Aus dem Physiologiseh-chemischen Institut der Universit~t Bonn/Rheim

Eine einfache Mikromethode zur photometrischen Bestimmung yon Magnesium mit Eriochromschwarz T.

Von

Wilhelm Dirseherl und Heinz Breuer.

Mit 5 Abbfldungen.

(Eingelangt am 20. Dezember 1952.) /

Die quantitative Bestimmung kleiner Magnesiummengen (1 bis 10 y) ist besonders in neuerer Zeit wiederholt Gegenstand eingehender Unter- suehungen gewesen. So haben z. B. E. Havinga und .4. F . K. B. Balliot 1 die Bestimmung des Magnesiums mit Trop£olin 00 nach K. Lang 2 modifi- ziert und H. W. Spier 3 hat fiber die Oxydimetrie des Magnesiumoxinats berichte%, wobei Mengen ab etwa 5 y Mg erfaBt werden kSnnen. Von den kolorimetrischen Verfahren hat sieh die yon I . M . Koltho/] 4 an- gegebene Farblackbildung mit Titangelb durchgesetzt, ffir die eine Reihe yon Vorschriften ausgearbeitet worden ist (Lit. s. Hinsberg-Lang 5, ferner 6-10). Die geringsten noch erfaBbaren Magnesiummengen betragen 1 bis 10 ~,.

Bei unseren Arbeiten fiber den Gewebestoffwechsel ergab sich die Notwendigkeit der Bestimmung noch kleinerer Magnesium- mengen. Hierffir erwies sich nach dem Rat von Herrn Prof. Schwarzenbach (Zfirich) der farbige Komplex yon Magnesium mit Erio- ehromschwarz T Ms geeignet. Diesen Farbstoff haben bekanntlieh W. Biedermann und G. Schwarzenbach n als Indikator bei der kom- plexometrischen Titration yon Metallionen mit Athylendiamintetra- acetat (Komplexon III) angewandt. W~hrend mit der Titrations- methode der Magnesiumgehalt bis 10-4Mol/Liter erfaBt wird, ist die im folgenden beschriebene Methode bis 5 .10 -7 Mol/Liter anwendbar (Endkonzentration 0,012y Mg/ml; Mindestmenge pro Bestimmung 0,06 ~, Mg).

Vv'. Dirscherl und 17t, Breuer: Photometrische Bestimmung. 323

I. Eigenschaften und Verhalten des Magnesium-Erioehromsehwarz T-Komplexes.

OH OH

O~N\__/ \ / \ /

Eriochromschwarz T (F 241 der Farbstof%abellen yon Schultz-Lehmann), im folgenden als I-I2F-bezeichne~.

Bei Abwesenheit mehrwertiger Metallionen ergeben sich nach W. Bieder-

mann und G. Schwarzenbach n bei verschiedenem p~r fiir Eriochromschwarz T folgende Farbstufen:

H2F- ~_ H F - - ~_ F - - - (1)

weinrot bei p~ 6,3 blau bei PH 11,5 orange

I m pH-Gebiet yon 8 bis 10 bilde~ das blaue Farbstoffion H F - - bei Zugabe yon Magnesiumionen einen weinroten Komplex:

MgT~ ~- H F - - --- MgF- -- H ~ (2)

blau weinrot

Die Komplexbildungskonstante ist sehr groin;

K [MF] ~ 10+7" [•]. [F]

Naeh Biedermann und Schwarzenbach (1. c.) arbeitet man am besten mit einem Ammoniak-Ammoniumsalz-Puffer vom pi~ 10, da bei hSheren pH-Werten Magnesiumhydroxyd ausfMlen und bei niedrigerem p~ das Metall veto Farbstoff weniger intensiv gebunden werden kann. Eine gut erkennbare weinrote Fi~rbung des Magnesium-Farbstoffkomplexes tr i t t noch in 10-4-m MagnesiumlSsungen auf, bei kleineren Konzen- trationen verschiebt sich die Farbe der LSsung naoh Violett, bis sie sieh sehliel31ieh bei 2 ,5 .10 -7 Mol/Liter yon der blauen Farbe des magnesium- freien Farbstoffs nieht mehr unterscheiden l~l~t (s. Eichkurven).

Wir haben zungehst die Extinktionen yon Eriochromschwarz T bei Zusatz yon MagnesiumlSsungen verschiedener Konzentrat ion im sicht- baren Spektralbereich gemessen. In der Abb. 1 sind die mit dem Unicam- Spektrophotometer ermittelten Absorptionskurven wiedergegeben.

Die folgenden Untersuehungen sind mit dem Pulfr ieh-Photometer ausgefiihrt worden; es sei erw~hnt, dab die hiermit aufgenommenen ungefghren Absorptionskurven mit den spektrophotometriseh gewonnenen iibereinstimmen.

W~hrend bis zu einem Magnesiumgehalt yon zirka 5 . 1 0 -6 Mol/Liter das Absorptionsmaximum des Gemisches yon freiem Farbstoff und Komplex

21"

324 W. Dirscherl und H. Breuer:

wie beim magnesiumfreien Farbstoff allein bei 610 m/z liegt, verschiebt es sich bei zunehmender Magnesiumkonzentration zum Kurzwelligen hin.

0, 706

E

0,~00

0,, 500

0, ~00

0,300

0.200

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.2.5, za-*~-M.a ( En dk o n z e n tr# t/'o n)

z,5. 70-sm-My _

"Endkozzentrahon) s. z o - ~ - A ¢ e

eentr~l/'on)

l\ \

'~.%

400 500 600 700 8#O~/z

Abb. 1. Absorpt ion yon ]~riochromschwarz T bei Zusatz VOlt Mg++-LOsungen verschiedener Konzent ra t ion . Un icam-Spek t ropho tomete r , Sehichtdicke 10 ram, PH ~ 10. KonzentraHon des Fa rb -

stoffs 5 ' 10-s-re.

Der reine weinrote Mugnesium-Eriochromschwarz T-Komplex absorbiert m~ximal bei 560 m~ (Magnesiumgehalt rund 5 . 1 0 -5 Mol, Liter und gr5Ber

Photometrische Bestimmung yon Magnesium mit Eriochromschwarz T. 325

bei der verwendeten Farbstoffkonzentration yon 5 . 1 0 -5 Mol/Liter). Da der Farbstoff im ~berschul] anzuwenden ist, muB (lessen Extinktion be- rfieksichtigt werden. Das geschieht am besten dadurch, dab man gegen die reine FarbstofflSsung als Leerwert photometriert . Wir messen die Extinktionsdifferenzen bei den Wellenl~ngen 533 und 665 m/~ (Filter S 53 und S 66 des Stufenphotometers); diese Differenzen sind bei der je- weiligen Magnesiumkonzentration etwa gleich grol3 (s. Abb. 3 und 4),, aber yon umgekehrtem Vorzeichen. Wir halten die Messung bei

E

~ ~ : , L eef~ve/,2

- - _ 2, ,£ 7 0 -.~,~. - . ~ . 0 •

7, Z

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" - - o,S. 7o-a:~ _ M 9

|

O 70 30 60 90 7ZO 750m/~

Abb. 2. Extinktionen der magnesiumfreien und magnesiumhaltigen Eriochromschwarz T-L6suugen bei verschiedenen Wellenl~ingen in Abh~ingigkeit yon der Zeit. Schichtdicke 30 ram, Farbstoffkonzen-

tration 5* 10-~-m Leerwert: Puffer-Wassergemisch wie bei den FarbstofflSsungen.

verschiedenen Wellenl~ngen fiir zweckm~l]ig, weil sie in manchen F~llen die Aufdeckung yon StSrungen ermSglicht. So kSnnen z. B. die Extinktionsdifferenzen bei dem weiter unten zu besprechenden Salzeffekt zwar auch verschiedenes Vorzeichen aufweisen, sind aber verschieden groin. Anderseits bedingt z. B. ein Kupfergehalt yon 10-4Mo!/Liter Extinktionsdifferenzen yon verschiedener GrSBe u n d

gleichen Vorzeichen. Naeh Angabe yon W. B i e d e r m a n n und G. Schwarzenbach zl ist die

LSsung von Erioehromschwarz T bei PH ~ 10 nicht l~ngere Zeit haltbar. Wir kSnnen dies best~tigen. Da die Abnahme der Extinktion aber, wie Abb. 2 zeigt; unabh~ngig vom Magnesiumgehalt der FarblSsung, somit fiir den Farbstoff selbst wie fiir seinen Magnesiumkomplex die gleiche ist, l~Bt sieh dieser Effekt ausschalten, indem m a n die magnesiumhaltigen FarblSsungen gegen den magnesiumfreien Farbstoff als Leerwert photo- metriert, wie wir das zu tun pflegen.

326 W. Dirscherl und H. Breuer:

Die giinstigste Farbstoffkonzentration lag im Bereich yon 3,5 bis 5,5 '10-SMol/Liter (Endkonzentration); wir arbeiten im allgemeinen bei 5- 10 -5 Mol/Liter.

In den Abb. 3 und 4 sind mit den Filtern S 53 und S 66 aufgenommene Eiehkurven fiir den ~Iolarit~tsbereich yon 5 . 1 0 -~ bis 5- 10 -~ an Magnesium wiedergegeben.

7,2

dE

7,7

0,5

0,3

I

0,2 ~ t-' , !

0 £70" 70 /4ole M~/Liter

l

fJ 2 2

/

/ / ,

!

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/ i I

,,li II 7.70 "5 5

7,2 .J£

7,7

0,3

0,6

0,6

-5 0 1

7,70-S Mole Mg/b~e,"~

Abb. 3. Abb. 4,

I

J h i

I I

I

l J

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f -T

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I iI

s.ro:

Abb, 3 und 4. Eichkurven zur Bes t immung des Magnesiums mi t Eriochromschwarz T bei den Fil ter~ S 53 und S 66. Farbstoffkonzentrat ion 5 • 10-~-m, Sehiehtdicke 30 ram, PH = 10.

Die Form der Eiehkurven erinnert an die Vergleichbarkeit der Reak- tion zwischen Magnesium und Eriochromsehwarz T m i t dem Farb- umschlag eines pmIndikators. Diese Analogie hat G. Schwarzenbach 1~

dazu veranlaBt, das Eriochromsehwarz T als Metallindikator zu be- zeiehnen, mit dessen Hilfe man den Wert - - log [M] -- ~ messen kann. Der p~-Bereich des Eriochromschwarz T erstreckt sich, wie die Abb. 3 und 4 zeigen, yon 6,3 bis 4,3.

Photometrische Bestimmung von Magnesium mit Eriochromschwarz T. 327

II. EinfluB st~render Ionen und dessen Ausschaltung.

Auger Magnesium reagieren eine Reihe weiterer Ionen mit Eriochrom- schwarz T unter Bildung roter Farbstoffe (Biedermann und Schwarzen- bach, 1. c.). Wir haben uns infolgedessen mit der Frage beseh~ftigt, inwieweit die Magnesiumbestimmung durch die uns aus biologisehen Griinden besonders interessierenden Metallionen Calcium, Zink, Kupfer sowie zwei- und dreiwertiges Eisen ges~Srt wird und welche MSglichkeiten zu ihrer Beseitigung bestehen.

Calcium bildet mit Eriochromschwarz T einen Farbkomplex, dessen Absorptionskurve, wie aus Abb. 5 hervorgeht, hinsichtlich ihres Verlaufes und der Lage des Maximums mit der des Magnesiumkomplexes weit- gehend iibereinstimmt. Entspreehend der kleineren Bildungskonstanten des Calciumkomplexes ( K : 2 . 1 0 +5) zeigen CalciumlSsungen mit Eriochromsehwarz T aber wesentlich kleinere Extinktionsdifferenzen als MagnesiumlSsungen gleicher Konzentration, wie das in der Abb. 5 sehr deutlich zum Ausdruck kommt. MiBt man 'die Extinktionsdifferenzen yon FarbstofflSsungen, die Calcium und Magnesium in ~quimolarer Menge enthalten, so erh~lt man die gleichen Werte wie bei Fehlen yon Calcium, da das Magnesium izffolge seiner grS[3eren Bildungskonstante mit dem Eriochromschwarz T bevorzugt reagiert.

Liegt das Calcium in der auf Magnesium zu untersuchenden LSsung in doppeltem bis hundertfaehem l~bersehul3 vor, so mul3 es durch Am- moniumoxalat beseitigt werden. Dabei ist ein zu groBer ~berschu~ zu vermeiden, da sonst Magnesiumverluste auftreten kSnnen. (Mit dem Farbstoff allein reagiert Ammoniumoxalat nicht.) Es ist zweckm~Big, sich vor Durehffihrung der Magnesiumbestimmung fiber den Calcium- gehalt der Probe zu orienti¢ren.

Zinlc und Kup/er stSren die Magnesiumbestimmung bereits in ~qui- molarer Menge erheblich ; im ersten Fall werden beide durch das Magnesium bedingten Extinktionsdifferenzen vergrSI3ert, im zweiten Fall nur die bei S 66 gemessene (bei zehnfachem (~berschul3 an Kupfer wird die Diffe- renz bei S 53 in umgekehrter Richtung ver~ndert). Beide Ionen lassen sich durch Cyanid aussehalten.

Eisen(III)-Ionen sind naeh unseren Versuchen bei ~quimolarem Verh~ltnis zu Magnesium ohne nennenswerten EinfluB auf seine Bestim- mung. Bei 10- bis 100fachem ~berschul3 werden sie durch Cyanid- zusatz beseitigt. Dagegen wirken Eisen(II)-Ionen schon in kleinen Mengen st6rend, indem sie d~s Erioehromsehwarz T reduzieren; sie miissen zu Ferriionen oxydiert und gegebenenfalls wie diese entfernt werden.

Auch Aluminium bildet mit Eriochromschwarz T einen roten Komplex. In ~quimolaren und grSBeren Konzentrationen stSrt es erheblich. Unsere

328 W . D i r s c h e r l u n d H . B r e u e r :

V e r s u c h e , e i n e e i n f a c h e M S g l i c h k e i t * z u r A u s s c h a l t u n g d i e s e s E i n f l u s s e s

z u l i n d e n , s i n d o h n e E r f o l g g e b l i e b e n . T a r t r a t z. B . , d a s z u r K o m p l e x -

0,700

E

O,606

a50~

0,~6

0,300

0, ~00

alle/n

z,5. 7o-s~- C.~

~,5. 7o-o~-M,~ h" ~ \

%

%

~oo coo 600 700 800 r~/~

Abb. 5. Absorption yon Eriochromschwarz T bei Zusatz yon Mg+÷- und Ca~-+-LSsungen gleicher Konzentration sowie ihrem ~tquimolaren Gemisch. Unicam-Spektrophotometer. Schichtdicke 10ram,

PH = 10. Konzentration des Farbstoffs 5 • 10-5-m.

* N a c h E . A b r a h a m c z i k ~ l a s s e n s i ch A l u m i n i u m u n d a n d e r e E l e m e n t e d u t c h A u s s c h i i t t e l u n g m i t A c e t y l a c e t o n e n t f e r n e n .

Photometrische Bestimmung yon Magnesium mit Eriochromschwarz T. 329

bildung mit Aluminium neigt, reagiert nicht mit dem Farbstoff allein, ver- st~rkt aber die dureh Alumininm hervorgerufene Rotf~rbung betri~chtlich.

W~hrend die biolo- gisch interessierenden Natrium- und Kalium- ionen in Konzentratio- non bis 10 -~ Mol/Liter .~r. keinen Einflul3 anf die

' Magnesiumbestimmung 1 ausfiben, treten bei h6- . . . . . . h e r e n Konzentrationen infolge des sog. Salz- fehlers (vgl. G. Korti~m ~3) 2 StSrungen auf, die durch Verdiinnung zu beseiti- gen sind.

SchlieBlich fiihren 3 wir in der Tabelle als Beispiel zwei Belegana- lysen von Magnesium- 15sungen an, die die 4 erw~hnten Fremdionen i in einem biologisch m5g- lichen Mischungsver- h~ltnis enthalten. Die

Tabelle. M a g n e s i u m b e s t i m m u n g e n bei An- wesenhe i t yon F r e m d i o n e n .

Endkonzentration der L6sung ~Iol/Liter

1. 10 -~ Mg

1 10 -4 Mg 1 I0 -4 Ca 1 10-4 Fe(III) 1 10 -5 Zn 1 10 -5 Cu 1 10 -5 A1 1. 10 -2 K 1. 10 -2 CN

1. 10 -5 Mg

1 • 10 -5 1 10 -5 1 10 -5 1 10 -~ 1 10 -6 1 10 -6 1 10 -2 1 10 -2

Mg Ca Fe(III) Zn Cu A1 K CN

Extinktion bei Filter

S 6 6 S 5 3

1,25 1,12

i

!

1,23 1,14

!

0,28 0,25

0,29 I 0,26

i i J

m i t Cyanid versetzten magnesiumhaltigen Mischl6sungen ergaben die gleichen Extinktionen wie die entsprechenden reinen MagnesiumlSsungen.

H I . A u s f i i h r u n g d e r M a g n e s i u m b e s t i m m u n g .

L6sungen. Zur Herstellung der LSsungen sind p. a.-Reagenzien und bidestilliertes Wasser (Quarzapparatur) zu verwenden. Wenn auch bei der kleinen Zahl der notwendigen Reagenzien die Gefahr einer Ein- schleppung yon Magnesium nm" gering ist, so empfiehlt es sich doch, vor dem Gebrauch neuer Substanzen diese auf Anwesenheit yon Magnesium zu prfifen.

O,05%ige alkoholische Stamml6sung yon Eriochromschwarz T*. Die Lo'sung ist gut verschlossen monatelang haltbar. Bei ihrer Herstellung ist darauf zu achten, dab der Farbstoff vollst/~ndig in L5sung geht; am besten tr~gt man ihn portionsweise in den 96~/oigen Alkohol ein.

Ammoniak-Ammoniumsalzpu//er, pH = 10. Wir verwendeten den yon Biedermann und Schwarzenbach 11 angegebenen Puffer ans n Ammonium- chlorid und n Ammoniak im Verh~ltnis 1:5.

* Hersteller: Aktiengesellschaft vorm. B. Siegfried, Zofingen (Schweiz).

330 W. Dirseherl und H. Breuer: :

Off-n Kaliumcyanid.L6sung. Ammoniumoxalatl6sung. Die Konzentration (10 -3- bis 10-5-m) richter

sich nach der Menge des auszusehaltenden Calciums. Ausfi~hrung. Einige ml der auf Magnesium zu prtifenden neutralen

und klaren LSsung werden in einem Zentrifugenglas mit 5 ml PufferlSsung und gegebenenfalls mit AmmoniumoxalatlSsung versetzt.

Die zuzusetzende Menge Ammoniumoxalatl6sung ergibt sich aus dem Gehalt~der L6sung an Calcium, der in einem Vorversuch zu ermitteln ist.. Dann wird an einer Calciuml6sung der gefundenen Konzentration in Parallelversuehen die zur quantitativen Ausf~llung notwendige Ammonium- oxalatmenge bestimmt. Bei Magnesiumgehalten yon 5 • 10 -7 bis 5- 10 -5 Mol / Liter und einem Verh~ltnis yon Ca:Mg ~ 2:1 bis 100:1 betr~gt die er- forderliche Ammoniumoxalatmenge das Ein- bis Vierfache der berechneten.

Dann werden die Zentrifugengl~ser 30 Minuten in ein Wasserbad yon 60 °, anschlieBend 10 Minuten in Wasser von zirka 10 ° gestellt und hierauf 10 Minuten abgeschleudert. Die tiberstehende L6sung wird in ein 25-ml- MeBkSlbchen tibergefiihrt, 2,5 ml einer 0,1.n KaliumeyanidlSsung sowie 1,0 ml der Eriochromschwarz T-StammlSsung zugegeben und unter Vor- schaltung der Filter S 53 und S 66 gegen die Blindprobe photometriert. Diese enth~lt mit Ausnahme der zu untersuehenden LSsung die gleiehen Zus~tze.

Der Fltissigkeitsbed~rf betr~gt bei 30-mm-Ktivetten 15ml, bei 10-mm-Ktivetten 5 ml, so dab das oben mit 25 ml angegebene End- volumen entsprechend reduziert werden kann. Da das Magnesium noch in einer Konzentration yon 5. 10 -~ Mo]/Liter naehgewiesen werden kann, gentigen bei einem Endvolumen yon 5 ml 0,06 y Mg fiir eine Bestimmung.

Die Fehlerbreite ergibt sich bei der besehriebenen Ausfiihrung zu ~ 5%.

Die beschriebene Bestimmungsmethode ist in unserem Institut yon Frl. Trudel Mi~ller nachgearbeitet worden; die Anwendung auf biologische Probleme, die yon uns schon vor einiger Zeit begonnen worden ist, wird fortgesetzt. Dartiber wird sparer an anderer SteUe zu berichten sein.

Zusammeniassung. Es wird eine einfache MCthode zur photometrischen Bestimmung yon

0,05 bis 5 7 Magnesium mit Eriochromschwarz T angegeben, die auf der Bildung des yon Biedermann und Schwarzenbach beschriebenen Farb- l(omplexes beruht. Auf Grund spektrophotometrisch ermittelter Ab- sorptionskurven hat es sich als zweckm~Big erwiesen, ftir die Bestimmung des Magnesiums die Extinktionsdifferenzen zwischen der reinen und der magnesiumhaltigen FarbstofflSsung bei 533 und 665 m# heranzuziehen. Es werden Angaben tiber den EinfluB und die Ausschaltung stSrender Ionen gemacht: Calcium wird gegebenenfalls durch Ammoniumoxalat

Photometrisehe Bestimmung yon Magnesium mit Eriochromschwarz T. 331

ausgef~llt, Zink, Kupfer und Eisen(I I I ) werden mi t Cyanid unsch~dlich gemacht , E isen( I I ) wird zu Eisen(I I I ) oxydiert . Sehliel31ieh wird eine Vorschrift zur Ausffihrung der Magnes iumbes t immung mitgeteflt.

Summary,

A simple method is given for the photometric determination of 0.05 t o 5 7 magnesium with Eriochrome black T, I t is based on the formation of the color complex described by Biedermann and Schwarzenbach. On the basis of the absorption curves obtained spectrophotometrically, it has been found expedient to draw on the extinction differences between the pure and the magnesium-bearing dyestuff solution at 533 and 665 m/~ when determining magnesit~n. Statements are given regarding the influence and the elimination of interfering ions: if necessary, calcium is precipitated by ammonium oxalate; zinc, copper, and iron (III) are rendered harmless by means of cyanide; iron (II) is oxidized to iron (III). Finally, a procedure is given for the magnesium determination.

R~sum~.

On donne une m6thode simple pour le dosage photom~trique de 0,05 /t 5 7 de magnesium avee le heir Eriochrome T qui repose sur la formation d'm~ eomplexo color~ d~crit par Biedermann et Schwarzenbach. Sur la base des courbes d 'absorption obtenues spectrographiquement, il est apparu Conve= nable pour le dosage du magadsium d'utiliser ~ 533 et ~ 665 m/~ les diff6rences d 'extinction entre les solutions pures de la matibre colorante d 'une part et con - tenants du magn(~sium d'autre part. On donne des indications sur l 'influence des ions gSnants et sur la maniSre de les ~liminer. Le calcium est pr~cipit~ par l 'oxalate d,ammonium; le zinc, le cuivre et le fer-III masqu6s par un cyanure, le fer-II oxyd8 en fer-III. Enfin, on fournit des instructions pour effectuer le dosage du magnesium.

Literatur. z E . Havinga und A . F . K . B . Ballot, Rec: tray. chim. 1)ays-Bas 61, 849

(1942). 3 K . Lang, Biochem. Z. 253, 215 (1932). 3 H . W. Spier, Klin. Wsehr. 29, 85 (1951).

4 I . M . Koltho]], Biochem. Z. 185, 344 (1927). s K . Hinsberg und K . Lang, Medizinische Chemie, Miinchen und Berlin:

Urban und Schwarzenberg. 1951. e A . D. Hirsch]elder und E . R . Serles, J. Biol. Chem. 104, 635 (1935). 7 R. J . Garner, Bioehemie. J. 40, 828 (1946). 3 E . Kreibisch und H . B~umler, Aluminium 20, 528 (1938). 9 E . Abrahamczilc, Mikroehem. 33, 209 (1948). zo M . Orange und H. C. Rhein, J. Biol. Chem. 189, 379 (1951). zz W. Biedermann und G. Schwarzenbaoh, Chimia 2, 56 (1948). z3 G. Schwarzenbach, Chimia 8, 1 (1948). 13 G. Korti~m, Kolorimetrie und Spektralphotometrie, Berlin: Springer-

Verlag. 1948.