor

Km Michaeliskonstante

M molar

MB Molenbruch

NAD Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid

NADP Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat

MCS multiple cloning site

min Minute(n)

ml Milliliter

MTP Mikrotiterplatte, 96 x 0,5 ml

µ mikro

n nano

nm Nanometer

N-Terminus Aminoterminus

org. organisch

O.D. optische Dichte

p.A. per analysis

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PCR Polymerase-Kettenreaktion

φ Volumenanteil

rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)

RT Raumtemperatur

s Sekunde(n)

SDS Natriumdodecylsulfat

SOP standard operating procedure (Standardvorgehensweise)

Tab. Tabelle

Tris Trishydroxymethylaminoethan

Abkürzungen

XI

ÜK Übernachtkultur

ü.N. über Nacht

U Unit (Enzymeinheit)

UpM Umdrehungen pro Minute

Vmax Maximalumsatzgeschwindigkeit

v/v Volumen pro Volumen

w/v Gewicht pro Volumen

WT Wildtyp

Abkürzungen

XII

Einleitung

1

1. Einleitung

1.1 Biokatalyse in der chemischen Industrie

Enzyme als biologische Katalysatoren sind in der chemischen Synthese längst keine

Besonderheit mehr. So bezieht eine stetig steigende Zahl chemischer Unternehmen

enzymkatalysierte Reaktionsschritte in die Planung ihrer Synthesen ein2. Dabei sind die

Einsatzgebiete vielfältig: von der Produktion pharmazeutischer und landwirtschaftlicher

Molekülzwischenstufen (building blocks)3 über Feinchemikalien bis hin zur Produktion von

Molekülblockbustern (bulk chemicals) und Biokraftstoffen4.

Besonders im Bereich der Feinchemiesynthese halten Enzyme Einzug. Feinchemikalien sind

nach Ciriminna et al. solche Verbindungen, die in reiner Form in batch-Reaktoren mit

limitiertem Volumen (< 5000 Tonnen/Jahr) und hohem Wert (> 10 $/kg) gewonnen werden5.

In diesem Fall ist der Einsatz von Enzymen besonders interessant, da sie eine sehr hohe

Stereoselektivität aufweisen können. Die dadurch generierte Enantiomerenreinheit des

Produkts ist vor allem im Bereich von Pharmaintermediaten, Aromen und Duftstoffen

unerlässlich6,7. Dies liegt in der Tatsache begründet, dass die Enantiomere eines Produktes oft

voneinander abweichende Eigenschaften aufweisen. Beispielsweise besitzt (R)-Limonen ein

orangenartiges Aroma, während die (S)-Form nach Terpentin riecht. Ähnliches gilt in der

Pharmaindustrie, wobei hier die Wirksamkeit aktiver Moleküle stark von ihrer

Stereokonformation abhängen kann. Der β-Blocker Propranolol ist beispielsweise in der

(-)-Form etwa 100fach stärker wirksam als in der (+)-Form8, was an der chiralen Natur seines

Rezeptors liegt.

Enzyme werden schätzungsweise bei der Synthese von 2/3 der chiralen Produkte im

industriellen Großmaßstab eingesetzt, da sie es ermöglichen, die Ausbeute von 50 % auf

100 % zu erhöhen9. Beispiele für chirale Medikamente, die mit Hilfe von Enzymen produziert

werden, sind Sitagliptin (Januvia), Rosuvastatin (Crestor), Atorvastatin (Lipitor) und

Montelukast (Singulair)5,10. Besonders bekannte Enzyme, die in der Industrie eingesetzt

werden, sind Penicillin-Amidase11, Xylose-Isomerase12 und Nitril-Hydratase9,13.

Allgemeine Vorteile von Biokatalysatoren gegenüber der klassisch-chemischen Synthese

liegen vor allem in milderen Reaktionsbedingungen. So sind Enzyme überwiegend bei

physiologischen pH-Werten, niedrigen Temperaturen und Drücken aktiv. Dadurch können

Synthesen energieeffizienter durchgeführt werden. Weiterhin können Enzyme auch

hochregioselektiv katalysieren, wodurch auf das Aktivieren beziehungsweise Schützen von

funktionellen Gruppen im umzusetzenden Molekül verzichtet werden kann.

Einleitung

2

Probleme der Biokatalyse liegen dagegen noch immer in ihrer begrenzten Einsetzbarkeit.

Diese kann je nach Enzym auf wenige Substrate beschränkt sein. Andere Enzyme hingegen,

die ein sehr großes Substratspektrum aufweisen, sind oft nur wenig spezifisch bezüglich ihrer

Stereo- oder Regioselektivität. Es gibt jedoch auch Ausnahmen, wie die ADH von

Parvibaculum lavamentivorans, die eine hohe Selektivität beim Umsatz einer Vielzahl von

Substraten aufweist14.

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass Enzyme bereits heute zur Synthese einer großen

Zahl von Molekülen eingesetzt werden7. Dadurch hat die Biokatalyse sowohl in der

akademischen als auch der industriellen Forschung den Stellenwert einer aussichtsreichen

Technologie erlangt, insbesondere bei der Entwicklung nachhaltiger Produktionssysteme3,15–

18. Dieser Trend spiegelt sich auch im wachsenden Wirtschaftszweig der Biotechnologie in

Deutschland wider. Sowohl Umsatz-, Mitarbeiter- als auch Finanzierungszahlen des Bereichs

stiegen im Jahr 2014 an. Die Zahl der Mitarbeiter in den dedizierten Unternehmen ist dabei

auf 17.930 (+ 5,8 %), die Zahl dieser Firmen auf 579 (+ 1,6 %) gestiegen19.

Dabei ist jedoch auch zu beachten, dass der Bereich der industriellen Biotechnologie im

Wirtschaftszweig Biotechnologie „lediglich“ 9,8 % ausmacht. Allerdings befindet sich dieser

Bereich auch in einem besonders starken und stabilen Wachstum. Der Umsatz stieg 2014 um

fast 4 % auf 214 Mio. Euro (Abb. 1)19.

Abb. 1: Verteilung von Umsatz und F&E-Ausgaben dedizierter Biotechnologie-Unternehmen 2014 (nach

biotechnologie.de)19

Einleitung

3

1.2 Alkoholdehydrogenasen (ADHs)

Alkoholdehydrogenasen bilden nach Einteilung der „International Union of Biochemistry“

die Enzymklasse EC 1.1.1.1.. Sie katalysieren Redoxreaktionen, bei denen

Reduktionsäquivalente zwischen Akzeptoren und Donoren ausgetauscht werden. Dabei

nutzen ADHs alkoholische Gruppen als Donoren und ketonische Gruppen als Akzeptoren. Sie

sind NAD(H)- oder NADP(H)-abhängig.

ADHs sind in Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen sehr weit verbreitet20. Ihre

physiologischen Aufgaben bestehen in der Energieversorgung der Zelle mittels NAD(P)H-

Regenerierung. Weiterhin katalysieren sie oxidative Abbauprozesse der Zellabwehrfunktion,

Gärungsprozesse sowie assimilatorische und dissimilatorische Stoffwechselwege21. Industriell

interessant sind ADHs, da die Reduktion von Ketonen (Abb. 2) hoch enantiomerenselektiv

ablaufen kann.

Alkoholdehydrogenasen lassen sich in verschiedene Enzymsuperfamilien einteilen. Die

wichtigsten Vertreter sind die langkettigen Dehydrogenasen/ Reduktasen (LDR)22 mit einer

Aminosäure-Kettenlänge von über 450 AS, die mittelkettigen Dehydrogenasen/ Reduktasen

(MDR)23 mit 350 bis 400 AS und die kurzkettigen Dehydrogenasen/ Reduktasen (SDR)24 mit

unter 350 AS. Weitere wichtige Vertreter sind die Eisen-abhängigen Dehydrogenasen25 und

die Aldo-Keto-Reduktasen (AKR)26.

Abb. 2: Schematische Darstellung einer ADH-

katalysierten Reduktionsreaktion. Die

Rückreaktion, die Oxidation vom Alkohol zum

Keton, ist ebenso möglich (nicht dargestellt).

Die zwei am besten untersuchten Enzymsuperfamilien der ADHs sind die der MDR- und

SDR-Proteine:

Mittelkettige Dehydrogenasen/ Reduktasen sind Zink-abhängig und als Homodimere

oder -tetramere enzymatisch aktiv. Ein Monomer besteht aus 350 - 400 Aminosäuren und

setzt sich aus einer katalytischen und einer NAD(P)H-Bindedomäne zusammen27. Die

Struktur der katalytischen Domäne variiert stark zwischen den einzelnen Mitgliedern der

MDRs, wohingegen die der Cofaktor-Bindedomäne konserviert geblieben ist. Sie besteht aus

einer βαβ-Supersekundärstruktur27. Wichtige Vertreter dieser Gruppe sind beispielsweise die

Hefe-ADH, ein tetrameres Eukaryotenprotein, und Pferdeleber-ADH (HL-ADH), ein dimeres

Säugetierprotein28.

Einleitung

4

Kurzkettige Dehydrogenasen/ Reduktasen (SDR) liegen wie die MDRs in ihrer biologisch

aktiven Form als Homodimere oder Homotetramere vor24. Es gibt aber auch Ausnahmen, wie

die Carbonylreduktase aus dem Hausschwein, die als Monomer aktiv ist29. Eine Untereinheit

der SDRs ist aus etwa 250 AS aufgebaut. Ihre katalytische Aktivität ist Tyrosin-vermittelt und

sie enthält nur wenige Cysteine30. SDRs sind zwar wie die MDRs NAD(P)H-abhängig,

benötigen allerdings kein Metallion zur enzymatischen Aktivität. Die bisher einzigen

beschriebenen Metallionen-abhängigen SDR-ADHs stammt aus Lactobacillus brevis und

Lactobacillus kefir31.

Ubiquitär tritt in den SDRs ein konserviertes Substratbindungsmotiv auf: Tyr-X-X-X-Lys. Es

ist mit einem konservierten Serin-Rest im aktiven Zentrum lokalisiert und bildet eine

katalytische Triade, welche die enzymatische Reaktion katalysiert32,33. Daraus ist zu

schließen, dass allen SDRs der gleiche Reaktionsmechanismus zu Grunde liegt. Initiiert wird

die Reaktion durch das Binden des Cofaktors. Durch den Tyrosin-Rest der katalytischen

Triade kommt es parallel zum Hydridtransfer zu einer Protonenübertragung. Der Serinrest

übernimmt die Aufgabe der Orientierung und damit der Stabilisierung der

Reaktionsintermediate. Das Lysin ist hauptsächlich für die Stabilisierung des Nicotinamid-

Ribose-Endes des Cofaktors zuständig34–36 (Abb. 3).

Abb. 3: Möglicher Übergangszustand im

Reaktionsmechanismus der SDR-ADH

aus Drosophila lebanonensis36

Alkoholdehydrogenasen werden bereits heute industriell eingesetzt. Beispiele für

literaturbeschriebene Herstellungsverfahren zur Synthese chiraler Alkohole sind Tab. 1 zu

entnehmen.

Tab. 1: Beispiele industriell genutzter ADHs zur Produktion von chiralen Alkoholen

Organismus Stereospezifität Quelle

Thermoanaerobium brockii (S)-Alkohol 37

Pseudomonas sp. (R)-Alkohol 38

Lactobacillus kefir (R)-Alkohol 39

Einleitung

5

1.3 Alkohole in der Industrie

Alkohole dienen als wertvolle Syntheseintermediate in der chemischen Industrie. Die

alkoholische Funktion kann mittels klassisch-chemischer Methoden durch andere funktionelle

Gruppen ersetzt oder in diese überführt werden. Abb. 4 gibt einen Überblick über die

möglichen Reaktionen. Darstellbar sind beispielsweise Alkoxide, Alkene, Acetale und

Esterverbindungen. Besonders enantiomerenreine Alkohole erfreuen sich steigender

Beliebtheit40,41, da auch die daraus darstellbaren Produkte eine hohe Enantiomerenreinheit

aufweisen können (solange das chirale Zentrum bestehen bleibt).

Abb. 4: Reaktionen der alkoholischen Funktion42

1.4 Biologische Verfahren zur Gewinnung enantiomerenreiner Alkohole

Da die Enantiomeren optisch aktiver Alkohole sehr ähnliche physikalische Eigenschaften

aufweisen, ist ihre Darstellung und/ oder Aufreinigung nicht leicht durchführbar.

Grundsätzlich sind vier biotechnische Methoden anwendbar, um diese Substanzen in reiner

Form verfügbar zu machen43,44. Dabei ist die Anzahl und Art der durch die ersten beiden

Methoden (1.4.1 & 1.4.2) zu produzierenden Produkte jedoch gering. Daher wird in

biotechnologischen Prozessen zur Darstellung von enantiomerenreinen Alkoholen

hauptsächlich die kinetische Racematspaltung oder asymmetrische Reduktion angewendet

(1.4.3 & 1.4.4).

Einleitung

6

1.4.1 „Chirale Pools“

Als „chirale Pools“ werden natürliche Quellen bezeichnet, aus denen Substanzen wie

Milchsäure, Aminosäuren, Terpene oder Lipide extrahiert werden können45. Diese Moleküle

liegen in der natürlichen Quelle in reiner Form vor.

1.4.2 Fermentation

Die fermentative Anzucht von Mikroorganismen erlaubt die Gewinnung von optisch aktiven

Substanzen in reiner Form. Die Gewinnung ist jedoch auf die Stoffwechselwege des

fermentierten Organismus beschränkt. Mögliche Produkte sind somit Metabolite und

Sekundärmetabolite46.

1.4.3 Asymmetrische Reduktion prochiraler Ketone

Bei der asymmetrischen Reduktion wird eine ADH benötigt, die die Reduktion eines

prochiralen Edukts hochselektiv katalysiert. Es können auch nicht-natürliche Edukte

eingesetzt werden. Theoretisch ist bei dieser Methode eine Ausbeute von bis zu 100 %

möglich, da das gesamte Edukt zum gewünschten Produkt reduziert werden kann (Abb. 5)47.

Allerdings ist es oft schwierig, ein solch hochselektives Enzym zu identifizieren. Alternativ

kann die Selektivität eines Enzyms mittels Protein Engineering erhöht werden. Dies erfordert

jedoch einen hohen Forschungsaufwand und erhebliche Geldmittel.

Abb. 5: Asymmetrische

Reduktion mittels einer

enantioselektiven ADH

1.4.4 Kinetische Racematspaltung

Bei der kinetischen Racematspaltung wird ein racemisches Gemisch eines Alkohols

eingesetzt. Es können ebenfalls nicht-natürliche Edukte verwendet werden. Die benötigte

Alkoholdehydrogenase oxidiert in der folgenden Enantiomeren-differenzierenden Reaktion

das unerwünschte Enantiomer schneller als das gewünschte Enantiomer. Dieses bleibt somit

erhalten und kann mit einer maximalen Ausbeute von 50 % des eingesetzten Edukts

rückgewonnen werden (Abb. 6).

Um die Produktausbeute zu erhöhen, kann das entstandene Keton parallel rückreduziert

werden. Dabei entsteht auch das gewünschte Enantiomer erneut. Somit kann die

Einleitung

7

Produktausbeute theoretisch auf 100 % erhöht werden. In einem solchen Fall spricht man von

der „dynamisch-kinetischen Racematspaltung“48.

Abb. 6: Kinetische

Racematspaltung mittels

einer enantioselektiven

ADH.

1.4.5 Vorteile enzymatischer Verfahren

Der größte Vorteil der enzymatischen Verfahren im Vergleich zu klassisch-chemischen liegt

in einer teils herausragenden Selektivität der eingesetzten Biokatalysatoren. Optisch aktive

Alkohole lassen sich mit sehr hoher Enantiomerenreinheit gewinnen (ee bis ≥ 99 %)31,49,50.

Ein weiterer Vorteil liegt in den milden Bedingungen, unter denen die Reaktion abläuft. Dies

hat einen direkten positiven Einfluss auf die Produktionskosten. So wird in der Regel unter

neutralen bis schwach basischen/ sauren pH-Werten und unter atmosphärischem Druck

gearbeitet. Die erforderliche Temperatur liegt meist im physiologischen Bereich bei etwa

40 °C. Abhängig vom jeweiligen System und Enzym können die Reaktionen mit hohen

Ausbeuten und ohne störende Nebenprodukte ablaufen. Ein großer ökologischer Vorteil liegt

weiterhin im Verzicht auf umweltbelastende Schwermetallkatalysatoren.

1.5 Chemische Methoden zur Synthese von Alkoholen

Neben den beschriebenen biotechnischen Methoden existieren die folgenden klassisch-

chemischen Methoden zur Darstellung alkoholischer Verbindungen:

1.5.1 Nukleophile Substitution aus Halogenalkanen

Die einfachste Art der Darstellung alkoholischer Funktionen ist die Hydrolyse von

Halogenvorstufen mittels nukleophiler Substitution (Abb. 7). Es reagiert ein Nukleophil in

Form einer Lewis-Base (Elektronenpaardonator) mit einer organischen Verbindung vom Typ

R–X51.

Abb. 7: Beispiele zur Gewinnung von alkoholischen Verbindungen mittels nukleophiler Substitution

Einleitung

8

1.5.2 Reduktion von Carbonylverbindungen

Die Hydrierung von Carbonylverbindungen stellt eine weitere Möglichkeit zur Synthese von

alkoholischen Verbindungen dar. Unter Hydrierung versteht man im Allgemeinen die

Addition von Wasserstoff an andere chemische Elemente oder Verbindungen mittels Hydrid-

übertragender Reagenzien.

Zu den wichtigsten Hydrierungsreagenzien gehören Natriumborhydrid (NaBH4) oder

Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH4). Dabei eignet sich NaBH4 vor allem für die Reduktion von

Aldehyden und Ketonen. LiAlH4 wird zur Reduktion von Carbonsäuren eingesetzt.

Die Verwendung dieser Katalysatoren führt allerdings zu einer unselektiven Darstellung der

Alkoholverbindung. Zur Gewinnung reiner Produkte werden spezielle Katalysatoren wie

1,2-Diamin-Ruthenium(II)-Cl2-BINAP52 benötigt (Abb. 8-A), die selbst einen chiralen

Charakter aufweisen. Eine weitere Möglichkeit zur Darstellung enantiomerenangereicherter

Alkohole ist die Nutzung von Boran in Gegenwart von Oxazaborolidin (Abb. 8-B).

Abb. 8: A) 1,2-Diamin-Ruthenium(II)-Cl2-

BINAP-Katalysator B) ein Oxazaborolidin.

Weitere Informationen: siehe 1.5.2.

1.5.3 Reaktion metallorganischer Verbindungen (Grignard-Reaktion)

Mittels metallorganischer Verbindungen lassen sich Alkohole ebenfalls darstellen. Bei der

sogenannten Grignard-Reaktion53 reagiert dabei eine Grignard-Verbindung (metallorganische

Verbindung) als Nukleophil mit einer elektrophilen Verbindung (z. B. der Carbonylgruppe in

einem Aldehyd oder Keton) zu einem Alkohol. Es wird allerdings auch ein Alkyl- oder Aryl-

Rest eingebracht.

1.5.4 Aldolreaktion

Ketone und Aldehyde können eine Aldolreaktion eingehen, wenn mindestens in einem der

Edukte in α-Stellung zur Carbonylgruppe ein H-Atom steht. Als Produkt ensteht ein

β-Hydroxyketon. Alternativ können bei einer gekreuzten Aldolreaktion zwei

Carbonylverbindungen miteinander reagieren. Dabei entstehen bis zu vier verschiedene

Aldole.

Einleitung

9

1.5.5 Vorteile klassisch-chemischer Verfahren

Klassisch-chemische Prozesse, welche nicht auf sehr hohe Enantiomerenreinheit abzielen,

sind oft ökonomischer. So benötigen sie, im Gegensatz zu ADH-katalysierten Synthesen,

keine teuren Cofaktoren wie NADH oder NADPH.

Weiterhin können die benötigten Enzyme an sich auch schon sehr teuer sein. So liegt zum

Beispiel der derzeitige Preis für das Enzym ADH von Parvibaculum lavamentivorans bei

60 €/ml Zellrohextrakt (≥ 40.0 U/ml) (Sigma-Aldrich, 2015).

Klassisch-chemische Prozesse sind oftmals schon lange etabliert53. Sie sind intensiv erforscht

und daher schnell zu adaptieren. Erste intensive Studien über ADHs wurden dagegen erst

gegen Ende der 40er Jahre des 20sten Jahrhunderts publiziert54–56. Es muss daher meist erst

nach einem geeigneten Enzymkandidaten und den anzuwendenden Prozessbedingungen

gesucht werden.

Weiterhin leiden viele ADHs unter einer niedrigen Lösemitteltoleranz57,58. Dies kann zu einer

geringen Substratbeladung des biokatalytischen Prozesses führen7. Darüber hinaus können

Enzyme sensibel gegen pH- und Temperaturveränderungen sein und dadurch im Prozess

inaktiviert oder denaturiert werden59.

1.6 Cofaktor-Regenerierung

Alkoholdehydrogenasen benötigen Cofaktoren für ihre katalytische Aktivität. Dabei dient

NAD(P)H zur Reduktion von ketonischen Funktionen und NAD(P)+ zur Oxidation von

alkoholischen. Diese Cofaktoren werden auch Coenzyme genannt, da sie für die Reaktionen

unabdingbar sind.

Industriell angewandt wird hauptsächlich der reduktive Schritt der ADHs von einer

Ketoverbindung zum entsprechenden Alkohol. In solchen Prozessen wird daher das reduzierte

Coenzym benötigt. Es überträgt während der Reaktion ein Hydrid-Ion auf die Ketogruppe.

Eine alkoholische Funktion und das nun oxidierte Coenzym (NAD(P)+) entstehen. Dabei wird

bei Monoalkoholen pro umgesetztem Substratmolekül ein Molekül des Cofaktors verbraucht.

Stöchiometrisch betrachtet müsste somit im präparativen Ansatz genauso viel Cofaktor wie

Substrat in die Reaktion eingebracht werden.

Um Produktionskosten zu minimieren, wird der Cofaktor in einer parallel laufenden Reaktion

wiederholt reduziert. Man spricht von einer in situ Cofaktor-Regenerierung. Mittels dieses

Verfahrens muss der Cofaktor lediglich in katalytischen Mengen eingesetzt werden. Ein

Beispiel ist in Abb. 9 dargestellt.

Einleitung

10

Abb. 9: Prinzip der Cofaktor-Regenerierung. In der

Hinreaktion (oben) wird Methylacetoacetat zum Methyl-

3-hydroxybutyrat unter NADH-Verbrauch reduziert.

Unter Oxidation von 2-Propanol wird gleichzeitig der

Cofaktor durch dasselbe Enzym regeneriert.

Es existieren verschiedene Möglichkeiten der Cofaktor-Regenerierung. Es wird zwischen

enzymatischen, chemischen, elektro- und photochemischen Methoden unterschieden60.

Letztere drei haben lediglich akademische Bedeutung, da sich der Cofaktor auf

enzymatischem Weg am effektivsten und preisgünstigsten regenerieren lässt.

Auf enzymatischem Weg lässt sich NAD(P)H auf zwei Arten zurückgewinnen:

a) Enzym-gekoppelte Regenerierung

In diesem Fall wird ein weiteres Enzym dem Reaktionsansatz beigesetzt, das in einer parallel

laufenden Reaktion die Reduktion des Cofaktors übernimmt.

Ein Beispiel dafür ist die Formiat-Dehydrogenase (FDH)61,62. Sie katalysiert die Oxidation

von Formiat zu CO2 (Abb. 10). Zur NADH-Regenerierung findet die FDH aus Candida

boidinii Verwendung, für NADPH wird FDH aus Pseudomonas sp. eingesetzt63. Einer der

größten Vorteile der FDH liegt in der Entstehung von Kohlendioxid als Produkt der

Formiatoxidation. Es verursacht keine Probleme bei der Produktaufreinigung, da es sich leicht

aus dem Ansatz entfernen und sich damit auch das Gleichgewicht der Gesamtreaktion in

Richtung NADH-Regenerierung verschieben lässt.

Abb. 10: Schematische Darstellung der Cofaktor-Regenerierung mittels FDH

Ein weiteres oft eingesetztes Enzym ist die Glucosedehydrogenase bzw. die

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase64. Sie oxidiert Glucose(-6-Phosphat) unter

Regenerierung von NAD(P)H (Abb. 11). Verwendung findet vor allem die GDH aus Bacillus

subtilis65,66.

Einleitung

11

Abb. 11: Schematische Darstellung der Cofaktor-Regenerierung mittels G(-6-P-)DH-Reaktion

b) Substrat-gekoppelte Regenerierung65

In diesem Verfahren wird kein zusätzliches Enzym, jedoch ein zusätzliches Substrat

eingesetzt. Es handelt sich um eine alkoholische Verbindung, die von der im Ansatz

enthaltenen ADH unter NAD(P)H-Regenerierung oxidiert wird (Abb. 9).

Ein Problem besteht darin, dass das zweite Substrat (im Falle der Abb. 9: 2-Propanol) oft in

hohem Überschuss eingesetzt werden muss, um das Reaktionsgleichgewicht auf die Seite der

NADH-Regenerierung zu verschieben. Dadurch wird der organische Anteil im

Reaktionsansatz stark erhöht, wodurch es zu Stabilitätsproblemen des Enzyms kommen kann.

Dennoch wird dieses Verfahren aufgrund seiner Einfachheit und Effizienz oft angewandt,

besonders im Bereich der Reduktion wasserunlöslicher Ketone67.

1.7 Identifizierung und Entwicklung neuer Enzyme

Ein Nachteil der ADH-katalysierten, selektiven Biotransformation liegt immer noch in ihrer

begrenzten Einsetzbarkeit. Dies liegt daran, dass die Enzyme zwar oft ein breites

Substratspektrum aufweisen, aber meist nur wenige dieser Substrate hochselektiv umgesetzt

werden. Daher wird ständig an der Identifizierung und Entwicklung neuer Enzyme

geforscht68. Es existieren unterschiedliche Herangehensweisen, um die zur Verfügung

stehende Enzympalette zu erweitern69:

1.7.1 Metagenombanken

Bei der Erstellung von Metagenombanken werden enzymkodierende Gensequenzen aus der

Umwelt isoliert. Diese können daraufhin in Expressionsvektoren kloniert und die Proteine in

Expressionsstämmen wie E. coli BL21 heterolog exprimiert werden. Die auf diese Weise neu

gewonnenen Enzyme werden im Anschluss experimentell charakterisiert und damit

Eigenschaften wie Substratspektrum und Selektivität aufgedeckt68–71.

Einleitung

12

1.7.2 Entdeckung neuer Mikroorganismen

Aus allen erdenklichen Umweltisolaten wie Bodenproben, Wasserproben etc. kann versucht

werden, bisher unbekannte Mikroorganismen zu isolieren72,73. Besonders interessant sind

dabei Organismen aus extremen Ökosystemen wie der Tiefsee, der Arktis oder vulkanischen

Gebieten74–77, da die Biokatalysatoren dieser Organismen oft speziell an die extremen

Bedingungen angepasst sind72. So können sie beispielsweise besonders temperatur- und

lösemittelstabil sein oder auch ungewöhnliche Moleküle als Substrate akzeptieren69.

1.7.3 Gentechnische Veränderung bereits bekannter Enzyme (Enzyme Engineering)

Es steht heute bereits eine breite Palette an Enzymen zur Verfügung, die im industriellen

Maßstab hergestellt und zur Synthese von Chemikalien genutzt werden78–80. Diese Enzyme

können mittels verschiedener Methoden des Enzyme Engineerings verändert werden, um

optimierte Varianten zu generieren. Dabei werden meist Eigenschaften wie Selektivität,

Aktivität oder Stabilität der Katalysatoren als Ziel adressiert81–85. Mittels solcher

Optimierungen lassen sich die Enzyme an bestimmte Prozesse adaptieren, um sie

ökonomischer und/ oder ökologischer ablaufen zu lassen. Grundsätzlich werden die

Methoden des Enzyme Engineerings in a) gerichtete Evolution und b) rationales

Proteindesign unterteilt82,86–91.

a) Rationales Design: Um die Methoden des rationalen Proteindesigns anwenden zu können,

werden Kenntnisse über den atomaren Aufbau des Enzyms benötigt. Idealerweise steht eine

experimentell bestimmte Struktur zur Verfügung, beispielweise gewonnen mittels

Röntgenstrukturanalyse. Alternativ können jedoch auch Homologiemodelle berechnet

werden, welche, abhängig von den zur Verfügung stehenden templates, der Realität sehr nahe

kommen können92,93.

Anhand dieser Strukturinformationen kann rational in silico versucht werden,

Aminosäurepositionen zu identifizieren, die einen entscheidenden Einfluss auf die

Enzymeigenschaften nehmen könnten. Die daraus abgeleiteten Substitutionen können

definiert als Einzelaustausch oder semi-rational in Form einer Sättigungsmutagenese94 in das

Enzym eingefügt werden. Bei Kenntnis des Reaktionsmechanismusses können weiterhin

molekulardynamische Simulationen durchgeführt werden, um den Einfluss bestimmter

Substitutionen zu simulieren95. Nichtsdestotrotz sind die tatsächlichen Auswirkungen der

Mutationen auf die Eigenschaften des Enzyms nicht mit Sicherheit vorherzusehen, da die

atomaren und molekularen Mechanismen und Zusammenhänge sehr komplex sind. Daher

müssen die generierten Varianten im Anschluss in vitro oder in vivo genau charakterisiert

Einleitung

13

werden. Mit zunehmendem Verständnis der molekulardynamischen Zusammenhänge und

zunehmendem technischem Potential zur Berechnung der Simulationen ist jedoch

anzunehmen, dass die Vorhersagen präziser werden95,96. Erfolgreich eingesetzt wurde diese

Methode bisher meist bei lokalisierbaren Eigenschaften wie Substratselektivität

oder -spektrum97, die hauptsächlich durch den Aufbau der active site definiert werden98,99.

b) Gerichtete Evolution: Bei der gerichteten Evolution werden über die gesamte Gensequenz

oder in bestimmten, vorher definierten Bereichen auf zufällige Art Mutationen eingebracht88.

Dies kann mittels rekombinativer oder nicht-rekombinativer Methoden geschehen. Es werden

dabei meist große Variantenbanken des nativen Enzyms generiert100. Die Banken werden

nach gewünschten Eigenschaften durchmustert und positive Klone selektiert. Diese können in

einer nächsten Mutageneserunde als neue templates verwendet werden101. Mittels dieses

Verfahrens werden die Eigenschaften eines Enzyms Schritt für Schritt in eine gewünschte

Richtung verändert102,103. Im Prinzip ist das Verfahren vergleichbar mit dem Prozess der

natürlichen Evolution, welcher von Charles R. Darwin als „survival of the fittest“ bezeichnet

wurde104. Der Unterschied der gerichteten Evolution im Sinne des Protein Engineerings liegt

darin, dass die Selektionsmechanismen vom Experimentator und nicht durch

Überlebensvorteile in der Natur festgelegt werden.

Durch die Wahl der geeigneten Selektionsparameter kann rein theoretisch jede Eigenschaft

des Enzyms evolviert werden. Die Methode ist somit sehr weit anwendbar. Große Erfolge

wurden beispielsweise im Bereich der Lösemittelstabilität102,105,106 und

Thermostabilität85,107,108 erzielt, aber auch bei der Optimierung von Substratspektrum109,110

und Enantioselektivität14,91,102 eines Enzyms.

- Nicht-rekombinative, gerichtete Evolution

Die häufigste Technik, die bei der nicht-rekombinativen, gerichteten Evolution angewendet

wird, ist die fehlerhafte PCR (error-prone polymerase chain reaction). Es wird eine

Polymerase genutzt, die im Laufe der Genamplifikation zufällig falsche Basen in die Sequenz

einbaut111,112. Meist findet die Taq-Polymerase Anwendung. Durch Veränderung der

Reaktionsbedingungen (MgCl2- oder MnCl2-Konzentration) kann die Fehlerrate beeinflusst

werden. In der Regel liegt die gewünschte Mutationsrate bei 1-10 Basenaustauschen je

Kilobase113,114. Weiterhin kann durch den Einsatz von Nukleosidtriphosphat-Analoga oder

ungleichen Nukleosid-Konzentrationen die Fehlerrate beeinflusst werden115.

Einleitung

14

Der Erfolg der gerichteten Evolution mittels nicht-rekombinativer Methoden hängt dabei

entscheidend von der Qualität der generierten Variantenbanken ab. So muss eine vom zu

optimierenden Enzym abhängige, adäquate Mutationsrate ermittelt werden. Ist diese zu hoch

angesetzt, so droht die Inaktivierung eines Großteils der Mutanten. Ist sie dagegen zu niedrig

gewählt, so ist mit einer hohen Anzahl an Wildtyp-Enzymen und einer nur niedrigen Quote an

positiven Klonen zu rechnen14,116. Weiterhin muss beachtet werden, dass die Redundanz des

genetischen Codes bestimmte Aminosäuresubstitutionen aus statistischen Gründen besonders

bevorzugt. So ist Serin beispielsweise mit sechs verschiedenen Basentripletts im Vergleich zu

Histidin mit zwei Tripletts überrepräsentiert. Weiterhin treten bestimmte Basenaustausche mit

erhöhter Häufigkeit auf. So handelt es sich beispielsweise bei 40,9 % der Mutationen in der

Standard-epPCR um A↔T Transversionen117,118. Darüber hinaus können gewisse Bereiche

des Gens bevorzugt mutagenisiert werden. Dies alles führt zu Tendenzen in der Mutagenese,

durch die der abgedeckte Sequenzraum der Banken eingeschränkt wird118. Neue

Mutagenesetechniken wie SeSaM (Sequence Saturation Mutagenesis) überwinden diese

Nachteile, indem hot spots vermieden und mehrere nebeneinanderliegende DNA-Basen

gleichzeitig ausgetauscht werden118. Dadurch kann die Redundanz des genetischen Codes und

die Mutationstendenz überwunden und eine qualitativ hochwertige Mutantenbank generiert

werden.

- Rekombinative, gerichtete Evolution

Rekombinative Evolutionsmethoden basieren auf dem Prinzip der Fragmentrekombination.

Es werden also keine Punktmutationen in das Gen eingebracht, sondern ganze Genregionen

ausgetauscht. Dazu werden Gene unterschiedlicher Enzyme fragmentiert und die Fragmente

im Anschluss auf unterschiedliche Art neu reassembliert, wodurch Hybridgene entstehen. Die

ursprünglichste Technik ist das DNA-Shuffling109, welches auf DNase I Verdau beruht109.

Voraussetzung für diese Technik ist jedoch eine gewisse Sequenzhomologie.

Neben den sequenzhomologen Techniken wie DNA-Shuffling109, Staggered Extension

Process (StEP)119, Random Priming and Recombination (RPR)120, Nucleotide Excision and

Exchange (NExT)121 und weiteren existieren aber auch nicht-sequenzhomologe Verfahren.

Bekannte Vertreter solcher Techniken sind etwa Incremental Truncation for the creation of

Hybrid Enzymes (ITCHY)122, SCRATCHY123 oder Structure-based Combinatorial Protein

Engineering (SCOPE)124.

Es kann bei dieser evolutiven Methode nicht vorhergesagt werden, welche Neukombinationen

entstehen und ob diese Fusionsgene noch aktive Enzymvarianten codieren. Somit muss auch

Einleitung

15

in diesem Fall mittels Screening-Verfahrens die Variantenbank nach aktiven Enzymen

durchmustert werden. Die rekombinative, gerichtete Evolution wurde bereits vielfach

erfolgreich zur Veränderung nativer Enzyme eingesetzt, etwa zur Veränderung der

Selektivität125.

1.8 Zielsetzung der Arbeit

Chirale Alkohole dienen als wichtige Synthesebausteine für Feinchemikalien. Besonders im

Bereich der Pharma-, Agrar- sowie in der Aroma- und Duftstoffindustrie6,7 nehmen sie einen

bedeutenden Stellenwert ein. Dies führt zu einem wachsenden Bedarf an chiralen Alkoholen

in der Industrie126. Grundsätzlich sind diese Bausteine auch durch chemische Synthese

zugänglich. Die Produktionsverfahren leiden jedoch sowohl unter niedriger Selektivität als

auch unter dem Einsatz von giftigen und teuren Katalysatoren. Insbesondere kleine, chirale

Alkohole wie 2-Butanole sind nur schwer über chemische Prozesse in reiner Form

produzierbar. Daher stellen diese Moleküle interessante Ziele für eine biotechnologische

Synthese dar. Speziell Oxidotransferasen können zur Reduktion der Ketovorstufen eingesetzt

werden, bieten teilweise eine herausragende Selektivität und erfreuen sich daher steigender

Beliebtheit40,41. Dennoch leiden auch diese enzymatischen Redoxreaktionen unter einigen

Nachteilen, die in dieser Arbeit gelöst werden sollten. Das Ziel der Arbeit war, ein

ökonomisches sowie ökologisches Verfahren zur Synthese von enantiomerenreinem

(S)-2-Butanol zu entwickeln.

1) Identifizierung eines selektiven Enzyms

Für die Entwicklung des Prozesses zur Synthese von (S)-2-Butanol bot sich die Nutzung eines

Enzyms aus der Klasse der Alkoholdehydrogenasen (ADH) an. Diese katalysieren

Redoxreaktionen, bei denen Reduktionsäquivalente zwischen Akzeptoren und Donoren

ausgetauscht werden. Dadurch könnte die Darstellung des Butanols durch die Reduktion des

preisgünstigen Ketonsubstrats 2-Butanon realisiert werden.

Allerdings ist die Selektivität von ADHs meist nur auf wenige Substrate beschränkt. Dies

stellte die Suche nach einem passenden Biokatalysator an den Anfang der

Bioprozessentwicklung. Dabei war die geringe Größe des Substrates (2-Butanon) eine

besondere Herausforderung. So handelt es sich bei 2-Butanon um die kleinste vorkommende

achirale Kohlenwasserstoffverbindung ohne zusätzliche Heteroatome. Um dem Problem

angemessen zu begegnen, sollte eine breite Palette an Enzymen auf deren Fähigkeit zur

selektiven Umsetzung des Substrats untersucht werden.

Einleitung

16

2) Lösung des Problems der Produktaufreinigung

Ein besonderes Problem bei der Synthese von kurzkettigen Alkoholen und insbesondere von

2-Butanol ist die Bildung von azeotropen Mischungen der organischen Reaktions-

komponenten mit Wasser. Dies führt zu einer stark erschwerten destillativen

Produktaufreinigung, da diese Mischungen (und andere Reaktionskompenenten) sehr ähnliche

Siedepunkte aufweisen. Sie können daher nur noch mit großem Aufwand voneinander

getrennt werden.

Dieses Problem sollte durch den Einsatz hoher Volumenanteile der organischen Phase im

Reaktionsansatz gelöst werden. Durch den Verzicht auf Wasser könnte die

Azeotropenbildung unterbunden werden. Dadurch wäre das Problem der Produktaufreinigung

gelöst.

Allerdings stellt dieses organische Milieu eine große Herausforderung an das Enzym dar. So

werden die meisten Enzyme in Gegenwart großer Mengen an Lösemittel inaktiviert und/ oder

denaturiert. Es musste also ein Biokatalysator gefunden werden, der neben einer exzellenten

Selektivität auch eine enorme Lösemitteltoleranz aufweist.

3) Überwindung der ungünstigen Gleichgewichtslage

Als Reaktionstyp wurde ein System der asymmetrischen Reduktion127,128 gewählt. Dabei

werden prochirale Substrate eingesetzt, die entweder zum gewünschten Produkt oder seinem

(unerwünschten) Enantiomer umgesetzt werden. Theoretisch ist bei dieser Methode eine

Ausbeute von bis zu 100 % möglich, da bei genügend hoher Selektivität das gesamte Edukt

zum gewünschten Produkt reduziert werden kann.

Allerdings ist dieses System als Form der Meerwein-Ponndorf-Verley (MPV) Reaktion

anzusehen129–133. Diese erfordert aufgrund ihrer ungünstigen stöchiometrischen

Gleichgewichtslage den Einsatz hoher Überschüsse an Cosubstrat.

Dieses Problem könnte ebenfalls durch den geplanten hohen Anteil an organischer Phase im

Reaktionsmedium gelöst werden. Würde 2-Propanol als organisches Lösemittel eingesetzt

werden, so könnte es gleichzeitig als Cosubstrat dienen und das thermodynamische

Gleichgewicht stark auf die Produktseite verlagern Damit wäre die MPV Problematik

überwunden. Es würde auch den Einsatz von sehr hohen Mengen an Substrat ermöglichen.

4) Prozess Up-scaling

Das zu entwickelnde Verfahren musste auf die industrielle Tauglichkeit überprüft werden.

Dazu sollten Biotransformationen bis zu einem Volumen von vier Litern durchgeführt

Einleitung

17

werden. Gleichzeitig sollte damit auch genug Ausgangsmaterial produziert werden, um

signifikante Mengen des Produkts (S)-2-Butanol isolieren zu können.

5) Optimierung des Enzyms

Unter weitgehend wasserfreien Bedingungen war es wahrscheinlich, dass Aktivität und

Stabilität des Enzyms beeinträchtigt werden. Daher sollte der Biokatalysator (nach

eingehender Charakterisierung) mittels verschiedener Techniken des Protein Engineerings

hinsichtlich seiner Aktivität und/ oder Lösemittelstabilität optimiert werden.

6) Ökologische Aspekte

Die Verfahren nach Stand der Technik basieren hauptsächlich auf kinetischen

Racematspaltungen40,134,135. Diese produzieren signifikante Mengen an Nebenprodukten. Das

hypothetische Verfahren (basierend auf publizierten Modellreaktionen) zur dynamisch-

kinetischen Resolution (DKR) führt zu einer Produktion an Abfallstoffen von über 25 kg je

Kilogramm Produkt48,135 (23,5 kg Toluol/kg Produkt zur Verdünnung des racemischen

Substrats, dazu noch 1,8 kg Katalysator (Ru-Katalysator und Kalium-tert-Butylat) und 2 kg

Acylierungsreagenz). Darüber hinaus sind die Enantioselektivitäten oft nicht befriedigend. Es

ist davon auszugehen, dass weitere Reinigungsschritte mit dem entsprechenden Aufwand an

Energie und Zusatzstoffen notwendig sind.

ADH-katalysierte Verfahren wären prinzipiell geeignet, diesen Nachteil zu überwinden.

Allerdings beruhen die etablierten Verfahren auf wässrigen Reaktionssystemen, deren

Produktaufreinigung aufgrund der Azeotropenbildung nicht trivial ist. Dieses Problem wäre in

dem geplanten wasserarmen Verfahren nicht zu erwarten. Darüber hinaus würde der neue

Ansatz eine deutlich bessere Auslastung der Reaktoren ermöglichen (lösemittelfreie Systeme

statt einer 80 - 90 %igen Beladung mit Wasser), was sowohl aus ökonomischer als auch aus

ökologischer Sicht eine Verbesserung darstellt. Die generierte Menge an Abfallprodukten

könnte damit deutlich reduziert werden.

Material und Methoden

18

2. Material und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Geräte

Analytik

Spektrometer UV-1800 Shimadzu

MTP Spektramax 250 (BC-MDSMX250) GMI

Gaschromatograph Focus GC mit FID Thermo Scientific

Gaschromatograph Autosampler TriPlus Thermo Scientific

Nanodrop 2000 Thermo Scientific

Zentrifuge

Ultrazentrifuge J2-21 M/E Beckmann Coulter

Tischzentrifuge 5810 R Eppendorf

Sonstige

Thermomixer compact Eppendorf

Thermostat CF31 Kryo-Kompakt Julabo

Multimagnetrührer Multipoint Komet Variomag

Rotationsverdampfer Rotavapor R-215 BÜCHI

Ultraschall Sonoplus Bandelin

Pipettierroboter Genesis Workstation 200 Tecan

Ultraschall-Homogenisator Sonopuls Bandelin Electronic

French-Press Homogenisator LM10 Microfluidics

PCR Mastercycler Gradient Eppendorf

Elektroporator MicroPulser BTX

Mikrotiterplattenschüttler Edmund-Bühler GmbH

Pickroboter Genetix Qpix Molecular Devices

SDS-PAGE Mini-Protean Bio-Rad

Lyophille Alpha 1-4 LSC Christ 2.1.2 Chemikalien

Alle im Rahmen dieser Doktorarbeit verwendeten Chemikalien und Medienkomponenten

wurden in p.A.- Qualität von folgenden Firmen erworben:


19

Antibiotika: Gerbu (Geilberg), Serva (Heidelberg), Sigma (Deisenhofen), Carl Roth

(Karlsruhe)

Chemikalien: Biomol (Hamburg), Fluka (Sternheim), Gibco BRL (Eggenstein),

Merck (Darmstadt), Pharmacia (Freiburg), Riedel-de-Haën (Seelze),

Carl Roth (Karlsruhe), Sigma (Deisenhofen), Serva (Heidelberg)

Enzyme: Restriktionsenzyme wurden von den Firmen MBI Fermentas

(St. Leon-Rot) und New England BioLabs (Schwalbach) bezogen.

Weitere Enzyme wurden von folgenden Firmen bezogen: Lysozym von

Sigma (Deisenhofen), T4-DNA-Ligase, Taq-Polymerase, Phusion-

Polymerase von New England BioLabs (Schwalbach), DNase I von

Promega (Mannheim).

Medien: Difco (Detroit, USA), Gibco BRL (Eggenstein)

2.2 Mikrobiologische Methoden

2.2.1 Mikroorganismen und Vektoren

Tab. 2: Verwendete Mikroorganismen

Stamm Genotyp Referenz

Escherichia coli DH5α

supE44 ∆(lacZYA-argF)U196

(Φ80∆lacZM15) hsdR17 recA1 endA1

gyrA96 thi-1 relA1

136

E. coli BL21 (DE3) F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal (DE3) 137

E. coli T7 Shuffle

F ́lac, pro, lacIQ / ∆(ara-leu)7697

araD139 fhuA2 lacZ::T7 gene1

∆(phoA)PvuII phoR ahpC* galE (or U)

galK λatt::pNEB3-r1-

cDsbC (SpecR, lacIq) ∆trxB

rpsL150(StrR) ∆gor ∆(malF)3

New England BioLabs

Tab. 3: Verwendete Vektoren

Vektoren Genotyp Referenz

pET-21a(+) bla lacI PT7 137


20

2.2.2 Oligonukleotide

Sämtliche in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide und Primer wurden lyophilisiert von

der Firma Microsynth (Lindau) bezogen. Zur Verwendung wurden sie in einer Konzentration

von 100 pmol/µl in A. dest. gelöst, die Lagerung erfolgte bei -20 °C.

Tab. 4: Verwendete Oligonukleotide.

Name Nukleotidsequenz

(unkenntlich gemacht zum Schutz der propriäteren Gensequenz (evocatal GmbH))

evo-040-Fwd GTGAGCGGATAACAATTCCC

evo-040-Rev TAGCAGCCGGATCTCAGTGG

SSB-E34C-Fwd XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXtgcXXXXXXXXXXXXXX

SSB-E34C-Rev XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXgcaXXXXXXXXXXXXXX

SSB-G64C-Fwd XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXtgcXXXXXXXXXXXXXX

SSB-G64C-Rev XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXgcaXXXXXXXXXXXXXX

SSB-V63C-Fwd XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXtgcXXXXXXXXXXXXXX

SSB-V63C-Rev XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXgcaXXXXXXXXXXXXXX

SSB-A142C-Fwd XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXtgcXXXXXXXXXXXXXX

SSB-A142C-Rev XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXgcaXXXXXXXXXXXXXX



SSB-A130C-Fwd XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXtgcXXXXXXXXXXXXXX

SSB-A130C-Rev XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXgcaXXXXXXXXXXXXXX

SSB-D138C-Fwd XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXtgcXXXXXXXXXXXXXX

SSB-D138C-Rev XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXgcaXXXXXXXXXXXXXX

SSB-Q141C-Fwd XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXtgcXXXXXXXXXXXXXX

SSB-Q141C-Rev XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXgcaXXXXXXXXXXXXXX





SSB-T238C-Fwd XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXtgcXXXXXXXXXXXXXX

SSB-T238C-Rev XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXgcaXXXXXXXXXXXXXX




21

3DM-1-Fwd XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXnnkXXXXXXXXXXXXXX

3DM-1-Rev XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXmnnXXXXXXXXXXXXXX





















2.2.3 Medien

Alle Nähr- und Testmedien wurden für mindestens 20 Minuten bei 121°C und 200 kPa

autoklaviert. Hitzelabile Komponenten wurden sterilfiltriert (Millipore - Membranfilter:

0,22 µm Porendurchmesser) und den autoklavierten Medien bei < 60 °C zugefügt.

LB-Flüssigmedium138

10 g/l Trypton; 10 g/l NaCl; 5 g/l Hefeextrakt; pH 7,5


22

TB-Medium139

12 g/l Trypton; 24 g/l Hefeextrakt; 100 ml/l 10-fach konzentrierter KPi-Puffer

10-fach konz. KPi-Puffer (0,17 M KH2PO4; 0,72 M K2HPO4):

23 g/l KH2PO4; 164 g/l K2HPO4

2.2.4 Isolierung von Nukleinsäuren

Die Isolierung von Plasmid-DNA wurde nach der von Birnboim & Doly beschriebenen

Methode der alkalischen Lyse unter Verwendung eines Plasmid-Isolationskits der Firma

Fermentas (St. Leon-Rot) nach Herstellerangaben durchgeführt140. Die Konzentration von

DNA-Präparaten wurde durch analytische Gelelektrophorese oder durch einen Nanodrop

(Thermo Scientific) bestimmt.

2.2.5 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren

Die Agarose-Gelelektrophorese wurde zur Analyse von DNA und der gezielten Isolierung

von DNA-Fragmenten durchgeführt. Dabei wurde nach der von Sambrock et al.

beschriebenen Methode vorgegangen138. Als Elektrophoresepuffer wurde 0,5 x TBE (45 mM

Tris-Base; 45 mM Borat; 1,25 mM EDTA; pH 8,3) benutzt. Als Größenstandard für die

DNA-Banden wurde, soweit nicht anders bezeichnet, die „1 kb-Ladder“ der Firma NEB

verwendet. Zur gezielten Isolierung von DNA aus Agarosegelen wurde das „Gel-Extraction-

Kit“ der Firma Eppendorf (Hamburg) benutzt.

2.2.6 in vitro-Rekombination von Nukleinsäuren

Die Restriktion und die Ligation von DNA-Fragmenten wurde nach Sambrock et al. sowie

nach den Angaben der Hersteller der jeweiligen Enzyme durchgeführt138. Die Reaktionen

fanden in den mitgelieferten Puffern statt.

2.2.7 Amplifikation von Nukleinsäuren durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Zur Amplifikation von DNA wurde die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nach Saiki et al.

durchgeführt141. Standardmäßig wurden PCR-Ansätze mit einem Volumen von 50 µl

angesetzt, die sich wie folgt zusammensetzten: 1-5 ng Plasmid, 25 pmol von jedem

Oligonukleotid, 0,2 mM dNTPs und 1 U „Phusion High Fidelity“-DNA-Polymerase im

Reaktionspuffer des Herstellers. Die PCR wurde in dem PCR-Automaten „Mastercycler ep

gradient“ der Firma Eppendorf (Hamburg) und, wenn nicht anders angegeben mit dem


23

folgenden Programm durchgeführt: 1 x (3 min, 98 °C), 35 x (1 min, 98 °C; 0,5 min, 58 °C;

1 min, 72 °C, abhängig von der Länge des zu amplifizierenden DNA-Fragments), 1 x (7 min,

72 °C).

2.2.8 QuikChange-Mutagenese

Zur Insertion einer oder mehrerer definierter Mutationen diente die QuikChange-Methode

nach Kunkel142. Bei der QuikChange-Mutagenese können Mutationen an beliebigen Stellen

der Nukleotidsequenz eingefügt werden, wobei als template ein Dam-methyliertes, zirkuläres

Doppelstrang-DNA-Plasmid dient. Durch zwei zueinander revers-komplementäre Primer wird

die Mutation in das Zielplasmid eingefügt. Die Mutagenese-Primer binden an die zu

mutierenden Bereiche des Plasmids und werden anschließend durch eine Polymerase zu

einem vollständigen, mutierten DNA-Strang aufgefüllt. Das template wird danach durch

Behandlung mit der Restriktionsendonuklease DpnI entfernt. Diese Nuklease hydrolysiert

spezifisch methylierte und hemimethylierte DNA an der häufig vorkommenden Zielsequenz

5’-Gm6ATC-3’143.

Das Produkt der QuikChange-Mutagenese kann durch Transformation in kompetente E. coli

Zellen eingebracht werden. Durch die zelleigenen Reparatursysteme werden die

Nukleotidstränge geschlossen und das Plasmid methyliert und repliziert. Aufgrund der

erneuten Methylierung kann das durch eine Mini-Präparation gewonnene Mutagenese-

Produkt als template für weitere Mutagenese-Runden eingesetzt werden.

2.2.9 Sättigungsmutagenese

Sättigungsmutagenesen wurden durchgeführt, um ein bestimmtes Basen-Triplett vollständig

zu mutagenisieren und so sämtliche natürliche Aminosäuren an dieser Position in das

Zielprotein einzubauen. Hierzu wurde die beschriebene Methode der QuikChange-

Mutagenese angewandt. Es wurde ein Gemisch aus Oligonukleotiden als Primer genutzt,

welche bis auf das Basentriplett, das sich an der zu sättigenden Position befand, identisch

waren. Dieses Triplett war randomisiert, das heißt jeder Primer des Gemisches codierte an

dieser Stelle für eine der 20 proteinogenen Aminosäuren in äquimolarem Verhältnis.

Der weitere Ablauf war identisch zu der Standard QuikChange-Mutagenese.

2.2.10 Ungerichtete Mutagenese mittels epPCR

Um ungerichtet über das gesamte evo-040-Strukturgen verteilt Basen zu substituieren, wurde

der Ansatz der fehlerhaften Polymerase-Kettenreaktion (epPCR = error-prone polymerase


24

chain reaction) gewählt113,114. Je nach Höhe der gewünschten Mutationsrate wurde eines der

unten aufgeführten Protokolle angewandt (Tab. 5).

Tab. 5: Protokoll zur Durchführung der epPCR.

Protokoll 1 Protokoll 2

Oligonukleotid evo-040-Fwd 5 pmol 5 pmol

Oligonukleotid evo-040-Rev 5 pmol 5 pmol

Puffer Taq-Puffer Taq-Puffer

MgCl2 6,0 mM 6,0 mM

MnCl2 0,07 mM 0,3 mM

dNTPs 0,2 mM 0,2 mM

DMSO 3 % 3 %

Taq-DNA-Polymerase 2,5 U 2,5 U

Plasmid 1 ng 1 ng

durchschnittliche Fehlerrate

(Basensubstitution/kb) ca.1,5 ca. 13

2.2.11 DNA-Sequenzierungen

DNA-Sequenzierungen wurden als Auftragsarbeit von GATC Biotech (Düsseldorf) durch-

geführt.

2.2.12 Transformation von Bakterienzellen mit Plasmid-DNA durch Hitzeschock

Die Transformation von Bakterienzellen mit Plasmid-DNA wurde nach Hanahan

durchgeführt144. 100 ng des entsprechenden Plasmids wurden mit 200 µl chemisch

kompetenter E. coli Zellen gut vermischt und mindestens 30 Minuten auf Eis inkubiert. Der

folgende Hitzeschock bei 42 °C dauerte 90 Sekunden. Unmittelbar danach wurden 900 µl LB

zugegeben und der Ansatz für die „phänische Expression“ in einem Reagenzglasrotator bei

37 °C inkubiert. Die Bakterien wurden anschließend auf Selektivagarplatten ausplattiert und

über Nacht bei 37 °C bebrütet.

2.2.13 Transformation von Bakterienzellen mit Plasmid-DNA durch Elektroporation

Zur Gewinnung von elektrokompetenten E. coli Zellen wurden eine 800 ml LB-Hauptkultur

in einem 5 Liter Erlenmeyerkolben mit 3,2 ml einer Vorkultur angeimpft. Diese wurde bis zu

einer O.D.580nm = 0,5 - 0,7 geschüttelt. Anschließend erfolgte die Ernte durch Zentrifugation

(4 °C; 6000 rpm; 5 min). Das Pellet wurde dreimal in 250 ml eiskaltem H2O (millipore)


25

resuspendiert, gewaschen und erneut abzentrifugiert. Um die elektrokompetenten Zellen

lagern zu können, mussten sie daraufhin einmal in 40 ml 10 %igem Glycerin resuspendiert,

gewaschen und erneut geerntet werden (15 min; 7000 rpm; 4 °C). Das Zellpellet konnte dann

in 2 ml A. dest. mit 10 % Glycerin aufgenommen und in 50 µl Portionen aliquotiert werden.

Die Aliquots wurden zur längeren Lagerung bei – 80 °C eingefroren.

Für die Transformation wurden 5 µl dialysierter Plasmidlösung (100 ng/µl) zu einem Aliquot

kompetenter Zellen gegeben und das Gemisch wurde in eine vorgekühlte

Elektroporationsküvette (2 mm Spaltenbreite) überführt.

Unmittelbar danach fand die Transformation durch Anwenden eines elektrischen Pulses statt

(2,5 kV, 25 µF, 200 Ohm). Nach Zugabe von 800 µl SOC-Medium wurde die „phänische

Expression“ bei 37 °C durchgeführt, um den Resistenzmarker zu exprimieren (1 h).

Anschließend konnten die transformierten Zellen auf Selektionsagarplatten ausplattiert

werden.

2.2.14 Kultivierung von Bakterien und Proteinexpression

Kulturen von Escherichia coli wurden, wenn nicht anders angegeben, in LB-Medium bei

37 °C bebrütet. Unter Selektionsdruck wachsende Stämme wurden mit Antibiotika

(100 µg/ml Amp) angezogen. Die Anzucht von Flüssigkulturen erfolgte in zu maximal 10 %

befüllten Erlenmeyerkolben auf einem Rundschüttler mit 180 UpM.

Als Übernachtkulturen wurden solche Kulturen bezeichnet, die mindestens 16 h bebrütet

wurden. Hauptkulturen wurden aus einer solchen Übernachtkultur auf eine O.D.600nm = 0,05

beimpft. Die Bestimmung der Zelldichte von Kulturen erfolgte photometrisch bei einer

Wellenlänge von 600 nm gegen das entsprechende Medium als Referenz.

Als Expressionsinduktor wurde IPTG bei einer Zelldichte der Hauptkultur von

O.D.600nm = 0,5 - 0,7 mit einer Endkonzentration von 100 µM zugegeben. Die anschließende

Proteinexpression lief über insgesamt 16 h bei 30 °C im Rundschüttler (180 UpM).

Kulturen auf Festmedien wurden auf LB-Agarplatten ausgestrichen und bei 37 °C für ca. 16 h

inkubiert bzw. so lange, bis sich deutlich erkennbare Kolonien gebildet hatten.

2.2.15 Zellaufschluss/ Rohextraktgewinnung

Nach der Proteinexpression erfolgte der Aufschluss der E. coli Zellen per Ultraschall oder

mittels French-Press Homogenisator.


26

Die Bakterien wurden in der Ultrazentrifuge bei 4 °C über 20 min bei 21.000 UpM geerntet.

Die Zellmasse wurde bestimmt und in dreifacher Menge Puffer (100 mM Tris/ HCl; pH 7,2;

1 mM MgCl2) resuspendiert.

Ultraschall: Zum Zellaufschluss wurde die Lösung für 3 Zyklen von je 30 Sekunden

(Intensität 70 %) einer Ultraschallbehandlung unterzogen.

French-Press Homogenisator: Die Homogenisierung fand in zwei Durchläufen (900 bar) statt.

Der entstandene Zellrohextrakt wurde 20 Minuten bei 10.000 g zentrifugiert, um Zelltrümmer

zu entfernen.

2.2.16 Lagerung von Proteinlösungen

Der durch Ultraschallaufschluss gewonnene Rohextrakt wurde 20 min bei 14.000 g und 4 °C

zentrifugiert, der Überstand in 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen aliquotiert und bei -20 °C

aufbewahrt.

2.2.17 Anzucht und Expression im Hochdurchsatzverfahren

Die hergestellten Bibliotheken mutierter Gene der ADH evo-040 wurden mittels BamHi und

NdeI in den Expressionsvektor pET21(a)+ kloniert und der T7-Expressionsstamm E. coli

BL21(DE3) damit transformiert. Die Zellen wurden auf Selektiv-Agarplatten (100 µg/ml

Ampicillin) ausplattiert und nach ausreichender Entwicklung der Kolonien (37 °C)

automatisiert und in großer Zahl (500 – 5000 Kolonien pro Durchgang) per Pickroboter

(Qpix, Genetix) in 96-Deepwell-Mikrotiterplatten (Einzelgefäßvolumen je 2 ml (Greiner Bio-

One, Frickenhausen)) mit TB-Medium inklusive Ampicillin überführt.

Kulturen für Aktivitäts-Screening im Hochdurchsatz (HTS) wurden zu je 1 ml Volumen bei

37 °C im Mikrotiterplattenschüttler (TiMix 5, Edmund Bühler GmbH, Hechingen) bei

500 rpm angezogen. Die Proteinexpression erfolgte durch Induktion mit 0,1 mM IPTG

(Endkonzentration) für 5 h bei 30 °C.


27

2.3 Biochemische Methoden

2.3.1 ADH evo-040 Aktivitätsassay

Die Aktivität der Alkohol-Dehydrogenase evo-040 wurde photometrisch über die Abnahme

der NADH-Konzentration bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen.

Ablauf:

970 µl 10 mM trans-2-Hexen-1-al in 50 mM TEA-Puffer pH 7 mit 1 mM DTT

20 µl 12,5 mM NADH

10 µl Enzymlösung

Das Lyophilisat wurde eingewogen und in einer entsprechenden Menge A. dest. auf eine

Endkonzentration von 50 mg/ml gelöst. Puffer, Substrat- und NADH-Lösung wurden in eine

Küvette gegeben und 5 min bei 30 °C inkubiert. Nach Zugabe der Enzymlösung und

Durchmischen der Lösung wurde der Extinktionsverlauf über eine Minute bei 30 °C und

340 nm gemessen.

Für die Bestimmung der Aktivität der Dehydrogenase konnte die Umsetzung des Cofaktors

NAD+ bzw. NADH genutzt werden. Im Gegensatz zu NADH absorbiert NAD+ bei 340 nm

nicht, so dass bei dieser Wellenlänge im Photometer die Oxidation von NADH zu NAD+

beobachtet werden konnte. Die Aktivität des Enzyms wurde nach folgender Formel

berechnet:

��ä� � �� =∆� ∙ �� ∙ � ∙ � ∙ �

∆E/∆t = Extinktionsänderung bei 340 nm (min-1)

V = Testvolumen (µl)

ε = molarer Extinktionskoeffizient für NAD(P)H (6,22 ml · mmol-1 · cm-1)

d = Schichtdicke der Küvette (cm)

v = Probenvolumen (µl)

f = Verdünnungsfaktor der Enzymlösung


28

2.3.2 Hochdurchsatz-Screening von Variantenbibliotheken

Die im Folgenden beschriebenen Pipettierschritte wurden in einem automatisierten Verfahren

in einer TECAN Workstation Genesis 200 der Firma TECAN (Crailsheim) durchgeführt:

ADH-Varianten wurden nach Anzucht in einer DWP mittels Zelllyse aufgeschlossen. Die

Lysislösung bestand aus 2 ml Aufschlusspuffer (30 mM Imidazol; 300 mM NaCl; 50 mM

NaH2PO4), 20 µl Lysozym (Stock 100 mg/ml), 2 µl MgCl2 und 1 ml A. dest..

40 µl Zellkultur wurden mit 120 µl Lysislösung vereint, durchmischt und der Ansatz zwei

Stunden bei RT inkubiert.

Assay 1: Thermostabilität

50 µl des Zelllysates wurden mit 50 µl KPi-Puffer (50 mM; pH 7,0) vermengt, in eine PCR-

Platte überführt und diese einem Hitzeschock unterzogen. Dieser fand separat in einem

„Mastercycler ep gradient“ der Firma Eppendorf (Hamburg) statt. Der Hitzeschock bei 50 °C

dauerte 5 Minuten mit einer anschließenden Rückkühlphase für 30 Sekunden bei 4 °C.

20 µl der behandelten Lösung wurden mit 180 µL Reaktionslösung (50 mM KPi pH 7,0;

10 mM 2-Butanon; 0,3 mM NADH) in eine flache, durchsichtige ELISA-Mikrotiterplatte

(96-Well MTP 0,3 ml (Greiner Bio-One, Frickenhausen)) überführt. Die MTP wurde zur

Messung ins Photometer (Sunrise, Tecan) transportiert, wo die Absorptionsänderung bei einer

Wellenlänge von 340 nm über 2 min aufgezeichnet wurde und mit Hilfe einer Software

(Magellan, Fa. TECAN, Crailsheim) ausgewertet werden konnte, um die Enzymaktivität zu

bestimmen.

Assay 2: Lösemittelstabilität

20 µl des Zelllysates wurden mit 180 µl Isopropanol in flache, durchsichtige ELISA-

Mikrotiterplatten (96-MTP 0,3 ml (Greiner Bio-One, Frickenhausen)) überführt und

5 Minuten bei RT inkubiert. 20 µl der so behandelten Lösung wurden mit 180 µL

Reaktionslösung (50 mM KPi pH 7,0; 10 mM 2-Butanon; 0,3 mM NADH) gemischt und die

MTP zur Messung ins Photometer (Sunrise, Tecan) transportiert, wo die Absorptionsänderung

bei 340 nm Wellenlänge über 2 min aufgezeichnet wurde und mittels Software (Magellan, Fa.

TECAN, Crailsheim) ausgewertet werden konnte, um die Enzymaktivität zu bestimmen.

2.3.3 Quantitative Proteinmessungen

Die Proteinbestimmung wurde photometrisch nach Bradford mit Roti Quant Fertiglösung

(Roth) in der Mikrotiterplatte durchgeführt. Gemessen wurde die Zunahme der Absorption bei


29

590 nm durch den CBBG-Protein-Komplex nach fünfminütiger Inkubationszeit.

Durch gemessene Absorptionswerte konnten die Proteinkonzentrationen der Enzymlösungen

berechnet werden. Dazu musste eine Kalibriergerade erstellt werden, anhand derer die

Absorptionswerte den Konzentrationen zugeordnet werden konnten. Die Kalibriergerade

wurde mittels Rinderalbumin (BSA) unter folgenden Standardkonzentrationen erstellt:

0,0 mg/ml; 0,02 mg/ml; 0,04 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,08 mg/ml; 0,10 mg/ml.

Verlässliche Proteinwerte konnten nur innerhalb dieses Kalibrationsspektrums bestimmt

werden, weshalb die Rohextrakte entsprechend ihrer Konzentration verdünnt werden mussten.

Die Reaktion selbst lief unter Raumtemperatur nach folgendem Schema ab:

50 µl Probe + 200 µl Reagenz (2 Teile Roti Quant + 5,5 Teile A. dest.).

2.3.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die Trennung von Proteinen erfolgte unter denaturierenden Bedingungen in Gegenwart von

SDS145. Das diskontinuierliche Gelsystem setzte sich aus einem 5 %igen Sammelgel und aus

einem 15 %igen Trenngel zusammen. Vor der elektrophoretischen Trennung wurden die

Proteinproben in SDS-Probenpuffer (50 mM Tris/ HCl; pH 6,8; 4 % (w/v) SDS; 10 % (v/v)

Glycerol; 2 % (v/v) β-Mercaptoethanol; 0,03 % (w/v) Bromphenol-Blau R-250)

aufgenommen und 10 min bei 98 °C denaturiert.

Zum Färben des Gels diente Coomassie-Färbelösung (Coomassie Brilliant Blue R250 1 g/l;

Methanol 40 % v/v; Eisessig 10 % v/v), zum Entfärben Coomassie-Entfärbelösung (Ethanol

40 % v/v; Eisessig 10 % v/v).

2.3.5 Gaschromatographische Umsatz- und ee-Bestimmung

Gaschromatographische Analysen wurden mit einem Gaschromatographen Focus GC

(Thermo Scientific) mit Flammenionisationsdetektor durchgeführt.

Geräteparameter: Trägergas: Helium; T(Injektor) = 200 °C; T(FID) = 250 °C

Temperaturprofile und Retentionszeiten sind unten aufgeführt.

1. IPC- (Umsatz) Analytik

Probenahme: 400 µl MtBE wurden mit 50 µl Reaktionslösung und 1 Spatelspitze Na2SO4

vermengt. Die Mischung wurde 3 Minuten bei 14.000 rpm zentrifugiert und 200 µl der

organischen Phase wurden in ein GC-Probengefäß überführt.


30

- Säule: FS-Innopeg 2000 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm)

- Flow: Helium const. 0,3 ml/min

- Split flow: 20 ml/min

- Ofen: Initial: 0 °C/min - 38 °C - 15,00 min

Rampe 1: 10 °C/min - 70 °C - 5,00 min

Rampe 2: 25 °C/min - 180 °C - 5,00 min

- Retentionszeiten: 2-Butanon: 8,49 min

2-Butanol: 15,89 min

2. Isomeren- (ee) Analytik

Probenahme: 400 µl MtBE wurden mit 50 µl Reaktionslösung und 1 Spatelspitze Na2SO4

vermengt. Die Mischung wurde 3 Minuten bei 14.000 rpm zentrifugiert und 200 µl der

organischen Phase in ein GC-Probengefäß überführt.

- Säule: CP-Chirasil-DEX CB (25 m x 0,25 mm x 0,25 µm)

- Flow: Helium const. 0,5 ml/min

- Split flow: 50 ml/min

- Ofen: Initial: 0 °C/min - 37 °C - 26,00 min

- Retentionszeiten: (R)-2-Butanol: 20,12 min

(S)-2-Butanol: 20,55 min

2.3.6 Computerprogramme

Tab. 6: Verwendete Computerprogramme.

Software Anwendung

MS-Office 2010 Textverarbeitung, Tabellenkalkulation

Softmax Pro 3.2.1 Auswertung Enzymaktivität

Chrom-card data system Ver. 2.7 GC Chromatogramme

Swiss pdb-Viewer 4.0.3 Kristallstrukturen

ChemSketch Molekülstrukturen

Pubmed, SciFinder Literaturrecherche

FACTS, Gemini, Magellan Bedienung Tecan-Pipettierautomat

In dieser Arbeit wurden Ergebnisse mit Hilfe eines Scanners, einer Digitalkamera oder durch

Videodokumentationsanlagen digitalisiert und eingefügt. Es wurden keine inhaltlichen

Änderungen der Abbildungen vorgenommen.

Ergebnisse

31

3. Ergebnisse Teil 1: Entwicklung eines Prozesses zur biokatalytischen Darstellung von

(S)-2-Butanol

3.1 Identifizierung einer geeigneten Alkoholdehydrogenase (ADH)

Das Ziel der Arbeit war die Entwicklung eines ökonomischen sowie ökologischen Verfahrens

zur Synthese von enantiomerenreinem (S)-2-Butanol. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde

angestrebt, die enzymatische Reduktion des zugehörigen Ketons 2-Butanon in einem

wasserarmen Reaktionsmilieu stattfinden zu lassen. Dadurch sollten Verbesserungen

besonders in Bezug auf Prozessausbeute, Produktaufreinigung und Abfallvermeidung erreicht

werden146. Zu Beginn der Prozessentwicklung ergaben sich also zwei grundsätzliche

Herausforderungen: Der angemessene Biokatalysator musste zum einen eine sehr hohe

Stereoselektivität bei der Umsetzung des Ketons aufweisen (ee(Produkt) ≥ 99,5 %) und zum

anderen eine hohe Toleranz gegenüber organischen Lösemitteln besitzen

(φ(organische Phase) ≥ 80 %).

3.1.1 Etablierung einer analytischen Methode zum Nachweis von 2-Butanon und der

quantitativen Analyse der Stereoisomeren des 2-Butanols

Es wurde zunächst eine Analytik zur Detektion des Edukts und Produkts sowie der getrennten

Enantiomere entwickelt. Die Methode der Wahl war ein Nachweis mittels

Gaschromatographie, da diese eine schnelle und kostengünstige Detektion der Substanzen

ermöglicht. Die Trennung von Keton und Alkohol konnte mittels einer achiralen

FS-Innopeg-2000-Säule realisiert werden. Dabei musste der Ofen möglichst kühl temperiert

werden (40 °C), da die Analyten sowie die eingesetzten Lösemittel und

Cofaktorregeneratoren nahe beieinander liegende Siedepunkte besitzen (MtBE: 55 °C;

2-Butanon: 80 °C; 2-Propanol: 82 °C; 2-Butanol: 99 °C). Dadurch ergaben sich relativ lange

Retentionszeiten von 8,49 min für 2-Butanon und 15,89 min für 2-Butanol (Abb. 12-A).

Die Trennung der Produktenantiomere wurde über eine chirale CP-Chirasil-DEX CB Säule

realisiert. Auch hier ergaben sich durch ein möglichst niedriges Temperaturprofil lange

Retentionszeiten. Diese lagen bei 20,12 min für das (R)-Enantiomer sowie 20,55 min für das

(S)-Enantiomer, wobei sich die Retentionszeiten aufgrund von Peaktailing teils leicht

verschoben (± 0.5 min) (Abb. 12-B). Das Ausmaß des Tailings hing dabei von der injizierten

Probenmenge ab und konnte durch veränderte Elutionsprofile nicht behoben werden. Da es

die quantitative Analyse jedoch nicht beeinträchtigte, stellte es kein Problem bei der

Peakflächenbestimmung dar.

Ergebnisse

32

Abb. 12: Gaschromato-

graphische Analyse der

Reaktionskomponenten. (A)

GC-Chromatogramm der

Trennung von 2-Butanon und

2-Butanol über eine achirale

FS-Innopeg-2000 Säule.

(B) Quantitative Enantiomeren-

analyse von (S)- und

(R)-2-Butanol über eine chirale

CP-Chirasil-DEX CB Säule.

3.1.2 Identifizierung von Alkoholdehydrogenasen, die 2-Butanon als Substrat

akzeptieren

Neben den in der Literatur beschriebenen Alkoholdehydrogenasen HL-ADH (Horseliver-

ADH) 28,147,148, LB-ADH (Lactobacillus brevis-ADH)149–152 und PL-ADH (Parvibaculum

lavamentivorans-ADH)14,153,154 wurden 21 proprietäre Enzyme der Firma evocatal GmbH

untersucht.

Aus diesem Portfolio sollte ein Enzym identifiziert werden, welches in der Lage war,

2-Butanon nicht nur selektiv, sondern auch mit hoher Aktivität zu reduzieren. Dass die

beschriebene katalytische Reaktion grundsätzlich möglich ist, wurde bereits in der

Vergangenheit dokumentiert40,134. Allerdings waren die beschriebenen (und ähnliche)

Prozesse stets durch niedrige Produktausbeute und -reinheit oder durch schwer zu

produzierende Biokatalysatoren gekennzeichnet.

Die insgesamt 24 in dieser Arbeit untersuchten Alkoholdehydrogenasen wurden in einem

initialen Screening auf ihre Eignung zur Reduktion von 2-Butanon untersucht. Dazu wurden

je 10 mg/ml lyophilisierter Enzymrohextrakt (heterolog exprimiert in E. coli BL21(DE3))

eingesetzt. Tab. 8 gibt einen Überblick über die Enzymaktivität der Lyophilisatpräparate.

Die Reaktionen liefen im 5 ml Maßstab (50 mM KPi-Puffer; pH 7,5) mit einer

Substratbeladung von 100 mM 2-Butanon ab (0,1 mM NAD+ bzw. 0,4 mM NADP+). Es

wurden Reaktionen zum einem mit einem Isopropanol (iPrOH)- und zum anderen mit einem

Glucosedehydrogenase (GDH)-Cofaktorregenerationssystem analysiert. Das iPrOH-

Ergebnisse

33

Regenerationssystem war durch einen Anteil von 10 Vol.-% 2-Propanol gekennzeichnet.

Dadurch wurde eine NAD(P)H-Cofaktorregenerierung direkt durch die eingesetzte ADH

ermöglicht. Das GDH-System dagegen benötigte neben Glucose (30 mg/ml) auch die Zugabe

von Glucosedehydrogenase (10 mg/ml), um den Cofaktor zu regenerieren.

Nach 24 Stunden Reaktionsdauer wurden Proben entnommen und die Konzentration von

2-Butanon und eventuell entstandenem 2-Butanol gaschromatographisch ermittelt. Die

Analyse zeigte, dass von den 24 Alkoholdehydrogenasen zwölf in mindestens einem der

Regenerationssysteme eine signifikante Aktivität aufwiesen. Tab. 7 gibt eine Übersicht über

diese zwölf aktiven ADHs.

Tab. 7: Übersicht über die im Initial-Screening aktiven Enzyme nach 24 Stunden Reaktionsdauer. Zwölf

ADHs zeigten signifikante Aktivität gegenüber 2-Butanon als Substrat. Die niedrigeren Umsätze wurden grau

unterlegt.

Alkoholdehydrogenase GDH-Regenerationssystem

Umsatz (% abs.)

iPrOH-Regenerationssystem

Umsatz (% abs.)

evo-010 93 57,9

evo-020 84,5 25,5

evo-030 94 77,5

evo-040 94,5 72

evo-050 23 11,2

evo-250 43,2 11,7

evo-260 93,9 82,8

evo-270 93,2 84

evo-320 92,4 76,2

evo-330 44,3 9,1

PL-ADH 93,8 76,3

LB-ADH 93,4 86,2

Drei der Enzyme zeigten nur geringe Aktivität beim Umsatz des Substrates, während die

übrigen neun das Potential aufzeigten, für die Zielreaktion geeignet sein zu können. Um eine

genauere Aussage treffen zu können, sollte im nächsten Schritt die Selektivität dieser Enzyme

bestimmt werden.

Ergebnisse

34

Tab. 8: Übersicht über die Aktivitäten der eingesetzten Enzympräparate. Die Aktivitäten beziehen sich

jeweils auf das enzymspezifische Standardsubstrat. Die Aktivitäten wurden unter Zuhilfenahme des

Standardsubstrat wie unter 2.3.1 beschrieben photometrisch bestimmt. Die „Proteinaktivität“ bezieht sich auf die

Gesamtproteinmenge im Zelllyophilisat.

Enzym Standardsubstrat Aktivität

(U/mg Lyophilisat)

Proteingehalt

(mg/mg Lyophilisat)

„Proteinaktivität“

(U/mg Protein)

PL-ADH Ethylacetoacetat 2,52 0,38 6,63

LB-ADH Acetophenon 42,3 0,76 55,7

evo-010 3-Nonanon 23,6 0,38 62,1

evo-020 Ethylpyruvat 5,0 0,36 13,9

evo-030 Ethylacetoacetat 4,5 0,39 11,5

evo-040 trans-2-Hexenal 6,83 0,32 21,3

evo-050 trans-2-Hexenal 5,3 0,23 23,2

evo-250 2,5-Hexandion 5,2 0,55 9,5

evo-260 2-Propanol 7,6 0,46 16,5

evo-270 Acetophenon 38,0 0,5 76,0

evo-330 D-Glukose 26,1 0,44 59,1

evo-380 Diacetyl 58,1 0,32 181,5

3.1.3 Ermittlung der Enantioselektivitäten der aktiven Alkoholdehydrogenasen

Nach diesen vielversprechenden Ergebnissen war der nächste Schritt, die Selektivitäten der

zwölf aktiven Enzyme (3.1.2) zu bestimmen.

Dass Alkoholdehydrogenasen eine sehr hohe Selektivität aufweisen können, wurde in der

Vergangenheit bereits vielfach beschrieben10,155–157. Die besondere Herausforderung im Falle

von 2-Butanon lag darin, dass es sich bei diesem Molekül um das kleinste prochirale

Kohlenwasserstoffketon (ohne zusätzliches Heteroatom) handelt, das in der Natur vorkommt.

Diese Tatsache könnte den selektiven Umsatz erschweren, da die Substratgröße

und -topologie einen entscheidenden Einfluss auf die Selektivität einer Biokatalyse

nimmt14,158. Somit wurde vermutet, dass 2-Butanon mit nur geringer Enantioselektivität

reduziert werden würde.

Die Bioreaktionen wurden mit den zwölf aktiven ADHs aus 3.1.2 durchgeführt und die

Verhältnisse der Enantiomere ((S)-2-Butanol und (R)-2-Butanol) nach Reaktionsende

gaschromatographisch bestimmt (Tab. 9). In diesem Screening konnten drei Enzyme

identifiziert werden (evo-040/ 050 & 320), die eine gute bis hervorragende Stereoselektivität

in der Reduktion von 2-Butanol vorwiesen. Das selektivste Enzym evo-040 lieferte einen

Enantiomerenüberschuss von 99,9 % für das gewünschte (S)-2-Butanol. Auffällig war, dass,

Ergebnisse

35

abhängig von den Cofaktor-Regenerationssystemen, teils starke Schwankungen der

Selektivitäten der Enzyme auftraten.

Tab. 9: Übersicht über die Enantiomerenreinheiten der ADH-Reaktionen nach 24 Stunden. Die höchsten

Enantiomerenüberschüsse sind grau unterlegt.

Alkoholdehydrogenase GDH-Regenerationssystem

ee (S)-2-Butanol (% rel.)

iPrOH-Regenerationssystem

ee (S)-2-Butanol (% rel.)

evo-010 44,1 20,5

evo-020 26,8 42

evo-030 -0,3 -0,6

evo-040 99,8 99,9

evo-050 92,1 99,8

evo-250 67 81,4

evo-260 1,6 0,1

evo-270 2,1 -0,4

evo-320 82,4 98,6

evo-330 32,2 29,3

PL-ADH 1,9 0

LB-ADH 1,2 -0,4

3.1.4 Screening nach lösemittelstabilen Alkoholdehydrogenasen

Die unter 3.1.2 identifizierten Enzyme wurden weiterhin auf ihre Stabilität gegenüber

2-Propanol untersucht. Angestrebt wurde ein sehr hoher Volumenanteil an organischer Phase,

um bestehende Probleme in der Meerwein-Ponndorf-Verley (MPV) Reduktion zu überwinden

und gleichzeitig die Produktaufreinigung zu erleichtern (siehe 4.1). Alle Reaktionen wurden

mit einer Enzymbeladung von 10 mg/ml Lyophilisat und 100 mM 2-Butanon in 50 mM

KPi-Puffer pH 7,5 durchgeführt (0,1 mM NAD+ bzw. 0,4 mM NADP+) (Tab. 8 gibt einen

Überblick über die Enzymaktivität der Lyophilisate).

Der Volumenanteil des Cosubstrats (iPrOH) im Reaktionsansatz wurde schrittweise erhöht.

Es wurden nach 24 Stunden Proben entnommen und sowohl Umsatz als auch

Enantiomerenreinheit bestimmt. Sechs Enzyme zeigten auch bei einem hohen organischen

Volumenanteil von 80 % noch Aktivität (Tab. 10). Daraufhin wurden diese ADHs in

Reaktionsmedien aus rein organischer Phase eingesetzt. Dadurch wurden allerdings alle

Enzyme nahezu komplett inaktiviert. Lediglich die PL-ADH generierte nach einer

verlängerten Reaktionsdauer (90 Stunden) noch relevante Produktmengen. Zur Steigerung des

Umsatzes wurde daraufhin versucht, die Enzyme zu stabilisieren. Dazu wurde

Ergebnisse

36

Enzymlyophilisat in 2 %iger Sorbitol-Lösung resuspendiert und anschließend erneut

lyophilisiert. Die so gewonnenen Sorbitol-Lyophilisate wurden mittels Pyridin gewaschen,

um überschüssiges Sorbitol zu entfernen. Diese Präparate wurden erneut in einem

Reaktionsansatz aus 100 % organischer Phase eingesetzt. Eines der Enzyme erzielte nach der

Sorbitolbehandlung einen achtfach höheren Umsatz, während die übrigen Enzyme keinen

Effekt aufzeigten. Tab. 10 gibt eine Übersicht über die Ergebnisse.

Tab. 10: Bewertung der Lösemitteltoleranz der ausgewählten ADHs. Sechs Enzyme zeigten selbst bei

φ(iPrOH) = 80 % noch Umsatz (24 h Proben). (A) In rein organischem Reaktionsmilieu zeigten nur zwei

Enzyme nach 96 h leichten Umsatz. (B) Die Sorbitolstabilisierung führte zu einem ~ 8-fach höheren Umsatz der

PL-ADH.

φ(iPrOH) = 80 % φ(iPrOH) = 100 % (A) φ(iPrOH) = 100 % (B)

Umsatz (%) ee-(S) (%) Umsatz (%) ee-(S) (%) Umsatz (%) ee-(S) (%)

evo-030 98,9 83,6 0 - 0 -

evo-040 71,4 99 0 - 0 -

PL-ADH 99 -5 10,3 -44,3 85,6 -43

evo-260 92,4 0,1 0 - 0 -

evo-270 7,5 -53,7 0 - 0 -

LB-ADH 97 -5,5 3,8 -54 0 -

Zusammenfassend ließ sich feststellen, dass sechs Enzyme eine ungewöhnlich hohe Toleranz

gegenüber organischem Lösemittel aufweisen. Sie waren selbst bei einem angestrebten

Volumenanteil von 80 % 2-Propanol noch signifikant aktiv. Die PL-ADH zeigte sogar in rein

organischer Phase noch Aktivität.

Interessanterweise wichen die Enantiomerenüberschüsse teils stark von den Ergebnissen aus

3.1.3 ab. Es kam die Vermutung auf, dass der Grund für die unterschiedlichen Ergebnisse eine

Produktracemisierung im Laufe der Reaktion sein könnte.

Ergebnisse

37

3.2 Produktracemisierung

3.2.1 Untersuchung der Produktstabilität

Um zu überprüfen, ob es im Laufe der Umsetzung von 2-Butanon zu einer Racemisierung des

Produktes kommt, wurde die Änderung der Produktreinheit in Abhängigkeit von der

Reaktionsdauer untersucht. Drei Alkoholdehydrogenasen wurden ausgewählt (evo-030,

evo-260 und evo-270), die sehr unterschiedliche Selektivitäten zu besitzen schienen. Die

Reaktionen fanden in 50 mM KPi-Puffer, pH 7,5 mit einer Substratbeladung von 100 mM

2-Butanon statt (1,3 M iPrOH; 0,1 mM NAD+ bzw. 0,4 mM NADP+; 0,5 mg/ml

Enzymlyophilisat (vgl. Tab. 8)).

In allen Reaktionen ließ sich eine moderate bis starke Racemisierung des Produktes

beobachten (Abb. 13). Der Effekt schien am ausgeprägtesten bei der ADH evo-260 zum

Tragen zu kommen. Dieses Enzym besaß interessanterweise auch die höchste Aktivität und

setzte somit das Substrat am schnellsten um (nicht dargestellt). Diese Ergebnisse allein ließen

daher keinen Rückschluss zu, ob die Racemisierung rein zeitlich bedingt auftritt oder ob

weitere Faktoren den Effekt beeinflussen.

Abb. 13: Analyse der

Produktstabilität. Das

Verhältnis der

2-Butanol-Enantiomere

wurde in Abhängigkeit

der Reaktionsdauer

untersucht. Bei allen

ADHs kam es zu einer

Relativierung des ee im

Laufe der Reaktion.

3.2.2 Einfluss der Reaktionstemperatur auf die Produktracemisierung

Die Versuche zur Untersuchung des Einflusses der Reaktionstemperatur auf die

Produktracemisierung wurden mit der ADH evo-270 durchgeführt. Dieses Enzym setzte das

Substrat zwar (R)-selektiv um, wies jedoch neben einer langsamen Racemisierung auch eine

gute Aktivität auf. Es wurde vermutet, dass sich der Effekt daher an diesem Enzym besonders

gut untersuchen ließe.

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150

Ena

ntio

mer

enüb

ersc

huss

(%

(S

)-B

utan

ol)

Reaktionsdauer (h)

evo-030

evo-260

evo-270

Ergebnisse

38

Es wurden vier identische Reaktionen durchgeführt, die sich lediglich in ihrer Temperatur

unterschieden. Die 20 ml Reaktionen bestanden zu 20 % aus wässrigem Anteil (50 mM

Kpi-Puffer; pH 7,5), 50 % iPrOH und 30 % 2-Butanon. Eingesetzt wurden je 40 mg evo-270

Lyophilisat aus Zellrohextrakt (vgl. Tab. 8). Da die Umsatzgeschwindigkeiten von der

Temperatur beeinflusst werden, wurden regelmäßig Proben genommen und die

Enantiomerenreinheit bei Erreichen des thermodynamischen Gleichgewichts miteinander

verglichen (Tab. 11).

Tab. 11: Enantiomerenreinheit am thermodynamischen Gleichgewicht bei unterschiedlichen

Reaktionstemperaturen. Beim -10 °C Ansatz wurde das Gleichgewicht nicht erreicht.

Temperatur ( °C) Umsatz (%) Reaktionsdauer (h) ee (R)-2-Butanol (%)

50 58 5 76

25 57 21 84

10 57 36 86

- 10 25 120 94

Erwartungsgemäß wurde das thermodynamische Gleichgewicht bei 50 °C am schnellsten

erreicht. In diesem Ansatz war der Enantiomerenüberschuss am Reaktionsgleichgewicht

jedoch auch am schlechtesten. Die Umsätze bei 25 °C und 10 °C wiesen am

Gleichgewichtspunkt sehr ähnliche ee-Werte auf und waren signifikant höher als in der 50 °C

Reaktion. Die Reaktion bei -10 °C erreichte den Gleichgewichtspunkt auch nach 120 Stunden

nicht, hatte zu diesem Zeitpunkt aber immer noch den mit Abstand höchsten Reinheitsgrad.

Zusammenfassend ließ sich eine Temperaturabhängigkeit der Racemisierung, zumindest im

Bereich hoher Temperaturen, feststellen. Inwiefern sich Temperaturen < 10 °C positiv auf die

Produktreinheit auswirken, konnte nicht abschließend geklärt werden.

3.2.3 Einfluss des pH-Wertes auf die Produktracemisierung

Um die pH-Abhängigkeit der Produktracemisierung zu untersuchen, wurden identische

Reaktionen mit der ADH evo-270 analysiert, die sich nur im pH-Wert des Mediums

unterschieden. Die 5 ml Reaktionen bestanden zu 20 % aus wässrigem Anteil (Kpi-Puffer), zu

50 % aus iPrOH und zu 30 % aus 2-Butanon. Eingesetzt wurden 10 mg evo-270 Lyophilisat

aus Zellrohextrakt. Nach 20 Stunden Reaktionsdauer wurden Proben entnommen und die

Enantiomerenüberschüsse verglichen (Tab. 12).

Es zeigte sich, dass der pH-Wert nur einen geringen Einfluss auf die Selektivität des Enzyms

zu nehmen scheint. Die Unterschiede in den ee-Werten waren gering. Die größte Differenz

Ergebnisse

39

zwischen pH 5 und dem Optimum bei pH 8 betrug 3 %. Interessant war jedoch, dass die

höchste Stereoselektivität bei dem pH-Wert erreicht wurde, unter dem das Enzym auch am

stabilsten ist (intern, unveröffentlicht), und dass evo-270 eine erstaunliche pH-Toleranz

aufweist.

Tab. 12: Enantiomerenreinheit in Abhängigkeit vom pH-Wert der Reaktionslösung. Nach 20 Stunden

wurden Proben entnommen und die Enantiomerenüberschüsse verglichen.

pH-Wert Umsatz (%) ee (R)-2-Butanol (%)

5 55 87

5,5 54 87

6 54 89

6,5 54 89

7 53 88

7,5 54 90

8 55 89

8,5 54 89

3.2.4 Führt eine Schädigung der Strukturintegrität des Enzyms zur Erniedrigung der

Selektivität?

In 3.2.3 konnte gezeigt werden, dass eine Abweichung vom optimalen pH-Wert zu leichter

Veränderung der Produktreinheit führen kann. Es kam die Vermutung auf, dass ein nicht

optimales Medium die Enzymstruktur negativ beeinflussen könnte und dadurch die

Selektivität des Katalysators verändert.

Um dies zu überprüfen, wurde das Enzym evo-270 (Endkonzentration 2 mg/ml, vgl. Tab. 8)

zwei Tage in einem harschen Reaktionsmilieu inkubiert, bevor die katalytische Reaktion

durch Zugabe des Cofaktors (0,4 mM NADP+) initiiert wurde. Die Reaktionslösung bestand

aus 80 % organischer Phase (φ(iPrOH) = 50 %, φ(2-Butanon) = 30 %), welche die Struktur

des Enzyms stark beanspruchen sollte159,160. Als Vergleich dazu wurde eine Parallelreaktion

durchgeführt, in welcher das Enzym nicht vorinkubiert wurde. Der Umsatz sowie der

Enantiomerenüberschuss wurden nach 24 Stunden Reaktionsdauer analysiert (Tab. 13).

Tab. 13: Einfluss einer strukturschädigenden Vorinkubation auf die Selektivität der ADH evo-270. Nach

24 Stunden wurden Umsatz und Enantiomerenüberschuss bestimmt.

Präparation Umsatz (%) ee (R)-2-Butanol (%)

Vorinkubierte Reaktion 51 93

Vergleichsreaktion 68 80,5

Ergebnisse

40

Wie zu erwarten war, fiel der Umsatz der nach Enzyminkubation gestarteten Reaktion

niedriger aus als in der Vergleichsreaktion. Allerdings zeigten die Ergebnisse auch, dass keine

starke Beeinträchtigung der Selektivität stattgefunden hatte. Die Produktreinheit beim Einsatz

des vorinkubierten Enzyms erreichte 93 % (ee) bei einem Umsatz von 51 %. Damit lag sie im

Rahmen dessen, was nach den Vorversuchen zu erwarten war (3.2.1).

3.2.5 Einfluss des Cosubstrates auf die Produktracemisierung

Es wurde vermutet, dass die Menge an eingesetztem Cosubstrat ebenfalls die

Geschwindigkeit der Racemisierung beeinflussen könnte:

Die Reduktion des Butanons wird thermodynamisch kontrolliert durch das Gleichgewicht

zwischen Substrat/ Produkt (2-Butanon/ 2-Butanol) und Cosubstrat/ Coprodukt (2-Propanol/

Aceton). Durch eine Erhöhung der Cosubstratkonzentration wird die Reaktion in Richtung

Coprodukt verschoben und damit einhergehend auch die Reaktion von Substrat zu Produkt.

Daher ist zu erwarten, dass durch die Erhöhung der Cosubstratkonzentration die Rückreaktion

von Produkt zu Substrat unterbunden wird. Sollte diese Annahme zutreffen, müsste dadurch

die Racemisierung des 2-Butanols verlangsamt oder sogar gestoppt werden können.

Zur Überprüfung dieser Theorie wurde die Umsetzung des 2-Butanons durch evo-270 bei

unterschiedlichen Molenbrüchen (2-Propanol/ 2-Butanon) durchgeführt. Um ein breites

Spektrum abzudecken, kamen Molenbrüche (MB) vom Faktor 1 bis 50 zum Einsatz. Die

Reaktionen wurden bei Raumtemperatur und mit einer Eduktbeladung von 100 mM in

wässriger KPi-Phase (50 mM; pH 7,4) durchgeführt.

Die Ergebnisse bestätigten die Annahme, dass unter Anwendung hoher Molenbrüche die

Racemisierung verlangsamt abläuft (Abb. 14).

Abb. 14: Einfluss

der Cosubstrat-

konzentration auf

die Produkt-

racemisierung. Es

konnte gezeigt

werden, dass die

Racemisierung durch

den Einsatz hoher

Molenbrüche

verlangsamt wird.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100

Ena

ntio

mer

enüb

ersc

huss

(%

(S

)-B

utan

ol)

Umsatz (%)

MB 1

MB 10

MB 50

Ergebnisse

41

Bei einem Molenbruch (MB) von 50 blieb bis zu einer Produktausbeute von ca. 80 % die

Enantiomerenreinheit über 99 %. Es ist jedoch zu beachten, dass solch hohe Molenbrüche nur

zu erreichen sind, wenn die Substratbeladung sehr niedrig gewählt wird. In industriell

interessanten Prozessen, die den Einsatz hoher Eduktmengen erfordern, können solch hohe

Molenbrüche nicht realisiert werden.

3.2.6 Läuft die Rückoxidation des 2-Butanols enantioselektiv ab?

Es ist zu vermuten, dass der Racemisierung eine Art „Ping-Pong“-Effekt zu Grunde liegt, bei

der repetitiv die Umsetzungen 1) Butanon ↔ Butanol und 2) 2-Propanol ↔ Aceton

ablaufen161. Es stand zur Diskussion, ob die Stereokonfiguration des Butanols Einfluss auf die

Geschwindigkeit der Rückoxidation des Produktes nimmt. Das würde bedeuten, dass eines

der Enantiomere schneller rückoxidiert werden könnte.

Um dies zu überprüfen, wurde ein Versuchsaufbau gewählt, der als organische Phasen

2-Butanol und Aceton (anstatt Butanon und iPrOH) enthielt. Somit wurde das 2-Butanol in

diesem Versuch zum Substrat (φ = 30 %), das aus thermodynamischen Gründen oxidiert wird.

Die Besonderheit bestand darin, dass zwei identische Versuche durchgeführt wurden, die

jeweils ein Enantiomer des 2-Butanols in angereicherter Form enthielten (je ~ 90 % ee). Sollte

das Butanol in einem der Fälle schneller umgesetzt werden, wäre dies ein Indiz dafür, dass die

Oxidation des 2-Butanols ebenfalls enantioselektiv stattfindet.

Weiterhin bestand der Versuchsaufbau aus 25 % Aceton, 50 mM Kpi-Puffer (pH 7,5) sowie

0,4 mM NADP+ und 2 mg/ml Enzymlyophilisat aus Zellrohextrakt.

Die Ergebnisse zeigten sehr deutlich, dass die Oxidation des (R)-Enantiomers schneller

abläuft als die seines Stereoanalogons (Abb. 15). Bereits bei der Entnahme der 16 Stunden

Probe wurde in diesem Fall das thermodynamische Gleichgewicht erreicht, während dies im

Falle des (S)-Enantiomers auch nach 170 Stunden noch nicht der Fall war. Es ist somit davon

auszugehen, dass die Oxidation von 2-Butanol enantiomerenselektiv abläuft.

Ergebnisse

42

Abb. 15: Selektive

Umsetzung von

2-Butanol in

Abhängigkeit von

seiner Stereo-

konfiguration. Das

(R)-Enantiomer wurde

von der ADH evo-270

deutlich schneller

umgesetzt als das

(S)-2-Butanol.

3.3 Festlegung eines geeigneten Ausgangsenzyms für die Prozessentwicklung

Nach dem Screening der Enzympalette erwiesen sich zwei Alkoholdehydrogenasen als

besonders geeignet für die Synthese von (S)-2-Butanol. Dabei handelte es sich zum einen um

die PL-ADH, zum anderen um evo-040.

Nach Abwägung der Argumente fiel die Entscheidung auf den Einsatz der evo-040

(siehe 4.1). Daher sollte dieses Enzym genauer charakterisiert werden.

3.4 Nähere Untersuchung der Lösemittelstabilität der ADH evo-040

Wie bereits beschrieben, stellt die Produktaufreinigung ein Hauptproblem bei der Gewinnung

von 2-Butanolen dar. Durch die Azeotropenbildung von 2-Butanol mit Wasser sowie von

Isopropanol mit Wasser wird eine destillative Aufreinigung wesentlich erschwert, da die

Reaktionskomponenten nur noch mit großem Aufwand voneinander getrennt werden können.

Ein Ziel des Projektes war es daher, den Wassergehalt im Reaktionsmedium zu minimieren.

Diesbezüglich wurde die Lösemittelstabilität von evo-040 genauer untersucht. Dazu wurde

schrittweise der Anteil der organischen Phase im Reaktionsmedium angehoben. Das

Verhältnis zwischen Cosubstrat und Substrat musste konstant gehalten werden, um die

Ergebnisse vergleichen zu können (Molenbruch = 6).

Durch die Experimente wurde ein ungewöhnliches Verhalten des Enzyms offensichtlich: Der

Umsatz der ADH war unter den getesteten Bedingungen bei φ = 10 % am höchsten (Abb. 16).

Mit steigendem Lösemittelanteil fiel der Umsatz stark ab, stieg jedoch ab φ = 70 % wieder an

und erreichte einen lokalen Umsatzpeak bei einem Volumenanteil von 90 % (Isopropanol +

Butanon).

0

25

50

75

100

0 50 100 150 200

Sub

stra

t (%

)

Dauer (h)

(S)-Enantiomer

(R)-Enantiomer

Ergebnisse

43

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

Um

satz

(%

)

φ(organische Phase) (%)

Abb. 16: Verhalten des Enzyms

evo-040 bei unterschiedlichen

Lösemittelbeladungen. Der Bereich

zwischen 20 % und 60 % wurde nicht

genauer untersucht und interpoliert.

Die Umsätze wurden nach einer

Reaktionsdauer von 20 Stunden

bestimmt.

3.5 Enzymstabilisierung in organischem Lösemittel mit Hilfe von Additiven

Die Versuche unter 3.4 zeigten, dass die ADH evo-040 bei einem Lösemittel-Volumenanteil

von etwa 90 % ein lokales Aktivitätsmaximum erreicht. Dennoch lag der Umsatz nur bei etwa

50 % im Vergleich zu der Produktausbeute, die bei φ = 10 % erzielt wurde. Es ist davon

auszugehen, dass das Enzym unter diesen harschen Bedingungen inaktiviert oder denaturiert

wird162. In der Vergangenheit wurden verschiedene Vorgehensweisen entwickelt, um Enzyme

in organischem Umfeld zu aktivieren oder stabilisieren. Dazu gehören unter anderen die

Immobilisierung des Biokatalysators163–165, dessen Einschluss in Hydrogele oder

Nanofasern166, die Proteinevolvierung167, die Anwendung von stabilisierenden

Additiven168,169 oder die chemische Modifizierung des Enzyms170.

In dieser Arbeit wurde die Stabilisierung von fünf verschiedenen Alkoholdehydrogenasen

gegen sehr hohe Lösemittelkonzentrationen durch den Einsatz von Additiven untersucht (Tab.

14). Das Enzymportfolio bestand aus der LB-ADH, evo-030, evo-040, evo-270 und evo-380.

Die Besonderheit lag darin, dass die Additive (entgegen früheren Studien) direkt der Reaktion

zugegeben werden sollten (ohne vorherige Polymerisierung oder Immobilisierung des

Katalysators). Außerdem sollten Volumenanteile der organischen Phase bis zu 90 %

eingesetzt werden. Damit würde die Anwendung für industrielle Prozesse noch interessanter

werden.

Ergebnisse

44

Tab. 14: Additive, die auf ihren stabilisierenden Effekt auf ADHs untersucht wurden

Polyol 1 Polyol 2 Salz PEG zusätzliche

Sukrose Mannitol KCl 400 Lysin

Erythritol Glycerol (NH4)2SO4 4000 Glycin

Fruktose Sorbitol NH4Cl 6000 PEI

Maltose Glukose

Insgesamt wurden 17 Substanzen auf ihr Potential hin untersucht, ADHs in Gegenwart von

organischen Lösemitteln zu stabilisieren. Die Substanzen lassen sich in folgende Gruppen

unterteilen: Polyole, Salze und Polyethylenglykole (PEG). Zusätzlich kamen auch Stoffe zum

Einsatz, die bereits für ihre stabilisierende Wirkung unter ähnlichen Bedingungen bekannt

waren. Da die getesteten Enzyme abweichende Eigenschaften, wie pH-Optimum,

Substratspektrum und bevorzugte Puffersysteme aufweisen, unterschieden sich die

angewandten Reaktionsbedingungen:

evo-030, evo-270 und LB-ADH (ADH aus Lactobacillus brevis):

Die eingesetzte Menge des organischen Lösemittels betrug 90 % des Gesamtvolumens und

bestand aus 3975 µl 2-Propanol sowie 525 µl des Substrats Acetophenon (Endkonzentration:

900 mM). Die Enzymbeladung lag bei 0,5 mg/ml, die Konzentration des Cofaktors NAD+ war

0,15 mM (evo-030) sowie 0,5 mM NADP+ (evo-270 und LB-ADH). Kaliumphosphat wurde

als Puffersystem genutzt (100 mM, pH 7,5) und beinhaltete 0,1 mM ZnCl2 im Falle der evo-

030 oder 0,1 mM MgCl2 im Falle von evo-270 und der LB-ADH (Tab. 8 gibt einen Überblick

über die Enzymaktivität der Lyophilisate).

ADH040 und ADH380

Die eingesetzte Menge des organischen Lösemittels betrug 90 % des Gesamtvolumens (5 ml)

für die evo-040 beziehungsweise 50 % für evo-380 mit einem Anteil von 100 µl 2-Butanon

(Endkonzentration: 200 mM). Die Enzymbeladung lag bei 5 mg/ml, die Konzentration des

Cofaktors NAD+ war 0,15 mM in 50 mM TEA-Puffer (pH 7) (siehe auch Tab. 8).

Stabilisierungsprotokoll

Das Lyophilisat wurde eingewogen und für 15 Minuten in 125 µl einer Cofaktorlösung

resuspendiert (100 rpm). 375 µl (2375 µl im Falle der evo-380) einer Lösung aus einem

Additiv (Tab. 15) in dem entsprechenden Puffersystem wurden zugegeben und die Mischung

für 60 Minuten bei 300 rpm inkubiert.

Ergebnisse

45

Um anschließend die Reaktion zu starten, mussten Substrat und Cosubstrat unter Rühren

zügig zugegeben werden. Umsatz und Enantiomerenüberschuss wurden

gaschromatographisch analysiert.

Frühere Publikationen legten offen, dass die Konzentration eines Additivs ausschlaggebend

auf dessen stabilisierenden Effekt wirkt171,172. Daher wurden in einem ersten, groben

Screening die Additive in zwei Konzentrationen eingesetzt. Substanzen, die unter diesen

Bedingungen einen positiven Einfluss auf den Substratumsatz zeigten, wurden anschließend

kleinmaschiger auf ein Konzentrationsoptimum hin untersucht. Durch die Anwendung dieses

Verfahrens konnte eine Erhöhung des Umsatzes aller fünf Enzyme durch die Additive erzielt

werden (Tab. 16).

Tab. 15: Konzentrationen, in denen die Additive im ersten Screening-Ansatz eingesetzt wurden. Die

Substanzen wurden in zwei unterschiedlichen Mengen eingesetzt, um konzentrationsabhängige Effekte

aufdecken zu können.

Additiv Konzentration (mol/l) Additiv Konzentration (mol/l)

A B A B

Sukrose 0.1 1 (NH4)2SO4 0.1 1

Erythritol 0.1 1 NH4Cl 0.1 1

Fruktose 0.1 1 PEG400 0.1 1

Glukose 0.1 1 PEG4000 0.05 0.1

Maltose 0.1 0.5 PEG6000 0.025 0.05

Mannitol 0.05 0.1 Lysine 0.1 1

Glycerol 0.1 1 Glycine 0.1 1

Sorbitol 0.1 1

KCl 1 3 PEI 1 % 10 %

3.5.1 Stabilisierung der ADH evo-030

Die Stabilisierung der ADH evo-030 wurde durch Sukrose, Sorbitol sowie Ammoniumsulfat

erreicht. Dabei konnte der stärkste Effekt beim Einsatz von 0,5 M Sukrose beobachtet werden

(Tab. 16). Der Umsatz wurde auf 362 % im Vergleich zum ungeschützten Enzym erhöht. Im

Vergleich zum Disaccharid Sukrose musste das Monosaccharid Sorbitol in dreimal höherer

Menge eingesetzt werden, um einen maximalen Effekt zu erzielen.

Ergebnisse

46


Da die Umsatzrate der ADH evo-040 sehr niedrig war, wurde die Reaktionszeit auf

140 Stunden erhöht. Eine Sorbitolzugabe (1 M) erhöhte den Umsatz auf 157 % im Vergleich

zum ungeschützten Enzym (Tab. 16). Der Enantiomerenüberschuss blieb bei allen Ansätzen

hervorragend und belief sich auf über 99,9 % für das (S)-2-Butanol.

3.5.3 Stabilisierung der LB-ADH

Der stabilisierende Effekt der Additive auf die LB-ADH war signifikant, jedoch der niedrigste

im Vergleich zu den anderen Enzymen. Der Umsatz in Gegenwart von Ammoniumsulfat

belief sich im Maximum auf 152 % (Tab. 16) und war somit 52 % höher als im ungeschützten

Zustand.


Die ADH evo-270 konnte durch fünf verschiedene Additive erfolgreich stabilisiert werden:

Ammoniumsulfat, PEG4000, PEG6000, PEI und Glycin (Tab. 16). Der stärkste Effekt konnte

mit PEG6000 bei einer Konzentration von 0,01 M erreicht werden (159 %).


Im Falle der ADH evo-380 konnte der signifikanteste Effekt erzielt werden. In Gegenwart

von 0,1 M PEG4000 wurde eine fast siebenfache Steigerung des Umsatzes erzielt (690 %,

Tab. 16). Das kurzkettigere PEG400 musste im Vergleich dazu in vielfach höherer Menge

eingesetzt werden, um einen maximalen Einfluss zu nehmen (2,5 M).

Ergebnisse

47

Tab. 16: Einfluss der effektivsten Additive auf den relativen Substratumsatz der ADHs. Die

Produktausbeute ist relativ zum Umsatz des ungeschützten Enzyms angegeben. Die Zeitpunkte der Probenahme

sind jeweils aufgelistet.

evo-030 Rel. Umsatz

nach 70 h (%) evo-270

Rel. Umsatz

nach 70 h (%)

0.1 M Sukrose 135 0.01 M (NH4)2SO4 139

0.5 M Sukrose 362 0.1 M (NH4)2SO4 146

1 M Sukrose 143 0.25 M (NH4)2SO4 139

1 M Sorbitol 146 0.025 M PEG4000 124

1.5 M Sorbitol 195 0.05 M PEG4000 136

2 M Sorbitol 169 0.1 M PEG4000 132

0.05 M (NH4)2SO4 171 0.001 M PEG6000 122

0.1 M (NH4)2SO4 221 0.01 M PEG6000 159

0.25 M (NH4)2SO4 140 0.025 M PEG6000 146

evo-040 Rel. Umsatz

nach 140 h (%)

0.1 M Glycine 130

1 % PEI 134

evo-380 Rel. Umsatz

nach 70 h (%) 0.5 M Sorbitol 120

1 M Sorbitol 157

1.5 M Sorbitol 113 2.0 M PEG400 650

0.1 M Sukrose 100 2.5 M PEG400 676

0.5 M Sukrose 120 2.8 M (pure) PEG400 649

1 M Sukrose 75 0.05 M PEG4000 470

LB-ADH Rel. Umsatz

nach 140 h (%)

0.1 M PEG4000 690

0.2 M PEG4000 680

0.1 M (NH4)2SO4 136

0.25 M (NH4)2SO4 152

0.5 M (NH4)2SO4 114

0.001 M PEG6000 97

0.01 M PEG6000 150

0.025 M PEG6000 147

1 % PEI 139

3.5.6 Up-scaling und Validierung der Ergebnisse

Der nächste Schritt bestand darin, die Ergebnisse auf ihre industrielle Anwendbarkeit hin zu

überprüfen. Dazu wurde die ADH evo-040 ausgewählt, da sie im 2-Butanol Prozess

eingesetzt werden sollte. Die Reaktion wurde entsprechend der 5 ml Versuche durchgeführt

Ergebnisse

48

und enthielt 1 M Sorbitol als Stabilisator. Das Volumen des Prozesses wurde jedoch auf 50 ml

erhöht. Somit enthielt der Ansatz 44 ml 2-Propanol und 1 ml 2-Butanon, was einer

Substratbeladung von 220 mM entspricht. Die Enzymbeladung blieb konstant bei 5 mg/ml.

Abb. 17 verdeutlicht die Ergebnisse der Reaktion. Es konnte bestätigt werden, dass der

Einsatz von Sorbitol den Substratumsatz positiv beeinflusst. Dabei konnte ein Umsatz von

67 % erzielt werden, was einem relativen Umsatz von 167 % im Vergleich zum

ungeschützten Enzym entsprach. Dies war in etwa mit den Ergebnissen im Kleinmaßstab

identisch (Tab. 16). Leichte Abweichungen waren wahrscheinlich durch eine leicht kürzere

Reaktionszeit und Messungenauigkeiten bedingt. Gaschromatographisch konnte ein

unveränderter Enantiomerenüberschuss von ≥ 99,9 % des (S)-2-Butanols nachgewiesen

werden.

Abb. 17: Umsatz von

2-Butanon im 50 ml

Up-scaling Ansatz, erzielt

durch die Sorbitol-stabilisierte

evo-040 und das unstabilisierte

Enzym (Referenz)

3.6 Bestimmung der optimalen Substratbeladung (2-Butanon) für die ADH evo-040

Die Ergebnisse der Enzymstabilisierung stellten eine erfolgreiche Entwicklung eines

wasserarmen Bioprozesses in Aussicht. Daher wurde mit der Identifizierung der optimalen

Prozessparameter fortgefahren. Grundlegend war dabei die Bestimmung der optimalen

Substratbeladung, unter welcher die höchste (absolute) Produktausbeute erzielt werden kann.

Es wurde eine Versuchsreihe durchgeführt, in der schrittweise die Konzentration des

Substrates 2-Butanon erhöht wurde. Dabei blieb der Gesamtvolumenanteil der organischen

Phase konstant (90 %), was dazu führte, dass sich die Molenbrüche (2-Propanol/ 2-Butanon)

innerhalb der Versuchsreihe veränderten. Es ist somit zwischen dem Substratumsatz (Abb.

18–A) und der absoluten Produktausbeute (Abb. 18–B) zu unterscheiden.

Sorbitol Stabilisierung

Referenz

0

20

40

60

80

100

Um

satz

nac

h 88

Stu

nden

(%

)

Ergebnisse

49

Die Enzymbeladung lag bei 5 mg/ml (vgl. Tab. 8), die Konzentration des Cofaktors NAD+

betrug 0,15 mM in 50 mM KPi-Puffer (pH 7) inklusive 1 M Sorbitol.

Abb. 18: Bestimmung der

optimalen Substrat-

beladung (2-Butanon) für

die ADH evo-040. A) Der

Umsatz von 2-Butanon

wurde in Abhängigkeit von

der Substratbeladung

bestimmt.

Erwartungsgemäß schritt die

Substratumwandlung bei

niedrigen Konzentrationen

am schnellsten voran. B) Die

absolute Produktausbeute

(mmol 2-Butanol) wurde

nach einer Reaktionsdauer

von 70 Stunden berechnet.

Es zeigte sich, dass niedrige Substratbeladungen erwartungsgemäß zu einer schnellen

Umsetzung führten. Dies ist auf ein niedrigeres Substrat/ Katalysator-Verhältnis, aber auch

auf ein höheres Cosubstrat/ Substrat-Verhältnis zurückzuführen.

Die Berechnung der absoluten Produktausbeute offenbarte jedoch ein verändertes Bild. Die

Reaktionen, die das Substrat am schnellsten umsetzten, führten nicht zum effizientesten

Prozess. Die absolute Produktausbeute erreichte bei einer Substratbeladung von etwa

20 Prozent ihr Maximum. Nach 70 Stunden Reaktionsdauer wurden ungefähr 3,7 mmol

2-Butanol/ 5 ml Reaktionsansatz hergestellt. Höhere Substratbeladungen führten zu keinem

signifikanten Anstieg der absoluten Produktausbeute.

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Um

satz

(%

)

Dauer (h)

A5%

10%

15%

20%

25%

30%

0

0.4

0.8

1.2

1.6

2

2.4

2.8

3.2

3.6

4

0 5 10 15 20 25 30 35

Abs

olut

e P

rodu

ktau

sbeu

te

(mm

ol)

Substratbeladung (%)

B

Ergebnisse

50

3.7 Bestimmung des pH-Optimums für die ADH evo-040

Die Alkoholdehydrogenase evo-040 sollte auf ihr pH-Optimum bei RT hin untersucht

werden. Da bereits bekannt war, dass das Enzym bei einem pH von 7 hohen Umsatz zeigt,

beschränkte sich der zu untersuchende Bereich auf pH 6,0 bis 8,0. Um die Auswirkungen des

pH-Wertes zu erhöhen, wurden die Versuche mit einem neunzigprozentigen Anteil der

wässrigen Phase durchgeführt (dazu noch 0,22 M 2-Butanon und 1,04 M 2-Propanol). Die

KPi-Konzentration wurde auf 100 mM erhöht und der pH-Wert jeweils nach Zugabe von

2 mg/ml Enzymlyophilisat (vgl. Tab. 8) exakt eingestellt.

Abb. 19 fasst die Ergebnisse der Versuchsreihe zusammen. Das Enzym zeigte ein

Umsatzoptimum im Bereich pH 7,0 bis 7,5. Die Aktivität blieb dabei über den gesamten

Reaktionsverlauf erhalten. Hohe Aktivität konnte auch bei pH 6,5 und 8,0 beobachtet werden,

womit dem Enzym eine moderate pH-Akzeptanz zugeschrieben werden kann.

Abb. 19: Bestimmung

des pH-Optimums

für die ADH evo-040.

Es wurde der

Substratumsatz unter

dem Einfluss

verschiedener pH-

Milieus bestimmt.

Starker Umsatz-

einbruch wurde nur bei

pH 6,0 beobachtet.

3.8 Zugabereihenfolge der organischen Komponenten

In der Vergangenheit wurde beobachtet, dass die Zugabereihenfolge der

Reaktionskomponenten Auswirkung auf den Verlauf einer Biokonversion nehmen kann

(intern, unveröffentlicht). So wurde beispielweise beschrieben, dass die Zugabe des Cofaktors

vor den organischen Phasen stabilisierend auf das Enzym wirken kann173,174. Es konnte auch

beobachtet werden, dass Ketoverbindungen eine Biokonversion meist negativer beeinflussen

als deren korrespondierende Alkohole. Erklärungen wurden beispielsweise im höheren

log P-Wert gesucht, welcher zum Entzug von „Struktur-essentiellen Wassermolekülen“

führen könnte175,176.

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Um

satz

(%

)

Reaktionsdauer (h)

pH 6,0

pH 6,5

pH 7,0

pH 7,5

pH 8,0

Ergebnisse

51

Daher galt es zu untersuchen, ob eine Zugabevariation der organischen Komponenten

Einfluss auf die Effizienz des 2-Butanol Prozesses nimmt. Um den potentiellen Effekt besser

beobachten zu können, wurde die Konzentration des Enzymlyophilisats auf 2 mg/ml

erniedrigt (vgl. Tab. 8). Die Substratbeladung betrug 20 % des Gesamtvolumens, die des

Cosubstrates 70 % (wässrige Phase: 50 mM KPi; pH 7,0 inklusive 1 M Sorbitol; 0,15 mM

NAD+).

Nach der Durchführung des unter 3.5 beschriebenen Stabilisierungsprotokolls wurde die

Enzymlösung a) direkt mit der gesamten organischen Phase vereint, b) 2 Minuten mit der

2-Propanol Fraktion inkubiert, c) 5 Minuten mit der 2-Propanol Fraktion inkubiert,

d) 2 Minuten mit der 2-Butanon Fraktion inkubiert oder, e) 5 Minuten mit der 2-Butanon

Fraktion inkubiert, bevor die noch fehlende Komponente zugegeben wurde.

Die Ergebnisse sind in Abb. 20 dargestellt. Es zeigte sich, dass die separate Zugabe von

2-Propanol vor 2-Butanon Zugabe zu signifikant höherem Umsatz führte. Erstaunlicherweise

lag dieser sogar über dem der Inkubations-freien Reaktion. Die Inkubation mit 2-Butanon

dagegen schien den Prozess negativ zu beeinflussen. Der Effekt verstärkte sich bei

verlängerter Inkubation (5 Minuten). Dieses Verhalten zeigte Isopropanol dagegen nicht, es

spielte keine signifikante Rolle, ob das Enzym für kurze oder längere Zeit inkubiert wurde.

Weiterhin muss jedoch auch beachtet werden, dass während der unterschiedlichen

Inkubationsphasen (a - e) auch unterschiedliche Verhältnisse der wässrigen zur organischen

Phase herrschten, da (prozessbedingt) 2-Butanon und Isopropanol in unterschiedlichen

Volumina eingesetzt werden. Dies könnte ebenfalls Einfluss auf die Enzymintegrität

genommen haben.

Ergebnisse

52

Abb. 20: Auswirkung der Zugabereihenfolge der Reaktionskomponenten auf den Verlauf der

Biokonversion. Die separate Zugabe von 2-Propanol vor dem Substrat 2-Butanon führte zu deutlich höherem

Umsatz.

3.9 Einsatz von “smart cosubstrates” zur Erhöhung der Prozesseffizienz

Die Oxidoreduktase-katalysierte Reduktion eines Ketonsubstrats in dessen

korrespondierenden Alkohol kann als Form der Meerwein-Ponndorf-Reaktion angesehen

werden (siehe 3.1.4). Die Reaktion ist abhängig von der Bereitstellung reduzierender

Äquivalente (Cofaktoren), welche in diesem Fall durch NAD(P)H geliefert werden. Aus

ökonomischen Gründen wird der Cofaktor nur in katalytischen Mengen dem System

zugegeben und ist deshalb auf ein Regenerationssystem angewiesen151,156,177,178. Nach

umfangreichen Untersuchungen in der Vergangenheit wurde das Problem grundsätzlich

gelöst179. Der Einsatz von Cosubstraten, idealerweise im Ein-Enzym-Regenerationssystem, ist

das am weitesten verbreitete Verfahren149,155,180. Dabei wird das Cosubstrat (in dieser Arbeit

Isopropanol) durch dasselbe Enzym unter Regeneration des Cofaktors oxidiert, das auch für

die Darstellung des Produktes verwendet wird (evo-040). Nichtsdestotrotz leidet dieses

Verfahren, wie alle MPV-Reaktionen, unter ihrer Reversibilität und einer schwachen

thermodynamischen Triebkraft. Daher werden hohe molare Überschüsse des Cosubstrates

benötigt, um einen wirtschaftlichen Reaktionsumsatz zu erreichen. Dies ist aufgrund hoher

Kosten und dem Anfall großer Mengen an Abfallstoffen sowohl ökologisch als auch

ökonomisch nicht wünschenswert.

In Zusammenarbeit mit der Technischen Universität Delft, Holland (Dr. Selin Kara und Dr.

Frank Hollmann) wurde nach einem alternativen Regenerationssystem gesucht, um die oben

stehenden Nachteile zu umgehen. Die im Folgenden präsentierten Ergebnisse zum Einsatz der

sogenannten „smart cosubstrates“ sind in dieser Kooperation entstanden:

0

10

20

30

0 20 40 60 80 100 120 140

Um

satz

(%

)

Reaktionsdauer (h)

ohneInkubation

kurze iPrOHInkubation

lange iPrOHInkubation

kurze ButanonInkubation

lange ButanonInkubation

Ergebnisse

53

Inspiriert von der Arbeit von Lavandera et al.181 wurde vermutet, dass thermostabile

Coprodukte die Reversibilität der MPV-Reaktion unterbinden und damit die Triebkraft der

Reaktion erhöhen würden. Damit könnte möglicherweise auch der beschriebene

Racemisierungseffekt unterdrückt werden (3.2). Besonders vielversprechend erschienen

α,ω-Diole als Cosubstrate, da sie zum einen zwei zu oxidierende Reaktionsäquivalente pro

Molekül repräsentieren (2 OH-Gruppen) und zum anderen das entstehende Lacton

thermodynamisch stabil und kinetisch inert ist. Abb. 21 verdeutlicht die Enstehung des

Lactonproduktes und die dadurch verdoppelte Ausbeute an regeneriertem Cofaktor je

Cosubstratmolekül.

Abb. 21: Prognostizierter Oxidationsmechanismus vom α,ω-Diol zum entsprechenden Lactonprodukt

Zur Evaluierung dieses neuen Systems wurde eine Reihe von ADHs auf ihre Aktivität zur

Oxidation von 1,4-Butandiol durchmustert. Sowohl NADH- als auch NADPH-abhängige

Enzyme zeigten signifikante Aktivität (Abb. 22). Die HL-ADH war dabei am aktivsten und

wurde zur weiteren Evaluation ausgewählt182.

Abb. 22: Screening von ADHs zur Oxidation

von 1,4-Butandiol. Reaktionsbedingungen:

c(1,4-BD) = 0 – 4,2 M; c(NAD+) = 0,5 mM/

c(NADP+) = 0,4 mM; c(ADH) = 0,12 – 0,36 g/l;

Puffer = Tris-HCl (50 mM, pH 7,0); T = 30 °C182

Daraufhin wurde die Effizienz von 1,4-Butandiol im Vergleich zum konventionellen

Cosubstrat 2-Propanol bestimmt. Da das Enzym HL-ADH eine gute Aktivität in der

Reduktion von Zimtaldehyd aufweist, wurde diese Substanz als Substrat ausgewählt49,183. Die

Ergebnisse

54

Versuche zeigten, dass der maximale Umsatz (erzielt durch iPrOH) durch den Einsatz einer

halb-äquimolaren Menge des 1,4-Butandiols (1,4-BD) weit übertroffen wurde, selbst wenn

das Isopropanol in fünffachem Überschuss eingesetzt wurde (Abb. 23)182.

Abb. 23: Substratumsatz nach 72 Stunden in der

HL-ADH katalysierten Reduktion von Zimtaldehyd

in Gegenwart von 0,5 Äquivalenten 1,4-BD (1,4-

Butandiol) oder 0,5 – 5 Äquivalenten Isopropanol.

Reaktionsbedingungen: c(Zimtaldehyd) = 5 mM;

c(NAD+) = 0,1 mM; c(HL-ADH) = 1 g/l;

Puffer = Tris-HCl (50 mM, pH 7,0); T = 30 °C182.

Motiviert von diesen Ergebnissen sollte die Einsetzbarkeit der „smart cosubstrates“ im

(S)-2-Butanol-Prozess evaluiert werden. Als besonders interessant wurde auch hier

1,4-Butandiol bewertet. Darüber hinaus sollte 1,5-Pentandiol evaluiert werden, da auch dieses

strukturell betrachtet ein stabiles Lactonprodukt ausbilden könnte. Abschließend wurde

2,3-Butandiol (2,3-BD) als Wasserstoffbrücken-stabilisiertes Cosubstrat untersucht.

Leider zeigten die Ergebnisse, dass die ADH evo-1.1.040 die getesteten Cosubstrate nur sehr

schlecht akzeptierte. Die Umsätze waren wesentlich niedriger im Vergleich zur Nutzung von

Isopropanol zur Cofaktorregenerierung (Tab. 17).

Daraufhin wurden strukturell einfachere Cosubstrate wie 1-Hexanol oder 1-Pentanol

eingesetzt, um eine generell fehlende Akzeptanz zu belegen. Auch in diesen Fällen war nur

ein sehr geringer Umsatz messbar. Es zeigte sich, dass die ADH evo-040 eine niedrige

Toleranz gegenüber alternativen Cosubstraten aufweist. Eine Implementierung des „smart

cosubstrat“-Ansatzes schien somit zum derzeitigen Zeitpunkt noch nicht möglich. Um dieses

vielversprechende System nutzen zu können, wäre (zumindest im Falle der evo-040) eine

vorherige Adaption des Substratspektrums zum Beispiel mittels Protein Engineerings nötig.

Ergebnisse

55

Tab. 17: Substratumsatz der ADH evo-040 bei der Reduktion von 2-Butanon (2,3 M) durch Einsatz

verschiedener Cosubstrate. Die Reaktionen wurden bei einem Gesamtvolumenanteil φ(organische

Phase) = 90 % durchgeführt und die Umsätze nach 70 Stunden bestimmt. Reaktionsbedingungen:

c(NAD+) = 0,15 mM; c(evo-040) = 2 mg Lyophilisat/ml; Puffer = KPi (50 mM; pH 7,0). BD = Butandiol,

PD = Pentandiol.

Cosubstrat 2,3-BD 1,4-BD 1,5-PD 1-Pentanol 1-Hexanol Isopropanol

Umsatz (%) 0 1,1 1,9 5,8 5,2 30

3.10 Prozess Up-scaling

Die erfolgreichen Versuche zur Identifizierung der optimalen Reaktionsparameter ließen auf

die Entwicklung eines erfolgreichen Prozesses zur Synthese von (S)-2-Butanol im

wasserarmen Reaktionsmilieu hoffen. Nachdem die hochselektive Alkoholdehydrogenase

evo-040 mittels Additiv in Medien mit hohem organischem Anteil stabilisiert werden konnte,

wurde mit dem Up-scaling der Reaktion begonnen. Die Substratbeladung wurde auf 20 %

festgelegt (siehe 3.6) und die optimierte Komponentenzugabe angewendet.

3.10.1 Produktion des Biokatalysators

Um den Butanol-Prozess im 1 Liter Maßstab durchführen zu können, wurden insgesamt 5 g

Enzymlyophilisat benötigt. Dieses sollte aus Zellrohextrakt gewonnen werden.

Dazu wurde E. coli BL21 (DE3) mit dem Enzymvektor frisch transformiert. Der Vektor

bestand aus einem pET-21a(+)-Plasmid als backbone, dem über die Restriktionsschnittstellen

NdeI und BamHI die proprietäre Gensequenz (welche das ADH evo-040 Gen codiert)

eingefügt wurde. Das dadurch gebildete Konstrukt besaß eine Größe von 6,45 Kilobasen,

wobei das Insert eine Größe von etwa 1 kb ausmacht. Die korrekte Integrität wurde mittels

Sanger-Sequenzierung bestätigt (GATC). Die Vektor-vermittelte Ampicillin-Resistenz konnte

ausgenutzt werden, um die mittels Elektroporation transformierten Zellen auf positive Klone

zu selektieren. Eine Einzelkolonie des ausplattierten Transformationsansatzes diente zur

Inokulation einer 50 ml Vorkultur (LB-Medium inklusive Ampicillin) zur Expression der

ADH. Eine Probe der Vorkultur wurde ebenfalls entnommen, um mittels Plasmidextraktions-

Kit das Vorhandensein des korrekten Plasmids zu überprüfen. Das aufgereinigte Plasmid

wurde mit BamHI singulär geschnitten und elektophoretisch auf einem Agarosegel analysiert.

Die Höhe der Laufbande stimmte mit der Größe des erwarteten Plasmids überein (Abb.

24-A).

Ergebnisse

56

Abb. 24: Expression der ADH evo-040 für die Biotransformation. A) Testrestriktion des Konstrukts

pET21a(+)-evo-040. Die Laufhöhe der mit BamHI geschnittenen DNA stimmt mit dem erwarteten Plasmid

überein (6,45 kb). B) SDS-Elektrophoresegel des Zellrohextrakts. Es ist eine Überexpressionsbande auf Höhe

des erwarteten Enzyms zu erkennen.

Je 10 ml der Vorkultur wurden genutzt, um vier Hauptkulturen aus 1 Liter TB-Medium

(inklusive Ampicillin) zu inokulieren (37 °C; 180 rpm). Die Hauptkulturen wuchsen bis zu

einer OD600 = 0,9, bevor die Expression durch Zugabe von IPTG

(Endkonzentration = 0,1 mM) induziert wurde. Nach 20 Stunden der Expression bei 30 °C

wurde die gesamte Zellmasse durch Zentrifugation (15 min, 8000 rpm) geerntet. Sie ergab

eine Zellfeuchtmasse von 72 g. Für den Zellaufschluss wurde das Pellet in 216 ml TEA-

Puffer (50 mM, pH 7,0) resuspendiert, 280 µl einer 1 M MgCl2 sowie 3 U/ml DNase I

zugegeben.

Durch French-Press Homogenisierung in zwei Durchläufen (900 bar) sollten die Zellen

aufgeschlossen werden. Der entstandene Zellrohextrakt wurde 20 Minuten bei 10.000 g

zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Durchführung einer SDS-Gelelektrophorese

bestätigte die Überexpression des Zielproteins (Abb. 24-B).

Der dadurch gewonnene Rohextrakt wurde photometrisch auf Oxidoreduktaseaktivität unter

Ausnutzung des evo-040 Aktivitätsassays untersucht. Die Lösung besaß eine Aktivität von

1110 U/ml (Substrat: trans-2-Hexenal) bei einem Proteingehalt von 22 mg/ml, was einer

Proteinaktivität von 50 U/mg Protein entspricht.

Zur Lyophilisierung wurde der Rohextrakt bei -20 °C eingefroren und anschließend für 48

Stunden gefriergetrocknet. Das Lyophilisat besaß eine Gewichtsaktivität von 8,2 U/mg

Lyophilisat beziehungsweise eine Proteinaktivität von 28,2 U/mg Protein.

Die Gesamtausbeute an Lyophilisat betrug 13,4 g, womit genug Produkt gewonnen werden

konnte, um den Bioprozess im 1 Liter Maßstab durchführen zu können.

Ergebnisse

57

3.10.2 Durchführung der Biotransformation bis 4 Liter

Das nach 3.10.1 produzierte Lyophilisat (5 g) wurde in einem 125 ml Plastikbecher

abgewogen. Es fand daraufhin die folgende Stabilisierungsmethode Anwendung: 100 mg

NAD+ wurden dem Lyophilisat zugegeben und in 25 ml KPi-Puffer (50 mM; pH 7,0) bei

120 rpm gelöst. Die Mischung wurde für 15 min inkubiert, bevor 75 ml Puffer (inkl.

1 M Sorbitol) zur Stabilisierung zugefügt und der Ansatz für 1 Stunde unter leichtem Rühren

inkubiert wurde. Die gesamte Lösung musste anschließend in eine 1 Liter Schottflasche

überführt werden. Es folgte zunächst die zügige Zugabe von 700 ml Isopropanol und

anschließend die Zugabe von 200 ml 2-Butanon unter hoher Rührzahl (1000 rpm).

Der Verlauf der Reaktion wurde gaschromatographisch verfolgt und ist Abb. 25 zu

entnehmen.

Am Ende der Reaktion wurde ein Umsatz von etwa 60 % bestimmt. Das entspricht einer

Gesamtproduktmenge von 120 ml. Eine chirale Gasanalytik bestätigte weiterhin eine

Produktreinheit von ≥ 99,5 % des (S)-Enantiomers.

Abb. 25: Verlauf der Bioreduktion von 2-Butanon im 1000 ml Maßstab

Nach der erfolgreichen Durchführung des Prozesses im 1 Liter Maßstab sollte die Reaktion

auf ein 4 Liter Volumen übertragen werden. Die Konversion wurde äquivalent zum

beschriebenen Vorgehen durchgeführt und verlief wie der 1 Liter Ansatz erfolgreich. Es

konnte nach 66 Stunden ein Umsatz von 50 % beobachtet werden184.

0

50

100

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Um

satz

(%

)

Reaktionsdauer (h)

Ergebnisse

58

3.11 Produktaufreinigung

Auch wenn bereits ein Prozess etabliert wurde, in dem der Wasseranteil auf nur 10 %

erniedrigt war, stellte dieser immer noch ein Problem bei der Aufreinigung des Butanols dar

(siehe 3.4). Zum Entfernen des restlichen Wassers wurden zwei Strategien entwickelt:

3.11.1 Produkttrocknung über ein Molekularsieb

Die erste Strategie beruhte auf dem Entzug des Wassers nach Reaktionsende durch Zugabe

von Salz und eines Molekularsiebs. Dazu wurden zuerst 10 % w/w Kaliumcarbonat dem

Reaktionsmedium beigemischt, gut durchmengt und anschließend über eine Nutsche

abfiltriert. Die Feintrocknung des Filtrats erfolgte anschließend über Nacht über einem 3 Å

Molekularsieb. Der Wassergehalt konnte durch diese Methode auf unter 0,1 % reduziert

werden. Allerdings ergaben sich einige Nachteile: So flockte das Salz sehr stark aus und es

blieb ein Teil der Reaktionslösung an diesem anhaften. Deshalb musste das Kaliumcarbonat

mittels Dichlormethan nachgespült werden. Weiterhin erwies sich auch das Molekularsieb,

insbesondere in Hinblick auf ein Up-scaling, als unpraktisch, da es ebenfalls nachgespült und

nach Gebrauch aufwändig regeneriert werden musste.

3.11.2 Produkttrocknung mittels Azeotroprektifikati on

Die zweite Methode zur Trocknung beruhte auf dem Prinzip der Azeotroprektifikation. Dazu

wurde dem azeotropen Gemisch ein Lösemittel zugesetzt, welches das Wasser aus dem

Reaktionsmedium bei einer niedrigen Siedetemperatur ausschleppt. Es wurde Cyclohexan im

Verhältnis 1,5:1 mit dem Reaktionsmedium vereint und anschließend die gesamte

Reaktionslösung über eine Füllkörperkolonne abdestilliert. Der Wassergehalt des so

erhaltenen Produktes belief sich auf unter 0,1 %.

3.11.3 Produktaufreinigung mittels Destillation

320 ml der filtrierten Reaktionslösung wurden mit 500 ml Cyclohexan versetzt und über drei

50 cm Füllkörperkolonnen mit 5 mm Raschig-Ringen destilliert. Das Destillationsprotokoll ist

Tab. 18 zu entnehmen.

Der Sumpf (S2) wurde separat erneut destilliert. Es ergab sich eine Fraktion ohne Vorlauf mit

einem Siedepunkt von 99 °C. Auswaage: 32 g farblose, klare Flüssigkeit (40 ml). Die GC-

Analytik bezifferte das Produkt auf eine Reinheit von ≥ 99 % 2-Butanol sowie eine

Enantiomerenreinheit von ≥ 99,5 % des (S)-Enantiomers. Durch die Karl-Fischer-Titration

konnte ein Wassergehalt von 0,05 % bestimmt werden.

Ergebnisse

59

Bei einem Substratumsatz der Biokonversion von etwas über 60 % konnte eine Produktmenge

von circa 40 ml/ 320 ml Reaktionslösung berechnet werden. Die gesamte theoretisch

vorhandene Menge an 2-Butanol konnte somit mittels Destillation aufgereinigt und

rückgewonnen werden.

Tab. 18: Destillationsprotokoll der Aufreinigung von 320 ml Reaktionslösung (mit 500 ml Cyclohexan

vesetzt) (S = Sumpf; w. Ph. = wässrige Phase; Reflux = Rückfluss in Tropfen).

Frakt. Bad

( °C)

Sdp.

( °C)

Reflux

(x:1)

Menge

(ml)

cHexan

(%)

Aceton

(%)

Butanon

(%)

iPrOH

(%)

Butanol

(%)

I 80 56 3 41 69,2 30,8

II 80 61 3 16 82,7 17,2

III 80 65 1 196 99,0 0,05 0,95

IV 90 65 2 205 99,7 0,01 0,30

V 100 65 2 125 99,0 1,0

VI 110 65 2 44,5 99,0 1,0

S1 (erneut destilliert; VII – X) 110 41,3 58,7

VII 140 80 2 3 100

VIII 140 81 2 28 100

IX 145 81 1 8 100

X 160 83 6 20 100

S2 (erneut destilliert; siehe Text) 51 0,05 99,95

Ergebnisse

60

Ergebnisse Teil 2: Enzymoptimierung durch Verfahren des Protein Engineerings

In diesem Arbeitsabschnitt sollte die Alkoholdehydrogenase evo-040 mittels Protein

Engineering optimiert werden. Ziel war es, den entwickelten Prozess zur Darstellung von

enantiomerenreinem (S)-2-Butanol durch den Einsatz einer optimierten Enzymvariante noch

effizienter zu machen. Idealerweise sollte das Enzym gegen die organischen Lösemittel

stabilisiert werden. Allerdings würde auch eine höhere Aktivität der evo-040 die

Prozessausbeute verbessern.

Zur Entwicklung einer optimierten Variante wurden drei Ansätze verfolgt (siehe auch 4.5.1):

A) Rationale Proteinentwicklung: Durch die Integration von Disulfidbrücken sollte die

Proteinstruktur stabilisiert werden. Um die Etablierung solcher Brücken zu bewerkstelligen,

mussten je Variante zwei Aminosäureaustausche mittels QuikChange-Mutagenese

durchgeführt werden.

B) Semi-rationale Proteinentwicklung: Es sollte das Bioinformatikprogramm Bio-Prodict

3DM verwendet werden, um Aminosäureaustausche vorherzubestimmen, die vorteilhaft sein

könnten, da sie in homologen Proteinen zu verbesserten Eigenschaften geführt haben. Die

dadurch bestimmten Aminosäuren sollten durch Sättigungsmutagenese mittels QuikChange-

Technik ausgetauscht und die Enzymvarianten im Anschluss charakterisiert werden.

C) Zufallsmutagenese: In diesem Ansatz sollten durch das Anwenden der error-prone PCR

Technik111 zufällig Mutationen in die DNA-Sequenz der Alkoholdehydrogenase evo-040

eingeführt werden. Die generierten Mutanten sollten anschließend in einem high-throughput

Verfahren auf verbesserte Eigenschaften durchmustert und die Gensequenzen dieser

Varianten aufgeklärt werden.

3.12 Rationales Proteindesign durch den Einbau von Disulfidbrücken

3.12.1 Produktion der Enzymvarianten

Zur Identifizierung von Aminosäurepositionen, die theoretisch im Stande sind,

Disulfidbrücken auszubilden, wurde das Programm „Disulfide by Design Version 1.2“

(http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD/) genutzt185 (siehe auch 4.5.1). Um die Berechnungen

durchzuführen, wurden im Vorfeld zwei Homologiemodelle der ADH evo-040 erstellt. Dazu

wurde zum einen das Programm „Swiss-Model“ (http://swissmodel.expasy.org/)92,186, zum

anderen das Programm „CPHmodels 3.2“ (http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/“)93

genutzt. Die beiden erstellten Homologiemodelle zeigten untereinander eine sehr hohe

Strukturübereinstimmung. Die erstellten Modelle wurden in das Programm „Disulfide by

Ergebnisse

61

Design Version 1.2“ eingepflegt. Dieses berechnete eine Vielzahl möglicher Positionspaare,

die theoretisch zur Ausbildung einer Schwefelbrücke imstande sein könnten. Unter

Berücksichtigung des idealen Torsionswinkels fand eine Selektion von insgesamt sechs

Positionspaaren statt (Tab. 19).

Tab. 19: Disulfidvarianten, die zur Konstruktion ausgewählt wurden

Disulfid-Variante Mutation A Mutation B

SSB1 E34C G64C

SSB2 V63C A142C

SSB3 V125C A130C

SSB4 D138C Q141C

SSB5 G174C G331C

SSB6 T238C V261C

Die Disulfidvarianten wurden mittels QuikChange-Technik generiert. Dazu mussten zunächst

die optimalen Mutagenesebedingungen evaluiert werden. Je ein Primerpaar (SSB-xxC-Fwd

und SSB-xxC-Rev) diente zur Insertion einer Mutation. Bereits unter Standardbedingungen

waren zehn der zwölf PCR-Reaktionen erfolgreich (Abb. 26). Die QuikChange-PCR der

beiden Mutanten A142C und T238C konnte durch eine zehnfach erniedrigte

Primerkonzentration realisiert werden.

Abb. 26: Evaluierung der idealen QuikChange-Bedingungen zur Generierung der Disulfidvarianten.

Lediglich die Mutationen A142C und T238C konnten nicht unter Standardbedingungen etabliert werden.

Im Folgenden wurden die Doppelmutanten der evo-040 durch je zwei aufeinander folgende

QuikChange-Mutageneseschritte konstruiert. Die Korrektheit der Varianten konnte durch

Sanger-Sequenzierung bestätigt werden. Als Expressionswirt diente E. coli SHuffle T7

(NEB), da dieser Stamm im Stande ist, Disulfidbrücken auszubilden. Die Transformation

konnte durch Elektroporation erfolgreich durchgeführt werden.

Nach erfolgreicher Entwicklung der neuen Stämme wurden die Enzyme im 500 ml Maßstab

exprimiert und Lyophilisate hergestellt. Eine SDS-Gelelektrophorese der löslichen und

Ergebnisse

62

unlöslichen Proteinfraktionen zeigte jedoch, dass die Mutationen zu Problemen in der

Expression der Enzyme führten (Abb. 27). Im Fall der Varianten SSB1 - SSB4 war nahezu

keine Expression von löslichem Enzym zu erkennen. Lediglich SSB5 und SSB6 schienen in

löslicher Form exprimiert werden zu können, wobei auch hier die Proteinbanden schwächer

waren als im Fall des Wildtyps. Bei allen Varianten dagegen waren starke bis sehr starke

Banden in der unlöslichen Proteinfraktion nachweisbar. Daher fand eine nähere

Charakterisierung nur für die Varianten SSB5 und SSB6 statt.

Abb. 27: SDS-Gelelektrophorese der löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen der Disulfidmutanten.

Das Zielprotein besitzt eine Größe von etwa 37 kDa.

3.12.2 Untersuchung der Hitzestabilität der Disulfidvarianten

Um einen Einfluss der Disulfidbrücken auf die Stabilität der Enzyme zu untersuchen, sollte

die Hitzetoleranz der Enzyme quantifiziert werden. Aus den produzierten Lyophilisaten

wurde eine Stammlösung erstellt (50 mg/ml) und diese einem fünfminütigen Hitzeschock

unterzogen. Dazu konnte ein PCR-Cycler eingesetzt werden, der jeweils 200 µl der Lösungen

sehr schnell und präzise auf die gewünschte Temperatur erhitzte und nach der

Ergebnisse

63

Schockbehandlung die Proben für 30 Sekunden auf 4 °C abkühlte. Zur Messung der so

behandelten Enzyme wurde das evo-040 Aktivitätsprotokoll genutzt (2.3.1), jedoch mit

2-Butanon (50 mM) als Substrat. Die gemessenen Aktivitäten in Dreifachbestimmung wurden

anschließend auf die Proteinmenge in der Probe bezogen (mU/mg Protein) und die relative

Restaktivität des Enzyms nach Hitzeschockbehandlung berechnet.

Die Ergebnisse zeigten, dass die Varianten keine erhöhte Temperaturstabilität aufwiesen

(Abb. 28). Während SSB6 ein dem Wildtyp sehr ähnliches Profil zeigte, wies SSB5 eine

signifikant niedrigere Temperaturtoleranz auf. Bereits bei 44 °C war nahezu keine

Restaktivität mehr messbar, wohingegen der Wildtyp unter gleichen Bedingungen noch eine

Aktivität von über 90 % beibehielt. Der Einbau der beiden Cystein-Aminosäuren schien

negativen Einfluss auf die Stabilität zu nehmen.

Abb. 28: Untersuchung der

Temperaturstabilität der

Disulfidvarianten. Die

Restaktivität der Enzyme

wurde dazu nach einem

5-minütigen Hitzeschock

bestimmt. Es konnte keine

Verbesserung der Stabilität

beobachtet werden.

3.12.3 Kinetische Parameter der Disulfidvarianten

Die kinetischen Parameter Km und Vmax zum Umsatz von 2-Butanon sollten für SSB5 und

SSB6 bestimmt werden. Dazu wurde eine Lösung des produzierten Lyophilisates mit einer

Konzentration von 50 mg/ml angesetzt. Diese diente zur Durchführung des evo-040

Aktivitätsassays, wobei 2-Butanon das Substrat war, dessen Konzentration schrittweise erhöht

wurde. Die gemessenen Aktivitäten in Dreifachbestimmung wurden anschließend auf die

Proteinmenge in der Probe bezogen (mg Protein/mg Lyophilisat: WT = 0,576; SSB5 = 0,448;

SSB6 = 0,408). Anhand dieser Daten konnten die Parameter Km und Vmax mittels

Michaelis-Menten-Diagramm bestimmt werden, in welchem die Substratbeladung gegen die

Aktivität aufgetragen wurde (Abb. 29). Die bestimmten Vmax Werte beliefen sich auf

709 mU/mg für das Wildtyp Enzym, 88 mU/mg für SSB6 und 258 mU/mg für SSB5.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

44 46 48 50 52 54

Res

takt

ivitä

t (%

)

Hitzeschock (°C)

Wildtyp

SSB6

SSB5

Ergebnisse

64

Die davon abgeleiteten Km Werte betrugen 32 mM für den Wildtyp, 5 mM für SSB5 und

30 mM für SSB6. Da die Charakterisierung der Varianten somit keine verbesserten

Eigenschaften aufzeigte, wurde auf den Einsatz der Enzyme im 2-Butanon Prozess verzichtet.

Abb. 29: Bestimmung von Km und Vmax der Disulfidvarianten SSB5 und SSB6. Die gemessenen

Aktivitäten zum Umsatz von 2-Butanon wurden in ein Michaelis-Menten-Diagramm eingetragen und die

kinetischen Parameter graphisch bestimmt. Die Mutanten zeigten eine deutlich erniedrigte

Maximalumsatzgeschwindigkeit.

3.13 Semi-rationales Proteindesign mittels „Bio-Prodict 3DM“

3.13.1 Produktion der Enzymvarianten

Grundlage des semi-rationalen Engineerings war das Programm 3DM

(https://www.bio-prodict.nl/) (siehe 4.5.2). Zur Analyse der ADH evo-040 wurde die

Aminosäuresequenz des Enzyms in die 3DM-Datenbank eingepflegt. Dadurch konnten elf

Positionen der ADH evo-040 identifiziert werden, die in homologen Proteinen für die

Enzymstabilität verantwortlich zu sein schienen (Tab. 20).

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 100 200 300 400 500 600

Akt

ivitä

t (m

U/m

g P

rote

in)

Substratbeladung (mM Butanon)

WT

SSB6

SSB5

Ergebnisse

65

Tab. 20: Die von „Bio-Prodict 3DM“ zur Sättigung vorgeschlagenen Positionen. Vier weitere Positionen

konnten als Fehlinterpretation ausgeschlossen werden.

Position 3D-Alignment

Position

ADH evo-040

Position

3DM - 1 12 N9

3DM - 2 14 A12

3DM - 3 34 D32

3DM - 4 55 T53

3DM - 5 89 M87

3DM - 6 92 C91

3DM - 7 190 L178

3DM - 8 252 V240

3DM - 9 255 V243

3DM - 10 262 D250

3DM - 11 284 D269

Die elf bestätigten Positionen mussten daraufhin sättigungsmutagenisiert werden. Es wurde

die QuikChange-Methode eingesetzt, jedoch unter Einsatz von (an der zu mutagenisierenden

Position) degenerierten Primern (nnk- bzw. mnn-Tripletts). Je ein Primerpaar (3DM-x-Fwd

und 3dm-x-Rev) diente zur Insertion der Mutationen.

Unter Variation der Annealing-Temperatur und unter Beibehaltung der Standardbedingungen

konnten alle PCR-Reaktionen erfolgreich durchgeführt werden. Die dadurch gewonnenen

Plasmide dienten als templates zur Transformation von elektrokompetenten Zellen des

Stamms E. coli BL21(DE3). Nach Ausstrich auf Selektivagar und Bebrütung über Nacht

wurden zehn der gewachsenen Kolonien selektiert (von Variante 3DM–3; zufällig

ausgewählt) und zur Überprüfung der Mutagenese ihre Plasmide sequenziert. Es zeigte sich,

dass alle zehn Klone dieser Platte an der gewünschten Position einen Aminosäureaustausch

trugen (A, G, L, Q, F, Q, K, E, G, Y).

Nach der erfolgreichen Bestätigung der Mutagenesearbeiten konnten aus den transformierten

Zellen Variantenbanken generiert werden, jeweils in einem Umfang von 200 Klonen pro

Aminosäureposition. Damit entstand eine etwa zehnfache Abdeckung der möglichen

Austausche. Die Varianten wurden in Deepwell-Platten im 1 ml Maßstab angezogen und die

Expression der Enzyme mittels IPTG induziert (Endkonzentration: 0,1 mM). Nach

fünfstündiger Expression fand der Zellaufschluss mittels Lysozym statt.

Das Screening der generierten Variantenbänke gliederte sich in zwei verschiedene Assays auf.

Im ersten Assay wurden die Enzyme auf Temperaturstabilität untersucht. Der durchgeführte

Ergebnisse

66

Hitzeschock der Zellrohextrakte bei 50 °C dauerte fünf Minuten, gefolgt von einer

Rückkühlphase von 30 Sekunden bei 4 °C. Daraufhin wurde die Restaktivität der Rohextrakte

im Mikroplatten-Photometer mittels NADH-Abnahme bestimmt und mit der Restaktivität des

auf gleiche Weise behandelten Wildtyps verglichen.

Der zweite Assay zielte auf die Lösemittelstabilität der Varianten ab. Dazu wurden die Klone

5 Minuten in einer Lösung aus 90 % Isopropanol inkubiert. Auch hier wurde die Restaktivität

der Enzyme photometrisch bestimmt und mit der des Wildtyps verglichen.

Die beiden beschriebenen Assays wurden mit den Varianten der Enzymbank dreimal

durchgeführt. Klone, die in einer Bank bei allen drei Wiederholungen des Screenings die

höchste Aktivität zeigten, wurden selektiert und die Gensequenz mittels Sequenzierung

offengelegt (Tab. 21).

Tab. 21: Ergebnisse der beiden Screenings der 3DM-Varianten. Die aktivsten Klone jeder Bank wurden

sequenziert und sind unten aufgeführt. Die angegebenen relativen Restaktivitäten sind auf die Restaktivität des

Wildtyps nach identischer Behandlung bezogen.

Variante Mutation Hitzeschock-Behandlung

Restaktiv. rel. zum Wildtyp (%)

Lösemittelinkubation

Restaktiv. rel. zum Wildtyp (%)

3DM - 1 N9G 125 263

3DM - 2 A12Q 141 246

3DM - 8 V240N 120 306

3DM - 9 V243G < 100 148

3DM - 10 D250W 141 255

Insgesamt wurden aus den elf Banken auf diese Weise fünf Enzymvarianten isoliert. Die

restlichen sechs Enzymbanken zeigten keine Mutanten, die in einem der beiden Assays

höhere Restaktivität als der Wildtyp aufwiesen. Der Anteil der durch die Mutagenese

inaktivierten Enzyme war in allen Bänken sehr niedrig (Tab. 22).

Tab. 22: Anteil der inaktiven Enzymvarianten je 3DM-Position

Mutantenbank 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Inaktive

Mutanten (%) 4,3 1 0 0 2 0,3 0,6 1,6 1,6 7,6 0

Da nicht ausgeschlossen werden konnte, dass die Aktivitätsunterschiede auf veränderte

Expressionsraten zurückzuführen waren, musste von den Rohextrakten auch ein SDS-Gel

erstellt werden. Dieses zeigte nur leichte Variationen der Enzymeexpressionen (Abb. 30).

Ergebnisse

67

Abb. 30: SDS-Gelelektrophorese der löslichen Proteinfraktionen einiger 3DM-Enzymvarianten. Die

Überexpressionsbanden der ADHs (37 kDa) sind nicht sehr ausgeprägt, da die Expression nur unter

suboptimalen Bedingungen im Deepwell-Format durchgeführt wurde.

3.13.2 Untersuchung der Hitzestabilität der 3DM-Varianten

Die fünf unter 3.13.1 identifizierten Enzymvarianten wurden zur genaueren Charakterisierung

im 500 ml Maßstab exprimiert und der Rohextrakt nach Zellaufschluss mittels Homogenisator

lyophilisiert.

Die produzierten Lyophilisate dienten zur Untersuchung der Hitzestabilität der Enzyme. Die

Versuche verliefen parallel zu dem unter 3.12.2 vorgestellten Verfahren. Auch in diesem Fall

handelte es sich um die Analyse der Restaktivitäten in Dreifachbestimmung nach Behandlung

der Lyophilisatlösung durch Hitzeschock. Die Ergebnisse zeigten, dass zwei der Varianten

(N9G und V240N) eine signifikant höhere Temperaturtoleranz besaßen (etwa 3 - 4 °C) als der

Wildtyp (Abb. 31). Die übrigen Varianten dagegen zeigten eine leichte bis signifikante

Erniedrigung ihrer Temperaturstabilität.

Diese Ergebnisse standen teilweise im Widerspruch mit den Ergebnissen des Screenings der

Variantenbanken (Tab. 21). Allerdings wurde das vorhergehende Screening in sehr viel

kleinerem Volumen durchgeführt, als die hier beschriebene genauere Charakterisierung der

Enzyme. Daher sind die hier generierten Ergebnisse als verlässlicher anzusehen.

Ergebnisse

68

Abb. 31: Untersuchung der Temperaturstabilität der 3DM-Varianten. Die Restaktivität der Enzyme wurde

dafür nach einem 5-minütigen Hitzeschock bestimmt. Zwei Varianten (V240N & N9G) zeigten eine höhere

Hitzetoleranz als der Wildtyp.

3.13.3 Kinetische Parameter der 3DM-Varianten

Zur näheren Charakterisierung sollten Km und Vmax der Varianten bestimmt werden. Die

Versuche liefen wie unter 3.12.3 beschrieben ab. Die gemessenen Aktivitäten in

Dreifachbestimmung wurden auf die Proteinmenge in der Probe bezogen (mg Protein/mg

Lyophilisat: WT = 0,576; N9G = 0,528; A12Q = 0,512; V240N = 0,448; V243G = 0,496;

D250W = 0,448) und in ein Michaelis-Menten-Diagramm eingetragen (Abb. 32). Dadurch

wurden die Maximalumsatzgeschwindigkeit Vmax und die Km-Werte graphisch bestimmt

(Tab. 23).

Tab. 23: Bestimmung von Km und Vmax der 3DM-Varianten. Die Werte wurden anhand der graphischen

Auswertung der Aktivitäten bestimmt (Abb. 32).

Variante WT N9G A12Q V240N V243G D250W

Vmax (mU/mg Protein) 709 855 1053 539 644 1339

Km (mM) 32 55 65 40 70 80

Insbesondere die Variante D250W stach heraus, da sie eine Maximalumsatzgeschwindigkeit

Vmax von 1339 mU/mg Protein besaß und damit nahezu doppelt so viel Substrat unter

Idealbedingungen umsetzen konnte wie der Wildtyp. Doch auch die Mutanten A12Q und

N9G wiesen signifikant höhere Vmax Werte auf.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

44 46 48 50 52

Res

takt

ivitä

t (%

)

Hitzeschock (°C)

Wildtyp

N9G

A12Q

V240N

V243G

D250W

Ergebnisse

69

Abb. 32: Bestimmung von Km und Vmax der 3DM-Varianten. Die gemessenen Aktivitäten zum Umsatz von

2-Butanon wurden in ein Michaelis-Menten-Diagramm eingetragen und die kinetischen Parameter graphisch

bestimmt.

3.13.4 Einsatz der 3DM-Varianten im (S)-2-Butanol Prozess

Die Enzymvarianten wurden zunächst in einem Prozess mit niedrigem Anteil an organischer

Phase eingesetzt. Der Volumenanteil des Isopropanols lag bei 8,5 %, die Substratbeladung bei

φ(2-Butanon) = 1,5 %. Die Menge des eingesetzten Enzyms betrug 0,625 g Protein/ml

Reaktionsansatz. Weitere Parameter waren: c(NAD+) = 0,1 mM; Puffer = KPi (50 mM,

pH 7,0); T = RT.

Es zeigte sich, dass insbesondere die Variante D250W wesentlich aktiver war als der Wildtyp

(Abb. 33). Nach sechs Stunden lag der Umsatz bereits bei 64 % (vgl. Wildtyp: 28 %). Die

Varianten N9G, A12Q und V240N waren leicht aktiver als der Wildtyp, während die Variante

V243G leicht stabiler zu sein schien als die übrigen Enzyme. Alle Enzyme lieferten einen

unveränderten Enantiomerenüberschuss von ≥ 99,5 % für das (S)-Enantiomer.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 100 200 300 400 500 600

Akt

ivitä

t (m

U/m

g P

rote

in)

Substratbeladung (mM Butanon)

WT

N9G

A12Q

V240N

V243G

D250W

Ergebnisse

70

Abb. 33:

Umsatzverläufe der

3DM-Varianten in

einem wasserreichen

Prozess zur Dar-

stellung von

2-Butanol.

Insbesondere die

Variante D250W fiel

durch eine deutlich

schnellere Reduktion

des Substrats auf.

Daraufhin wurden die Enzyme in einer Reaktion mit 90 % organischem Anteil eingesetzt. Auf

eine Stabilisierung mittels Sorbitol wurde verzichtet, um die Auswirkungen der Mutationen

nicht zu beeinflussen. Der Volumenanteil des Isopropanols lag bei 70 %, die

Substratbeladung bei 20 %. Die Menge eingesetzten Enzyms betrug 1,25 g Protein/ml


pH 7,0); T = RT.

In diesem Fall erreichten die Varianten A12Q und D250W einen signifikant höheren Umsatz

als der Wildtyp. Im Laufe der Reaktion stieg auch der Umsatz der Enzyme N9G und V243G

leicht über den des Wildtyps an. Die Mutante V240N dagegen lag weit hinter den Resultaten

der anderen Enzyme zurück (Abb. 34).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50

Um

satz

(%

)

Reaktionsdauer (h)

WT

N9G

A12Q

V240N

V243G

D250W

Ergebnisse

71

Abb. 34: Einsatz

der 3DM-Varianten

im wasserarmen

Reaktionsprozess.

Der Anteil der

organischen Phase

betrug 90 %. Die

Mutanten D250W

und A12Q zeigten

einen signifikant

höheren Umsatz als

das Wildtyp-Enzym.

3.14 Zufallsmutagenese mittels epPCR

3.14.1 Entwicklung der Enzymvarianten

Bei der Zufallsmutagenese wurden Mutationen über das gesamte Gen auf zufällige Art

eingebracht und die dadurch entstandenen Varianten auf verbesserte Eigenschaften

durchmustert.

Zur Zufallsmutagenese der ADH evo-040 wurde eine Variantenbank mittels epPCR-Methode

erstellt (Primerpaar: evo-40-Fwd und evo-040-Rev). Durch Verwendung von

Taq-DNA-Polymerase bei 6 mM MgCl2 und 0,07 mM MnCl2 wurde dabei eine

durchschnittliche Fehlerrate von 1,2 Nukleotidaustauschen pro kb erreicht (ermittelt aus 50

sequenzierten Mutanten). Versuche mit einer höheren Konzentration an MnCl2 (0,3 mM)

führten zu einer Fehlerrate von 13 Nukleotidaustauschen pro kb. 3.200 Klone dieser Bank mit

hoher Mutationsrate wurden gescreent, es waren jedoch 86 % der Enzyme inaktiv, so dass nur

der Ansatz mit niedriger Mutationsrate weiter verfolgt wurde.

Die Banken mutierter Gene wurden mittels BamHI und NdeI in den Expressionsvektor

pET-21(a)+ kloniert und der T7-Expressionsstamm E. coli BL21(DE3) damit transformiert.

50 Klone der Bibliothek wurden sequenziert und die Mutationen charakterisiert (4.5.3).

Das folgende Screening der generierten Variantenbänke gliederte sich wie in den rationalen

und semi-rationalen Studien in zwei verschiedene Assays auf. Im ersten Assay wurden die

Enzyme auf Temperaturstabilität untersucht. Der durchgeführte Hitzeschock der

Zellrohextrakte bei 50 °C dauerte fünf Minuten, gefolgt von einer Rückkühlphase von

30 Sekunden bei 4 °C. Daraufhin wurde die Restaktivität der Rohextrakte im Mikroplatten-

0

5

10

15

20

25

30

35

0 10 20 30 40 50

Um

satz

(%

)

Reaktionsdauer (h)

WT

N9G

A12Q

V240N

V243G

D250W

Ergebnisse

72

Photometer mittels NADH-Abnahme bestimmt und mit der Restaktivität des auf gleiche

Weise behandelten Wildtyps verglichen.

Der zweite Assay zielte auf die Lösemittelstabilität der Varianten ab. Dazu wurden die Klone

5 Minuten in einer Lösung aus 90 % Isopropanol inkubiert. Auch hier wurde die Restaktivität

der Enzyme photometrisch bestimmt und mit der des Wildtyps verglichen. Die Gesamtanzahl

der auf diese Weise untersuchten Varianten betrug circa 13.000 Mutanten.

Nach jedem Screening wurden etwa 10 % der aktivsten Klone isoliert und nach Neuanzucht

in Deepwell-Platten erneut dem Screening unterzogen. Auf diese Weise kam es zu drei

Screening-Runden, aus denen am Schluss acht Klone ausgewählt und deren

Nukleotidsequenzen bestimmt wurden. Diese Enzyme wiesen in mindestens je einem der

beiden Assays eine höhere Restaktivität als der Wildtyp auf (Abb. 35).

Das beste Enzym, welches aus der Hitzeschockbehandlung hervorging, war die Mutante

D250R. Sie lieferte eine Restaktivität von 155 % verglichen mit dem Wildtyp. Auch die

Variante M87V war deutlich aktiver, ihre Restaktivität belief sich auf 151 %.

Aus dem Screening der Lösemittelstabilität gingen vier Enzyme mit deutlich erhöhter

Restaktivität hervor. Diese waren Y182F (172 %), M87V (171 %), P273L (154 %) und N7S

(143 %).

Ergebnisse

73

0

100

200R

esta

ktiv

. rel

. zum

Wild

typ

(%)

A

Abb. 35: Screening-

Ergebnisse der besten

Varianten aus der

Zufallsmutagenese.

A) Hitzeschock-

behandlung. Ange-

geben ist die

Restaktivität nach

5-minütigem Hitze-

schock relativ zur

Restaktivität des

Wildtyp-Enzyms.

B) Lösemittel-

inkubation. Die

Enzyme wurden im

Gegensatz zu A)

5 Minuten in Löse-

mittel inkubiert, bevor

die Restaktivität

gemessen wurde.

3.14.2 Untersuchung der Hitzestabilität der Varianten aus der Zufallsmutagenese

Die acht unter 3.14.1 entwickelten Enzymvarianten sollten genauer charakterisiert werden.

Dazu wurden sie im 500 ml Maßstab in E. coli BL21(DE3) exprimiert und der Rohextrakt

nach Zellaufschluss mittels French-Press Homogenisator lyophilisiert. Um auszuschließen,

dass die Aktivität der Lyophilisate durch unterschiedlich starke Expression der Enzyme

beeinflusst wird, wurde ein SDS-Gel von den löslichen Überständen angefertigt. Es zeigte

sich, dass die Expressionsraten nicht sehr stark voneinander abwichen (Abb. 36).

0

100

200

Res

takt

iv. r

el. z

um W

ildty

p (%

)

B

Ergebnisse

74

Abb. 36: SDS-Gelelektrophorese der löslichen Proteinfraktionen von Enzymvarianten aus der

Zufallsmutagenese. Alle Enzyme zeigten ähnlich starke Expressionsmuster.

Die produzierten Lyophilisate dienten zur Untersuchung der Hitzestabilität der Enzyme. Die

Versuche verliefen parallel zu dem unter 3.12.2 vorgestellten Verfahren. Auch in diesem Fall

handelte es sich um die Analyse der Restaktivitäten in Dreifachbestimmung nach Behandlung

der Lyophilisatlösung durch Hitzeschock.

Zwei Mutanten (M87L und P273L) zeigten eine signifikant erhöhte Toleranz gegenüber dem

Hitzeschock (Abb. 37). Die Variante M87V, die an gleicher Position wie M87L eine Mutation

trägt, war dagegen gegenüber der Temperaturbehandlung deutlich weniger tolerant. Das

gleiche Verhalten wies auch die Mutante Y182F auf, welche deutlich schneller inaktiviert

wurde als das Wildtyp-Enzym.

Ergebnisse

75

3.14.3 Kinetische Parameter der Varianten aus der Zufallsmutagenese

Zur Charakterisierung der Varianten aus der Zufallsmutagenese sollten die maximale

Umsatzgeschwindigkeit Vmax und die Substratkonzentration bei halbmaximaler

Umsatzgeschwindigkeit (Km) bestimmt werden. Die Versuche liefen wie unter 3.12.3

beschrieben ab. Die gemessenen Aktivitäten in Dreifachbestimmung wurden auf die

Proteinmenge in der Probe bezogen (mg Protein/mg Lyophilisat: WT = 0,576;

N7S/K345R = 0,592; S10R = 0,576; M87L = 0,544M; M87V = 0,592; Y182F = 0,608;

D250R = 0,56; P273L = 0,552; Q339H = 0,568) und in ein Michaelis-Menten-Diagramm

eingetragen (Abb. 38). Dadurch konnten die Maximalumsatzgeschwindigkeit Vmax und die

Km-Werte graphisch bestimmt werden (Tab. 24).

Sechs der acht Varianten zeigten eine deutlich erhöhte Maximalumsatzgeschwindigkeit

(Vmax). M87L erreichte 1336 mU/mg Protein und war damit am aktivsten. Das Enzym hatte

somit im Optimum eine doppelt so hohe Aktivität wie der Wildtyp. Lediglich M87V und

P273L wiesen eine niedrigere Vmax als das Ursprungsenzym auf, sie lag bei 280

beziehungsweise 103 mU/mg Protein.

0

20

40

60

80

100

44 45 46 47 48 49 50 51 52 53

Res

takt

ivitä

t (%

)

Hitzeschock (°C) B

Wildtyp

Y182F

D250R

P273L

Q339H

0

20

40

60

80

100

44 45 46 47 48 49 50 51 52 53

Res

takt

ivitä

t (%

)

Hitzeschock (°C) A

Wildtyp

N7S/K345R

S10R

M87L

M87V

Abb. 37: Untersuchung der Temperaturstabilität der Varianten aus der Zufallsmutagenese. Die

Restaktivität der Enzyme wurde dafür nach einem 5-minütigen Hitzeschock bestimmt. Zwei Varianten

(M87L & P273L) zeigten eine signifikant höhere und zwei (M87V & Y182F) eine signifikant niedrigere

Hitzetoleranz als der Wildtyp.

Ergebnisse

76

Tab. 24: Bestimmung von Km und Vmax der Varianten aus der Zufallsmutagenese. Die Werte wurden

anhand der graphischen Auswertung der Aktivitäten bestimmt (Abb. 38).

Variante Wild-

typ

N7S/

K345R S10R M87L M87V Y182F D250R P273L Q339H

Vmax

(mU/mg

Protein)

709 1129 987 1336 280 1205 1112 103 1080

Km (mM) 32 35 35 35 20 75 75 15 70

Abb. 38: Bestimmung

von Km und Vmax der

Varianten aus der

Zufallsmutagenese. Die

gemessenen Aktivitäten

zum Umsatz von

2-Butanon wurden in ein

Michaelis-Menten-

Diagramm eingetragen

und die kinetischen

Parameter graphisch

bestimmt. Die

Konzentration des

Substrats wurde so lange

erhöht, bis die

Umsatzgeschwindigkeit

stagnierte oder abnahm.

3.14.4 Einsatz der Varianten aus der Zufallsmutagenese im (S)-2-Butanol Prozess

Parallel zu 3.12.4 wurden die Enzymvarianten vorerst in einem Prozess mit niedrigem Anteil

organischer Phase eingesetzt. Der Volumenanteil des Isopropanols lag bei 8,5 %, die

Substratbeladung bei 1,5 %. Die Menge eingesetzten Enzyms betrug 0,625 g Protein/ml


pH 7,0); T = RT.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 50 100 150 200 250 300 350

Akt

ivitä

t (m

U/m

g P

rote

in)

Substratbeladung (mM Butanon) A

Wildtyp

N7S/K345R

S10R

M87L

M87V

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 100 200 300 400 500 600

Akt

ivitä

t (m

U/m

g P

rote

in)

Substratbeladung (mM Butanon) B

Wildtyp

Y182F

D250R

P273L

Q339H

Ergebnisse

77

Unter diesen Reaktionsbedingungen zeigten die drei Varianten N7S/K345R (Doppelmutante),

M87L und Y182F einen signifikant höheren Umsatz als der Wildtyp (Abb. 39). Die

Substratkonversion lag etwa 10 Prozent über dem des Wildtyp Enzyms. Die beiden Mutanten

S10R und Q339H schienen dagegen etwas stabiler zu sein, da sie im Laufe des Prozesses ihre

Aktivität länger aufrechterhalten konnten. Die Enzyme M87V, D250R und P273L schnitten

dagegen wesentlich schlechter ab. Sie erreichten nur einen geringen Umsatz und lagen weit

hinter den übrigen Enzymen zurück.

Abb. 39:

Umsatzverläufe der

Varianten aus der

Zufallsmutagenese im

wasserreichen Prozess

zur Darstellung von

2-Butanol. Drei Enzyme

zeigten einen deutlich

erhöhten Umsatz im

Vergleich zum Wildtyp

Enzym.

Daraufhin wurden die Enzyme in einer Reaktion mit 90 % organischem Anteil (ohne

Sorbitolstabilisierung) eingesetzt. Der Volumenanteil des Isopropanols lag bei 70 %, die

Substratbeladung bei 20 %. Die Menge eingesetzten Enzyms betrug 1,25 g Protein/ml


pH 7,0); T = RT.

Unter diesen Bedingungen zeigte lediglich die Variante M87L einen leicht erhöhten Umsatz

im Vergleich zum Wildtyp (Abb. 40). Nach 120 Stunden erreichte das Enzym etwa 52 %

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120

Um

satz

(%

)

Reaktionsdauer (h) A

Wildtyp

N7S/K345R

S10R

M87L

M87V

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120

Um

satz

(%

)

Reaktionsdauer (h) B

Wildtyp

Y182F

D250R

P273L

Q339H

Ergebnisse

78

Substratkonversion, während der Wildtyp zu diesem Zeitpunkt 47 % umgesetzt hatte. Die drei

Mutanten M87V, D250R und Q339H waren in diesem Reaktionsmilieu kaum aktiv und

erreichten nach 120 Stunden Umsätze zwischen 4 und 12 %. Die übrigen Enzyme lagen etwa

im Bereich des Umsatzes des Wildtyp Enzyms.

Abb. 40: Einsatz der

Varianten aus der

Zufallsmutagenese im

wasserarmen Reaktions-

prozess. Der Anteil der

organischen Phase betrug

90 %. Nur die Variante

M87L zeigte unter diesen

Bedingungen einen

höheren Umsatz als das

Wildtyp Enzym.

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80 100 120

Um

satz

(%

)

Reaktionsdauer (h) A

Wildtyp

N7S/K345R

S10R

M87L

M87V

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80 100 120

Um

satz

(%

)

Reaktionsdauer (h) B

Wildtyp

Y182F

D250R

P273L

Q339H

Diskussion

79

4. Diskussion


Bereich der Pharma-, Agrar- sowie in der Aroma- und Duftstoffindustrie6,7 nehmen sie einen

bedeutenden Stellenwert ein. Dies liegt an der Tatsache, dass unerwünschte Enantiomere

eines Moleküls oft abweichende Eigenschaften aufweisen. Beispielweise besitzt Limonen

zwei Enantiomere, wobei die (R)-Form ein orangenartiges Aroma aufweist, während das

(S)-Enantiomer nach Terpentin riecht. Einen besonders hohen Stellenwert nimmt die

Enantiomerenreinheit jedoch in der Pharmaindustrie ein. Der β-Blocker Propranolol ist in

seiner (-)-Form etwa 100fach stärker wirksam als die (+)-Form8, was an der chiralen Natur

seines Rezeptors liegt. Weitere wichtige Beispiele für chirale Wirkstoffe aus der

Pharmaindustrie sind die Progesteron-Rezeptor Antagonisten in der Krebstherapie

(modifizierte Indolsulfonamide)187,188 oder auch 4-Chromenonyl-1,4-dihydropyridin zur Herz-

Kreislauf-Therapie189.

Somit besteht ein wachsender Bedarf an chiralen Alkoholen in der Industrie126. Grundsätzlich

sind diese Bausteine auch durch eine chemische Synthese darstellbar. Die

Produktionsverfahren leiden jedoch sowohl unter niedriger Selektivität als auch unter dem

Einsatz von giftigen und teuren Katalysatoren. Insbesondere kleine, chirale Alkohole wie

2-Butanole sind nur schwer über chemische Prozesse in reiner Form zu synthetisieren. Daher

stellen diese Moleküle interessante Ziele für eine biotechnologische Synthese dar. Speziell

Oxidotransferasen können zur Reduktion der Ketovorstufen eingesetzt werden, bieten

teilweise eine herausragende Selektivität und erfreuen sich daher steigender Beliebtheit40,41.

Dennoch leiden auch biokatalytische Reduktionsreaktionen unter einigen Nachteilen, wie

ungünstigen Gleichgewichtslagen, erschwerter Produktaufreinigung oder instabilen und/ oder

unselektiven Enzymen.

Diese Probleme sollten in dieser Arbeit durch die Entwicklung eines neuen

Biotransformationsverfahrens gelöst werden. Es war geplant, die Produktion von

enantiomerenreinem 2-Butanol durch den Einsatz von hochselektiven Oxidoreduktasen in

einem wasserarmen System durchzuführen. Dadurch könnte die Produktausbeute stark erhöht,

die Aufreinigung erleichtert und die Abfallmenge reduziert werden. Idealerweise sollten auch

neue „smart cosubstrates“ zum Einsatz kommen, welche die Menge an Cosubstrat auf ein

Minimum reduzieren sollten. Der dazu benötigte Biokatalysator musste neben einer

exzellenten Selektivität auch eine enorme Lösemitteltoleranz aufweisen. Unzureichende

Eigenschaften sollten durch Techniken des Protein Engineerings optimiert werden.

Diskussion

80

4.1 Identifizierung eines geeigneten Biokatalysators

Am Anfang der Prozessentwicklung stand die Suche nach einem geeigneten Enzym zur

Reduktion von 2-Butanon. Dabei stellte die geringe Größe des Substrates eine besondere

Herausforderung dar. So handelt es sich um die kleinste vorkommende achirale

Kohlenwasserstoffverbindung ohne zusätzliche Heteroatome. In der Literatur ist lediglich

eine einzige Alkoholdehydrogenase beschrieben, die die Reduktion selektiv katalysiert. Dies

ist die Candida parapsilosis ADH41. Leider ist dieses Enzym nur schwer zu exprimieren und

besitzt keine hohe Lösemittelstabilität. Dennoch belegt es die grundsätzliche Verfügbarkeit

von Katalysatoren, die in dieser Reaktion eingesetzt werden könnten. Im Gegensatz dazu gibt

es eine Vielzahl von ADHs, welche laut Literatur nur eine unzureichende Enantioselektivität

bezüglich des Umsatzes von 2-Butanon aufweisen. Dazu gehören beispielsweise die Enzyme

von Rhodococcus ruber, Saccharomyces cerevisiae, Thermoanaerobium brockii, Thermus

ethanolicus und viele weitere134,161,190–192. Diese Tatsache verdeutlicht die Herausforderung,

die das kleine Substrat an das Enzym stellt.

Um dem Problem angemessen zu begegnen, wurde eine breite Palette an Enzymen auf deren

Fähigkeit zur selektiven Umsetzung des Substrats untersucht. Neben den in der Literatur

beschriebenen Alkoholdehydrogenasen HL-ADH (Horseliver-ADH)28,147,148, LB-ADH

(Lactobacillus brevis-ADH)149–152 und PL-ADH (Parvibaculum

lavamentivorans-ADH)14,153,154 gehörten 21 proprietäre Enzyme der Firma evocatal GmbH

dazu. Zu Beginn wurden diese 24 Enzyme in einem Initial-Screening auf ihre grundsätzliche

Eignung zum Umsatz von 2-Butanon untersucht. Es zeigte sich, dass zwölf der Katalysatoren

einen signifikanten Umsatz erzielten (Tab. 7). Diese dienten als Grundlage für die weiteren

Untersuchungen. Interessanterweise lag der Umsatz in allen Fällen bei Einsatz des GDH-

Regenerationssystems deutlich über dem des 2-Propanol-Regenerationssystems. Dies ist

dadurch zu erklären, dass es sich im ersten Fall nicht um ein Cosubstrat-gekoppeltes, sondern

um ein Enzym-gekoppeltes Regenerierungssystem handelt. Dabei wird ein zweiter

Biokatalysator, hier eine GDH, eingesetzt, um in einer unabhängigen Nebenreaktion unter

Oxidation von Glukose den Cofaktor NAD(P)H zu regenerieren. Somit besteht die Aufgabe

der ADH in diesem Fall nur darin, das Butanon zu reduzieren und nicht, wie im Falle des

Cosubstrat-Systems darin, auch das 2-Propanol zu oxidieren. Weiterhin leidet es unter einem

höheren Prozentanteil an organischer Phase, was die Struktur des Enzyms stören und damit

dessen Aktivität beeinflussen kann.

Die zwölf aktiven Dehydrogenasen wurden daraufhin auf ihre Selektivität untersucht.

Angestrebt wurde dabei, das (S)-Enantiomer zu synthetisieren. Hier spiegelte sich die

Diskussion

81

Problematik des sehr kleinen Substrates in den erzielten Ergebnissen wider (Tab. 9). Nur zwei

der untersuchten Enzyme erreichten die geforderte Selektivität von über 99,5 %. Eines davon

erzielte diese Vorgabe jedoch nur im 2-Propanol Regenerationssystem, womit die

Reproduzierbarkeit in Frage gestellt wurde. Auffällig war dabei, dass in fast allen Fällen die

Produktreinheit der beiden Regenerationssysteme teils stark variierte. Da in den

vorhergehenden Versuchen bereits beobachtet wurde, dass die Systeme auch unterschiedliche

Umsätze erzielten, stellte sich zu diesem Zeitpunkt bereits die Frage, ob die

Enantiomerenreinheit auch abhängig vom generierten Substratumsatz sein könnte.

Das Enzym-Screening beinhaltete auch die Untersuchung der Lösemittelstabilität der

Enzyme, da ein hoher Volumenanteil an organischer Phase im Prozess angestrebt wurde. Die

Auswahl eines geeigneten Katalysators beschränkte sich damit auf lösemitteltolerante ADHs.

Dass diese unter solch harschen Bedingungen zwar meist inaktiviert werden, es aber auch

tolerante Vertreter gibt, wurde in der Vergangenheit beschrieben57,162,169,193,194.

Die Ergebnisse der Experimente bescheinigten insgesamt sechs Enzymen eine ungewöhnliche

Toleranz gegenüber hohen Anteilen an 2-Propanol (3.1.4). Diese lag bei mindestens achtzig

Prozent des Gesamtvolumens. Dennoch wurde ein signifikanter Umsatz erzielt, welcher in

vier Fällen sogar über 90 % lag, auch wenn zu beachten ist, dass die Substratbeladung

lediglich 100 mM betrug (Tab. 10).

Im wasserfreien Medium konnte dagegen kaum noch Aktivität gemessen werden. Lediglich

die PL-ADH und die LB-ADH zeigten unter diesen Umständen einen leichten Umsatz. Grund

für diesen abrupten Aktivitätsverlust im Vergleich zu den vorhergehenden Versuchen lag

wahrscheinlich am Entzug von benötigten Wassermolekülen aus der Enzymstruktur. Diese

dienen als eine Art Schmiermittel und gewährleisten die Elastizität der Strukur. Daher sind sie

für den Ablauf der Katalyse unabdingbar195,196. Der Versuch, die Enzyme durch Zugabe von

Sorbitol während der Lyophilisierung unter diesen Bedingungen zu stabilisieren, führte im

Falle der PL-ADH zum Erfolg. Das Enzym erzielte damit trotz der erneuten Lyophilisierung

einen etwa achtfach höheren Umsatz. Es ist davon auszugehen, dass Sorbitol als sogenanntes

„Lyoprotectant“197 die Struktur vor Wasserentzug schützt. Die genaueren Hintergründe

werden unter 4.3 diskutiert.

Nach dem Screening der Enzympalette stellten sich somit zwei Alkoholdehydrogenasen als

besonders geeignet für die Synthese von (S)-2-Butanol dar. Dabei handelte es sich zum einen

um die PL-ADH, zum anderen um die evo-040.

Die Ergebnisse zeigten, dass die PL-ADH eine ungewöhnlich hohe Lösemitteltoleranz besitzt.

Dies wäre ein großer Vorteil bei der Entwicklung eines wasserarmen Prozesses.

Diskussion

82

Nichtsdestotrotz produzierte das Enzym unter den genannten Bedingungen keine

zufriedenstellende Enantiomerenreinheit (Tab. 9).

Die Alkoholdehydrogenase evo-040 wurde dagegen als einziges Enzym identifiziert, das

einen exzellenten und reproduzierbaren Enantiomerenüberschuss generiert (siehe 4.2). Der ee

belief sich auf > 99,5 % für das (S)-Enantiomer.

Da nach der Prozessentwicklung eine Enzymevolution geplant war, boten sich damit zwei

Herangehensweisen an: Die erste Möglichkeit bestand im Einsatz und der späteren Evolution

der PL-ADH in Richtung einer verbesserten Stereoselektivität, die zweite beruhte auf einer

Nutzung und Evolution der ADH evo-040 in Bezug auf ihre Lösemittelstabilität.

Die Entscheidung fiel letztlich auf die Nutzung der evo-040. Ausschlaggebend dafür war die

Tatsache, dass sich eine Optimierung der Enzymstabilität in der Vergangenheit oftmals

einfacher und erfolgversprechender als die der Selektivität gestaltete. Auch die Tatsache, dass

alle Enzyme außer der evo-040 unter schwankender Produktreinheit litten (4.2), die bisher

nicht erklärt werden konnte, bestärkte diese Entscheidung. Weiterhin ist der Wildtyp der

evo-040 bereits an sich auch schon relativ lösemitteltolerant (Tab. 10).

In Hinblick auf ein kommendes high-throughput Screening der Mutantenbanken war

außerdem von Vorteil, dass sich die Analyse von Enzymaktivitäten wesentlich einfacher

gestaltet als die Bestimmung einer veränderten Selektivität. Im letzteren Fall müsste eine

zeitintensive chromatographische Bestimmung der Enantiomerenreinheit für jede

Enzymvariante durchgeführt werden, während Aktivitäten schnell und parallel im

Photometerassay im 96-well Format durchgeführt werden können.

Somit lässt sich abschließend festhalten, dass eine Enzymevolution der ADH evo-040 sowohl

aus proteinchemischen als auch aus praktischen Gründen bevorzugt wurde.

4.2 Produktracemisierung

Während der Versuche zur Identifizierung eines geeigneten Enzymkandidaten zeigte sich,

dass die Enantiomerenreinheit des Produkts auch unter Nutzung desselben Enzyms teilweise

stark schwankte. Es kam die Vermutung auf, dass es im Laufe der Reaktion zu einer

Racemisierung des Produktes kommt. Diese Problematik könnte die vielversprechenden

Ergebnisse des Enzym-Screenings relativieren und musste daher untersucht werden.

Das Phänomen der Produktracemisierung in ADH-Reaktionen wurde auch von Yang et al.

beobachtet161. In der genannten Arbeit wurde ein Mechanismus vorgeschlagen, welcher

versucht, den Effekt zu erklären.

Diskussion

83

In der vorliegenden Arbeit sollte nun geklärt werden, ob sich der vorgeschlagene

Mechanismus auf die hier untersuchten Biokatalysatoren übertragen lässt, welche weiteren

Faktoren die Racemisierungsgeschwindigkeit beeinflussen könnten, und ob der

vorgeschlagene Mechanismus eventuell erweitert werden kann.

In der Arbeit von Yang et al. wurde die Reduktion von 2-Butanon durch die ADH von

Thermoanaerobium brockii (TB-ADH) untersucht. Erste Umsetzungen ergaben dabei einen

Enantiomerenüberschuss von 55 % für die (R)-Form. Dieser Wert erniedrigte sich jedoch im

Laufe der Reaktion bis hin zu einem racemischen Gemisch. Es wurde gefolgert, dass die

Reduktion des Substrates reversibel ist, und somit ein einmal entstandenes Produkt

rückoxidiert und anschließend erneut reduziert werden könnte. Der Effekt ist schematisch

dargestellt Abb. 41 zu entnehmen. Wie dargestellt, wird davon ausgegangen, dass der

Cofaktor entweder dauerhaft oder zumindest über einen bestimmten Zeitraum mit dem

Substrat verbunden bleibt, wie an anderer Stelle auch belegt wurde198,199. Dadurch entstehen

die Komplexe E●NADPH oder E●NADP+. An diese können nun die Redoxpartner binden,

wodurch die Komplexe E●NADPH●ket(S), E●NADPH●ket(R) und E●NADPH●Aceton

entstehen (bzw. die entsprechenden Gegenpaare). Da die nun folgende Redoxreaktion eine

MPV-Gleichgewichtsreaktion darstellt, findet sie auch im scheinbar ruhenden System ständig

als Hin- und Rückreaktion statt.

Abb. 41: Schematische Darstellung des Reaktionsweges einer ADH-katalysierten Substratreduktion sowie

des beschriebenen Racemisierungseffekts nach Yang et al 161

Um zu verstehen, weshalb die Rückoxidation und damit die Racemisierung erst im Laufe des

Prozesses stattfindet, müssen zwei Situationen im Reaktionsverlauf gesondert betrachtet

werden. Zu Beginn zeigt sich folgendes Bild: Das Substrat 2-Butanon sowie das Cosubstrat

2-Propanol stehen in hohem Überschuss zur Verfügung. Thermodynamisch betrachtet wird

Diskussion

84

ein Gleichgewicht angestrebt, woraus sich eine starke Triebkraft zur Reduktion des Butanols

und zur Oxidation des 2-Propanols ergibt. Das führt zur Bildung von Produkt (2-Butanol) und

Coprodukt (Aceton).

In einem weiter fortgeschrittenen Zustand der Reaktion ergibt sich ein anderes Bild: Als

alkoholische Komponenten stehen nun entstandenes (S)-2-Butanol und (R)-2-Butanol sowie

immer noch 2-Propanol zur Verfügung, welche oxidiert werden können. Reduziert werden

können dagegen 2-Butanon und das entstandene Aceton. Da die anfänglichen

Konzentrationsüberschüsse von Substrat und Cosubstrat nicht mehr vorhanden sind, fehlt die

Gleichgewichtstriebkraft, so dass eine thermodynamisch bedingte Selektion nicht mehr

stattfindet. Damit erfolgt die Oxidation des 2-Propanols nun kompetitiv mit der des

(R)-Butanols und (S)-Butanols.

Während eine Oxidation des Propanols die Stereomerenreinheit des Produkts in der Reaktion

nicht verändert, so ist dies bei der Oxidation eines Enantiomers durchaus der Fall. Da damit

gerechnet werden kann, dass bei einer selektiven Umsetzung ein Enantiomer im Überschuss

vorhanden ist, wird dieses mit höherer Wahrscheinlichkeit rückoxidiert, was nach Yang et al.

zum Racemisierungseffekt führt.

Um zu überprüfen, ob ein ähnlicher Effekt auch bei den Enzymen in der vorliegenden Arbeit

zum Tragen kam, wurde die Stereomerenreinheit des Produkts in Abhängigkeit von der

Reaktionsdauer analysiert. Es ergab sich ein eindeutiges Bild, das eine Racemisierung auch

bei den getesteten ADHs nachwies (Abb. 13). Der Effekt trat sowohl bei (R)- als auch bei

(S)-selektiven Enzymen auf und die Geschwindigkeit der Racemisierung schien

enzymabhängig zu sein. So verlief die Isomerisierung bei der evo-260 beispielsweise deutlich

schneller ab als bei der evo-030 oder evo-270.

Weiterhin wurde ein Einfluss der Cosubstratbeladung auf die Racemisierungsgeschwindigkeit

vermutet161. Dieser Effekt konnte in Versuchen mit der evo-270 nachvollzogen werden

(3.2.5). Wurde dem Reaktionsansatz mehr Cosubstrat zugesetzt, so lief die Racemisierung

stark verlangsamt ab. Unter Hinzunahme der oben erläuterten Hypothese des

Reaktionsablaufs ist dieses Ergebnis verständlich. So wird die Reduktion des Butanons

thermodynamisch kontrolliert durch das Gleichgewicht zwischen Substrat/ Produkt

(2-Butanon/ 2-Butanol) und Cosubstrat/ Coprodukt (2-Propanol/ Aceton). Durch eine

Erhöhung der Cosubstratkonzentration wird die Reaktion in Richtung Coprodukt verschoben

und damit einhergehend auch die Reaktion vom Substrat zum Produkt. Eine Rückreaktion des

Produktes zum Substrat und die damit einhergehende Racemisierung wird somit

unwahrscheinlicher.

Diskussion

85

Weitere Versuche zeigten auch einen Einfluss der Reaktionstemperatur. Umsetzungen bei

50 °C erzielten niedrigere Enantiomerenüberschüsse am Reaktionsgleichgewicht als bei 25 °C

oder 10 °C (Tab. 11). Dieses Ergebnis ist thermodynamisch erklärbar191,192,199–201. So kann die

stereochemische Reinheit einer Substanz als E beschrieben werden, was dem Verhältnis der

Enantiomere enstpricht.

Dabei gilt: E = (R/S) = (kcat/Km)R / (kcat/Km)S (1)

Weiter kann E kinetisch beschrieben werden als Differenz der freien Aktivierungsenergie der

Enantiomere: ∆∆G = -RTlnE (2)

Ist ein Enyzm unselektiv, so ergibt sich aus (2), dass der Unterschied ∆∆G = 0, da E = 1.

Wird ∆G durch die Eyring Aktivierungsparameter dargestell, ergibt sich:

∆∆G = ∆∆H - T∆∆S (3)

Wird nun wieder angenommen, dass ein Enzym unselektiv ist, so ergibt sich aus (2), dass

∆∆G = 0 und damit aus (3):

∆∆H = T∆∆S (4)

Das bedeutet, dass die Beiträge aus Enthalpie und Entropie gleichwertig sind.

Da die Reaktionstemperatur T variabel ist und der Entropiebeitrag ∆∆S von T abhängt, lässt

sich daraus schließen, dass für jede Reaktion im Sinne von (1) gilt, dass eine Temperatur Tr

existiert, unter welcher Gleichung (4) erfüllt ist. Es ergibt sich die „racemische Temperatur“

Tr als:

Tr = ∆∆H / ∆∆S (201) (5)

Dies verdeutlicht die Temperaturabhängigkeit der Reaktion. Bei Temperaturen unter Tr wird

∆∆G (und damit E) durch ∆∆H bestimmt. Bei Temperaturen über Tr wird ∆∆G durch ∆∆H

bestimmt201.

Weitere Experimente zeigten, dass der pH-Wert des Reaktionsmediums ebenfalls einen

Einfluss auf die Stereoisomerenreinheit des Produktes nehmen kann (3.2.3). Auch wenn die

Unterschiede gering waren, erreichte die untersuchte ADH evo-270 bei dem pH-Wert ihrer

größten Stabilität (pH = 7,5) den höchsten ee mit einem Wert von 90 % nach 20 Stunden

Reaktionsdauer. Bei Reaktionen in basischerem oder saurerem Milieu sank die

Produktreinheit leicht ab, auch wenn der gleiche Umsatz erzielt wurde (Tab. 12). Durch diese

Ergebnisse kam die Vermutung auf, dass ein nicht optimales Medium die Enzymstruktur

negativ beeinflussen könnte und dadurch die katalytischen Eigenschaften des Katalysators

verändert.

Diskussion

86

Versuche zur Überprüfung dieser Hypothese widerlegten jedoch diese Annahme (3.2.4). Ein

durch Inkubation (48 Stunden) in Lösemittel „geschädigtes“ Enzym zeigte eine ähnliche

Selektivität wie dasselbe Enzym ohne Vorinkubation.

Diese Ergebnisse zeigten, dass das Enzym auch nach längerer Reaktionsdauer noch dieselben

selektiven Eigenschaften aufweist, wie zu Beginn der Reaktion. Daher erschien es fraglich,

ob, wie von Yang et al.161 vermutet, in erster Linie die Konkurrenz der vorhandenen

Enantiomere um einen freien Enzymkomplex die Racemisierung vorantreibt. Nach dieser

Theorie wäre die Rückoxidation eines bestimmten Enantiomers umso wahrscheinlicher, je

höher dessen Konzentration in der Reaktion ist. Dies erscheint plausibel, da es sich um ein

zufälliges und nicht gelenktes Aufeinandertreffen handelt. Somit würde bei einem Enzym mit

E = 95 % die Rückoxidation des überwiegenden Enantiomers auch mit einer

Wahrscheinlichkeit von 95 % stattfinden (da es sich in 95 %igem Überschuss befindet). Das

zweite Enantiomer würde somit mit einer Wahrscheinlichkeit von 5 % rückoxidiert werden

(in einem rein theoretischen Reaktionszustand, in welchem die Racemisierung beginnt). Das

kann jedoch die Isomerisierung nicht vollends erklären, da gezeigt werden konnte, dass das

Enzym seine Selektivität beständig beibehält. Somit würde das rückoxidierte Produkt in

einem nächsten Reduktionsschritt auch mit 95 % Wahrscheinlichkeit wieder zum präferierten

Enantiomer reduziert werden. Es würde sich somit ein Gleichgewichtszustand ergeben, bei

dem der ee beständig bleibt.

Eine Erklärung, wie es dennoch zur Racemisierung kommen kann, könnte möglicherweise in

der unterschiedlichen Kinetik der zwei Rückoxidationsreaktionen liegen. Die zugehörigen

Versuche zeigten, dass im Falle der evo-270 das (R)-Enantiomer mindestens zehnmal

schneller rückoxidiert wird als die (S)-Form (3.2.6). Dieses Ergebnis ist durchaus

nachvollziehbar, da die Reaktionsgeschwindigkeit nach Arrhenius202,203

= � ×�� ×� (6)

von der Aktivierungsenergie EA abhängig ist, welche für die beiden Enantiomere

unterschiedlich ist191,192,200.

Es lässt sich daraus schließen, dass zwei Tatsachen zur Racemisierung führen: 1) Das

überwiegende Enantiomer wird mit höherer Wahrscheinlichkeit auf einen freien

Enzymkomplex treffen. 2) Unter gleichen Bedingungen wird das überwiegende Enantiomer

mit vielfach höherer Geschwindigkeit als das mengenmäßig unterlegene Enantiomer

rückoxidiert.

Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Reaktionsparameter wie Temperatur, pH-Wert und

Cosubstratkonzentration die Racemisierungsgeschwindigkeit beeinflussen. Die Auswirkungen

Diskussion

87

waren aber eher gering. Die Racemisierung konnte nur durch das Anwenden hoher

Molenbrüche (Cosubstrat/ Substrat) deutlich verlangsamt werden. Allerdings ist dies nur bei

Prozessen mit niedriger Substratbeladung möglich, welche dann allerdings unter

ökonomischer Ineffizienz leiden.

4.3 Enzymstabilisierung in organischem Lösemittel

Die Optimierung der Enzymstabilität ist eine Grundvoraussetzung zur Entwicklung

ökonomischer biokatalytischer Prozesse. Die dabei am häufigsten adressierten Ziele sind eine

verlängerte Lagerstabilität oder eine erhöhte Resistenz gegenüber hohen Temperaturen,

extremen pH-Werten und Lösemitteln.

Die Stabilisierung gegen hohe Konzentrationen an organischem Lösemittel ist dabei

besonders interessant, da der Einsatz solcher Reaktionsmedien einige Vorteile gegenüber der

Arbeit in rein wässrigem Milieu besitzt:

Ein mengenmäßig höherer Einsatz von organischen Lösemitteln erlaubt beispielsweise die

Anwendung höherer Substratbeladungen, was zu besseren Reaktionsausbeuten führen kann.

Im Hinblick auf die Thermodynamik einer Reaktion führen hohe Mengen an Cosubstrat durch

die Verschiebung des thermodynamischen Gleichgewichts in der Regel ebenso zu höheren

Produktausbeuten146. Ein weiterer interessanter Aspekt ist eine erleichterte

Produktaufreinigung, wenn Lösemittel mit niedrigem Siedepunkt eingesetzt werden. Auf den

Reaktionsmechanismus bezogen, unterdrücken niedrige Wasserkonzentrationen unerwünschte

Nebenreaktionen204. Diese Faktoren können die Ökonomie eines Prozesses signifikant

verbessern und ihn damit wettbewerbsfähiger gegenüber klassisch-chemischen Synthesen

machen.

Darüber hinaus existieren auch bestimmte Reaktionen wie Veresterung und Transveresterung,

die eine niedrige Wasseraktivität benötigen, um stattfinden zu können146,205.

Grundsätzlich gibt es verschiedene Techniken, um Proteine zu stabilisieren. Ein Ansatz ist,

die Enzyme mittels Protein Engineering zu optimieren, etwa über gerichtete Evolution oder

durch rationale Methoden83,105. Beispiele dafür sind das Einfügen von Prolin Aminosäuren

oder Disulfidbrücken durch den Austausch flexibler Aminosäuren (hoher B-Faktor) oder

durch Polypeptid Chain Extension 172,206,207.

Eine zweite Stabilisierungsmethode ist die Nutzung chemischer Modifikationen von

Enzymen. Beispiele sind die Monofunktionalisierung durch Aminosäurederivate, Acylierung

Diskussion

88

oder Alkylierung171 oder die Bifunktionalisierung durch verknüpfende Reagenzien wie

Glutaraldehyd oder Diimidate.

Eine dritte und vielgenutzte Technik ist die Immobilisierung von Enzymen. Es handelt sich

um ein sehr beliebtes Verfahren, da weitere Vorteile enstehen208: Es ermöglicht eine leichte

Rückgewinnung des Katalysators, vereinfachte Produktaufreinigung und ein flexibleres

Reaktor-Design.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Stabilisierung von Biokatalysatoren gegen organische

Lösemittel durch den Einsatz von stabilisierenden Additiven untersucht. Diese Methode

wurde früher überwiegend angewendet, um die Lagerstabilität von Enzymen in wässrigen

Medien zu verlängern209,210, oder um Peptide während der Lyophilisierung zu schützen197,211.

Nun sollte jedoch das gelöste Enzymlyophilisat direkt im Reaktionsansatz gegenüber

extremen Reaktionsmilieus stabilisiert werden. Diese Milieus bestanden aus einem

Volumenanteil der organischen Phase von bis zu 90 %. Für die Arbeit wurden fünf Enzyme

(evo-030, evo-040, evo-270, evo-380 und LB-ADH) ausgewählt, die mit verschiedenen

Selektivitäten und Substratspektren eine Bandbreite unterschiedlicher

Alkoholdehydrogenasen abdecken sollten. Die Erhöhung des Reaktionsmaßstabs auf bis zu

vier Liter sollte weiterhin die Anwendbarkeit des Verfahrens für industrielle Zwecke

überprüfen.

Insgesamt wurden 17 Substanzen auf ihr Potential hin untersucht, ADHs in Gegenwart von

organischen Lösemitteln zu stabilisieren. Die Substanzen ließen sich in folgende Gruppen

unterteilen: Polyole, Salze und Polyethylenglykole (PEG) (Tab. 14). Frühere Publikationen

legten offen, dass die Konzentration eines Additivs ausschlaggebend auf dessen

stabilisierenden Effekt wirkt171,172. Daher wurden in einem ersten, groben Screening die

Additive in zwei Konzentrationen eingesetzt. Substanzen, die unter diesen Bedingungen einen

positiven Einfluss auf den Substratumsatz zeigten, wurden anschließend kleinmaschiger auf

ein Konzentrationsoptimum durchmustert. Durch die Anwendung dieses Verfahrens konnte

eine positive Beeinflussung aller fünf Enzyme durch spezifische Additive erzielt werden

(Tab. 16).

Der größte Erfolg konnte dabei mit der evo-380 erzielt werden. Der Umsatz war fast

siebenfach erhöht, wenn der Katalysator mit 0,1 mM PEG4000 stabilisiert worden war. Auch

die ADH evo-030 erreichte eine sehr viel höhere Substratumsetzung. Sie lag bei 360 % im

Vergleich zum ungeschützten Enzym. Die übrigen Enzyme evo-040 und evo-270 und

LB-ADH erreichten Werte von etwa 150 % Umsatz im Vergleich zum ungeschützten Enzym,

womit auch hier von einer erfolgreichen Stabilisierung gesprochen werden kann.

Diskussion

89

Bis heute ist der Einfluss von stabilisierenden Substanzen nicht sicher geklärt. Dabei spielt es

auch eine Rolle, welcher Typ der Stabilisierung adressiert wird. So ist zu unterscheiden, ob

die Additive (i) in der Produktion des Katalysators bei der Lyophilisierung197 (ii), während

der Lagerung zur Erhöhung der Haltbarkeit212 oder (iii) direkt in der Reaktion zur Reduktion

der Enzyminaktivierung168 eingesetzt werden. Die Effekte in der vorliegenden Arbeit sind

dabei der Gruppe (iii) zuzuordnen, da die Substanzen dem Reaktions-Batch direkt zugesetzt

wurden.

Es existieren unterschiedliche Hypothesen, wie die Additive im Reaktionsbatch wirken. Die

am weitesten verbreitete beruht darauf, dass die Substanzen an die Enzymstruktur binden und

dadurch eine Aufrechterhaltung der Hydrathülle bewirken169,213,214. Andere Studien dagegen

ordnen den verschiedenen Klassen der Additive auch unterschiedliche Wirkweisen zu205:

(a) Unspezifische ionische Effekte von Salzen, die an geladene Aminosäuren binden. Dadurch

könnte es zu einem Aussalzeffekt der Proteine kommen, welcher die Steifheit der Struktur

erhöht215. (b) Polyole und Zucker zeigten die Fähigkeiten, hydrophobe Interaktionen von

Aminosäuren zu stärken204. (c) Niedermolekulare Additive führten zu einer bevorzugten

Hydratation von Enymen im Reaktionsmilieu207. Vermutlich entsteht der Effekt durch

Wechselwirkungen der Additive mit dem Proteinrückgrat. Da diese thermodynamisch

ungünstig sind, werden die Additive abgesondert. Dies erhöht die Wasseraktivität des

Mediums und führt zur gewünschten Hydratation des Enzyms216,217. (d) Polymere wie PEG

könnten das Enzym durch unspezifische Wechselwirkungen teilweise aus dem Lösemittel

absondern204,218.

In der vorliegenden Arbeit zeigten alle Enzyme je eine Präferenz entweder für PEG oder für

Zuckeradditive. Keines erzielte mit beiden Additivklassen erhöhten Umsatz. Es ist zu

vermuten, dass dieses Verhalten auch auf andere Alkoholdehydrogenasen übertragbar ist und

die Stabilisatoren somit sehr spezifisch mit den Enzymen interagieren. Nichtsdestotrotz

beantwortet das nicht die Frage, ob die Additive direkt an das Enzym binden und damit die

Hydrathülle aufrechterhalten, welche für die Aktivität unabdingbar ist219, oder ob sie Einfluss

auf die Eigenschaften des Reaktionsmediums nehmen und dadurch nur indirekt auf die

Enzyme wirken204.

Im Gegensatz zu den vorherigen Substanzen wirkte Ammoniumsulfat auf beide Enzymtypen,

auf solche, die von PEG stabilisiert werden und auf solche, die durch Zucker stabilisiert

werden. Dies könnte die Hypothese untermauern, dass Salze wiederum einen anderen

Wirkmechanismus besitzen. Nichtsdestotrotz kann allen Substanzen, die positiven Einfluss

zeigten, eine hygroskopische Eigenschaft zugeschrieben werden. Das würde wiederum dafür

Diskussion

90

sprechen, dass die Additive direkt an die Enzymstruktur binden und dort die Wasserhülle

aufrechterhalten. Dabei kann angenommen werden, dass die enzymspezifische

Oberflächentopologie und –ladungsverteilung die Interaktion mit bestimmten Additivklassen

begünstigt und mit anderen wiederum behindert.

Weiterhin wurden in dieser Arbeit auch Hinweise gefunden, dass ein Zusammenhang

zwischen der Molekülgröße des Additivs und dessen idealer Konzentration besteht. Im Falle

der evo-040 konnte beispielsweise beobachtet werden, dass das Monosaccharid in doppelt so

hoher Konzentration wie das Disaccharid eingesetzt werden musste, um einen optimalen

Effekt zu erzeugen (Tab. 16). Im Falle der evo-030 musste das Monosaccharid sogar in

dreifacher Menge zugefügt werden. Im Vergleich dazu fiel bei der evo-380 auf, dass

kurzkettige PEGs in vielfach höherer Konzentration eingesetzt werden mussten als

langkettige.

Im Falle der evo-040, die zur Prozessentwicklung genutzt werden sollte, konnte durch die

Zugabe von 1 M Sorbitol der Umsatz um 57 % (relativ) erhöht werden. Der

Enantiomerenüberschuss blieb erfreulicherweise exzellent (ee ≥ 99,5 % für (S)-2-Butanol).

Daher wurde diese Stabilisierungstechnik im 1 Liter Reaktionsmaßstab angewendet (3.5.6).

Die Ergebnisse bestätigten die Versuche im Kleinmaßstab, woraufhin eine 4 Liter Reaktion

durchgeführt wurde. Auch diese erzielte den gewünschten Umsatzanstieg. Das Ergebnis

bestätigte die Reproduzierbarkeit der entwickelten Technik.

Es ist davon auszugehen, dass durch den Einsatz dieser Technik die Effizienz des

(S)-2-Butanol Prozesses steigt, wodurch die absolute Abfallproduktion pro generierter Menge

Produkt sinkt. Dies würde neben einer erhöhten ökonomischen Relevanz auch die

Umweltverträglichkeit verbessern.

4.4 Prozessentwicklung

Es stehen bereits chemische Verfahren zur Herstellung von 2-Butanol zur Verfügung. Diese

lassen sich in zwei Gruppen unterteilen. Die erste nutzt die enantioselektive Reduktion von

2-Butanon, die zweite beruht auf einer kinetischen Resolution von racemischem 2-Butanol.

Letztere stellt dabei die derzeit etablierte und industriell bevorzugte Technik zur

enantiomerenreinen Synthese dar43. Atomökonomisch betrachtet leidet dieses Verfahren

jedoch unter einer maximalen Produktausbeute von nur 50 % des eingesetzten Substrats. Um

dieses Problem zu umgehen kann zusätzlich die Technik der in situ Racemisierung eingesetzt

werden, womit die dynamisch-kinetische Racematspaltung erreicht wird. Das erfordert jedoch

den Einsatz von Übergangsmetallkatalysatoren wie Ruthenium in relativ großen Mengen und

Diskussion

91

kann zur Bildung von Esternebenprodukten führen48. Bei der beschriebenen Technik werden

in der Regel Lipasen eingesetzt, wie in Abbildung Abb. 42 dargestellt135.

Abb. 42: Hypothetisches

Verfahren zur dynamisch-

kinetischen Racematspaltung

nach Martín-Matute et al.135

Dies führt zu großen Mengen an Abfallprodukten, da das racemische Substrat verdünnt

werden muss, der beschriebene Rutheniumkatalysator und außerdem ein Acylierungsreagenz

benötigt werden. Das wiederum führt zu einer hypothetischen Produktion an Abfallstoffen

von über 25 kg je Kilogramm Produkt. Die genauen Reaktionsparameter sind jedoch nicht

öffentlich zugänglich (z.B. ChiprosTM, BASF). Ein weiterer Nachteil liegt in der niedrigen

Enantioselektivität vieler Lipasen220–222. Beispiel für einen solchen Prozess beschreibt Patent

US2007/02207529134, welches ein Verfahren zur Synthese von 2-Butanol mittels dynamisch-

kinetischer Racematspaltung beschreibt. Es wird eine Produktreinheit von ≥ 98 % bei einer

Ausbeute von maximal 50 % beschrieben.

Eine Alternative zur kinetischen Racematspaltung wird durch die enantioselektive Reduktion

von 2-Butanon geboten. Diese ist aus atomökonomischer Sicht sinnvoller, da theoretisch eine

Produktausbeute von bis zu 100 % erreicht werden kann. Die chemische Meerwein-Ponndorf-

Verley Reduktion (MPV) liefert allerdings nur eine ungenügende Enantiomerenreinheit und

benötigt ebenfalls Al-, Rh oder Ru-Katalysatoren133. Daher ist an dieser Stelle der Einsatz von

biologischen Katalysatoren interessant. Diese können (abhängig vom Enzym) hochselektiv

ablaufen223–225. Beispiel für ein Verfahren, welches die enantioselektive Reduktion nutzt, wird

in Patent WO 2006/053713 beschrieben40. Das eingesetzte Enzym erreicht dabei einen

Enantiomerenüberschuss von ≥ 98 %. Auch wenn diese Reinheit bereits sehr hoch ist, so

reicht sie für viele Anwendungen, wie etwa im Pharmabereich, nicht aus. Es wird deutlich,

wie schwierig es ist, einen Biokatalysator zu finden, der das sehr kleine Substrat 2-Butanon

enantiomerenrein reduziert. Ein weiterer Nachteil in der Nutzung von Enzymen liegt darin,

dass sie meist nur in wässrigen Reaktionsmilieus aktiv sind. Dadurch können sich azeotrope

Mischungen aus organischen Komponenten mit Wasser bilden, wodurch die

Produktaufreinigung stark erschwert wird, da eine einfache destillative Aufreinigung nicht

Diskussion

92

anwendbar ist. Tab. 25 veranschaulicht die sehr nahe beieinanderliegenden Siedepunkte der

Reaktionskomponenten im 2-Butanol Prozess.

Tab. 25: Mischverhältnisse und daraus resultierende Siedepunkte der Reaktionskomponenten

Komponenten

Mischverhältnis Siedepunkt

Aceton

56,0 °C

2-Butanol/ Wasser

79 %/ 21 % 73,0 °C

2-Propanol/ 2-Butanon 32 %/ 68 % 78,0 °C

2-Butanon

80,0 °C

2-Propanol

82,0 °C

2-Propanol/ Wasser

72 %/ 28 % 88,1 °C

2-Butanol/ Wasser

68 %/ 32 % 88,5 °C

2-Butanol

99,0 °C

Weiterhin leidet dieses Verfahren, wie alle MPV-Reaktionen, unter ihrer Reversibilität und

einer schwachen thermodynamischen Triebkraft.

Die Probleme sollten nun durch den Einsatz von sehr hohen Mengen an Cosubstrat

(2-Propanol) in der Reaktion umgangen werden. Da durch das fehlende Wasser die

Azeotropenbildung unterbunden wird, könnte dies zu einer stark erleichterten

Produktaufreinigung führen. Weiterhin würde das thermodynamische Gleichgewicht auf die

Produktseite verschoben, was zu einer erhöhten Raum-/ Zeitausbeute führt.

4.4.1 Lösemittelstabilität der evo-040

Wie in 4.1 beschrieben, wurde die Alkoholdehydrogenase evo-040 ausgewählt, um einen

biokatalytischen Prozess zur Synthese von enantiomerenreinem (S)-2-Butanol zu entwickeln.

Das Enzym zeigte in den Vorversuchen bereits eine ungewöhnlich hohe Lösemitteltoleranz.

Aktivität konnte bis zum einem Anteil der organischen Phase von bis 80 % nachgewiesen

werden (3.1.4). Eine genauere Charakterisierung der Stabilität des Enzyms offenbarte einen

ungewöhnlichen Effekt: Der erzielte Umsatz des Enzyms sank, wie zu erwarten war, mit

steigender organischer Beladung. Dies ist auf Deaktivierung oder Denaturierung durch das

Eindringen von Lösemittelmolekülen in die Enzymstruktur zu erklären226. Die organischen,

apolaren Moleküle stören dabei intramolekulare Bindungen in der Enzymstruktur und

zerstören damit den Tertiäraufbau. Ab einer bestimmten Lösemittelkonzentration stieg der

Umsatz der evo-040 jedoch wieder an. Ein lokales Umsatzmaximum lag bei 90 %

Gesamtanteil der organischen Phase (Abb. 16). Zwei unterschiedliche Mechanismen könnten

der Grund für diesen Effekts sein: Zum einen führt die sinkende Wasserkonzentration im

Diskussion

93

Medium zu einem Entzug von Wassermolekülen aus der Enzymstruktur. Dadurch wird deren

Starrheit erhöht227–229. Ein Eindringen von Lösemittelmolekülen in die Struktur wird

erschwert und damit die Denaturierung verlangsamt230. Eine andere Theorie ist, dass sich ab

einer kritischen Konzentration die Wassermoleküle im Reaktionsmedium zu Mizellen

zusammenfinden und damit wässrige „Inseln“ bilden, in denen die Proteine akkumulieren und

somit vor dem Lösemittel geschützt sind146.

Das beschriebene Umsatzmaximum bei 90 % organischer Phase wurde ausgenutzt, um einen

Prozess unter diesen Bedingungen zu entwickeln. Weiterhin konnte eine zusätzliche

Stabilisierung der evo-040 unter diesen harschen Bedingungen erreicht werden, wie unter 4.3

beschrieben.

4.4.2 Substratbeladung

Der nächste Schritt der Prozessentwicklung war die Bestimmung der optimalen

Substratbeladung. Es handelt sich um einen kritischen Parameter, da hohe Substratbeladungen

auch eine hohe Produktausbeute ermöglichen. Nachdem die absolute Menge an organischer

Phase jedoch festgelegt war (4.4.1), nahm die Menge an Cosubstrat mit der Zunahme der

Substratkonzentration ab, wodurch die thermodynamische Triebkraft nachließ. Somit musste

ein idealer Mittelwert ermittelt werden, der den höchsten Umsatz gewährleistete.

Es ließ sich anhand der Umsätze erkennen, dass die ADH evo-040 bei allen untersuchten

Beladungen aktiv war (3.6). Da der Gesamtanteil der organischen Phase konstant gehalten

wurde, änderte sich durch steigende Substratkonzentrationen der Molenbruch (2-Propanol/

2-Butanon). Der Umsatz war bei hohen Molenbrüchen und damit niedrigen

Substratbeladungen erwartungsgemäß höher, auch wenn die eingesetzte Enzymmenge die

gleiche blieb. Um aussagekräftige Werte zu erhalten, mussten daher die relativen Umsätze in

absolute Werte umgerechnet werden (Abb. 18-B). Hier zeigte sich, dass niedrigere

Molenbrüche höhere Ausbeuten bewirkten (auch wenn der prozentuale Umsatz geringer war).

Das Optimum wurde ab einer Butanonbeladung von 20 % erreicht.

4.4.3 Zugabereihenfolge der organischen Komponenten

Es konnte festgestellt werden, dass 2-Butanon einen schädlicheren Einfluss auf evo-040

ausübt als 2-Propanol (3.8). Die Inkubation in 2-Propanol vor Reaktionsstart führte sogar zu

einem relativen Umsatzanstieg. Die Inkubation mit 2-Butanon dagegen schien den Prozess

negativ zu beeinflussen. Der Effekt verstärkte sich bei verlängerter Inkubation (5 Minuten).

Diskussion

94

Ein möglicher Grund dafür könnte die höhere Hydrophobizität von 2-Butanon sein176. Es

besitzt einen log P von 0,25, während der von Isopropanol bei 0,17 liegt. Dabei bedeutet ein

höherer Wert für log P auch eine erhöhte Hydrophobizität231. Dadurch besitzt 2-Propanol

möglicherweise eine niedrigere wasserentziehende Wirkung auf das Enzym und wirkt

weniger strukturschädigend. Prozesstechnisch empfiehlt es sich daher, nach der Vereinigung

von Puffer, Cofaktor und Enzym zuerst das 2-Propanol und erst nach kurzer Inkubationszeit

2-Butanon zuzugeben.

4.4.4 Bestimmung des pH-Optimums

Enzyme sind in der Regel nur in einem engen pH-Bereich maximal aktiv und stabil. Dabei

handelt es sich meistens um die H+-Konzentration, die in dem Mikroorganismus vorliegt, aus

dem sie stammen. Liegt der pH-Wert unter oder über diesem Optimum, so leidet die Aktivität

und/ oder Stabilität des Enzyms und damit der zu erwartende Umsatz eines Prozesses. Gründe

dafür liegen in einer pH-bedingten Änderung der Raumstruktur des Enzyms, verursacht durch

Ladungsveränderungen der Aminosäuren sowie deren Seitenketten, und in veränderten

Wechselwirkungen des Enzyms mit dem Reaktionsmedium. Das kann bis zur Denaturierung

führen, wodurch das Enzym irreversibel inaktiviert wird. Daher ist es für Reaktionen

unabdingbar, das pH-Optimum des eingesetzten Biokatalysators zu kennen.

Die ADH evo-040 zeigte den höchsten Umsatz bei einem pH-Wert von 7,0 (Abb. 19). Eine

minimal erniedrigte Produktausbeute war laut GC-Messung im pH 7,5-Ansatz zu erkennen.

Dieser Unterschied könnte jedoch auf Reaktionsungenauigkeiten zurückzuführen sein. Solche

entstehen durch eine ungenaue Einwaage des Enzymlyophilisats oder durch

Pipettierabweichungen bei der Zugabe der Reaktionskomponenten. Auch die

gaschromatographische Bestimmung der Edukt- und Produktmenge zeigte leichte

Schwankungen (≤ 1 %), die zu Ungenauigkeiten führen können. Relevante Umsatzverluste

konnten erst bei pH 6,5 und 8,0 beobachtet werden, so dass hier die Grenze der pH-Toleranz

der evo-040 anzusetzen war.

4.4.5 „smart cosubstrates“

Auf den Einsatz der neuen „smart cosubstrates“182,232 musste in diesem Prozess leider

verzichtet werden. Grund dafür war die mangelnde Akzeptanz der ADH evo-040 für die

untersuchten Cosubstrate (3.9). Nichtsdestotrotz konnte für andere Enzyme die grundsätzliche

Anwendbarkeit und der Nutzen des Regenerierungssystems verdeutlicht werden. In

Reaktionen zur Reduktion von Carbonylverbindungen und Kohlenstoffdoppelbindungen oder

Diskussion

95

der aromatischen Hydroxylierung konnte gezeigt werden, dass die diolischen Cosubstrate wie

1,4-Butandiol in halbäquimolaren Mengen bereits zum Vollumsatz führten182. Weiterhin

stellen die generierten Coprodukte an sich auch schon wertvolle Synthesebausteine dar und

könnten die Ökonomie von Bioreduktionen stark erhöhen232.

4.4.6 Prozess Up-scaling

Die erfolgreichen Versuche zur Identifizierung der optimalen Reaktionsparameter ließen auf

die Entwicklung eines erfolgreichen Prozesses zur Synthese von (S)-2-Butanol im

wasserarmen Reaktionsmilieu hoffen.

Die Alkoholdehydrogenase evo-040 wurde als Biokatalysator ausgewählt, da sie als einziges

Enzym einen stabilen Enantiomerenüberschuss ≥ 99,5 % lieferte. Weiterhin konnte gezeigt

werden, dass die Katalyse bei einem Gesamtvolumenanteil φ(organische Phase) = 90 %

durchgeführt werden kann, da das Enzym in diesem Bereich ein lokales Aktivitätsmaximum

besitzt. Die optimale Substratbeladung wurde auf 20 % festgelegt und darüber hinaus ein

Protokoll entwickelt, welches den Katalysator im wasserarmen Milieu stabilisiert. Weitere

Parameter wie der optimale pH-Wert und die beste Komponentenzugabereihenfolge wurden

ebenfalls festgelegt.

Als nächstes musste die Durchführbarkeit des Prozesses im größeren Maßstab bewertet

werden. Für die 1 Liter Reaktion wurden 5 g Lyophilisat benötigt (3.10.1). Erfreulicherweise

produzierte E. coli kein Enzym, das durch eine Hintergrundaktivität den Prozess negativ

beeinflusste (z.B. bezüglich der Enantiomerenreinheit des Produkts), wie es in ähnlichen

Prozessen vorkommen kann233. Daher konnte das Lyophilisat aus Zellrohextrakt gewonnen

werden. Mit einer Lyophilisatbeladung von 5 g/l, was einer Aktivität von 2,5 kU je Liter

entspricht, scheint die eingesetzte Menge an Enzym hoch zu sein, liegt jedoch im Rahmen

vergleichbarer Biotransformationen38,40,41,134. Die Reaktion lief erfolgreich und in einer

Quantität ab, welche der der Vorversuche entsprach (3.10.2). Die Hälfte des eingesetzten

Substrats war nach 62 Stunden umgesetzt (Abb. 25). Der Prozess wurde nach 150 Stunden

beendet, auch wenn die Reaktion noch nicht am thermodynamischen Gleichgewicht

angekommen war. Jedoch sank die Umsatzgeschwindigkeit stark ab, wahrscheinlich aufgrund

einer langsamen Inaktivierung des Enzyms. Zum Ende der Reaktion wurde ein Umsatz von

etwa 60 % bestimmt. Das entspricht einer Gesamtproduktmenge von 120 ml. Eine chirale

GC-Analytik bestätigte weiterhin eine Reinheit von ≥ 99,5 % des (S)-Enantiomers. Mit einer

Gesamtreaktionsdauer von 62 Stunden liegt der Prozess etwas über dem Rahmen

vergleichbarer Biokonversionen. So wird in EP174513441 von einem 70 %igen Umsatz nach

Diskussion

96

maximal 48 Stunden berichtet. Aus Patent WO2006/05371340 sind keine genauen Angaben

über die Reaktionsdauer zu entnehmen, wobei schematisch dargestellt wird, dass 400 mM

2-Butanon nach 30 Stunden voll umgesetzt werden. Der in der vorliegenden Arbeit

entwickelte Prozess erreicht jedoch mit einer Substratkonzentration von etwa 2200 mM eine

weit höhere Eduktbeladung, was die Vergleichbarkeit mit Patent WO2006/053713

erschwert40.

Nach der Durchführung der Reaktion konnte der Prozess weiterhin erfolgreich auf den 4 Liter

Maßstab übertragen werden. Es traten keine Probleme auf und die Produktausbeute war im

Rahmen der vorherigen Experimente. Dadurch konnte gezeigt werden, dass der Prozess

reproduzierbar in einen größeren Maßstab übertragen werden kann. Es ist anzunehmen, dass

auch die Übertragung in noch höhere Volumina unproblematisch verlaufen sollte.

Es lässt sich zusammenfassend sagen, dass je Liter Reaktionsansatz insgesamt 120 ml

Produkt gewonnen werden konnten. Das entspricht hochgerechnet einer Generierung von

etwa 7 kg Abfall pro Kilogramm Produkt. Damit stellt das hier entwickelte System (neben

ökonomischen Vorteilen) ein wesentlich umweltfreundlicheres Verfahren zur Synthese von

(S)-2-Butanol im Vergleich zu dem oben beschriebenen (25 kg Abfall pro Kilogramm

Produkt) dar.

4.4.7 Produktaufreinigung

Auch wenn bereits ein Prozess etabliert wurde, in dem der Wasseranteil auf nur 10 %

erniedrigt war, stellte dieser Wert immer noch ein Problem bei der Aufreinigung des Butanols

dar. Durch die Anwendung der Azeotroprektifikation konnte das Problem gelöst werden.

Allerdings verlangte dies den Einsatz von großen Mengen an Cyclohexan im destillativen

Reinigungsschritt, was die Umweltbilanz der Reaktion zu verschlechtern drohte. Es zeigte

sich jedoch, dass während der Aufreinigung (3.11.3) 75 % des eingesetzten Cyclohexans

hochrein rückgewonnen werden konnten (375 ml von 500 ml, Tab. 18). Dennoch steigt die

Abfallmenge um etwa 2,5 kg je Kilogramm Produkt auf nun insgesamt 9,5 kg Abfall/

Kilogramm Produkt an.

Doch auch damit liegt das Verfahren noch deutlich unter den errechneten 25 kg an Abfall in

ähnlichen Prozessen. Es muss jedoch betont werden, dass die genauen Kennzahlen der

konkurrierenden Synthesewege der Geheimhaltung unterliegen und hier deshalb mit

hypothetischen Werten gerechnet werden muss.

Während der Produktaufreinigung zeigte sich auch, dass ein großer Teil des 2-Propanols

rückgewonnen werden konnte. Von den enthaltenen 210 ml 2-Propanol (gaschromatograpisch

Diskussion

97

bestimmt) konnten 59 ml hochrein isoliert werden und würden somit theoretisch aus der

Abfallberechnung entfallen. Es ist jedoch davon auszugehen, dass auch Vergleichsprozesse

durch eine solche Rückgewinnung ihre absolute Abfallgenerierung senken. Da die genauen

Kennzahlen jedoch leider nicht bekannt sind, wurde die Rückgewinnung von

Reaktionskomponenten aus der Berechnung ausgenommen.

Abschließend lässt sich festhalten, dass die komplette Produktmenge mittels Destillation über

eine Füllkörperkolonne rückgewonnen werden konnte. Die chemische Reinheit betrug

99,95 %, der Enantiomerenüberschuss ≥ 99,5 % und der Wassergehalt nach Karl-Fischer-

Titration 0,3 %. Es kann somit zusammengefasst werden, dass mit einer Produktausbeute von

120 ml (S)-2-Butanol je Liter Reaktionsansatz ein überaus ökonomisches Verfahren

entwickelt wurde. Auch aus ökologischer Sicht scheint es vergleichbare Synthesen zu

übertreffen, wobei hier nur mit hypothetischen Werten gerechnet werden konnte.

4.5 Enzymoptimierung

Die Natur stellt eine riesige Anzahl an Enzymen zur Verfügung, die zur Entwicklung von

Bioprozessen genutzt werden können. Dadurch ergibt sich auch ein sehr großes Spektrum an

Reaktionen, die katalysiert werden, und an Substraten, die umgesetzt werden. Allerdings sind

diese nativen Enzyme durch natürliche Evolution meist hochspezifisch an physiologisch

relevante Reaktionen adaptiert104. Anforderungen, wie sie in chemischen Synthesen gestellt

werden, können daher meist von den natürlichen Enzymen nicht erbracht werden. So sind sie

entweder nicht stabil genug, um den harschen Reaktionsbedingungen standzuhalten, oder die

gewünschte Umsetzung liegt außerhalb ihres Substrat- oder Selektionsspektrums. Daher

nimmt die Optimierung eines Enzyms einen immer höheren Stellenwert in der

Prozessentwicklung ein. Dies spiegelt sich auch in der wachsenden Zahl an Unternehmen

wider, die sich auf Enzymevolution spezialisiert haben78–80,234.

Das Verändern und Optimieren eines nativen Enzyms wird unter dem Oberbegriff Protein

Engineering zusammengefasst. Dabei werden durch Mutagenesearbeiten neue Varianten

bekannter Enzyme entwickelt, um deren Eigenschaften zu verändern. Das Vorgehen dabei

lässt sich in a) rationales Engineering (bzw. semi-rationales Engineering) oder b) gerichtete

Evolution unterteilen96–102. Angriffspunkte sind dabei, wie schon angesprochen, die

Enzymselektivität57,97,103, -aktivität239–242 und –stabilität83,84,243–245, wobei die Wahl der zu

verändernden Eigenschaft auch die Wahl der Mutagenesetechnik beeinflusst. So hat sich

beispielsweise zur Erhöhung der Selektivität die Methode des CASTings14,206,246 (neben

anderen) bewährt.

Diskussion

98

Um den in dieser Arbeit entwickelten Prozess zur Synthese von (S)-2-Butanol weiter zu

optimieren, sollte auch die Alkoholdehydrogenase evo-040 durch Techniken des Protein

Engineerings effizienter gemacht werden. Da sie bereits über eine hervorragende Selektivität

verfügt, waren die Angriffspunkte für eine Optimierung eine Erhöhung der Enzymstabilität

oder der –aktivität. Dazu wurden drei Ansätze verfolgt:

A) Rationale Proteinentwicklung: Die Idee bestand darin, dass die Integration von

Disulfidbrücken stabilisierenden Einfluss auf die Proteinstruktur nehmen könnte. Die

Anwendung eines solchen Verfahrens führte bereits in der Vergangenheit zur erfolgreichen

Stabilisierung verschiedener Enzyme107,185,247,248. Um die Etablierung solcher Brücken zu

bewerkstelligen, mussten je Variante zwei Aminosäureaustausche mittels QuikChange-

Mutagenese durchgeführt werden. Diese Aminosäuren wurden durch Cysteine ersetzt, die

dank ihrer räumlichen Lage dazu fähig waren, zusammen eine Disulfidbrücke auszubilden.

Auf diese Weise sollten mehrere Varianten entwickelt und anschließend charakterisiert

werden.

B) Semi-rationale Proteinentwicklung: In der Vergangenheit wurde eine hohe Anzahl von

Studien zur Optimierung von Biokatalysatoren veröffentlicht14,83,85,236,249,250. Das dadurch

generierte Wissen und Verständnis der Einflussnahme von Mutationen auf die

Enzymcharakteristika kann genutzt werden, um abzuschätzen, ob Mutationen in

strukturverwandten Enzymen auch zu verbesserten Eigenschaften führen könnten. Ein solcher

Algorithmus wird beispielsweise von dem Bioinformatikprogramm „Bio-Prodict 3DM“

eingesetzt (https://www.bio-prodict.nl/). Es wurde in dieser Arbeit verwendet, um

Aminosäureaustausche vorherzubestimmen, die vorteilhaft sein könnten, da sie in homologen

Proteinen zu verbesserten Eigenschaften geführt haben. Die so bestimmten Aminosäuren

sollten durch Sättigungsmutagenese mittels QuikChange-Technik ausgetauscht und die

Enzymvarianten im Anschluss charakterisiert werden.

C) Zufallsmutagenese: In diesem Ansatz sollten durch das Anwenden der error-prone PCR

Technik111 zufällig Mutationen in die DNA-Sequenz der Alkoholdehydrogenase evo-040

eingeführt werden. Im Gegensatz zum rationalen Design sind hierbei keine Kenntnisse über

die Struktur des Enzyms erforderlich. Die generierten Mutanten werden in einem high-

throughput-Verfahren auf verbesserte Eigenschaften durchmustert und die Gensequenz dieser

Diskussion

99

Varianten im Anschluss aufgeklärt. Diese Methode wurde bereits erfolgreich zur Optimierung

verschiedener Eigenschaften von Enzymen eingesetzt95,236,251,252.

4.5.1 Rationales Proteindesign durch den Einbau von Disulfidbrücken

Zur Identifizierung von Aminosäurepositionen, die theoretisch im Stande sind,

Disulfidbrücken auszubilden, wurde das Programm „Disulfide by Design Version 1.2“

(http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD/) genutzt185. Anhand eines Proteinstrukturmodells

durchmustert das Programm alle Aminosäure-Paare bezüglich ihrer räumlichen Lage und

Ausrichtung und bewertet daran (angenommen die Aminosäuren würden durch Cysteine

substituiert werden), ob stabile Disulfidbrücken ausgebildet werden könnten.

Um die Berechnungen durchzuführen, wurden im Vorfeld zwei Homologiemodelle der ADH

evo-040 erstellt. Dazu wurde zum einen das Programm „Swiss-Model“

(http://swissmodel.expasy.org/)92,186, zum anderen das Programm „CPHmodels-3.2“

(http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/“)93 genutzt.

Das Programm „Swiss-Model“ wählte das PDB template 1rjw Chain A zum Modellieren aus

(Auflösung 2,34 Å). Es besitzt mit einer Sequenzidentität von 50 % ausreichende Homologie,

um eine zuverlässige Struktur berechnen zu können. Der QMEAN Z-score des

Homologiemodells wurde mit -1,86 angegeben und kann somit als „good model“ klassifiziert

werden253.

„CPHmodels-3.2“ nutzte zur Modellierung das template 4eez Chain B. Es besitzt eine höhere

Sequenzidentität von 64,5 % und eine Auflösung von 1,9 Å. Damit weist es sehr gute

Voraussetzungen auf, um ein verlässliches Homologiemodell zu entwickeln. Daten zur

Qualität der berechneten Struktur wurden nicht angegeben.

Die beiden erstellten Homologiemodelle zeigten untereinander eine sehr hohe

Strukturübereinstimmung. Die Proteinrückgrate ließen sich übereinanderlegen (Abb. 43) und

zeigten auch in Bereichen des random coils nur geringe Abweichungen.

Diskussion

100

Abb. 43: Schematische

Übereinanderlegung des

Proteinrückgrats der beiden

erstellten Homologiemodelle von

evo-040. Schwarz dargestellt ist die

Struktur, die durch das Programm

„Swiss-Model“ berechnet wurde.

Grau dargestellt ist jene, die durch

„CPHmodels-3.2“ entstand. Die

Abbildung wurde mit Hilfe der

Programme „DeepView - Swiss-

PdbViewer“ (http://spdbv.vital-

it.ch/)186 und „POV-Ray 3.7“

(http://www.povray.org/) erstellt.

Die erstellten Modelle wurden in das Programm „Disulfide by Design Version 1.2“

eingepflegt. Dieses berechnete eine Vielzahl möglicher Positionspaare, die theoretisch zur

Ausbildung einer Schwefelbrücke imstande wären. Unter Berücksichtigung des idealen

Torsionswinkels χ3, welcher bei +100° oder -80° liegt254, und der berechneten Energiewerte

der Disulfidbrücken, wobei hier niedrige Werte bevorzugt wurden, fand eine Selektion von

insgesamt sechs Positionspaaren statt (Tab. 19).

Die Doppelmutanten wurden mittels QuikChange-Mutagenese erstellt. Allerdings zeigte sich,

dass die Aminosäureautausche dazu führten, dass sich vier der Varianten überhaupt nicht

mehr und die übrigen zwei schlechter als der Wildtyp in löslicher Form exprimieren ließen.

Es ist zu vermuten, dass die Austausche die Ausbildung der intakten Tertiärstruktur so weit

störten, dass sich die Proteine nicht mehr korrekt falten konnten. Ein Hinweis darauf war auch

in der Analyse der unlöslichen Zellbestandteile zu finden. Das SDS-Gel (Abb. 27) zeigte

starke Banden auf Höhe des Zielproteins - auch in den Stämmen, die kein lösliches Protein

mehr produzierten.

Die Varianten SSB5 und SSB6 (welche sich in löslicher Form exprimieren ließen) zeigten

jedoch bei näherer Charakterisierung schlechtere Eigenschaften als das Wildtypenzym. In

beiden Fällen war sowohl die Hitzestabilität als auch die maximale Umsatzgeschwindigkeit

Vmax teils stark erniedrigt (Abb. 28 & Abb. 29). Es lässt sich daher auch hier vermuten, dass

die eingebrachten Mutationen zu einer Fehlfaltung der Tertiärstruktur führten. Dies könnte die

sowohl niedrige Stabilität als auch Aktivität erklären.

Diskussion

101

4.5.2 Semi-Rationales Proteindesign mittels „Bio-Prodict 3DM“

Grundlage des semi-rationalen Engineerings war die 3DM-Datenbank

(https://www.bio-prodict.nl/). Das 3DM-Tool analysiert und kategorisiert einen Großteil der

online verfügbaren Wissenschaftsliteratur. Dabei durchmustert ein automatisierter

Algorithmus die publizierten Daten nach Enzym-Mutationsstudien. Solche Mutationen

werden in der Datenbank zusammen mit Informationen über die veränderten

Proteineigenschaften abgelegt. Wird das 3DM-Tool für die Planung eines neuen Engineerings

eingesetzt, so wird das zu optimierende Protein mit dieser Datenbank abgeglichen.

Zur Analyse der ADH evo-040 wurde die Aminosäuresequenz des Enzyms in die Software

eingepflegt. Mit dieser Information wurde ein dreidimensionales Strukturalignment

durchgeführt, bei dem die evo-040 mit allen hinterlegten strukturhomologen Enzymen

verglichen wurde. Die in der Datenbank hinterlegten Mutationsstudien wurden auf die

Struktur der ADH übertragen. Damit konnten Vorschläge generiert werden, welche

Aminosäureaustausche vorteilhaft sein könnten, da sie in homologen Proteinen zu

verbesserten Eigenschaften geführt haben.

Durch den Einsatz dieses Verfahrens identifizierte die Software 15 Positionen der ADH

evo-040, die in homologen Proteinen für die Enzymstabilität verantwortlich zu sein schienen.

Durch die Analyse der zugehörigen Publikationen konnten vier der Vorschläge als

Fehlinterpretationen identifiziert werden. Die übrigen elf Positionen wurden als Teil von

Mutationsstudien bestätigt, die das Engineering von homologen Enzymen beschreiben (Tab.

20)108,255–261.

Diese elf Positionen wurden mittels QuikChange-Technik und degenerierter Primer (nnk)

sättigungsmutagenisiert. Es entstanden Banken aus je 200 Klonen pro Position. Ein high-

troughput Screening identifizierte aus diesen Banken fünf Varianten, die in den angewandten

Assays besonders positiv abschnitten. Dabei muss beachtet werden, dass je Bank maximal 1

verbessertes Enzym ausgewählt wurde. Es kann vermutet werden, dass Banken, aus denen ein

verbessertes Enzym gewonnen werden konnte, auch über weitere Varianten verfügten, welche

zwar besser als der Wildtyp abschnitten, jedoch hinter den Ergebnissen der besten Variante

zurücklagen.

Die fünf Enzymvarianten trugen die Mutationen N9G, A12Q, V240N, V243G und D250W.

Zwei davon (N9G und V240N) stachen durch ihre erhöhte Temperaturstabilität von etwa

2 - 3 °C heraus (3.13.2). Dieser Anstieg bezieht sich dabei auf jene Temperatur, die zu einer

50 %igen Inaktivierung des Enzyms führte. Die beobachteten Stabilitätssteigerungen lagen in

dem zu erwartenden Bereich262. Die übrigen Enzyme dagegen waren instabiler als der

Diskussion

102

Wildtyp. Allerdings zeigten zwei dieser instabileren Varianten eine verbesserte

Maximalumsatzgeschwindigkeit. Sie lag bei 149 % (A12Q) beziehungsweise 189 %

(D250W) im Vergleich zum nativen Enzym (Tab. 23).

Dies spiegelte sich auch in den daraufhin durchgeführten Prozessversuchen wieder. Im

wasserreichen Medium stach die Variante D250W besonders heraus und erreichte das

thermodynamische Gleichgewicht bereits nach 20 Stunden, während dieses vom Wildtyp

auch nach 50 Stunden noch nicht erreicht war (Abb. 33). Die übrigen Varianten zeigten im

Prozess nur leichte Verbesserungen. So war der Umsatz nach 50 Stunden in allen Fällen um

etwa 4 % erhöht. Interessanterweise zeigte Variante V243G trotz ihrer erniedrigten

Maximalumsatzgeschwindigkeit am Ende der Reaktion einen höheren Umsatz als der

Wildtyp. Anscheinend besitzt dieses Enzym eine höhere Stabilität gegenüber diesem

Reaktionsmilieu. Dieses Verhalten war aus den vorhergehenden Untersuchungen zur

Temperaturstabilität nicht ersichtlich.

Unter realen, wasserarmen Prozessbedingungen stellten sich die zwei Varianten D250W und

A12Q als besonders geeignet heraus (Abb. 34). Dabei ist zu beachten, dass in diesen

Versuchen auf die entwickelte Sorbitolstabilisierung verzichtet wurde, um die Eigenschaften

der Enzyme nicht zu beeinflussen. Interessanterweise waren hier die besten Varianten auch

jene, die die höchste Maximalumsatzgeschwindigkeit besaßen. Leicht erhöhte Umsätze

konnten noch von den Varianten N9G und V243G erzielt werden, wobei es sich bei N9G um

eine temperaturstabile Variante handelt. Die stabile Variante V240N erreichte im

wasserarmen Prozess jedoch den mit Abstand schlechtesten Umsatz.

Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen schließen, dass die erhöhte

Temperaturstabilität in einem der beiden Fälle anscheinend auch Vorteile im

lösemittelreichen Milieu mit sich brachte (N9G), während dies für das zweite stabilere Enzym

nicht der Fall war (V240N). Weiterhin zeigte sich, dass die Enzyme mit höchster

Maximalumsatzgeschwindigkeit auch im wasserarmen Prozess den höchsten Umsatz

erzielten. Dies scheint naheliegend, da die Substratbeladung mit 20 Volumenprozent sehr

hoch war und damit die Maximalgeschwindigkeit auch zum Tragen kam.

4.5.3 Zufallsmutagenese mittels epPCR

Bei der Zufallsmutagenese werden Mutationen über das gesamte Gen auf zufällige Art

eingebracht und anschließend die generierten Varianten auf verbesserte Eigenschaften

durchmustert. Eine mögliche Technik zum Einfügen der zufälligen Mutationen ist die error-

prone PCR, welche hier Anwendung fand113,114.

Diskussion

103

Durch die Wahl der angemessenen Konzentration an MnCl2 konnte die Mutationsrate so

eingestellt werden, dass pro Kilobase im Durchschnitt 1,2 Basenaustausche stattfanden, was

ähnlichen Studien entspricht117. Damit wurde je Enzymvariante im Durchschnitt etwa auch

ein Aminosäureautausch erzielt (Abb. 44). Versuche mit höherer Fehlerrate von 13

Basenfehlpaarungen pro Kilobase wurden ebenfalls durchgeführt. Allerdings waren 86 %

dieser generierten Mutanten inaktiv.

Die Sequenzierung von 50 zufällig ausgewählten Mutanten konnte genutzt werden, um die

Qualität der Banken zu beurteilen. Dabei ist zu beachten, dass die geringe Anzahl von 50

Sequenzen keinesfalls einen statistisch abgesicherten Nachweis, sondern lediglich einen

groben Einblick erbringen kann. Es konnte gezeigt werden, dass es eindeutig präferierte

Bereiche in der Gensequenz gibt, die bevorzugt der Mutagenese unterliegen (Abb. 44), wie

auch in ähnlichen Studien beschrieben118. So wurden etwa doppelt so viele Mutationen im

Bereich 201-300 und 401-500 gefunden wie im Bereich 701-800 oder 901-1000. Dennoch

wurden die Mutationen über den gesamten Sequenzbereich in einem solchen Maße

eingebracht, dass kein Bereich komplett herausfiel. Weiterhin wurde auch gezeigt, dass A↔T

Transversionen die am häufigsten auftretenden Basenaustausche waren. Das stimmt mit

ähnlichen Studien überein, die von einer Häufigkeit der A↔T Transversionen von 40,9 %

berichten117,118. Überraschend hoch dagegen war die Anzahl der A→G Transitionen, wobei

dies auch an der geringen Anzahl an sequenzierten Genen gelegen haben könnte.

Diskussion

104

Abb. 44: Charakterisierung

von 50 Sequenzen der ADH-

Mutanten. 8 % der Sequenzen

trugen einen defekten open

reading frame aufgrund von

frame shifts oder eingefügten

STOP Tripletts. A) A↔T

Transversionen traten am

häufigsten auf, G↔C

Transversionen dagegen

überhaupt nicht. Das Auftreten

von A→G Transitionen war

ungewöhnlich hoch. B) Es zeigte

sich, dass die

Nukleotidaustausche über den

gesamten Genbereich eingefügt

wurden, wenn auch einige

Bereiche bevorzugt wurden.

Das folgende high-troughput Screening der generierten Variantenbänke erbrachte insgesamt

acht Enzymvarianten, die entweder im Hitzeschock- oder im Lösemittelassay eine höhere

Restaktivität besaßen als der Wildtyp (Abb. 35). Auffällig dabei war, dass kein direkter

Zusammenhang der Ergebnisse der beiden Assays hergestellt werden konnte. So war Variante

M87V beispielsweise im Hitzeschock-Assay besonders stabil, während sie nach

Lösemittelinkubation die niedrigste Restaktivität aller Enzyme aufwies. Die einzige

Ausnahme bildete das Enzym P273L, welches sowohl hitze- als auch lösemittelstabiler zu

sein schien.

Daraufhin wurden die Enzyme parallel zu den Versuchen der 3DM-Varianten als Lyophilisat

produziert und genauer charakterisiert. Bei der Untersuchung der Hitzestabilität zeigte sich

1 - 100

101-200

201-300

301-400

401-500

501-600

601-700

701-800

801-900

901-1000

- 5 10 15

Gen

bere

ich

(Nuk

leot

ide)

Mutationswahrscheinlichkeit (%)B

AA T G C

A - 10 4 0

T 10 - 3 2

G 14 6 - 0

C 4 6 0 -

Wildtyp-Anteil: 21 %

Durchschnitt Nukleotidaustausche: 1,2 / 1 kB

Durchschnitt Aminosäureaustausche: 0,29 / 100 AS

Silent mutations: 34,4 % aller AS Mutationen

Frame shifts: 3,3 % aller AS Mutationen

Transversionen: 57 %

Transitionen: 43 %

UrsprungM

uta

tion

Diskussion

105

ein anderes Bild als im Deepwell-Assay (Abb. 37). Auch jetzt waren zwar die Varianten

P273L und M87L deutlich stabiler als der Wildtyp, allerdings zeigten die Mutanten D250R

und M87V eine deutlich herabgesetzte Stabilität im Vergleich zu den high-troughput

Ergebnissen (Abb. 35). Dies lässt sich eventuell durch den veränderten Maßstab erklären. So

fanden im high-troughput Screening alle Schritte - von der Zellanzucht über die

Enzymexpression bis zur Aktivitätsbestimmung - im 1 ml Maßstab statt. Bei einem solch

kleinen Volumen können Ungenauigkeiten wie Pipettierfehler, Temperaturabweichungen

oder ungenügendes Vermischen einen wesentlich größeren Einfluss nehmen als bei einem

größeren Volumen. Daher ist anzunehmen, dass die Ergebnisse der Charakterisierung in

größerem Maßstab verlässlicher sind.

Nach diesen Ergebnissen waren nur die Varianten P273L und M87L hitzestabiler als das

Wildtyp-Enzym. Die beobachtete Stabilitätssteigerung lag bei 1 – 2 °C und damit in dem zu

erwartenden Bereich262. Besonders interessant war, dass mit der Aminosäure M87

anscheinend eine besonders signifikante Position bezüglich der Stabilität aufgedeckt wurde.

So war die Mutante M87V wesentlich instabiler als der Wildtyp, M87L dagegen deutlich

stabiler (Abb. 37). An dieser Position wäre somit eine Sättigungsmutagenese besonders

interessant, um die optimale Aminosäurebesetzung zu identifizieren.

Bei der Bestimmung der Maximalumsatzgeschwindigkeit zeigte sich, dass fast alle Varianten

eine deutlich höhere Vmax aufwiesen als der Wildtyp (Tab. 24). Lediglich die zwei Enzyme

M87V und P273L waren diesbezüglich schlechter als der Wildtyp. Besonders positiv stach

die Mutante M87L mit einer Umsatzgeschwindigkeit von 1336 mU/mg Protein heraus (188 %

im Vergleich zum Wildtyp). Erneut zeigte sich die Bedeutung der Position M87. So war die

Mutante M87V schwächer aktiv als der Wildtyp, M87L dagegen stark aktiviert.

Die hohen Maximalumsatzgeschwindigkeiten spiegelten sich auch in den daraufhin

durchgeführten Prozessversuchen wider. Im wasserreichen Reaktionsmedium erreichten drei

der Mutanten nach knapp 50 Stunden das thermodynamische Gleichgewicht, während dies

vom Wildtyp auch nach 120 Stunden nicht erreicht wurde (Abb. 39). Die zwei Enzyme

P273L und M87V waren dagegen schwächer aktiv als der Wildtyp, was im Einklang steht mit

den gemessenen, sehr niedrigen Maximalumsatzgeschwindigkeiten. Auch die Variante

D250R erreichte nicht das Wildtypniveau. Dies ist durch die vorherigen Versuche nicht zu

erklären, da sie sowohl eine gute Stabilität als auch eine sehr hohe Aktivität aufwies.

Möglicherweise ist diese Variante besonders anfällig gegenüber einer Inaktivierung in dem

angelegten wässrig-organischen Reaktionsmilieu (Volumenanteil der organischen

Phase = 10 %).

Diskussion

106

Anschließend wurden die Enzyme unter wasserarmen Prozessbedingungen untersucht (Abb.

40). Dabei ist zu beachten, dass an dieser Stelle auf die entwickelte Sorbitolstabilisierung

verzichtet wurde, um die Eigenschaften der Varianten nicht zu beeinflussen. Unter diesen

Bedingungen zeigte lediglich die Variante M87L einen erhöhten Umsatz im Vergleich zum

Wildtyp. Der Substratumsatz nach 120 Stunden war in Relation zum Wildtyp um 10 %

erhöht. Die drei Mutanten M87V, D250R und Q339H waren in diesem Reaktionsmilieu kaum

aktiv und erreichten nur Umsätze zwischen 4 und 12 % nach 120 Stunden. Die übrigen

Enzyme lagen etwa im Bereich des Umsatzes des Wildtyp Enzyms.

Abschließend lässt sich festhalten, das durch die Zufallsmutagenese lediglich ein Enzym

generiert werden konnte, dass durch seine verbesserten Eigenschaften die Effizienz des

2-Butanol Prozesses erhöhte. Besonders interessant wäre eine Kombination dieser Mutante

mit den Mutationen, die in der 3DM-Studie zu Verbesserungen geführt haben. Diese waren

D250W und A12Q. Beide führten zu einer relativen Umsatzerhöhung von 20 % im Vergleich

zum Wildtyp. Möglicherweise summieren sich die positiven Eigeschaften dieser Mutationen

auf und würden damit ein wesentlich effizienteres Enzym ergeben. Diese Arbeiten konnten

aus zeitlichen Gründen in dieser Studie nicht mehr durchgeführt werden.

4.5.4 Interpretation der Mutationen

Durch das Protein Engineering mittels Zufallsmutagenese und semi-rationalem Design

wurden in dieser Arbeit 13 Varianten der ADH evo-040 generiert, die verbesserte

Eigenschaften aufwiesen. Eine Variante trug zwei Aminosäuresubstitutionen (N7S/ K345R),

so dass insgesamt 14 Mutationen zu analysieren waren. Einen Überblick über diese gibt Tab.

26.

Es war möglich, die 14 Mutationen in insgesamt sechs Gruppen zu unterteilen. Positionen

einer Gruppe ähnelten sich dabei in ihrer räumlichen Lage in der Enzymstruktur. Somit war

denkbar, dass sie eine ähnliche Wirkungsweise entfalteten. Die Gruppen bestehen aus

folgenden Positionen:

A) N7, N9, S10, A12 B) M87 C)Y182

D) V240, V243, D250 E) P273 F) Q339, K345

Schematisch dargestellt ist die Lage der Aminosäuren sowie die Gruppenaufteilung auch Abb.

45 zu entnehmen.

Diskussion

107

Tab. 26: Übersicht über die Mutationen in den ADH evo-040 Varianten. Eine Variante trug zwei

Mutationen: N7S und K345R (grau unterlegt). Es kann nicht genau gesagt werden, welche der Mutationen in

diesem Fall zu den verbesserten Eigenschaften des Enzyms führte.

3DM-Mutanten

Mutation

Veränderte Eigenschaft durch neue Aminosäure (0 = ähnlich

geblieben) Lage der Aminosäure

Auswirkungen auf Enzym

Größe Ladung Polarität Im

aktiven Zentrum?

An der Oberfläche

?

Sek.- Struktur

Vmax Hitze-

stabilität

N9G kleiner 0 neutral nein ja r. coil + + +

A12Q größer 0 polar nein ja r. coil + + -

V240N größer 0 polar nah ja r. coil - + +

V243G kleiner 0 neutral nah ja α-Helix - -

D250W größer neutral unpolar nein ja α-Helix + + - -

Zufallsmutagenese-Mutanten

Mutation

Veränderte Eigenschaft durch neue Aminosäure (0 = ähnlich

geblieben) Lage der Aminosäure

Auswirkungen auf Enzym

Größe Ladung Polarität Im

aktiven Zentrum?

An der Oberfläche

?

Sek.- Struktur

Vmax Hitze-

stabilität

N7S kleiner 0 0 nein ja r. coil + + 0

S10R größer basisch 0 nein ja r. coil + 0

M87L kleiner 0 0 ja ja Faltblatt + + + +

M87V kleiner 0 0 ja ja Faltblatt - - - -

Y182F 0 0 unpolar ja nein α-Helix + + -

D250R größer basisch 0 nein ja α-Helix + + 0

P273L größer 0 0 nein ja α-Helix - - +

Q339H größer basisch 0 nein ja r. coil + 0

K345R größer 0 0 nein ja r. coil + + 0

Diskussion

108

Abb. 45: Schematische Darstellung der 14 Mutationspositionen, die zu veränderten Eigenschaften des

Enzyms führten. Die Positionen wurden in sechs Gruppen (A-F) aufgeteilt, die jeweils Positionen ähnlicher

räumlicher Lage vereinten. Weiß: Ausschnitt des Grundgerüsts des Proteinrückgrat mit Sekundärstrukturen /

Grau: Moleküloberfläche des gebundenen NADH-Moleküls / Stern: ungefährer Ort des katalytischen Zentrums.

Nähere Erläuterungen sind dem Text zu entnehmen (Strukturen dargestellt in einem Homologiemodell nach

„CPHmodels 3.2“, http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/).

Gruppe A: Die vier Positionen N7, N9, S10 und A12 führten alle nach Mutagenese zu

aktiveren Enzymvarianten (gegenüber 2-Butanon) (Tab. 26). Die Betrachtung der

Enzymstruktur zeigte, dass die Positionen in exponierter Lage an der Enzymoberfläche

Diskussion

109

lokalisiert sind. Abb. 45-A legt weiterhin offen, dass sie nicht unmittelbar an der Ausbildung

der katalytischen Tasche beteiligt sind. In der Abbildung Abb. 45-A ist diese im Vordergrund

links unten zu finden. Zwischen dieser Tasche und den vier Positionen liegt somit noch ein

random coil Bereich, welcher die Oberfläche der Tasche ausbildet. Es kann vermutet werden,

dass die vier Aminosäuren Einfluss auf die Form dieses random coil Bereichs nehmen

können. Dadurch würden sie die Ausbildung der katalytischen Tasche indirekt modifizieren.

Weiterhin liegen sie innerhalb eines Bereichs von 15 Å zum aktiven Zentrum. Die Distanz ist

somit so klein, dass Wechselwirkungen zugesprochen werden können206. Die erhöhte

Aktivität könnte beispielsweise durch eine räumliche Vergrößerung der active site zustande

kommen263, was den Eintritt des Substrats erleichtert.

Gruppe B: Sie beinhaltet lediglich eine Aminosäureposition: M87. Es konnte jedoch gezeigt

werden, welch hohen Einfluss die Position sowohl auf die Enzymaktivität als auch –stabilität

nimmt (vergl. M87L und M87V: Abb. 37 und Tab. 24). Sie ist auch die einzige identifizierte

Position, die direkt im katalytischen Zentrum lokalisiert ist. Mutationen an dieser Stelle

können somit großen Einfluss auf den katalytischen Mechanismus nehmen. Veränderungen

können dabei sowohl sterisch als auch ladungsbedingt sein263. Mutationen im aktiven

Zentrum beeinflussen jedoch auch oft die Selektivität des Enzyms81, was in diesem Fall

erfreulicherweise nicht beobachtet wurde.

Gruppe C: Ähnlich wie Gruppe B könnte die Position Y182 die katalytische Reaktion

beeinflussen. Sie liegt in der zweiten Sphäre um das aktive Zentrum und mit einem Abstand

von 12,5 Å in einem einflussnehmenden Bereich206. Der Bereich der sekundären Sphäre wird

oft in der Generierung von smart libraries adressiert, zum Beispiel beim sogenannten

CASTing14,246,264. Dieser Bereich wird ausgewählt, da die Mutagenese von Positionen in der

ersten Sphäre das Enzym oft inaktivieren.

Auch die Mutagenese von Y182 hätte zu veränderter Selektivität führen können81, was jedoch

nicht eintrat. Die beobachtete erhöhte Aktivität der Mutante Y182F könnte durch sterische

Veränderungen oder die erniedrigte Polarität stattgefunden haben.

Gruppe D: Diese Gruppe beinhaltet die Postitionen V240, V243 und D250. Sie sind räumlich

betrachtet nicht am katalytischen Zentrum, sondern am hinteren Teil der NADH-Bindetasche

lokalisiert. Dies macht es schwierig, ihren genauen Effekt zu deuten. Mutationen an diesen

Positionen führten außerdem zu sehr divergenten Auswirkungen auf das Enzym. So war

Diskussion

110

V240N wesentlich hitzestabiler, V243G dagegen hitzeinstabiler, dafür aber lösemittelstabiler

und D250W deutlicher aktiver als das Wildtyp Enzym.

Es kann nur vermutet werden, dass diese Positionen die Bindung des Cofaktors beeinflussen

könnten. Eventuell könnte die Mutation D250W die Bindung zwischen Enzym und Cofaktor

durch die neutrale Ladung und Unpolarität des Tryptophans verstärken, wodurch das Enzym

auch länger in aktivierter Form vorliegt. Insgesamt sind die Auswirkungen dieser Gruppe aber

nur schwer zu deuten.

Gruppe E: Zu dieser Gruppe gehört nur die Position P273. Die Mutante P273L führte zu einer

erhöhten Hitze- und Lösemittelstabilität des Enzyms (Tab. 26 & Abb. 35-B). Die Position

befindet sich in einer exponierten Lage an der Enzymoberfläche und in einer α-Helix.

Allerdings wird Prolin eine helixbrechende Funktion zugeschrieben265,266. Es kann somit

angenommen werden, dass die α-Helix und damit auch dieser Enzymbereich durch den

Austausch des Prolins stabilisiert wurde.

Gruppe F: Die Positionen Q339 und K345 dieser Gruppe führten nach Mutation zu aktiveren

Enzymvarianten. Diese Aminosäuren liegen am C-terminalen Ende des Enzyms. Leider war

dieser Bereich nicht modellierbar, da ihn die templates für das Homologie-Modelling

aufgrund ihrer geringeren Größe nicht abdeckten. Es ist daher nicht klar, wie ihre genaue

Lage im Raum ist. Allerdings befinden sie sich in Nachbarschaft zu den Positionen aus

Gruppe A, weshalb sie eventuell einen ähnlichen Einfluss nehmen wie N7, N9, S10 und A12.

Dafür würde auch sprechen, dass Q339H und K345R wie die Mutanten aus Gruppe A zu

einer erhöhten Aktivität des Enzyms führten.

Zusammenfassung

111

Zusammenfassung


Bereich der Pharma-, Agrar- sowie in der Aroma- und Duftstoffindustrie nehmen sie einen

hohen Stellenwert ein. Dabei ist eine hohe Enantiomerenreinheit des eingesetzten Alkohols

von entscheidender Bedeutung. Dies liegt an der Tatsache, dass unerwünschte Enantiomere

eines Moleküls oft voneinander abweichende Eigenschaften aufweisen.

Grundsätzlich sind chirale Alkohole auch durch eine chemische Synthese darstellbar. Die

Produktionsverfahren leiden jedoch sowohl unter niedriger Selektivität als auch unter dem

Einsatz von giftigen und teuren Katalysatoren. Insbesondere kleine, chirale Alkohole wie

2-Butanole sind nur schwer über chemische Prozesse in reiner Form darstellbar. Daher stellen

diese Moleküle interessante Ziele für eine biotechnologische Synthese dar. Dabei bietet sich

insbesondere die Nutzung von Alkoholdehydrogenasen an, welche die Reduktion der

prochiralen Ketonvorstufe hochselektiv katalysieren können.

Dennoch leiden auch diese enzymatischen Redoxreaktionen unter einigen Nachteilen, die in

dieser Arbeit durch die Entwicklung eines neuen Verfahrens umgangen werden sollten.

Zur Identifizierung eines Biokatalysators, der zur Reduktion von 2-Butanon geeignet ist,

wurde eine breite Palette von insgesamt 24 Enzymen durchmustert. Durch die Bestimmung

der Selektivitäten und Umsatzraten konnte ein Enzym identifiziert werden, welches die

Reduktion von 2-Butanon hochselektiv und effizient katalysiert und dabei einen

Enantiomerenüberschuss von ≥ 99,5 % für das (S)-Enantiomer generiert. Alle übrigen

Enzyme zeigten einen starken Racemisierungseffekt, der dazu führte, dass sich die

Produktreinheit im Laufe der Reaktion stark verringerte. Die Aufklärung dieses

Racemisierungseffekts war Teil der vorliegenden Arbeit. Es gelang, die potentiell zu Grunde

liegenden Mechanismen aufzudecken und entscheidende Parameter für die

Racemisierungsgeschwindigkeit zu identifizieren.

Ein weiteres Problem bei der Synthese von enantiomerenreinem 2-Butanol stellte die

schwierige Produktrückgewinnung dar, da sich aus den organischen Reaktionskomponenten

azeotrope Mischungen mit Wasser bilden, die nahe beieinanderliegende Siedepunkte

aufweisen. Daher wurde ein Reaktionsmilieu gewählt, das zu einem Anteil von 90 % aus

organischer Phase bestand, um die Bildung der Azeotrope zu minimieren. Es konnte

außerdem eine neuartige Stabilisierungstechnik entwickelt werden, die es ermöglicht, den

Zusammenfassung

112

Umsatz von Alkoholdehydrogenasen unter diesen anspruchsvollen Reaktionsbedingungen

stark zu erhöhen.

Das organische Reaktionsmilieu erlaubte weiterhin den Einsatz von hohen Mengen an

Substrat und Cosubstrat. Dies war einer der Schlüsselfaktoren zur Entwicklung eines

Prozesses der asymmetrischen Reduktion, der zu einer Produktausbeute von 120 ml

(= 1,34 mol) hochreinem (S)-2-Butanol pro Liter Reaktionsansatz führte. Die

Enantiomerenreinheit des Produkts lag bei hervorragenden ≥ 99,5 % und die chemische

Reinheit bei ≥ 99 %. Gleichzeitig wurde die theoretische Menge an generiertem Abfall von

25 kg (hypothetische Vergleichsreaktion) auf etwa 9,5 kg Abfall pro Kilogramm Produkt

reduziert.

Der gewählte Biokatalysator wurde weiterhin mittels verschiedener Techniken des Protein

Engineerings für den entwickelten Prozess optimiert. Es gelang, drei Varianten des Enzyms

zu generieren, die zu deutlich höheren Umsatzraten führten. Durch eine Auswertung der

eingefügten Mutationen wurden Hypothesen entwickelt, wie bestimmte

Aminosäuresubstitutionen zu einem Anstieg der Aktivität oder Stabilität beitragen könnten.

Durch den Einsatz der entwickelten Enzymvarianten konnte die Produktausbeute des

Prozesses um bis zu 20 % erhöht werden.

Summary

113

Summary

Chiral alcohols serve as important intermediates for the synthesis of fine chemicals. These

molecules are crucial for industrial supplies in a large variety of applications including

pharmaceuticals, pesticides, flavors and fragrances. However, undesired enantiomers of a

molecule can exhibit divergent properties of a product. Thus, a great enantiomeric purity is

highly important.

In principal, chiral alcohols are accessible by classical chemical synthesis. However, these

processes are low in selectivity and require expensive and toxic catalysts. Additionally, small

chiral compounds like 2-butanols are difficult to produce by chemical processes with high

purity. Biotechnological synthesis has the potential to increase the production efficiency of

these molecules.

One reason is that enzymes like alcohol dehydrogenases have the ability to reduce ketone

substrates with high selectivity. Thus, this class of enzymes is a good choice for the

production of enantiomerically pure 2-butanol. Nevertheless, there are some drawbacks in

using alcohol dehydrogenases like low stability in organic solvents or the need for inefficient

cofactor regeneration systems. These drawbacks hindered the development of successful

processes in the past. Now, a novel process approach was established to circumvent these

drawbacks.

To identify an appropriate biocatalyst for the reduction of 2-butanone, a large array of 24

different alcohol dehydrogenases was screened. Their selectivity and conversion rates were

determined. One enzyme was identified that catalyzed actively and highly selective the

conversion. The generated enantiomeric excess exhibited a value of ≥ 99.5 % for the

(S)-enantiomer. In contrast, all other enzymes displayed a racemization effect during the

reaction, which led to a decrease of product purity. The elucidation of this effect was part of

the present study. Several potential causes that may account for the racemization were

identified. Also, some critical parameters for the velocity of racemization were disclosed.

One central issue in the synthesis of 2-butanol was the impaired product recovery. This is due

to the formation of azeotropes of the reaction compounds. Those mixtures possess very

similar boiling points. The problem was solved by choosing a reaction environment with a

ratio of 90 % organic phase. Following this, the formation of azeotropic mixtures was

suppressed in large part. For that purpose, a novel enzyme stabilization technique was

developed. This increased substrate conversion under the harsh conditions dramatically.

Summary

114

Furthermore, the organic environment facilitated the usage of high loadings of substrate and

cosubstrate. This was a key factor for the development of asymmetric reduction process. The

yield of recovered product was 120 ml of (S)-2-butanol per liter of reaction broth. The

enantiomeric excess of the product was ≥ 99.5 % and the chemical purity ≥ 99 %.

Concomitantly, the amount of generated waste was reduced to 9,5 kg per kilogram of product.

In contrast, the comparative reaction leads to 25 kg of waste production.

Furthermore, the chosen biocatalyst was subject to different techniques of protein engineering

to improve the overall efficiency. Successfully, three variants of the enzyme were generated

that yielded significantly increased substrate conversion. Two of them elevated the conversion

by up to 20 %. Evaluation of the introduced mutations showed how amino acid substitutions

may act on the protein activity and/ or stability.

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134

Anhang

135

Anhang

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig verfasst und keine

anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe, dass alle Stellen der

Arbeit, die wörtlich oder sinngemäß aus anderen Quellen übernommen wurden, als solche

kenntlich gemacht sind und dass die Arbeit in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner

Prüfungsbehörde vorgelegt wurde.

Aachen, den

Dominik Spickermann

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