BS – ritgerð Maí 2019

Einbasabreytileiki í geninu Ppd-H1 í

íslensku og erlendu byggi

Þorbjörg Helga Sigurðardóttir

Auðlinda- og umhverfisdeild

ii

BS – ritgerð Maí 2019

Einbasabreytileiki í geninu Ppd-H1 í íslensku og

erlendu byggi Þorbjörg Helga Sigurðardóttir

Leiðbeinendur: Jón Hallsteinn Hallsson, Hrannar Smári

Hilmarsson og Magnus Göransson

Landbúnaðarháskóli Íslands

Auðlinda- og umhverfisdeild

i

ii

Yfirlýsing Hér með lýsi ég því yfir að verkefni þetta er byggt á mínum eigin athugunum, er samið af mér

og að það hefur hvorki að hluta né í heild verið lagt fram áður til hærri prófgráðu.

________________________________ Þorbjörg Helga Sigurðardóttir

iii

Ágrip Bygg (Hordeum vulgare ssp. vulgare) er mest ræktaða korntegundin á Íslandi og til að auka

öryggi byggræktunar hefur verið lögð áhersla á flýti, þ.e. hvenær plantan skríður, í kynbótum

þess hér á landi. Talið er að mörg gen hafi áhrif á skrið og ennfremur er talið að áhrif genanna

hvert á annað séu margslungin.

Talið er að pseudo-response regulator genið Ppd-H1 sé eitt af mikilvægari genum í

tengslum við stjórnun á skriðtíma í byggi. Talið er að ríkjandi samsætan Ppd-H1 valdi flýti og

er hún mun næmari fyrir löngum dögum en víkjandi samsætan ppd-H1. Vísbendingar benda

til þess genið hafi fjölvirk áhrif, talið er að genið hafi áhrif á tjáningu annarra gena sem

stjórna blómgun og hafi líka áhrif á hæð og lengd axpunts auk þess að hafa áhrif á fjölda

korna og títa í hverju axpunti.

Útraðir Ppd-H1 voru raðgreindar í 10 völdum yrkjum til að ná heildstæðu yfirliti yfir

opinn lesramma gensins. Raðgreindu yrkin, auk 24 annarra yrkja og lína úr gagnasafni

Landbúnaðarháskóla Íslands, voru borin saman við viðmiðunaryrkið Morex til að athuga

hvort einhvern einbasabreytileika væri að finna.

Sautján mögulegir einbasabreytileikar fundust í 15 yrkjum og línum en af þessum 17

breytileikum höfðu átta áhrif á umritun amínsýra í sjö yrkjum og línum.

Tuttugu og sjö yrki og línur bera enga einbasabreytileika eða þá að séður

einbasabreytileika hefur ekki áhrif á amínósýrur, þessi 27 yrki og línur bera því víkjandi

samsætuna ppd-H1. Fjögur yrki bera mögulegan einbasabreytileika sem hefur áhrif á

amínósýrur en léleg gæði raðgreininga valda því að niðurstöður eru óáreiðanlegar.

Eitt yrki og tvær íslenskar línur bera einbasabreytileika sem ber saman við ríkjandi

samsætuna Ppd-H1.

Lykilorð: Bygg (Hordeum vulgare ssp. vulgare), skriðtími, flýtir, Ppd-H1.

iv

Þakkir Ég vil þakka leiðbeinendum mínum þeim Jóni Hallstein Hallssyni, Hrannari Smára

Hilmarssyni og Magnus Göransson kærlega fyrir leiðsögn og aðstoð á öllum stigum

verkefnisins. Landbúnaðarháskóli Íslands fær þakkir fyrir afnot af rannsóknarstofu og

gögnum við gerð verkefnisins og Framleiðnisjóður landbúnaðarins fær þakkir fyrir að styrkja

gerð þessa verkefnis.

Að lokum vil ég þakka fjölskyldu minni og kærasta fyrir ómetanlegan stuðning.

v

Efnisyfirlit

Yfirlýsing .............................................................................................................................. ii

Ágrip .................................................................................................................................... iii

Þakkir ....................................................................................................................................iv

1. Inngangur ........................................................................................................................ 1

1.1. Bygg ....................................................................................................................... 1

1.2. Byggrækt á Íslandi .................................................................................................. 2

1.3. Stjórnun skriðtíma ................................................................................................... 3

1.4. Blómgunargen og boðleiðir í byggi ......................................................................... 4

1.5. Gen sem hafa áhrif á vetrun..................................................................................... 6

1.6. Daglengdarnæm gen ............................................................................................... 7

1.7. Flókin samskipti gena ............................................................................................. 9

1.8. Markmið ............................................................................................................... 10

2. Efni og aðferðir ............................................................................................................. 11

2.1. Byggyrki ............................................................................................................... 11

2.2. DNA einangrun ..................................................................................................... 11

2.3. Kjarnsýrumögnun ................................................................................................. 12

2.4. Rafdráttur og gelhreinsun ...................................................................................... 14

2.5. Gagnaúrvinnsla ..................................................................................................... 15

3. Niðurstöður ................................................................................................................... 17

4. Umræður ....................................................................................................................... 22

5. Ályktanir ....................................................................................................................... 26

6. Heimildaskrá ................................................................................................................. 27

7. Töfluskrá ....................................................................................................................... 34

8. Myndaskrá .................................................................................................................... 35

9. Viðaukar ....................................................................................................................... 36

1

1. Inngangur 1.1. Bygg

Bygg (Hordeum vulgare ssp. vulgare) er einær, tvílitna og sjálffrjóvgandi korntegund af

grasaættinni sem talin er hafa verið í ræktun í um 10.000 ár (Blattner, 2009; von Bothmer,

Jacobsen, Baden, Jørgensen og Linde-Laursen, 1995; Zohary, Hopf og Weiss, 2012). Bygg

var ein af fyrstu korntegundum nýtt til ræktunar (Kant, Amrapali og Babu, 2016) en uppruni

þess er nokkuð flókinn sem stafar af því að bygg virðist hafa verið tekið til ræktunar á

nokkrum stöðum og/eða frá nokkrum villtum tegundum (Poets, Fang, Clegg og Morell, 2015).

Skyldasti ættingi ræktaðs byggs (e. cultivated) er talið vera villt bygg (Hordeum vulgare ssp.

spontaneum) (Nevo, 1992). Flestar villigerðir (e. wild types) byggs skríða fyrr eftir vetrun (e.

vernalization) (Yan o.fl., 2004), þær skríða oftast snemma við langa daga en seint við stutta

daga. Þessi eiginleiki er tilkomin vegna aðlögunar að náttúrulegu útbreiðslusvæði plöntunnar

þar sem fræið liggur í dvala þar til aðstæður verða heppilegar fyrir spírun, fræþroska og

frædreifingu. Fræ spírar því þegar dag tekur að lengja (Fauré o.fl, 2012; Kant o.fl., 2016) sem

er merki um komandi vaxtartímabil.

Bygg er ein mest ræktaða korntegund í heimi en árið 2017 var bygg ræktað á um alls 47

milljón hekturum (ha) með heildaruppskeru upp á tæp 150 milljón tonn (FAO, 2018 ).

Undanfarin ár hefur ræktuðum hekturum fækkað en heildaruppskera þó aukist (FAO, 2018).

Útbreiðsla byggs er víðtæk, það er ræktað frá sjávarmáli upp í allt að 4000-5000 metrum yfir

sjávarmáli í Himalaja- og Andesfjöllunum (Kant o.fl. 2016) og langvarandi ræktun þess hefur

leitt til aðlögunar að mismunandi loftslagi og veðurfari (Allaby, 2015; Pasam o.fl., 2014).

Bygg er víða notað til ræktunar á jaðarsvæðum og talið er að erfðafræðilegur breytileiki

sem til staðar er, mögulega vegna margra upphafsstaða ræktunar, skýri aðlögunarhæfni byggs

(Allaby, 2015; Poets o.fl. 2015). Byggplantan sýnir marga og mismunandi þoleiginleika

tilkomna vegna aðlögunarhæfni plöntunnar. Þar má nefna til að mynda frostþol (Angessa og

Li, 2016) og þurrkþol en bygg er ræktað á mjög þurrum svæðum eins og t.d. Norður-Afríku

og Mið-Austurlöndunum (Kant o.fl. 2016) og þá er hægt að rækta sömu tegund á norðlægari

og blautari slóðum eins og á Íslandi (Jónatan Hermannsson, 1993).

Hægt er að skipta byggyrkjum upp í flokka eftir því hvort að líffræðilegur þroski þess á

sér stað eftir vetrun, eftir fjölda lóðréttra raða á axi og eftir áhrifum daglengdar á vöxt.

Byggplöntur flokkast í tveggja- eða sex raða yrki (e. cultivars) eftir fjölda þroskaðra smáaxa

2

(e. spikelet). Villigerð byggs hefur tvær þroskaðar lóðréttar raðir smáaxa sem geta frjóvgast

en hinar raðirnar fjórar eru vanþroskaðar og kallast þá tveggja raða (Komatsuda o.fl., 2007).

Talið er að sex raða formið, þar sem allar sex raðir smáaxa ná fullum þroska, sé afleiðing

stökkbreytingar sem olli því að Vrs1 genið missti virkni sína (e. loss of gene function)

(Komatsuda o.fl., 2007). Virkt, ríkjandi, genið hamlar kynþroska lóðréttu raðanna fyrir utan

tvær raðir en sé genið óvirkt, víkjandi, verða allar sex raðirnar kynþroska (Komatsuda o.fl.,

2007; Kant o.fl. 2016).

Vorafbrigði, það eru yrki sem sáð er að vori og þurfa því ekki á vetrun að halda, hafa

breiða aðlögun að loftslagi, en vetrarafbrigði, það eru yrki sem sáð er að hausti og þurfa því á

vetrun að halda til þess að hefja æxlunarfasann, gefa yfirleitt meiri uppskeru (Verstegen,

Köneke, Korzun og von Broock, 2014).

1.2. Byggrækt á Íslandi

Skipulagðar byggrannsóknir á vegum Rannsóknastofnunar landbúnaðarins (RALA, nú

Landbúnaðarháskóli Íslands) hófust árið 1960, en það var þó ekki fyrr en uppúr 1980 sem

kornræktarbændum fór að fjölga (Jónatan Hermannsson, 1993). Kornrækt náði hámarki hér á

landi árið 2009 en hefur dalað eilítið síðan sennilega vegna sveiflna í veðurfari, en

meðaluppskera virðist fylgja meðalhita (Hrannar Smári Hilmarsson o.fl., 2017).

Til að öruggt sé að bygg ná fullum þroska er talið þurfa u.þ.b. 1300 - 1500 daggráður yfir

vaxtartímabil þess (Jónatan Hermannsson, 1993, 2001), þ.e. frá því að fræ spírar þar til fullum

þroska er náð. Daggráður eru marfeldi fjölda daga og meðalhitastigs vaxtartímabils (Áslaug

Helgadóttir og Jónatan Hermannsson, 2003).

Svo að fljótþroska yrki nái lágmarksþroska til þreskingar þurfa daggráður að vera u.þ.b.

1100 (Hólmgeir Björnsson og Þórdís A. Kristjánsdóttir, 1999; Hólmgeir Björnsson og Þórdís

Kristjánsdóttir, 2004; Jónatan Hermannsson, 1993). Langar ljóslotur (e. photoperiods), þ.e.a.s.

hversu lengi ljós skín yfir sólarhringinn (hér eftir nefnt daglengd) á norðlægum slóðum eins

og hér á Íslandi veldur því að lágmarkskröfur um daggráður eru eilítið minni (Bergþórsson

o.fl., 1987). Hér á Íslandi eru daggráður að meðaltali um 1200 (Jónatan Hermannsson, 1993;

Þórdís Anna Kristjánsdóttir, 2013).

Áhersla hefur verið lögð á flýti í kynbótum byggs hér á landi til þess að nýta þann stutta

sumartíma sem við höfum. Skrið er þegar blómskipan byggs birtist fyrst þ.e.a.s. axpunturinn

birtist út úr blaðslíðrinu (e. flag leaf sheat) (Alqudah og Schnurbusch, 2017) og flýtir er þegar

plantan skríður fyrr en ella. Samantekt úr íslenskum byggrannsóknum frá árunum 1987-2014

3

sýndu að tíminn frá sáningu til skurðar hefur styst um 6,3 daga hér á landi (Hrannar Smári

Hilmarsson o.fl., 2017). Byggkynbætur hérlendis hafa skilað af sér yrkjum og línum sem

skríða fyrr og gefa af sér meiri uppskeru í tilraunum, þau yrki sem hafa verið sett í almenna

notkun úr íslenska kynbótaverkefninu eru Skegla, sem kom fyrst á markað árið 2002, Kría

sem kom fyrst á markað 2004, Lómur sem kom fyrst á markað 2007, og síðast kom Skúmur

sem kom fyrst á markað 2008 (Hrannar Smári Hilmarsson o.fl., 2017).

Ávinningur flýtis er margþættur, til að mynda geta fljótari byggyrki aukið öryggi í ræktun

þar sem haustveður setur mikið strik í reikninginn við kornskurð (Ólafur Reykdal o.fl., 2016).

Vænta má að fljótari yrki nái auknum þroska og þar af leiðandi auknu þurrkstigi sem þýðir

minni skemmdir við þreskingu og minni kostnað við þurrkun eða súrsun kornsins (Bjarni

Guðmundsson, 2014). Auk þess opnast möguleikar á að nýta bygg í aðrar afurðir en eingöngu

sem fóður fyrir búfénað, t.d. framleiðsla á maltkorni og jafnvel á sáðkorni (Ólafur Reykdal

o.fl., 2016) sem þýtt getur hærra verð fyrir ræktendur og þar af leiðandi betri afkomu bænda.

1.3. Stjórnun skriðtíma Lykilatriði í þróun plantna er skynjun á breytingum í daglengd (Greenup, Peacock, Dennis og

Trevaskis, 2009). Plöntur hafa þróað með sér fágað kerfi svo að skrið og blómgun eigi sér

stað þegar möguleikar á frjóvgun, fræþroska og frædreifingu eru sem mestir. Því þarf að stýra

skriði eftir árstíma og margar plöntur notast við daglengd sem umhverfisskilaboð um hvenær

skuli hefja skrið. Tímasetning skriðs hefur mikil áhrif á uppskeru og í gegnum tíðina hafa

kynbætur á flýti, það að plöntur skríði fyrr, breytt viðbrögðum plantna við

umhverfisskilaboðum (Turner, Beales, Fauré, Dunford og Laurie, 2005) og valdið breytingum

á erfðamengi tegundarinnar (Lundqvist, 2009).

Rétt fyrir blómgun hefjast formfræðilegar breytingar í vaxtarbroddi plantna og má skipta

tímabilinu, sem kallast forblómgunartímabil, upp í þrjá fasa: Gróðurfasa, frumæxlunarfasa og

síðæxlunarfasa. Fasarnir þrír eru misnæmir fyrir mismunandi umhverfisáhrifum (González,

Slafer og Miralle, 2002; Slafer og Rawson, 1994).

Tímasetning blómgunar fer bæði eftir innri skilyrðum sem og umhverfisáhrifum (Nitcher,

Distelfeld, Tan, Yan og Dubcovsky, 2013). Vetrun er árstíðarbundin umhverfisáhrif og hefur

þau áhrif á gróðurfasann að stytta tímalengd hans en vetrun hefur minni áhrif á frum- og

síðæxlunarfasana (González o.fl., 2002; Roberts, Summerfield, Cooper og Ellis, 1988).

Daglengd eykur hraða síðæxlunarfasans, sérstaklega á tímabilinu þegar stöngullinn er að vaxa

sem mest, en hefur minni áhrif á gróður- og frumæxlunarfasana (Miralles og Richards, 2000;

4

Roberts o.fl. 1988). Samanlagður tími þessara fasa ákveður tímasetningu skriðs. Það er því

stjórnun (e. regulation) formfræðilegra breytinganna sem eiga sér stað í öllum fösunum sem

ákveða blómgunartíma og geta haft áhrif á flýti í byggi. Sannað hefur verið að gen sem tjá

fyrir blómgunartíma í korntegundum hafi fjölvirk (e. pleiotropic) áhrif á fjölda eiginleika sem

hafa áhrif á uppskeru. Því má áætla að aukin vitneskja um áhrif gena á forblómgunartímabilið

og erfðabreytileiki innan þessara gena muni mögulega stuðla að aukinni uppskeru (Drosse,

Campoli, Mulki og von Korff, 2014).

1.4. Blómgunargen og boðleiðir í byggi

Mikill árangur hefur náðst á síðasta áratug í að skilja hvað veldur flýti í byggi (Alqudah og

Schnurbusch, 2017). Með „natural diversity mapping“ og með kortalagningu QTL svæða, en

það eru svæði innan erfðamengis sem stýra magnbundnum eiginleika, hafa til dæmis æ fleiri

mikilvæg blómgunargen fundist í byggi (Yan o.fl., 2003; Turner o.fl., 2005). Þessi

blómgunargen sem hafa áhrif á flýti eru dreifð um erfðamengi byggplöntunnar og enn er verið

að rannsaka þau og kortleggja áhrif þeirra. Gen sem þykir sannað að stuðli að flýti eru til

dæmis eam7, eam8, eam9 og eam10 genin (þar sem eam stendur fyrir „early maturity“) en

þau eru staðsett á litningum 6HS, 1HL, 4HL og 3HL (Campoli o.fl., 2013; Fauré o.fl., 2012;

Zakhrabekova o.fl., 2012).

Boðleiðir (e. pathways) blómgunar hafa nú þegar verið rannsakaðar ítarlega í

vorskriðnablómi (Arabidopsis thaliana), einærum tvíkímblöðung sem gegnir mikilvægu

hlutverki sem módel í erfðarannsóknum í plöntum (Fauré, Higgins, Turner og Laurie, 2007).

Mörg blómgunargen og boðleiðir eru mjög vel varðveitt á milli tegunda og samsvarandi (e.

orthologues) gen hafa í mörgum tilfellum fundist í byggi (Fauré o.fl., 2007). Talið er að fjórar

boðleiðir stuðli að blómgun í byggi, það eru sjálfstæðar og gibberellin boðleiðir auk tveggja

boðleiða sem tengjast vetrun og daglengd (Boss, Bastow, Mylne og Dean, 2004).

Fimm gen, þar á meðal HvFT1, HvFT2 og HvFT3, hafa fundist í byggi sem eru skyld (e.

homologus) blómgungargeninu Flowering Locus T (AtFT) sem mikið hefur verið rannsakað í

A. thaliana (Fauré o.fl., 2007).

HvFT1 er staðsett á stutta armi litnings 7H og er aðal genið í tengslum við stjórnun á

tímasetningu skriðs í byggi (Nitcher o.fl., 2013) og er eins og áður segir skylt AtFT geni í A.

thaliana. AtFT miðlar merkjum um vetrun og daglengd og tjáir hreyfanlegt prótein, svo kallað

„florigen“, sem setur af stað formfræðilegar breytingar í vaxtarbroddi. Í byggi starfar HvFT1

líkt og AtFT að því leyti að það sér um að miðla merkjum um vetrun, daglengd og

5

dægursveiflu auk þess að stuðla að blómstrun (Nitcher o.fl., 2013). Í rannsókn Fauré o.fl.

(2007) var HvFT1 eina FT-genið sem var tjáð á þeim tíma sem vaxtarbroddur róta og sprota

fer úr gróðurfasa yfir æxlunarfasa (Arifuzzaman o.fl., 2016; Comadran o.fl., 2012). HvFT1

samsvarar vetrunar geninu Vrn-B3 í hveiti (Yan o.fl., 2006) og OsFTL2/3 í hrísgrjónum

(Fauré o.fl., 2007). Yan o.fl. (2006) sýndu fram á að HvFT1 og vetrunar gen sem áður hafði

verið nefnt Vrn-H3 væru í raun eitt og sama genið. Tvær megin samsætur finnast í HvFT1,

ríkjandi samsæta, sem oftast er tengt við vorafbrigði og víkjandi samsæta sem er tengt við

vetrarafbrigði (Casas o.fl., 2011; Loscos, Igurtua, Contreras-Moreira, Gracia og Casas, 2014;

Stracke o.fl., 2009). Það finnst takmarkandi raðbreytileiki (e. sequence variation) í táknröðum

(e. coding sequences) gensins (Casas o.fl., 2011; Stracke o.fl., 2009).

HvCEN virðist hafa svipaða virkni og/eða verka með HvFT1 enda bæði genin væntanleg

komin af sama forgeninu (e. paralogue) (Loscos o.fl., 2014). HvCEN er líklegast það gen (e.

candidate gene) á svæði (e. locus) á litningi 2H sem hefur áhrif á lífmassa og kornaþyngd

hliðarsprota (e. tiller), fjölda korna á axi og hæð (Laurie, Prachett, Bezant og Snape, 1994).

Genið hefur tvær megin setraðir (e. haplotype) tengdar við vor- og vetrarafbrigði (Comadran

o.fl., 2012). Í blómategundinni Antirrhinum majus er talið sannað að myndun blómskipans

hefjist við upphaf tjáningar á geninu CEN sem er skylt HvCEN í byggi (Comadran o.fl.,

2012).

Loscos o.fl. (2014) skoðuðu samskipti HvFT1 og HvCEN og tóku eftir flýti þegar ein af

tveimur aðal samsætum voru til staðar en tjáning HvFT1 hélst þó óbreytt. Þeir áætluðu þá að

HvCEN starfi samsíða (e. parallel) HvFT1 í því að stuðla að blómgun. Tjáning HvFT1 virðist

stjórnast af Ppd-H1 við langa daglengd en Ppd-H2 við stutta daglengd. HvFT1 hefur áhrif á

vaxtarhegðun og tímasetningu skriðs. Áhrif annarra gena á tjáningu HvFT1 eru mikilvæg og

getur útrýmt þeim áhrifum sem breytileikar (e. polymorphisms) í geninu valda. Sem

aðalstjórnandi blómgunartíma á HvFT1 í samskiptum við t.d. Ppd-H1, HvCO2 og HvCEN.

Breytileiki í samsætum í Vrn-H1, Vrn-H2 og HvFT1 ákveður vaxtarhátt byggs (Loscos o.fl.,

2014; Nitcher o.fl., 2013).

Flest yrki hafa eingöngu eitt eintak af HvFT1 geninu en þó hefur fundist breytileiki í

eintakafjölda (CNV, e. copy number variation) í þessu geni. Nitcher o.fl. (2013) álíta að þau

fjögur eintök af HvFT1 geninu sem fundust í yrkinu BGS213, afkvæmi finnska yrkisins

Tammi, sé ástæðan fyrir flýti þess. Loscos o.fl. (2014) fundu tvær megin gerðir af CNV. Eina

sem inniheldur eingöngu eitt afrit af stýrilsvæði (e. promoter) en nokkur stykki af útröðum 1

og 3 og eina sem innihélt nokkur afrit af bæði stýrilsvæðum og útröðum 1 og 3. Sú fyrri var

tengd við aukna tjáningu á HvFT1 og fannst eingöngu í norrænu bygg. Samhengi á milli

6

CNV, genatjáningu og skriðtíma fannst bara í arfgerðum sem innihéldu samsætuna sem var í

BGS213. Þeir halda því líka fram að þrátt fyrir að CNV geti haft áhrif á tjáningu HvFT1 og

þar af leiðandi skriðtíma þá sé það ekki megin áhrifavaldurinn á tjáningu HvFT1.

Venjulega veldur samblanda af ákveðnum samsætum Vrn-H1 og Vrn-H2 vetrarvexti en

samsæta HvFT1 í áður nefndu yrki sem ber heitið BGS213 olli yfirstæðni (e. epistatic) yfir

vetrarvextinum sem varð til þess að plantan hóf vöxt að vori án vetrunar. Taka má fram að

talið er að engar arfgerðir sem innhalda virka Vrn-H2 samsætu (sem veldur venjulegum

vetrarvexti) hafa meira en eitt stykki af HvFT1 geninu (Nitcher o.fl., 2013).

Annað gen sem talið er að auki tjáningu HvFT1 er HvELF3 (einnig kallað eam8). HvELF3

er staðsett á litningi 1H í byggi (Fauré o.fl., 2012) og samsvarar dægurklukkugeninu ELF í A.

thaliana. Raðbreytileiki á HvELF3 gæti haft áhrif á dægurklukku með því að stjórna (e.

regulate) PRR genum, t.d. Ppd-H1, sem svo eykur tjáningu HvFT1. Sá möguleiki er fyrir

hendi að HvELF3 geti nýtt sér sjálfstæða boðleið, óháð Ppd-H1, sem veldur aukinni tjáningu

á HvFT1 (Fauré o.fl., 2012).

HvFT3 er líklegast Ppd-H2 í byggi (Fauré o.fl., 2007; Kikuchi, Kawahigashi, Ando,

Tonooka og Handa, 2009). HvFT2 virðist eingöngu vera tjáð við stutta daglengd og talið er að

genið stjórnist af annarri boðleið en HvFT1 (Kikuchi o.fl., 2009) og ólíkt HvFt1 virðist

HvFT2 vera tjáð eftir að æxlunarfasi hefst í vaxtarbroddum (Fauré o.fl., 2007).

1.5. Gen sem hafa áhrif á vetrun

Talið er fullsannað að genin Vrn-H1, Vrn-H2 og HvFT1 (Vrn-H3), hafi áhrif á stjórnun

vetrunar og að breytileiki innan þessara gena valdi breytilegum vetrunar skilyrðum, þ.e.

hversu mikinn kulda og/eða í hversu langan tíma vetrun þarf að standa yfir (Drosse o.fl.,

2014).

Við rannsóknir sínar fundu Yan o.fl. (2003) tengingu á milli Vrn-H1 og MADS-box

genanna Ap1 og AGLG1 í hveiti. Hveitigenin tjá MADS box umritunarþátt sem ber ábyrgð á

umbreytingu vaxtarbrodds úr gróðurfasa yfir í æxlunarfasana (Yan o.fl., 2003). Hemming,

Fieg, Peacock, Dennis og Trevaskis (2009) uppgötvuðu við rannsókn á Vrn-H1 að samsætur

sem misst höfðu stór svæði í fyrstu innröð eru tengd við fyrri skriðtíma og ríkjandi vorvöxt á

meðan að samsætur sem höfðu eingöngu misst lítið magn af fyrstu innröð höfðu veikari

tengingu við skriðtíma. Rannsóknir á hveiti sýndu fram á að breytileiki í eintakafjölda Vrn-H1

geninu er nátengdur því hvaða vetrunarskilyrði plantan krefst og tjáningarstigi gensins (Díaz,

Zikhali, Turner, Isaac og Laurie, 2012). Talið að Vrn-H1 genið auki tjáningu á HvFT1 geninu

7

við langa daga (Shimada o.fl., 2009) og sést hefur að Vrn-H1 hefur hamlandi áhrif á tjáningu

Vrn-H2 í byggi (Yan o.fl., 2004). Einnig er talið að breytileiki í Vrn-H1 myndi ákveðið

millistig milli sumar- og vetrarafbrigða (e. facultative) sem hægt er að sá hvenær árs sem er

(Hemming o.fl., 2009).

Vrn-H2 hamlar blómgun og er eingöngu tjáð við langa dagalengd (Campoli, Shtaya, Davis

og von Korff, 2012b; Drosse o.fl., 2014; Karsai o.fl., 2005). Yan o.fl. (2004) fundu að Vrn-H2

genið er svokallað ZCCT gen sem skráir fyrir próteini sem líklega hefur sink fingur og CCT

svæði sem samanstendur af CO, CO-líki og TOC1 hneppum (e. domains), áhugavert er að

ekki hafa fundist skyld gen í Arabidopsis (Yan o.fl., 2004 ).

Talið er að úrfelling (e. deletion) í víkjandi samsætunni vrn-H2 valdi vorsprettu í byggi

óháð samsætum í Vrn-H1 (Dubcovsky, Chen og Yan, 2005; Yan o.fl., 2004) og Hemming,

Peacock, Dennis og Trevaskis (2008) tengdu víkjandi samsætuna vrn-H2 við flýti og snögga

myndun blómskipans (e. inflorescence) en þó eingöngu í línum sem voru með

daglengdarnæmu ríkjandi samsætuna Ppd-H1. Í vorafbrigðum sem bera víkjandi samsætuna

vrn-H2 er blómgun því eingöngu háð daglengd (Porker, Jason, Coventry og Fettell, 2016).

Vrn-H2 gæti hafa upprunalega komið frá tvöföldun (e. duplication) á HvCO9, en bæði

tilheyra þau sömu undirfjölskyldu af genum sem eru ekki ólík dægurklukku geninu CO í A.

thaliana (Kikuchi, Kawahigashi, Oshima, Ando og Handa, 2012). HvCO9 tefur blómgun við

stutta daglengd líklega með því að draga úr tjáningu á HvFT1 (Drosse o.fl., 2014; Nitcher

o.fl., 2013).

Hjá vetrarafbrigðum af byggi sem eru næm fyrir daglengd hindrar Vrn-H2 tjáningu á

HvFT1 áður en vetrun hefst. Á þessu tímabili er tjáning Vrn-H2 mikil en við kulda eykst

tjáning á Vrn-H1 og tjáning á Vrn-H2 minnkar á móti. Þessar aðstæður, ásamt aukinni

tjáningu á Ppd-H1 og mögulega á HvCO1, leiðir til aukinnar tjáningar á HvFT1 (Campoli,

Drosse, Searle, Coupland og von Korff, 2012a; Campoli o.fl. 2012b; Drosse o.fl., 2014;

Loscos o.fl., 2014). Nitcher o.fl (2013) töldu að aukin tjáning á HvFT1 hefði aukin áhrif á

tjáningu á Vrn-H1 sem veldur því að upphaf blómgunar gerist hraðar en ella, Campoli o.fl.

(2012a) áætluðu að Vrn-H1 stjórnaði HvFT1 beint eða óbeint.

1.6. Daglengdarnæm gen

Skrið í byggi er stjórnað af daglengdarnæmum genum (e. photoperiod response genes) eins og

Ppd-H1 (samheiti Eam1 og HvPRR37) og Ppd-H2. Ppd-H1 og Ppd-H2 eru svokölluð PRR-

gen (e. pseudo-response regulator) (Alqudah o.fl., 2014; Fauré o.fl., 2012; Ren o.fl., 2012)

8

sem eru þekktir ljósmerkjaviðtakar (Mizuno og Nakamichi, 2005). PRR gen skrá fyrir

ákveðnu próteini sem er partur af dægursveiflu-klukku plöntunnar og er samsvarandi

dægursveiflu-klukku geninu PRR7 í A. thaliana. Áðurnefnt prótein, sem PRR gen skrá fyrir,

einkennist af tveimur varðveittum svæðum (Turner o.fl., 2005), fyrra svæðið er svokallað

pseudo-receiver hneppi og er keimlíkt merkjakerfi baktería sem kallast receiver regulator

hneppi (Mizuno og Nakamichi, 2005). Seinna svæðið er CCT svæði sem, eins og áður hefur

verið líst, inniheldur þrjú mismunandi CO hneppi (Turner o.fl, 2005).

Genin Ppd-H1 og Ppd-H2 stjórna eins og áður hefur komið fram að mestu

daglengdarferlinu í byggi og talið er að raðbreytileiki í þessum genum valdi að mestu þeim

fjölbreytileika sem sést í viðbragði við daglengd milli yrkja (Drosse o.fl., 2014; Comadran

o.fl., 2012; Kikuchi o.fl., 2012). Talið er að Ppd-H2, sem staðsett er á langa arminum á

litningi 1H, sé næst mikilvægasta daglengdar genið (Fauré o.fl., 2007). Ríkjandi Ppd-H2

samsæta finnst í mörgum vorafbrigðum byggs en finnst þó einnig í einstaka nýlegu

vetrararfbrigði sem krefst mikillar vetrunar (Casao o.fl., 2011).

Casao o.fl. (2011) leggja til þá tilgátu að þessi ríkjandi samsæta efli blómgun hjá plöntum

sem nái ekki að uppfylla vetrunarskilyrði sín, bæði við stutta og langa daglengd. Tjáning

hennar leiðir til aukinnar tjáningar á Vrn-H1 og HvFT1 en bæði þessi gen eru nauðsynleg til

að virkja upphaf blómgunar (Casao o.fl., 2011).

Fauré o.fl. (2007) settu fram þá tilgátu að HvFT3 væri líklegast Ppd-H2 eða að Ppd-H2

skrái fyrir (e. encodes) HvFT3. Við sérstakar aðstæður virðist Ppd-H2 virka á svipaðan máta

og HvFT1 en hefur þó ekki jafnmikil áhrif á blómgun (Kikuchi o.fl., 2012; Nitcher o.fl.,

2013).

Ppd-H1, sem er staðsett á stutta armi litnings 2H, var fyrsta genið sem var greint sem

daglengdar næmt gen og er lykilgen í því að ákvarða skriðtíma við langa daglengd (Turner

o.fl., 2005). Útbreiddur og hagnýtur breytileiki í Ppd-H1 gæti hafa verið kominn til sögunnar

áður en að maðurinn fór að nýta bygg til ræktunar (Jones o.fl., 2008). Talið er að vorafbrigði

byggs kom upprunalega frá Mið-Austurlöndum og beri daglengdarnæmu og ríkjandi

samsætuna Ppd-H1 sem veldur flýti (e. early heading) við langa daglengd (Andres og

Coupland, 2012; Nitcher o.fl., 2013) með því að valda aukinni tjáningu á HvFT1 og hraða

þroska vaxtarbrodds og axpunts (Hemming o.fl 2008; Turner o.fl., 2005). Víkjandi samsætan

ppd-H1 er ekki eins næm fyrir daglengd og veldur seinni skriðtíma (Andres og Coupland,

2012; Nitcher o.fl., 2013), hún hefur þveröfug áhrif, hindrar tjáningu á HvFT1 og seinkar

skriði við langa daglengd með því að aftra þroska vaxtarbrodds og axpunts (Hemming o.fl

2008; Turner o.fl., 2005).

9

Eins og áður hefur komið fram er það breytileiki í Ppd-H1 sem talinn er vera ástæðan fyrir

mismunandi á skriðtíma í byggi en niðurstöður rannsókna eru ekki á sama máli um

staðsetningu þess einbasabreytileika sem hefur mest áhrif á virkni gensins (Turner o.fl., 2005;

Jones o.fl., 2008). Turner o.fl. (2005) telja að einbasabreytileiki í CCT svæði gensins, úr Gly í

Trp, sé líklega sá einbasabreytileiki sem hafi mestu áhrifin á virkni víkjandi samsætunnar

ppd-H1.

Taið er að Ppd-H1 hafi ekki bein áhrif á dægursveiflu gen, líklegra þykir að genið stjórni

tjáningu gena sem virkjast við daglengd og að þau gen hafi áhrif á tjáningu daglengdar-

boðgena sem svo hafa áhrif á dægursveiflur. Sannað þykir að Ppd-H1 hefur áhrif á tjáningu

HvCO1 og HvCO2 en HvCO1 er gen sem stjórnast af dægursveiflu klukkunni og virkar

samsíða Ppd-H1 (Campoli o.fl. 2012a; Campoli o.fl. 2012b).

Ppd-H1 hefur fjölvirk (e. pleotropic) áhrif á hæð og lengd axpunts auk þess að hafa áhrif á

fjölda títa og fjölda korna í hverju axpunti (Laurie o.fl. 1994; Sameri, Takeda og Komatsuda,

2006). Digel o.fl. (2016) fundu að breytileiki í Ppd-H1 hafði áhrif á stærð laufblaða í

vetrarbyggi með því að hafa áhrif á frumufjölda, frumustærð og tímalengd frumuskiptingar

og/eða frumufjölgunar.

1.7. Flókin samskipti gena

Bæði breytileiki í Ppd-H1 og yfirtjáning HvCO1 hafa áhrif á vöxt og þroska stöngla og

blómskipan (Alqudah og Schnurbusch, 2017). HvCO1 ber væntanlega ábyrgð á blómgun með

því að virkja HvFT1 á meðan Ppd-H1stjórnar HvFT1 óháð mRNA frá HvCO1 (Campoli o.fl.,

2012a). Talið er að yfirtjáning HvCO1 verði til þess að meira sé tjáð af HvFT1 sem svo veldur

flýti (Campoli o.fl., 2012a; Campoli o.fl., 2012b). Talið er að yfirtjáning HvCO1 og

erfðabreytileiki í Ppd-H1 valdi auknum hraða á myndun blómskipans og lengingu stönguls og

einnig er talið að yfirtjáning HvCO1 auki umritun á vorsamsætu Vrn-H1 bæði við stutta og

langa daga en erfðabreytileiki í Ppd-H1 virðist ekki hafa áhrif á tjáningu Vrn-H1 (Campoli

o.fl., 2012a; Campoli o.fl., 2012b).

Yfirtjáning á HvCO2 í vorbyggi með náttúrulega úrfellingu í Vrn-H2 sætin veldur því að

Ppd-H1 virkjar tjáningu HvFT1. Í vetrarbyggi, sem ekki er með Vrn-H2 úrfellingu, veldur

yfirtjáning á HvCO1 eða HvCO2 aukinni tjáningu (e. up-regulation) á Vrn-H2 sem aftur

veldur minnkaðri tjáningu á HvFT1 og þar með seinkun blómgunnar við bæði stutta og langa

daglengd (Mulki og von Korff, 2016). Rannsókn Mulki og von Korff (2016) sýndi fram á

sterk gagnkvæm samskipti á milli HvCO2, Ppd-H1 og Vrn-H2. Einnig kom fram í

10

rannsókninni að virkjun (e. induction) á Vrn-H2, sem hamlar blómgun, og HvFT1, sem hvetur

blómgun, er stjórnað af sömu genunum, Ppd-H1, HvCO1 og HvCO2 (Mulki og von

Korff, 2016).

Ppd-H1 genið og hlutverk þess í tengslum við daglengd gefur til kynna að dægursveiflu

klukkan gegni mikilvægu hlutverki við stjórnun á skriðtíma byggs (Drosse o.fl., 2014).

Skriðtími er nátengdur umhverfinu og aðlögun plöntunnar að því. Vegna fjölvirkra áhrifa

gena sem hafa áhrif á skrið er talið er að skrið sé sá eiginleiki sem hægt sé að nýta til að auka

bæði uppskeru og ágóða uppskerunnar (Alqudah og Schnurbusch, 2017).

1.8. Markmið

Á einu stuttu íslensku sumri er æskilegt að bygg nái að klára lífsferill sinn, að plantan spíri,

vaxi, skríði og ná fullum kornþroska. Tímasetning skriðs hefur mikið um það að segja hvort

að byggplanta nái að vaxa og mynda spírunarhæft korn. Blómgun þarf að gerast á hárréttum

tíma til að tryggja aðgang og nýtingu auðlinda sem og til að tryggja hagstæðar kringumstæður

til vaxtar og þroska, vænta má aukinnar uppskeru náist frjóvgun innan ákjósanlegs tímaramma

(Nitcher o.fl., 2013).

Ræktun á yrkjum sem skríða á heppilegum tíma, s.s. nægilega snemma til að nýta

vaxtartímann sem best en ekki svo seint að kornþroski náist ekki, er því eitt af aðal

markmiðunum í byggkynbótum á Íslandi. Til þess að ná því markmiði þarf að auka skilning

okkar á virkni og stjórnun þeirra gena sem hafa áhrif á skriðtíma. Þessi rannsókn er partur að

kynbótastarfi Landbúnaðarháskóla Íslands á byggi og eitt af markmiðum þess starfs er að

reyna að komast betur að því hvaða erfðabreytileiki það er sem veldur flýti í íslenskum sem

og erlendum byggyrkjum og línum.

Markmið þessar rannsóknar er að skoða einbasabreytileika innan opins lesramma gensins

Ppd-H1 í völdum byggyrkjum, bæði íslenskum sem og erlendum, og athuga hvort sá

einbasabreytileiki geti útskýrt flýti. Klárað var að raðgreina tíu byggyrki út gagnsafni

Landbúnaðarháskóla Íslands í leit að einbasabreytileika auk þess sem að 24 áður raðgreind

yrki og línur úr gagnsafninu voru notuð til að leita að tengslum milli svip- og arfgerðar.

11

2. Efni og aðferðir Tilraunin fór fram á rannsóknarstofu Landbúnaðarháskóla Íslands á Keldnaholti.

2.1. Byggyrki

Tíu yrki voru valin til raðgreiningar, fyrir valin urðu vorafbrigði sem höfðu mismunandi

skriðtíma. 1. tafla sýnir hvaða tíu yrki urðu fyrir valinu, fjögur yrki eru 2ja raða en sex þeirra

6 raða.

Taflan sýnir einnig skriðtíma og þroskadag yrkjanna í tilraunum sem framkvæmdar voru á

Korpu á árunum 2014 – 2016. Hverju yrki var sáð í eins meters breiða röð, árin 2014 og 2015

var hverju yrki sáð í eina röð en árið 2016 var hverju yrki sáð í tvær raðir. Magnus Göransson

sá um skimun plantnanna árin 2014 og 2015 en árið 2016 fékk Magnus aðstoð frá

Seyedmoeen Shayestehaminzadeh við skimunina.

Árin 2014 og 2016 var skriðdagur skráður sem sá dagur er títa hafði birst í 50% plantna í

hverri röð, en árið 2015 var skriðdagur skráður sem sá dagur er 50% af axinu var sýnilegt í

50% plantna í hverri röð (Magnus Göransson, munnleg heimild, 20. apríl 2019).

Því miður var yrkið Akka ekki með í tilraunum á þessum árum.

2.2. DNA einangrun

Tíu fræjum af hverju yrki var komið fyrir í petrískál ofan á blautan pappír og skálarnar settar á

hlýjan stað. Þegar spírun var komin vel á stað voru kímblöðin klippt af og sett í Sarstedt 50

mL túpur ásamt gelkúlum, silica gel orange, sem draga í sig raka. Túpurnar voru geymdar í

kæliskáp við 4°C í tvær vikur.

1. tafla. Yfirlit yfir raðgreind yrki auk skriðtíma og þroska þeirra á Korpu árin 2014-2016.

Nr. Yrki Raðgerð* Skriðdagur** Fullum þroska náð Korpa-14 Korpa-15 Korpa-16 Korpa-14 Korpa-15 1 Akka 2 - - - - - 2 Arve 6 - 70 60,5 - 132 3 Asplund 6 - - 69,5 - - 4 Kría 2 64 73 58 113 132 5 Pernilla 2 75 - 67,5 121 - 6 Sigur-F 6 - 74 60,5 - 119 7 Tammi 6 - 71 56,5 - 132 8 Tampar 6 - 74 55 - 132 9 Teista II 2 - - 60,5 - -

10 VoH-2825 6 - 69 57 - 132 * Hvort yrki sé tveggja- eða sexraða. ** Skriðdagur 2016 er meðaltal tveggja endurtekninga en upplýsingar um skriðdag 2014 og 2015 komu úr einni endurtekningu.

12

DNA einangrun fór fram með NucleoSpin® Plant II setti frá Macherey-Nagel og

leiðbeiningum þess fylgt. Til þess að framkvæma frumurof var 5-8 mgr af hverju sýni sett í

1,5 mL Eppendorf túpur ásamt fjórum 0,7 mm stálkúlum. Sýnin voru möluð við tíðnina

30x/sek í tvær mínútur í mölunartækinu TissueLyser II (Qiagen). 400 µL af Buffer PL1 var

settur út í sýnin og þau hrist í Multi-vortex V-32 (Biosan). Þar á eftir var bætt við 10 µL af

RNase A og sýnin hrist aftur áður en þau voru hituð í Bio TDB-100 Dry Block Heating

Thermostat (Biosan) við 65°C í 10 mínútur. Lausninni var síðan komið fyrir í NucleoSpin®

Filter, sem búið var að para saman við 2 ml söfnunartúpu, og síðan sett í skildvindu við

11.000 snúninga/mín í tvær mínútur til að hreinsa lausnina. Síunni var hent en 450 µL af

Buffer PC blandað vel við lausnina. Þar með var undirbúningi fyrir DNA bindingu lokið. 700

µL af lausninni var komið fyrir í NucleoSpin® Plant II Column sem búið var að para saman

við nýja 2 mL söfnunartúpu og sett í skilvinduna við 11.000 snúninga/mín í 1 mínútu og

affallinu hellt niður. Þar með var DNA bundið við NucleoSpin® Plant II Column.

Hreinsun himnunnar á óæskilegum efnum fór fram í þremur þrepum. Í fyrsta og öðru þrepi

var sett 400 µL af Buffer PW1 í túpurnar og síðan 700 µL af Buffer PW2. Eftir hverja

ísetningu voru lausnirnar skildar niður við 11.000 snúninga/mín í 1 mín og affallinu hellt af. Í

loka þrepinu var sett 200 µL af Buffer PW2 í lausnirnar og þær skildar niður við 11.000

snúninga/mín í tvær mínútur.

Til að ná DNA úr NucleoSpin® Plant II Column var það sett í 1,5 mL Eppendorf túpur og

50 µl af 65°C heitum Buffer PE sett í túpurnar. Túpurnar voru hitaðar í fimm mínútur við

65°C hita áður en þær voru settar í skilvinduna við 11.000 snúninga/mín í 1 mínútu. Ísetning

buffers, hitun og notkun skilvindu var endurtekið einu sinni. Þar með var einangrun DNA úr

byggyrkjunum lokið.

Gæði einangrunar og magn DNA var mælt á NanoDrop Lite Spectrophotometer (Thermo

Scientific) sjá má gæði einangrunar í 8. töflu í viðauka.

2.3. Kjarnsýrumögnun Kjarnsýrumögnun (e. polymerase chain reaction) var gerð á útröðum 3, 6, 7 og 8 allt eftir því

hvað vantaði inn í gagnasafnið fyrir hvert yrki. Sjá má á 2. töflu hvaða kjarnsýrumögnun var

gerð fyrir hvert yrki. Sérstakir fram- og afturvísar (e. forward and reverse primers) frá

Eurofins MWG Operon voru notaðir og voru þeir þynntir út 1:10 með afjónuðu vatni.

3. tafla sýnir hvaða vísar voru notaðir fyrir hverja útröð.

13

Til að framkvæma kjarnsýrumögnunina var blandað saman 100µL lausn í 1,5 mL

Eppendorf túpur. Lausnin samanstendur af 10 µL af 10x Standard Taq Reaction Buffer, 100

ng af DNA (reiknað var út fyrir hvert yrki hve margir µL þyrftu að fara út í

kjarnsýrumögnunar-lausnina út frá því hversu mörg ng af DNA væri í DNA einangrunar

lausninni), 4 µL af framvísi, 4 µL af afturvísi , 4 µL af Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix,

0,5 µL af Taq DNA Polymerase og afjónuðu vatni.

Í fjórar 0,2 mL 4titude PCR túpur var sett 0, 1, 2 eða 4 µL af MgCl2 og svo 25 µL af

kjarnsýrumögnunar-lausninni í hverja túpu. Sýnunum var komið fyrir í Applied Biosystems

2720 Thermal Cycler PCR vél og fóru í gegnum hitunarferli sem sjá má á 1. mynd.

Skipta má hitunarferlinu upp í þrjár lotur. Fyrsta lotan er eðlissvipting DNA við 94°C í

fimm mínútur. Önnur lotan er þríþætt og endurtekur sig 35 sinnum. Fyrst er eðlissvipting við

94°C í 30 sekúndur, binding (e. annealing) vísa við DNA við 54°C 15 sekúndur og svo

lenging DNA við 72°C í 1 mínútu. Þriðja og síðasta lotan er lenging við 72°C í sjö mínútur,

eftir það eru sýnin kæld niður í 4°C.

2. tafla. Raðgreindar útraðir yrkja.

Ex-3 Ex-6 Ex-7 Ex-8 Akka Akka Asplund Akka Tammi

Asplund Arve Pernilla Asplund Tampar Kría Kría Tammi Kría Teista II

Sigur-F Pernilla Tampar Pernilla VoH-2825 Tammi Tammi Teista II Sigur-F Tampar VoH-2825

3. tafla. Fram- og afturvísar.

Nr. raðar Vísir* Basaröðun Útröð 3 Hvul_PpdH1-F6 5´-TCC AAC CCC ACT CGC CG-3´ Hvul_PpdH1-R1 5´- GTA GCA GTA TAC CTT AAG TAC A-3´ Útröð 6 Hvul_PpdH1-F7 5´-CTC AAG TGC CCA ACC AGC-3´ Hvul_PpdH1-R3 5´- ACG GAT GAT TTC AGG ATT CAC-3´ Útröð 7 Hvul_PpdH1-F5 5´-GCA AAG CAT AAT ATC AGT GTC CT-3´ Hvul_PpdH1-R8 5´-CTG AAT GAG TTG CTA CCA TAG TTG G-3´ Útröð 8 Hvul_PpdH1-F8 5´-CCA GTG TTG TCA ATC CTT CGG-3´ Hvul_PpdH1-R4 5´-GTA CTA GGT ATA GCT AGG TGC G-3´

* F stendur fyrir framvísi og R fyrir afturvísi.

14

2.4. Rafdráttur og gelhreinsun Til að sjá hvort kjarnsýrumögnun hafi heppnast var afurðin dregin á geli. Gelið sjálft var búið

til með því að hita upp 1 gr af agarósa í 100 mL af TAE lausn að suðumarki þangað til allur

agarósinn var uppleystur, þegar þessi lausn hafði náð um það bil 40°C var 10 µL SYBR® Safe

DNA Gel Stain (Fisher Scientific Inc.) bætt við lausnina og sett í þar til gert rafdráttarform, 20

x 10 cm/ 20 x 20 cm með 22 1 mm x 1 cm þykkum brunnkömbum.

Blandað var fimm µl af Gel Loading Dye, Purple (6X) saman við afurð kjarnsýrumögnunar

og þegar gelið hafði harðnað var 25 µl af blöndunni sett í brunna gelsins. Til viðmiðunar um

stærð kjarnabúts voru settir 1 kb DNA Ladder (BioLabs) í fyrsta brunn gelsins og Quick-

Load® Purple100 bp DNA Ladder (BioLabs) í síðasta brunn gelsins. Gelið var sett í EC-330

Midicell® PrimoTM Electrophoretic Gel System og EC-340 Midicell® PrimoTM

Electrophoretic Gel System (Thermo Electron Corporation) auk 1xTAE vökva og notast var

við EC135-90 (Thermo Electron Corporation) spennugjafa við rafdráttinn, spennan var 60 V

og 84 milliamp í 60 mínútur.

Til að sjá bæði framgang rafdráttar og gæði DNA var gelið sett á útblámatæki GE

Healthcare, en tækið gefur frá sér útfjólublátt ljós sem lýsir upp DNA sýnin. Ef

kjarnsýrumögnun heppnaðist var búturinn skorin úr gelinu og settur í merkta 1,5 mL

Eppendorf túpu.

Notast var við settið NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel) til að ná DNA

úr rafdráttargelinu og leiðbeiningum þess setts fylgt. Útskornir gelbútar voru vigtaðir og sett

var 2:1 af Buffer NTI. Túpurnar voru hitaðar í Bio TDB-100 Dry Block við 50°C og hristar í

Multi-vortex V-32 á tveggja til þriggja mínútna fresti þar til gelbútarnir höfðu leyst alveg upp.

NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Column var settur í 2 mL söfnunartúpu, allt að 700 µL af

sýni sett í túpuna og túpan sett í skilvinduna við 11.000 snúninga/mín í 30 sekúndur og

1. mynd. Hitunarferli kjarnsýrumögnunar.

94°C

30 sek

94°C

15 sek

54°C

1 mín 7 mín

72°C

∞4°C

5 mín

72°C

1x 35x 1x

15

affallinu hellt niður, þar með var DNA bundið við himnuna í Column. Ferlið var endurtekið

tvisvar í viðbót, nema nú var fyrst sett 700 µL af Bufffer NT3 í túpuna. Eftir að búið var að

hella affallinu af í seinasta skiptið var himnan þurrkuð, túpurnar voru settar í skilvinduna við

11.000 snúninga/mín í eina mínútu og eftir það varlega færðar yfir í Bio TDB-100 Dry Block

þar sem það var hitað í fimm mín við 70°C.

Þá hefst lokaskrefið, að losa DNA úr himnunni. NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up

Column voru færðar yfir í 1,5 mL Eppendorf túpur og 30 µL af 70°C heitum Buffer NE settur

í túpurnar. Túpurnar voru hitaðar í tvær til þrjár mínútur við 70°C áður en þær voru settar í

skilvinduna við 500 snúninga/mín í eina mínútu og svo 11.000 snúninga/mín í eina mínútu,

lokaskrefið var endurtekið einu sinni. Að þessu loknu vrou gæði kjarnsýrumögnunarinnar

mældar í NanoDrop Lite Spectrophotometer.

Tvær sendingar af sýnum voru send til fyrirtækisins Eurofins Genomics til

raðgreiningar.Tvö sýni eru send fyrir hvert yrki, 15µL af DNA auk 2µL af fram- eða afturvísi

í 1,5 mL Eppendorf túpur.

2.5. Gagnaúrvinnsla

Úrvinnsla gagna fór fram í Geneious Prime (Biomatters Ltd.). Farið var yfir niðurstöður

raðgreininga, endar snyrtir og nýjum raðgreiningum raðað saman við eldri raðgreiningar með

raðgreint Ppd-H1 gen frá yrkinu Morex (AY943294) til viðmiðunar. Að því loknu var

viðmiðunargenið fjarlægt og consensus röð mynduð, þ.e.a.s. heildstæð röð þeirra basa sem

myndar genið. Concensus raðir yrkjanna tíu sem voru raðgreind auk 24 áður raðgreindra yrkja

úr gagnasafni Landbúnaðarháskóla Íslands, sjá 4. töflu, voru borin saman til að sjá hvort

einhvern einbasabreytileika væri að finna í opnum lesramma gensins Ppd-H1

16

.

4. tafla. Yfirlit yfir raðgreind yrki eða línur úr gagnasafni Landbúnaðarháskóla Íslands

sem notuð voru í þessari rannsókn auk upplýsinga um meðalskriðdag úr tilraunum sem

framkvæmdar voru á Korpu árin 2014 – 2016.

Íslensk yrki/línur Skriðdagur

Korpa-14 Korpa-15 Korpa-16 247-1 - - 56,5

247-11 48 62 48,5 Is-046 - 71 60 Skegla - - 58,5 250-4 - - - 263-9 - - - 292-2 - - -

292-51 - - - Erlend yrki

Arla - - - Asa - - -

Binder - 84 78,5 Deba Abed - 86 71,5

Fimbul - 90 - Gull - 82 75,5 Mari 65 77 64

Maskin 63 73 59,5 Minttu - - - Nairn - 71 59,5 Opal - 82 70

ScotBere - - - Swallow - 82 68 Triumph 73 82 78

Varde - - 60 Vigdis - 78 66,5

17

3. Niðurstöður

Markmiðið verkefnisins var að raðgreina opinn lesramma gensins Ppd-H1 en

raðgreiningarnar heppnuðust tiltölulega vel. Í sumum tilfellum heppnaðist raðgreining ekki

nægilega vel, þ.e.a.s. gæði raðgreininga var ábótavant. Ekki náðist að raðgreina öll tíu yrkin

að fullu en þó náðist að fullklára yrkin VoH-2825, Pernilla og Kría. Vegna erfiðleika bæði

hvað varðar PCR og raðgreiningu á útröð 8 náðist ekki að klára hin sjö yrkin. Gæði

raðgreininga á útröð 8 voru að mestu mjög léleg og oftast ónothæf til úrvinnslu. Útraðir Ppd-

H1 gensins eru 2025 basapara langar, sem samsvarar 675 táknum, en það vantar 10-15

basapör á 3´ enda útraðar 8 í þeim yrkjum sem ekki náðist að fullklára. 2. mynd sýnir

raðgreiningar á útröð 8 hjá yrkinu Arve, þar sést vel hvernig gæðin verða verri eftir því sem

nær dregur 3´enda á útraðar átta.

2. mynd. Gæði raðgreiningar á 3´enda útraðar 8 hjá yrkinu Arve.

18

5. tafla. Raðgreindur einbasabreytileiki miðað við viðmiðunargenið Morex.

Yrki/línur Einbasabreytileiki

51

399

414

921

1110

1114

1353

1419

1488

1521

1584

1624

1717

1798

1951

1978

2011

Morex G C C C G T G G G G A C A G C T A 247-1 C T G A A C A G G G A C G A T G A

247-11 C T G A A C A G G A A C G A T G G Nairn C T G A A C A G G A A C G A T G G

Swallow G C C C G T A G G A A C R A C T A *Voh-2825 G C C M R Y G G G G A C A G C T A

Minttu G C C C G T G A G G T T A G C T A Gull G C C C G T G G T G A C G A C T A

Deba Abed G C C C G T G G T G A C A G C T A Fimbul G C C C G T G G T G A C A G C T A Is-046 G C C C G T G G T G A C A G C T A Mari G C C C G T G G T G A C A G C T A Opal G C C C G T G G T G A C A G C T A

*Pernilla G C C C G T G G T G A C A G C T A Skegla G C C C G T G G T G A C A G C T A

Triumph G C C C G T G G T G A C A G C T A 06-130 G C C C G T G G G G A C A G C T A 250-4 G C C C G T G G G G A C A G C T A 263-9 G C C C G T G G G G A C A G C T A 292-2 G C C C G T G G G G A C A G C T A

292-51 G C C C G T A G G G A C A G C T A Arla G C C C G T G G G G A C A G C T A Asa G C C C G T G G G G A C A G C T A

Binder G C C C G T G G G G A C A G C T A *Kría G C C C G T G G G G A C A G C T A

Maskin G C C C G T G G G G A C A G C T A ScotBere G C C C G T G G G G A C A G C T A

Varde G C C C G T G G G G A C A G C T A Vigdis G C C C G T G G G G A C A G C T A *Arve G C C C G T G G G G A C A G C T A *Akka G C C C G T G G G G A C A G C T A

*Asplund G C C C G T G G G G A C A G C T A *Tammi G C C C G T G G G G A C A G C T A *Teista II G C C C G T G G G G A C A G C T A *Sigur-F G C C C G T G G G G A C A G C T A *Tampar G C C C G T G G G G A C A G C T A

* yrki raðgreind í þessu verkefni. Litir segja til um gæði raðgreininga, blár: gæði fullnægjandi, grænn: gæði

ófullnægjandi, appelsínugulur: gæði tæplega fullnægjandi, gulur: misræmi í gögnum og gæði misgóð, bleikur:

misræmi í gögnum og gæði sæmileg.

19

Við úrvinnslu gagnanna komu í ljós 17 mögulegir einbasabreytileikar þar af 13

breytileikar þar sem gæði raðgreininga voru fullnægjandi. Í fjórum tilfellum voru gæði

raðgreiningar ekki nægjanlega góð til að segja með fullri vissu að um einbasabreytileika væri

að ræða. Sjá má á 5. töflu þá breytileika sem fundust, allur einbasabreytileiki frá

viðmiðunaryrkinu Morex er merkt inná með lit og eins og sjá má í töflunni er mismunandi á

milli yrkja hversu áreiðanlegar raðgreiningarnar eru. Í þeim tilfellum þar sem raðgreiningar

eru ekki nægjanleg góðar er annað hvort um að ræða misræmi í gögnum og/eða að gæði

raðgreininga sé mjög svo ábótavant, mismunandi litir segja til um gæði og hversu

áreiðanlegar niðurstöðurnar eru. Í tilfelli VoH-2825 sköruðust niðurstöður raðgreiningar þessa

verkefnis við fyrri niðurstöður raðgreininga úr gagnasafni Landbúnaðarháskóla Íslands á

þremur stöðum, í bösum 921, 1110 og 1114. 3. mynd sýnir gæði raðgreininga í áðurnefndum

bösum hjá VoH-2825, allir raðgreiningabútar fyrir þessa basa voru áreiðanlegir, bæði úr

þessari rannsókn sem og úr gagnasafninu.

Af þessum 17 raðbreytileikum sem fundust höfðu einungis átta þeirra áhrif á umritun yfir í

amínósýrur. Sjá má staðsetningu amínósýrubreytinga á 6. töflu, þar er líka merkt inn gæði

raðgreininganna sem eru á bakvið áætlaðar amínósýrubreytingar.

3. mynd. Gæði raðgreininga þessa verkefnis og

raðgreininga úr gagnasafni Landbúnaðarháskóla Íslands á yrkinu VoH-2825.

20

6. tafla. Amínósýrubreytingar af völdum einbasabreytileika miðað við viðmiðunaryrkið Morex.

Yrki/línur Amínósýrubreytingar

17

307

372

542

573

600

660

671

Igri H K P P A T G A Morex Q N S P T A W T 247-1 H K P P A T G T

247-11 H K P P A T G A Nairn H K P P A T G A

Swallow Q N S P X T W T *VoH-2825 Q X X P T A W T

Gull Q N S P A T W T Deba Abed Q N S P T A W T

Fimbul Q N S P T A W T Is-046 Q N S P T A W T Mari Q N S P T A W T Opal Q N S P T A W T

*Pernilla Q N S P T A W T Skegla Q N S P T A W T

Triumph Q N S P T A W T 06-130 Q N S P T A W T 250-4 Q N S P T A W T 263-9 Q N S P T A W T 292-2 Q N S P T A W T

292-51 Q N S P T A W T Arla Q N S P T A W T Asa Q N S P T A W T

Binder Q N S P T A W T *Kría Q N S P T A W T

Maskin Q N S P T A W T ScotBere Q N S P T A W T

Varde Q N S P T A W T Vigdis Q N S P T A W T *Arve Q N S P T A W T *Akka Q N S P T A W X*

*Asplund Q N S P T A W T *Tammi Q N S P T A W T *Teista II Q N S P T A W T *Sigur-F Q N S P T A W X* *Tampar Q N S P T A W X*

* þau yrki sem raðgreind voru í þessu verkefni. Litir segja til um gæði raðgreininga, sjá skýringar

á litakóðum í 5. töflu. X*, vegna ókláraðra raðgreininga vantar inn amínósýru.

21

Á 4. mynd má sjá á myndrænan hátt þróun (e. phylogenetic tree) yrkja og lína ásamt tengslum

og þróunarlega fjarlægð milli þeirra séð útfrá einbasabreytileika gensins Ppd-H1.

4. mynd. Þróunarleg fjarlægð yrkja.

22

4. Umræður Eins og áður hefur verið nefnt eru gæði raðgreininga misgóð en gæðin segja til um hversu vel

er hægt að álykta um að séður einbasabreytileiki sé í raun og veru til staðar eða hvort að slæm

gæði raðgreiningar sé valdur þeim breytileika sem birtist. Til að mynda er ekki hægt tala um

breytileika í bösum 1419, 1584 og 1624 hjá yrkinu Minttu með fullri vissu þar sem gæði

raðgreiningabúta er ekki fullnægjandi, nefna má að fáar raðgreiningar fyrir hverja útröð eru til

staðar til að vinna úr og því enn mikilvægara að gæði þeirra fáu raðgreininga sem til eru séu

góð. Sé um breytileika í yrkinu Minttu að ræða má sjá á 5. töflu að þessar breytingar hafa

áhrif á umritun einnar amínósýru. Breytileiki basa númer 1419 og 1584 veldur engum

amínósýrubreytingum (s.k. þöglar breytingar) en einbasabreytileiki í 1624 veldur

amínósýrubreytingu úr Prólín amínósýru 542 yfir í Serín amínósýru, þessi breyting er staðsett

í response regulatory hneppi í útröð sex.

Niðurstöður raðgreininga á yrkinu VoH-2825 í þessu verkefni voru á skjön við

niðurstöður úr gagnasafni Landbúnaðarháskóla Íslands í bösum 921, 1110 og 1114.

Raðgreiningar úr gagnasafninu sýndu A í basa 921, A í basa 110 og C í basa 1114 en

raðgreiningar þessa verkefnis sýndu C í basa 921, G í basa 1110 og T í basa 1114 líkt og í

viðmiðunaryrkinu Morex. Gæði allra raðgreindra búta voru fullnægjandi og því líklegt að sýni

hafi misfarist á einhverjum stað í ferlinu. Margt getur misfarist í raðgreiningaferlinu t.d. gæti

verið að DNA hafi verið einangrað úr röngu yrki, að sýni hafi mengast af öðru erfðaefni við

vinnslu eða að merking hafi misfarist á einhverju stigi ferlisins. Sá möguleiki er til staðar að

um arfblendni sé að ræða en það er mjög ólíklegt og mun líklegra að mannleg mistök orsaki

þetta misræmi. Ef um einbasabreytileika í VoH-2825 er að ræða hefur það áhrif á amínósýrur

307 og 372.

Eins og sést á 2. mynd eru Deba Abed, Fimbul, IS-046, Mari, Opal, Pernilla, Skegla og

Triumph þróunarlega séð nálægt hvort öðru og bera þau sama breytileikann í basa 1488, T í

stað G. Gull, sem er þróunarlega séð nálægt þessum yrkjum, ber sama breytileikann en

umræddur einbasabreytileiki virðist ekki valda amínósýrubreytingu og þar af leiðandi hefur

það engin áhrif á umritað prótein. Gull ber einnig breytileika í bösum 1717 og 1789 en gæði

raðgreininga er ábótavant.

Swallow ber mögulega breytileika í bösum 1353, 1521, 1717 og 1789 en mikið ber á

ósamræmi í niðurstöðum raðgreininga þess yrkis, í bösum 1717, 1353 og 1798 sýna sumar

raðgreiningar A en aðrar G . Hvað varðar basa 1353 og 1798 standa þeir raðgreiningabútar

sem sýna A í 1353 og 1798 uppúr þar sem þeir eru fleiri og/eða hafa betri gæði en þeir

23

raðgreiningabútar sem sýna G. Eins og áður hefur verið rætt um varðandi ósamræmi

raðgreininga í yrkinu VoH-2825 er hér einnig líklegt að um mannleg mistök sé að ræða. Eini

einbasabreytileikinn í Swallow sem telja má með nokkurri vissu að sé til staðar er í basa 1521.

Þeir einbasabreytileikar sem mögulega eru til staðar í Swallow, Gull og VoH-2825 má

finna einnig í yrkinu Nairn og íslensku línunum 247-11 og 247-1. Flesta breytileika, sem og

þá áreiðanlegustu, er að finna í Nairn og 247-11 en sama einbasabreytileika má finna í 13

bösum. 247-1 hefur alla sömu einbasabreytileikana nema hvað varðar basa 1521 og 2011. Í

þeim bösum finnst enginn breytileiki. Taka verður breytileikann í basa 2011 hjá Nairn og 247-

11 með fyrirvara þar sem eingöngu er um að ræða tvær raðgreiningar í hvoru yrki fyrir sig og

gæðin á endum bútanna eru mjög léleg, í og með vegna þess að basinn er staðsettur á 3´enda

síðustu útraðar gensins. Gæði raðgreininga í basa 1521 eru hinsvegar áreiðanlegar og mjög

athyglisvert í ljósi þess að 247-1 hefur ekki þann breytileika. Taka má fram að ósamræmi er í

basa 1353 hjá 247-11 en ef rýnt er í raðgreiningar sést að þeir raðgreiningabútar sem sýna G í

stað A eru af mjög lélegum gæðum á meðan margir bútar af góðum gæðum sýna A í þessum

basa.

Breytileikarnir sem finnast í Nairn, 247-11 og 247-1 hafa ekki allir áhrif á umritun

amínósýra. 6. tafla sýnir þá sjö breytileika sem hafa áhrif á umritun amínósýra, breytileiki í

5. Mynd. Gæði raðgreininga í basa 1353 hjá 247-11.

24

basa 51 veldur breytingu á Glútamín amínósýru 17 yfir í Histidín amínósýru, breytileiki í basa

921 veldur breytingu á Asparagín amínósýru 307 yfir í Lysín amínósýru, breytileiki í basa

1114 veldur breytingu á Serín amínósýru 372 yfir í Prólín amínósýru, breytileiki í basa 1717

veldur breytingu á Threonín amínósýru 573 yfir í Alanín amínósýru, breytileiki í basa 1798

veldur breytingu á Alanín amínósýru 600 yfir í Threonín amínósýru og breytileiki í basa 1978

veldur breytingu á Tryptófan amínósýru 660 yfir í Glysín. Sé miðað við að niðurstöður

raðgreininga fyrir basa 2011 í Narin og 247-11 séu áreiðanlegar veldur breytileiki þess basa

breytingum á Threonín amínósýru 671 yfir í Alanín amínósýru.

Viðmiðunaryrkið Morex hefur víkjandi samsætuna ppd-H1 (Turner o.fl., 2005) en sé

annað yrki, Igris (AAY42109) sem inniheldur ríkjandi samsætuna Ppd-H1 (Turner o.fl.,

2005), skoðað sést að Nairn og 247-11 innihalda alla sömu breytileika og Igris, eins og sjá má

í 7. töflu. Af þessum niðurstöðum má álykta að yrkið Nairn og línurnar 247-11 og 247-1 beri

ríkjandi samsætuna Ppd-H1 þó 247-1 beri ekki alla mögulega breytileika. Í rannsókn Eins og

Turner o.fl (2005) á geninu Ppd-H1 kom fram mismunandi einbasabreytileiki innan bæði

ríkjandi og víkjandi samsætna gensins.

Óáreiðanlegur einbasabreytileiki í yrkjunum Swallow og Gull tengist þeim breytileika

sem sést í Igri en óáreiðanlegur einbasabreytileiki í Minttu sést ekki í Igri.

Á 6. mynd má sjá ættartré systralínanna 247-11 og 247-1, þar má sjá að að yrkin Nairn,

Swallow og VoH-2825 leggja öll erfðaefni sitt að mörkum.

7. tafla. Einbasabreytileiki í yrkinu Nairn og línunum 247-11 og 247-1 borin saman við Igri sem ber ríkjandi samsætuna Ppd-H1.

Yrki Einkirnabreytileiki

51

399

414

921

1110

1114

1353

1521

1717

1798

1951

1978

2011

Igri (AAY42109) C T G A A C A A G A T G G

247-1 C T G A A C A G G A T G A 247-11 C T G A A C A A G A T G G Nairn C T G A A C A A G A T G G

Tveir basar, skyggðir með bláum lit, í 247-1 ber ekki saman við Igri sem ber ríkjandi samsætuna Ppd-H1.

25

Svipfarsgögn úr tilraunum á Korpu á árunum 2014 – 2016, 3. tafla, sýna að Nairn, 247-11

og 247-1 skríða snemma miðað við önnur yrki og línur í sömu tilraunum. En einnig má þar sjá

að meðalskriðdagur er einkar breytilegur á milli þeirra og því ekki hægt að draga þá ályktun

að ríkjandi samsætan Ppd-H1 ein og sér valdi þeim flýti sem sést í skriðtíma hjá yrkinu Nairn

og línunum 247-11 og 247-1.

Þau yrki sem ekki greindust með neina breytileika bera víkjandi samsætuna ppd-H1.

Þetta verkefni, sem er partur af stærra verkefni á vegum Landbúnaðarháskóla Íslands,

verður að teljast óklárað, þar eð ekki náðist að raðgreina öll yrkin að fullu. Í ríkjandi

samsætunni Ppd-H1 er að finna breytileika aftarlega á útröð 8 sem eykur enn mikilvægi þess

að ná góðum gæðum raðgreininga út allt genið.

Einnig er mikilvægt er að raðgreina aftur þau yrki sem innihalda ósamræmi og komast að

því hvort og þá hvaða einbasabreytileiki er til staðar og hvort sá einbasabreytileiki valdi

amínósýrubreytingum.

Áframhaldandi rannsóknir og öflun gagna um svipfar og arfgerð byggyrkja og -lína eru

nauðsynlegar til að komast að því hversu mikil áhrif Ppd-H1 hefur á skriðtíma byggs.

6. mynd. Ættartré yrkjanna 247-11 og 247-1.

Upplýsingar fengnar hjá Hrannari Smára Hilmarssyni

(Munnleg heimild, 1. apríl 2019).

26

5. Ályktanir

Í þessari rannsókn fannst mögulegur einbasabreytileiki í 15 yrkjum og línum, af þessum 15

bera átta yrki og línur einbasabreytileiki sem veldur amínósýrubreytingum. Segja má með

vissu að eitt yrki og tvær íslenskar línur innihaldi breytileika frá viðmiðunaryrkinu Morex en

það yrki ber víkjandi samsætuna ppd-H1. Þeir breytileikar sem finnast í geninu Ppd-H1 hjá

Nairn, 247-11 og 247-1 má einnig finna í sama geni hjá yrkinu Igri sem ber ríkjandi

samsætuna Ppd-H1 og má því álykta að yrkið Nairn og línurnar 247-1 og 247-11 beri sömu

samsætu. Hver áhrif ríkjandi samsætunnar Ppd-H1 á yrkið og línurnar er skal ósagt látið enda

ónæg gögn um arfgerð og svipfar til að vinna úr þó niðurstöður tilrauna á Korpu á árunum

2014 – 2016 gefi til kynna flýti.

27

6. Heimildaskrá

Allaby, R. G. (2015). Barley domestication: the end of a central dogma? Genome Biology

16(1),176.

Alqudah, A. M. og Schnurbusch, T. (2017). Heading Date Is Not Flowering Time in Spring

Barley. Frontiers in Plant Science 8, 896.

Alqudah, A. M., Sharma, R., Pasam, R. K., Graner, A., Kilian, B. og Schnurbusch, T. (2014).

Genetic dissection of photoperiod response based on gwas of pre-anthesis phase

duration in spring barley. PloS ONE, 9(11), e113120.

Andres, F. og Coupland, G. (2012). The genetic basis of flowering responses to seasonal cues.

Nature Reviews Genetics 13, 627–639.

Angessa, T. T. og Li, C. (2016). 8 - Frost Tolerance and Genetic Improvement in Barley. Í

Guoping Zhang og Chengdao Li (ritstjórar), Exploration, Identification and

Utilization of Barley Germplasm (bls. 209-221). Academic Press.

Arifuzzaman, M., Günal, S., Bungartz, A., Muzammil, S., Afsharyan, N.P., Léon, J. og Naz,

A.A. (2016). Genetic mapping reveals broader role of Vrn-H3 gene in root and shoot

development beyond heading in barley. PLoS ONE, 11(7), e0158718

Áslaug Helgadóttir og Jónatan Hermannsson. (2003). Verðmæti ræktunarlands.

Ráðunautafundur 2003, 12-16.

Bjarni Guðmundsson. (2014). Verkun og geymsla korns. Landbúnaðarháskóli Íslands.

Blattner, F. R. (2009). Progress in phylogenetic analysis and a new infrageneric classification

of the barley genus Hordeum (Poaceae: Triticeae). Breeding Science, 59(5), 471–480.

Boss, P. K., Bastow, R. M., Mylne, J. S. og Dean, C. (2004) Multiple pathways in the

decision to flower: enabling, promoting, and resetting. Plant Cell, 16(1), 18–31

Campoli, C., Drosse, B., Searle, I., Coupland, G. og Von Korff, M. (2012a). Functional

characterisation of HvCO1, the barley (Hordeum vulgare) flowering time ortholog of

CONSTANS. Plant Journal, 69(5), 868–880.

Campoli, C., Pankin, A., Drosse, B., Casao, C. M., Davis, S. J. og Von Korff, M. (2013).

HvLUX1 is a candidate gene underlying the early maturity 10 locus in barley:

phylogeny, diversity, and interactions with the circadian clock and photoperiodic

pathways. New Phytologist, 199, 1045–1059. doi:10.1111/nph.12346

Campoli, C., Shtaya, M., Davis, S. J. og von Korff, M. (2012b). Expression conservation

within the circadian clock of a monocot: natural variation at barley Ppd-H1 affects

28

circadian expression of flowering time genes, but not clock orthologs. BMC Plant

Biology, 12(1), 1-15.

Casao, M. C., Karsai, I., Igartua, E., Gracia M. P., Veisz, O. og Casas, A. M. (2011).

Adaptation of barley to mild winters: A role for PPDH2. BMC Plant Biology, 11(1),

164.

Casas, A. M., Djemel, A., Ciudad, F. J., Yahiaoui, S., Ponce, L. J., Contreras-Moreira, B. og

Igartua, E. (2011). HvFT1 (VrnH3) drives latitudinal adaptation in Spanish barleys.

Theoretical and Applied Genetics, 122(7), 1293–1304.

Comadran, J., Kilian, B., Russel, J., Ramsay, L., Stein, N., Ganal, M. ... Waught, R. (2012).

Natural variation in a homolog of Antirrhinum CENTRORADIALIS contributed to

spring growth habit and environmental adaptation in cultivated barley. Nature

Genetics, 44, 1388-1392

Digel, B., Tavakol, E., Verderio, G., Tondelli, A., Xu, X., Cattivelli, L., Rossini, L. og von

Korff. M. (2016). Photoperiod-H1 (Ppd-H1) Controls Leaf Size. Plant Physiology,

172(1), 405-415. doi: 10.1104/pp.16.00977

Distelfeld, A., Li, C. og Dubcovsky, J. (2009). Regulation of flowering in temperate cereals.

Current Opinion in Plant Biology, 12, 178–184.

Díaz, A., Zikhali, M., Turner, A. S., Isaac, P. og Laurie, D. A. (2012). Copy number variation

affecting the photoperiod-B1 and vernalization-A1 genes is associated with altered

flowering time in wheat (Triticum aestivum). PLoS ONE, 7(3), e33234.

Drosse, B., Campoli, C., Mulki, A. og von Korff, M. (2014). The world importance of barley

and challenges for further improvement. Í Kumlehn, J. og Stein, N. (ritstjórar),

Biotechnological approaches to Barley Improvement, Biotechnology in Agriculture

and Forestry 69 (bls. 81-99). Berlin Heidelberg: Springer Verlag.

Dubcovsky, J., Chen, C. og Yan, L. (2005). Molecular characterization of the allelic variation

at the VRN-H2 vernalization locus in barley. Molecular Breeding, 15(4), 395–407.

FAO. 2018. WORLD FOOD AND AGRICULTURE – STATISTICAL POCKETBOOK

2018. Rome. 254.

Fauré, S., Higgins, J., Turner, A. og Laurie, D. A. (2007). The FLOWERING LOCUS T-like

gene family in barley (Hordeum vulgare). Genetics, 176(1), 599–609.

Fauré, S., Turner, A. S., Gruszka, D., Christodoulou, V., Davis, S. J., Von Korff, M. og

Laurie, D. A. (2012). Mutation at the circadian clock gene EARLY MATURITY 8

adapts domesticated barley (Hordeum vulgare) to short growing seasons. Proceedings

of the National Academy of Scences of the United States of America, 109, 8328–8333.

29

González, F. G., Slafer, G. A. og Miralles, D. J. (2002). Vernalization and photoperiod

responses in wheat pre-flowering reproductive phases. Field Crops Research, 74(2-3),

183–195.

Greenup, A., Peacock, W. J., Dennis, E. S. og Trevaskis, B. (2009). The molecular biology of

seasonal flowering-responses in Arabidopsis and the cereals. Annals of Botany, 103,

1165–1172.

Hemming, M. N., Fieg, S., Peacock, W. J., Dennis, E. S. og Trevaskis, B. (2009). Regions

associated with repression of the barley (Hordeum vulgare) VERNALIZATION1 gene

are not required for cold induction. Molecular Genetics and Genomics, 282(5), 107–

117.

Hemming, M. N., Peacock, W. J., Dennis, E. S. og Trevaskis, B. (2008). Low-temperature

and daylength cues are integrated to regulate FLOWERING LOCUS T in barley.

Plant Physiology, 147(5), 355–366.

Hólmgeir Björnsson og Þórdís Anna Kristjánsdóttir. (1999). Jarðræktarrannsóknir 1998.

Fjölrit Rala, 198, 93 bls.

Hólmgeir Björnsson og Þórdís Anna Kristjánsdóttir. (2004). Jarðræktarrannsóknir 2003.

Fjölrit Rala, 215, 1-68.

Hrannar Smári Hilmarsson, Magnus Göransson, Morten Lillemo, Þórdís Anna Kristjánsdóttir,

Jónatan Hermannsson og Jón Hallsteinn Hallsson. (2017). An overview of barley

breeding and variety trials in Iceland in 1987-2014. Icelandic Agrucultural Sciences,

30, 13-28.

Jones, H., Leigh, F. J., Mackay, I., Bower, M. A., Smith, L. M. J., Charles, M. P. ... Powell,

W. (2008). Population-Based Resequencing Reveals That the Flowering Time

Adaptation of Cultivated Barley Originated East of the Fertile Crescent. Molecular

Biology and Evolution, 25(10), 2211–2219.

Jónatan Hermannsson. (1993). Kornrrækt á Íslandi. Ráðunautafundur 1993, 178-187.

Jónatan Hermannsson. (2001). Rannsóknir í kornrækt. Freyr 97, 9 11-13.

Kant, L., Amrapali, S. og Babu, B. K. (2016). 3 - Barley. Í Mohar Singh og Hari D.

Upadhyaya (ritstjórar), Genetic and genomic resource for grain cereals improvement

(bls. 125-157). Academic Press.

Karsai, I., Szűcs, P., Mészáros, K., Filichkina, T., Hayes, P. M., Skinner, J. S., Láng, L. og

Bedő Z. (2005). The Vrn-H2 locus is a major determinant of flowering time in a

facultative × winter growth habit barley (Hordeum vulgare L.) mapping population.

Theoretical and Applied Genetics, 110(8), 1458–66.

30

Kikuchi, R., Kawahigashi, H., Ando, T., Tonooka, T. og Handa, H. (2009). Molecular and

functional characterization of PEBP genes in barley reveal the diversification of their

roles in flowering. Plant Physiology, 149(3), 1341–1353.

Kikuchi, R., Kawahigashi, H., Oshima, M., Ando, T. og Handa, H. (2012). The differential

expression of HvCO9, a member of the CONSTANS-like gene family, contributes to

the control of flowering under short-day conditions in barley. Journal of Experimental

Botany, 63(2), 773–784.

Komatsuda, T., Pourkheirandish, M., He, C., Azhaguvel, P., Kanamori, H., Perovic, D. ...

Yano, M. (2007). Six-rowed barley originated from a mutation in a homeodomain-

leucine zipper I-class homeobox gene. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America, 104(4), 1424-9.

Laurie, D. A., Pratchett, N., Snape, J. W. og Bezant, J. H. (1995). RFLP mapping of five

major genes and eight quantitative trait loci controlling flowering time in a winter x

spring barley (Hordeum vulgare L.) cross. Genome, 38(3), 575-585.

Laurie, D., Pratchett, N., Bezant, J. og Snape, J. (1994). Genetic analysis of a photoperiod

response gene on the short arm of chromosome 2 (2H) of Hordeum vulgare (barley).

Heredity 72:619–627

Loscos, J., Igartua, E., Contreras-Moreira, B., Gracia, M. P. og Casas, A. M. (2014). HvFT1

polymorphism and effect-survey of barley germplasm and expression analysis.

Frontiers in Plant Science, 5(6), 1-15.

Lundqvist, U. (2009). Eighty years of Scandinavian barley mutation genetics and breeding. Í

Q.U. Shu (ritstjóri), Induced mutations in the genomics era (bls. 39-43). Rome: FAO.

Mizuno, T. (1998). His-Asp phosportranfer signal transduction. Journal of Biochemical and

Biophysical Methods (Tokyo) 123:555-563.

Mizuno, T. og Nakamichi, N. (2005). Pseudo-Response regulators (PRRs) or true oscillator

components (TOCs). Plant and Cell Physiology, 46(5), 677-685.

Mulki, M. A. og Von Korff, M. (2016). CONSTANS controls floral repression by up-

regulating VERNALIZATION2 (VRN-H2) in barley. Plant Physiology, 170, 325–

337.

Nevo, E. (1992). Origin, evolution, population genetics and resources for breeding of wild

barley, Hordeum spontaneum in the Fertile Crescent. Í P.R. Shewry (ritstjóri) Barley:

genetics, biochemistry, molecular biology and biotechnology (bls. 19–43). Oxford:

C.A.B. International, The Alden Press.

31

Nitcher, R., Distelfeld, A., Tan, C., Yan, L. og Dubcovsky, J. (2013). Increased copy number

at the HvFT1 locus is associated with accelerated flowering time in barley. Molecular

Genetics and Genomics, 288(5-6), 261–275.

Ólafur Reykdal, Sæmundur Sveinsson, Sigríður Dalmannsdóttir, Martin, P., Gerðinum, J. I.,

Kananagh, V. ... Jónatan Hermannsson. (2016). Northern cereals – New opportunities.

Skýrsla frá Matís . ISSN 1670-7192.

Pasam, R. K., Sharma, R., Walther, A., Özkan, H., Graner, A. og Kilian, B. (2014). Genetic

diversity and population structure in a legacy collection of spring barley landraces

adapted to a wide range of climates. PLoS ONE, 9(12), e116164.

doi.org/10.1371/journal. pone.0116164.

Páll Bergþórsson, Hólmgeir Björnsson, Ólafur Dýrmundsson, Bjarni Guðmundsson, Áslaug

Helgadóttir og Jón Viðar Jónmundsson. (1987). The effect of climatic variations on

agriculture in Iceland. Í Parry, M.L., Carter, T.R. og Konijn, N.T. (ritstjórar), The

impact of climatic variations on agriculture, Vol I: Assessments in cool temperature

and cold regions (bls. 383-09). Dordrecht: Kluwer Academic Publishers Group.

Poets, A. M., Fang, Z., Clegg, M. T. og Morrell, P. L. (2015). Barley landraces are

characterized by geographically heterogeneous genomic origins. Genome Biology, 16,

173.

Porker, K., Jason, E., Coventry, S. og Fettell, N. (2016). 10 - Improvement of Yield and

Adaptation by Manipulating Phenology Genes. Í Guoping Zhang og Chengdao Li

(Ritstj.), Exploration, Identification and Utilization of Barley Germplasm (bls. 241-

264). Academic Press.

Ren, X., Li, C., Cakir, M., Zhang, W., Grime, C., Zhang, X. ... Lance, R. (2012). A

quantitative trait locus for long photoperiod response mapped on chromosome 4H in

barley. Molecular Breeding, 30(2), 1121–30.

Roberts, E. H., Summerfield, R. J., Cooper, J. P og Ellis, R. H. (1988). Environmental Control

of Flowering in Barley (Hordeum vulgare L.). I. Photoperiod Limits to Long-day

Responses, Photoperiod-insensitive Phases and Effects of Low-temperature and Short-

day Vernalization. Annals of Botany, 62(2), 127-144.

Sameri, M., Takeda, K. og Komatsuda, T. (2006). Quantitative Trait Loci Controlling

Agronomic Traits in Recombinant Inbred Lines from a Cross of Oriental- and

Occidental-type Barley Cultivars. Breeding Science, 56(3), 243–252.

https://doi.org/10.1270/jsbbs.56.243

32

Shimada, S., Ogawa, T., Kitagawa, S., Suzuki, T., Ikari, C., Shitsukawa, N. og Murai, K.

(2009). A genetic network of flowering-time genes in wheat leaves, in which an

APETALA1/FRUITFULL-like gene, VRN1, is upstream of FLOWERING LOCUS T.

Plant Journal, 58(4), 668–681.

Slafer, G. A. og Rawson, H. M. (1994). Sensitivity of wheat phasic development to major

environmental factors: a reexamination of some assumptions made by physiologists

and modellers. Australian Journal of Plant Physiology, 21(4), 393–426.

Stracke, S., Haseneyer, G., Veyrieras, J. B., Geiger, H.H., Sauer, S., Graner, A. og Piepho,

H.P. (2009). Association mapping reveals gene action and interactions in the

determination of flowering time in barley. Theoretical and Applied Genetics, 118(2),

259–273.

The UniProt Consortium. (2015). UniProt: a hub for protein information. Nucleic Acids

Research, 43, D204-D212.

Turner, A., Beales, J., Fauré, S., Dunford, R. P. og Laurie, D. A. (2005). The Pseudo-

Response Regulator Ppd-H1 Provides Adaptation to Photoperiod in Barley. Science,

310(5750), 1031–1034.

Verstegen, H., Köneke, O., Korzun, V. og von Broock, R. (2014). The world importance of

barley and challenges for further improvement. Í Kumlehn, J. og Stein, N. (ritstjórar),

Biotechnological approaches to Barley Improvement, Biotechnology in Agriculture

and Forestry 69 (3-19). Berlin Heidelberg: Springer Verlag.

Von Bothmer, R.V., Jacobsen, N., Baden, C., Jørgensen, R.B. og Linde-Laursen, I. (1995). An

ecogeographical study of the genus Hordeum. Systematic and ecogeographic studies

on crop genepools 7 (2n edition.). Rome: International Plant Genetic Resources

Institute.

Yan, L., Fu, D., Li, C., Blechl, A., Tranquill,i G., Bonafede, M., ... Dubcovsky, J. (2006). The

wheat and barley vernalization gene VRN3 is an orthologue of FT. Proceedings of the

National Academy of Scences of the United States of America, 103, 19581–19586

Yan, L., Loukoianov, A., Blechl, A., Tranquilli, G., Ramakrishna, W., SanMiguel, P. ...

Dubcovsky, J. (2004). The Wheat VRN2 Gene Is a Flowering Repressor Down-

Regulated by Vernalization. Science, 303(5664), 1640–1644.

Yan, L., Loukoianov, A., Tranquilli, G., Helguera, M., Fahima, T. og Dubcovsky, J. (2003).

Positional cloning of the wheat vernalization gene VRN1. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, 100(10), 6263–6268.

33

Zakhrabekova, S., Gough, S.P., Braumann, I., Muller, A.H., Lundqvist, J., Ahmann, K. ...

Hansson, M. (2012). Induced mutations in circadian clock regulator Mat-a facilitated

short-season adaptation and range extension in cultivated barley. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America, 109, 4326–4331.

Zohary, D., Hopf, M. og Weiss, E. (2012). Domestication of Plants in the Old World: The

Origin and Spread of Domesticated Plants in Southwest Asia, Europe, and the

Mediterranean Basin. Oxford University Press on Demand.

Þórdís Anna Kristjánsdóttir. (2013). Jarðræktarrannsóknir 2012. Rit LbhÍ 44, 5-8.

34

7. Töfluskrá

1. tafla. Yfirlit yfir raðgreind yrki auk skriðtíma og þroska þeirra á Korpu árin 2014-

2016. .................................................................................................................................... 11

2. tafla. Raðgreindar útraðir yrkja. ................................................................................... 13

3. tafla. Fram- og afturvísar. .............................................................................................. 13

4. tafla. Yfirlit yfir raðgreind yrki eða línur úr gagnasafni Landbúnaðarháskóla Íslands

sem notuð voru í þessari rannsókn auk upplýsinga um meðalskriðdag úr tilraunum sem

framkvæmdar voru á Korpu árin 2014 – 2016.................................................................. 16

5. tafla. Raðgreindur einbasabreytileiki miðað við viðmiðunargenið Morex. .................. 18

6. tafla. Amínósýrubreytingar af völdum einbasabreytileika miðað við viðmiðunaryrkið

Morex. ................................................................................................................................. 20

7. tafla. Einbasabreytileiki í yrkinu Nairn og línunum 247-11 og 247-1 borin saman við

Igri sem ber ríkjandi samsætuna Ppd-H1. ........................................................................ 24

8. tafla. Yfirlit yfir gæði DNA einangrunar. ...................................................................... 36

35

8. Myndaskrá

1. mynd. Hitunarferli kjarnsýrumögnunar. ...................................................................... 14

2. mynd. Gæði raðgreiningar á 3´enda útraðar 8 hjá yrkinu Arve. ................................. 17

3. mynd. Gæði raðgreininga þessa verkefnis og raðgreininga úr gagnasafni

Landbúnaðarháskóla Íslands á yrkinu VoH-2825. ........................................................... 19

4. mynd. Þróunarleg fjarlægð yrkja. ................................................................................. 21

5. Mynd. Gæði raðgreininga í basa 1353 hjá 247-11. ........................................................ 23

6. mynd. Ættartré yrkjanna 247-11 og 247-1. ................................................................... 25

36

9. Viðaukar

8. tafla. Yfirlit yfir gæði DNA einangrunar.

DNA einangrun Yrki ng DNA/µl

Tammi 49,1 Pernilla 36,7 Asplund 31,3

VoH-2825 36,7 Tampar 44,6 Teista II 44

Kría 65,8 Akka 43,5

Sigur-F 62,5 Arve 58,7 Arve 162,7

8. tafla. Yfirlit yfir gæði DNA einangrunar

8. tafla. Yfirlit yfir gæði DNA einangrunar