elektroforeza

CAPILLARYS PROTEIN(E) 6Ref. 2003Ref. 2023*

2014/06

- 92 -

NAMENAPakovanje CAPILLARYS PROTEIN(E)-a je namenjeno za separaciju humanih seruma i proteina urina u alkalnom puferu (pH 9,9) kapilarnomelektroforezom sa sistemom CAPILLARYS.Normalni proteini seruma se separiraju u šest glavnih frakcija.Proteini urina se separiraju u pet zona, nakon pripreme uzoraka urina sa pakovanjem CAPILLARYS / MINICAP URINE (Pogledati uputstvo zaupotrebu u pakovanju CAPILLARYS / MINICAP URINE, SEBIA, PN 2013).CAPILLARYS je potpuno automatizovan sistem koji priprema proteine za kvalitativne i kvantitativne analize. Proteini, razdvojeni u silicijumskimkapilarama, direktno se odredjuju merenjem apsorbance na 200 nm. Elektroforegramom se vizuelno može otkriti svaki oblik abnormalnosti. Direktnoodredjivanje omogućava tačno relativno kvantitativno merenje pojedinačnih proteinskih frakcija.

Za in vitro dijagnostičku primenu.

NAPOMENA : U ovom uputstvu za upotrebu, naziv "CAPILLARYS" se koristi za automatske instrumente CAPILLARYS, CAPILLARYS 2 iCAPILLARYS 2 FLEX-PIERCING.

PRINCIP TESTAElektroforeza proteina je tehnika koja se rutinski koristi u kliničkim laboratorijima za proveravanje prisustva abnormalnih proteina u uzorcima.CAPILLARYS je proizveden kako bi omogućio potpunu automatizaciju ovog testa s brzom separacijom i dobrom rezolucijom. Metoda se u mnogimpogledima može smatrati prelaznom tehnikom izmedju klasične elektroforeze i tečne hromatografije.CAPILLARYS sistem koristi princip kapilarne elektroforeze u slobodnom rastvoru. Pomoću ove tehnike naelektrisani molekuli razdvajaju se premasvojoj elektroforetskoj pokretljivosti u alkalnom puferu specifičnog pH. Razdvajanje se, takodje, odvija na osnovu pH vrednosti elektrolita ielektroosmotskog toka. CAPILLARYS sistem ima 8 kapilara koje rade paralelno i tako omogućavaju 8 istovremenih analiza. Prethodno pripremljenorazblaženje uzorka s puferom usisa se na anodnom kraju kapilare. Zatim se vrši visokonaponska separacija proteina koji se direktno odredjuju na200 nm na katodnom kraju kapilare. Kapilare se odmah ispiraju rastvorom za ispiranje i pripremaju za sledeću separaciju sa puferom.Proteini se, u svakoj zoni koja sadrži jedan ili više proteina, odredjuju prema sledećem rasporedu: gama globulini, beta-2 globulini, beta-1 globulini,alfa–2 globulini, alfa-1 globulini i albumin.

REAGENSI I MATERIJAL PRILOŽEN U PAKOVANJIMA CAPILLARYS PROTEIN(E) 6

UPOZORENJE : Pogledajte listove sa bezbednosnim podacima.

* CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 MAXI-KITZA OPTIMALNE REZULTATE :Svi reagensi iz istog pakovanja moraju se koristiti zajedno i prema uputstvu za upotrebu.MOLIMO, PAŽLJIVO PROČITATI UPUTSTVO ZA UPOTREBU.

UPOZORENJE : Nemojte koristiti dejonizovanu vodu koju možete kupiti na tržištu, kao što je na primer voda za peglanje (rizik od velikogoštećenja kapilare). Koristite vodu samo izuzetne čistoće, kao što je voda za injekcije.

1. PUFERPripremaPufer je spreman za upotrebu. On sadrži : rastvor pufera pH 9,9 ± 0,5 ; aditive, nisu opasni u koncetracijama primenjenim za dobijanje optimalneperformanse.NamenaPufer za razdvajanje proteina kapilarnom elektroforezom.Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja Čuvati pufer na sobnoj temperaturi (15 do 30 °C) ili u frižideru (2 do 8 °C). Stabilan je do datuma isteka roka označenog na pakovanju ili na etiketibočice pufera. Izbegavati držanje u blizini prozora ili izvora toplote.NAPOMENA: Ako se pufer čuva na temperaturi 2 – 8 °C, zagrejati ga na sobnu temperaturu pre upotrebe.NE ZAMRZAVATI!Kada se bočica sa puferom otvori i postavi na instrument CAPILLARYS, pufer je stabilan najviše 2 meseca (ukupno). Ako se planira da se bočica sapuferom koristi više od 2 meseca, ona mora da se ukloni iz instrumenta nakon svake upotrebe i da se čuva na sobnoj temperaturi (na temperaturi od15 do 30 °C) ili u frižideru (na temperaturi između 2 i 8 °C), onda je stabilan do isteka roka trajanja označenog na nalepnici bočice sa puferom.Baciti pufer ukoliko promeni izgled, npr. zamuti se zbog mikrobiološke kontaminacije.

2. RASTVOR ZA ISPIRANJEPripremaBočicu sa nerazblaženim rastvorom za pranje treba razblažiti sa do 750 mL destilovane ili dejonizovane vode.Nakon razblaživanja, rastvor za pranje sadrži alkalni rastvor pH ≈ 12.NamenaZa ispiranje kapilara posle elektroforetskog razdvajanja proteina.VAŽNO: Pre nego što se napuni posuda rastvora za pranje, preporučuje se da se opere otvor posude, konektor i epruveta sa puno destilovane ilidejonizovane vode da se izbegne taloženje soli.

PROIZVODI KAT. br. 2003 KAT. br. 2023*Pufer (spreman za upotrebu) 2 bočice, 700 mL svaka 8 bočice, 700 mL svakaRastvor za ispiranje (nerazblažen) 1 bočica, 75 mL 4 bočice, 75 mL svakaSegmenti za razblaživanje 1 pakovanje od 90 komada 4 pakovanja od 90 komadaFilteri 3 filtera 12 filtera

CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 - 2014/06

SEBIA UPUTSTVO ZA UPOTREBU - Srpski

- 93 -

Čuvanje, stabilnost i znaci propadanja Nerazblažen i radni rastvor za ispiranje čuvati u zatvorenoj boci na sobnoj temperaturi ili u frižideru. Nerazblažen rastvor za ispiranje stabilan je doroka trajanja naznačenog na pakovanju ili etiketi bočice.Radni rastvor za razblaživanje stabilan je 3 meseca.Baciti rastvor za ispiranje ukoliko promeni izgled, npr. zamuti se zbog mikrobiološke kontaminacije.

3. SEGMENTI ZA RAZbLAŽIVANJENamenaSegmenti su namenjeni za jednokratnu upotrebu za razblaživanje uzorka na automatskom instrumentu.UPOZORENJE: Sa segmentima za razblaživanje koji sadrže biološki materijal treba pažljivo rukovati.

4. FILTERINamenaPotrošni filteri za filtraciju pufera za razdvajanje, radnog rastvora za ispiranje i destilovane vode (korišćene za ispiranje kapilara).VAŽNO: Kada se menja pakovanje, izvršite sistematski zamenu svih filtera.Pričvrstiti jedan filter na konektor smešten na kraju svakog creva uronjenog u bočicu pufera, rastvora za ispiranje i destilovanu ili dejonizovanu vodu.Kod postavljanja filtera na CAPILLARYS sistem, konektor i creva treba isprati destilovanom ili dejonizovanom vodom. ČuvanjeDo upotrebe filtere čuvati u njihovom zatvorenom pakovanju na suvom mestu i sobnoj temperaturi ili u frižideru.

REAGENSI KOJI SU POTREbNI ALI NISU PRILOŽENI

UPOZORENJE : Pogledajte listove sa bezbednosnim podacima.

1. DESTILOVANA ILI DEJONIZOVANA VODANamenaZa ispiranje kapilara u automatizovanom CAPILLARYS sistemu, SEBIA, za kapilarnu elektroforezu.Preporuka je da se koristi filtrirana destilovana ili dejonizovana voda (na filteru čija je poroznost ≤ 0,45 μm) čija otpornost je veća od 10 megaoma x cm.Svakog dana promeniti vodu kako bi se sprečio mikrobiološki rast. Za optimalan rad, dodajte 35 µL/dL CLEAN PROTECT (SEBIA, PN 2059, 1 bočica od 5 mL).VAŽNO: Pre punjenja boce za ispiranje, preporučuje se ispiranje s dosta destilovane ili dejonizovane vode.

2. CAPICLEANSastavBočica koncentrovanog rastvora CAPICLEAN-a (SEBIA, kat. br. 2058, 25 mL) sadrži: proteolitičke enzime, površinski aktivne materije i aditive,bezbedne pri korišćenoj koncentraciji, neophodne za optimalna izvodjenja.NamenaZa nedeljno pranje sonde za uzorkovanje u automatizovanom sistemu CAPILLARYS, SEBIA, za kapilarnu elektroforezu tokom redosleda čišćenjaCAPICLEAN-om.VAŽNO :- Kada se analizira manje od 500 uzoraka u toku jedne nedelje, makar jedanput nedeljno pokrenite CAPICLEAN sekvencu čišćenja.- Kada se manje od 500 uzoraka analizira u toku jednog dana, ali više od 500 uzoraka u toku jedne nedelje, pokrenite CAPICLEAN sekvencu čišćenja

na svakih 500 analiza.- Kada se analizira više od 500 uzoraka u toku dana, pokrenite CAPICLEAN sekvencu čišćenja jedanput dnevno.Pogledati uputstvo za upotrebu za CAPICLEAN, SEBIA.VAŽNO: Nemojte ponovo koristiti razblaženi segment nakon čišćenja sonde za uzorkovanje.Čuvanje, stabilnost i znaci propadanjaCAPICLEAN čuvati u frižideru (2 – 8 °C). Stabilan je do datuma roka trajanja naznačenog na etiketi bočice. NE ZAMRZAVATI!U bočici CAPICLEAN može se uočiti talog ili kombinovane čestice (flokule) bez neželjenih efekata na njegovu upotrebu.Nemojte rastvarati ovaj talog ili ove čestice. Preporuka je da se sakuplja samo supernatant.

3. RASTVOR NATRIJUM HIPOHLORIDA (za čišćenje igle za uzorke)PripremaPripremite hlorisani natrijum hipohlorit (2 % do 3 % hlorid) razblaživanjem 250 mL 9,6 % koncentrovanog rastvora hlorida na 1 litar hladne destilovaneili dejonizovane vode.NamenaZa čišćenje igle za uzorke u CAPILLARYS sistemu (nedeljno održavanje kako bi se s igle uklonili apsorbovani proteini).Pogledati uputstvo za upotrebu za CAPILLARYS, SEBIA.• Uzeti nosač za uzorke (br. 100).• Na poziciju 1 ovog nosača staviti epruvetu koja sadrži 2 mL prethodno pripremljenog razblaženog rastvora hlora.• Staviti nosač za uzorke br. 100 u CAPILLARYS sistem.• Na prozoru "MAINTENANCE" (Održavanje) koji se pojavljuje na ekranu, odaberite "Launch the probe cleaning (chlorinated sodium hypochlorite

solution)" (Pokrenite čišćenje sonde (hlorisani natrijum hipohlorit rastvor)) i potvrdite.Čuvanje, stabilnost i znaci propadanjaČuvajte radni hlorisani rastvor na sobnoj temperaturi u zatvorenoj posudi, stabilan je 3 meseca. Izbegavajte da stoji izložen na sunčevoj svetlosti, blizuizvora toplote ili paljenja, kao i kiselina i amonijaka.


- 94 -

4. CAPILLARYS / MINICAP RASTVOR ZA ISPIRANJEPripremaSvaku bočicu nerazblaženog CAPILLARYS / MINICAP rastvora za ispiranje (SEBIA, kat. br. 2052, 2 bočice, 75 mL) treba razblažiti destilovnom ilidejonizovanom vodom do zapremine od 750 mL.Nakon razblaživanja, rastvor za pranje sadrži alkalni rastvor pH ≈ 12.NamenaZa ispiranje kapilara u CAPILLARYS-u. Kada je broj testova u seriji manji od 40, neophodna je dodatna količina reagensa.VAŽNO: Pre nego što se napuni posuda rastvora za pranje, preporučuje se da se opere otvor posude, konektor i epruveta sa puno destilovane ilidejonizovane vode da se izbegne taloženje soli.Čuvanje, stabilnost i znaci propadanjaNerazblažen i radni rastvor za ispiranje čuvati u zatvorenoj boci na sobnoj temperaturi ili u frižideru. Nerazblažen rastvor za ispiranje stabilan je do roka trajanja naznačenog na pakovanju ili etiketi bočice.Radni rastvor za ispiranje stabilan je 3 meseca. Baciti rastvor za ispiranje ukoliko promeni izgled, npr. zamuti se zbog mikrobiološke kontaminacije.

NAPOMENE :Probe koje su izvršene za validaciju reagenasa pokazale su da, za različite rastvore i upotrebom prilagođene opreme za zapreminu rekonstitucije,varijacija od ± 5 % na krajnju zapreminu nema neželjenih efekata na analizu.U destilovanoj ili dejonizovanoj vodi koja je upotrebljena za razblaživanje rastvora, ne sme da rayvijaju bakterije ili buđ (upotrebite filter ≤ 0,45 µm) itreba da imate otpornost veću od 10 megaoma x cm.

POTREbNA OPREMA I PRIbOR

1. CAPILLARYS System SEBIA : CAPILLARYS PN 1220, CAPILLARYS 2 PN 1222 ili CAPILLARYS 2 FLEX-PIERCING PN 1227.2. Nosači za uzorke isporučeni uz CAPILLARYS.3. Boce isporučene uz CAPILLARYS: za ispiranje destilovanom ili dejonizovanom vodom i za otpad.

UZORCI ZA ANALIZU

ANALIZA UZORAKA SERUMA

Prikupljanje i čuvanje uzorakaZa analizu se preporučuju sveži serumski uzorci. Serum se mora prikupiti prema utvrdjenom postupku korišćenom u kliničkom laboratorijskomtestiranju. Uzorci se mogu čuvati do 10 dana na temperaturi izmedju 2 i 8 °C. Uzorci koji se čuvaju duže moraju se zamrznuti najkasnije 8 sati odprikupljanja. Zamrznuti serum stabilan je mesec dana.Kod seruma koji se čuvaju na temperaturi izmedju 2 i 8 °C, raspadanje proteina, a posebno komponenti komplementa, najviše zavisi od samog uzorka.S raspadanjem progresivno se smanjuje beta-2 frakcija, a može doći i do njenih promena pojavom malih frakcija u gamma zoni i/ili u beta-1 frakciji.Alfa-2, takodje može biti lagano izmenjena. Posle 10 dana čuvanja u frižideru (2 – 8 °C) beta-1 frakcija može se povećati uz odsustvo beta-2 frakcije.NAPOMENA: Tokom njihovog transporta, uzorci mogu da se drže na sobnoj temperaturi do 5 dana. Posebno se preporučuje da se transportuju natemperaturi od 2 do 8 °C.Priprema uzorkaKoristiti nerazblažene uzorke seruma.Posle čuvanja na temperaturi 2 – 8 °C ili zamrzavanja, neki serumi (posebno oni koji sadrže krioglobulin ili kriogel) mogu postati viskozni ili mogustvoriti talog. Na sobnoj temperaturi ti se uzorci mogu direktno analizirati. Uzorci koji sadrže polimerizovane imunoglobuline mogu se koristiti bezprethodne obrade. Pre separacije poželjno je proveriti izgled seruma (hemoliza, krioglobulini ili zamućenje).Uzorci koje treba izbegavati• Ne koristiti hemolizovani serum. Hemoliza dovodi do pojave dvostruke alfa-2 zone.• Izbegavati stare, nepravilno čuvane uzorke seruma jer kod ovih uzoraka može doći do smanjenja beta-2 frakcije.• Izbegavajte uzorke plazme. Fibrinogen prelazi u poziciju beta-2 (ivica na beta-2 ili pojačan sa zonom beta-2 tako da postoji mogućost rasta ove

frakcije). Kada je prisutan u nekim uzorcima (plazma, serum iz koga nije u potpunosti uklonjen fibrinogen ili kod pacijenta sa antikoagualacionimtretmanom), fibrinogen može da utiče na analizu i na preciznost tumačenja (povećava se sumnja na monoklonalni lanac ili beta-2 frakciju). Kada seanalizira stariji uzorak plazme (nije preporučljivo), C3 dodatak koji vremenom postaje nestabilan delimično degradira, tada uglavnom zona beta-2odgovara fibrinogenu.

ANALIZA UZORAKA URINAPogledati uputstvo za upotrebu u pakovanju CAPILLARYS / MINICAP URINE, SEBIA, PN 2013.

NAPOMENA : Epruvete za sakupljanje bioloških uzoraka opisane su u dostupnoj dokumentaciji za predanalitičku fazu biomedicinske analize (podacikoje obezbeđuju proizvođači epruveta, uputstva i preporuke o sakupljanju bioloških uzoraka…). Ukoliko nema nikakvih indikacija o tipu epruveta kojetreba koristiti u uputstvu za upotrebu, pogledajte ovu dokumentaciju, a za dimenzije epruveta koje treba koristiti, pogledajte SEBIA dokument"Characteristics of tubes to use according to the instrument" (Karakteristike epruveta koje treba koristiti u skladu sa instrumentom). Predanalitička fazamora da se izvodi u skladu sa najnovijim, različitim preporukama, uključujući one koje obezbeđuju proizvođači epruveta, kao i primenjivim propisima.


- 95 -

POSTUPAKCAPILLARYS je višeparametarski instrument za analizu serumskih proteina na 8 paralelnih kapilara koja se vrši sledećim redosledom:• Čitanje bar koda s epruveta uzorka (do 8 epruveta) i nosača za uzorke ;• Razblaživanje uzorka iz primarne epruvete u segmentu za razblaživanje ;• Ispiranje kapilara ;• Ubrizgavanje razblaženih uzoraka ;• Separacija proteina i direktno odredjivanje na kapilarama.

Koraci koji se ručno izvode uključuju:• Smeštanje epruveta uzoraka u nosače za uzorke ;• Smeštanje nosača u CAPILLARYS instrument ;• Uklanjanje nosača za uzorke posle separacije.

PAŽLJIVO PROČITATI UPUTSTVO ZA UPOTREBU ZA CAPILLARYS.

I. PRIPREMA ZA RAD1. Uključiti CAPILLARYS instrument i računar.2. Pokrenuti PHORESIS software i aparat je spreman za rad.3. CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 pakovanje namenjeno je za korišćenje s "PROTEIN(E) 6" programom separacije u CAPILLARYS instrumentu.

Za "PROTEIN(E) 6" program separacije i smeštanje boce s CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 puferom u instrument, pažljivo pročitati uputstvo zaupotrebu za CAPILLARYS.

4. Nosač za uzorke sadrži 8 pozicija za epruvete s uzorkom. Staviti 8 epruveta s uzorkom u svaki nosač ; bar kod svake epruvete mora biti vidljivna otvoru nosača za uzorke.VAŽNO: Ukoliko je broj uzoraka koje treba obraditi manji od 8, nosač za uzorke treba dopuniti s epruvetama koje sadrže destilovanu ilidejonizovanu vodu.

5. Postavite novi razblaženi segment na svaki nosač uzoraka. Nosač za uzorke će biti izbačen ako segment nedostaje.6. Kroz otvor u sredini instrumenta staviti nosač(e) u CAPILLARYS sistem. Do 13 nosača za uzorke može se uspešno i u kontinuitetu staviti u

sistem. Preporučuje se korišćenje nosača br. 0 koji je namenjen za kontrolni serum.7. Ukloniti nosače s obradjenim uzorcima s podloge na levoj strani instrumenta.8. Pažljivo skloniti korišćeni segment za razblaživanje s nosača i baciti ga.

UPOZORENJE: Sa segmentima za razblaživanje koji sadrže biološki materijal treba pažljivo rukovati.

RAZbLAŽIVANJE - MIGRACIJA - OPIS AUTOMATIZOVANIH KORAKA1. Čitanje bar koda na epruvetama s uzorcima i na nosačima.2. Razblaživanje uzoraka u puferu, a igla za razblaživanje ispira se posle svakog uzorka.3. Ispiranje kapilara.4. Ubrizgavanje razblaženih uzoraka u kapilare.5. Migracija traje oko 4 minuta pod stalnim naponom kontrolisanim Peltierovim efektom.6. Direktno odredjivanje proteina merenjem apsorbance na 200 nm, a elektroforetski profil se pojavljuje na ekranu sistema.NAPOMENA: Ovi koraci su opisani za prvi stavljeni nosač s uzorcima. Elektroforetske slike rezultata pojavljuju se posle 10 minuta. Za sledeće nosače,prva dva koraka (očitavanje bar koda i razblaživanje uzorka) učinjena su za vreme obrade prethodnog nosača s uzorcima.

II. REZULTATI ANALIZENa kraju analize, relativno kvantitativno odredjivanje pojedinih zona radi se automatski i profili se mogu analizirati. S ukupnom koncentracijom proteinasistem će izračunati koncentraciju svake frakcije.Elektroforegrami se vizuelno tumače na abnormalnosti.Elektroforetski profili se vizuelizuju korišćenjem re-drawn modu rada: tada je alfa-1 frakcija bliža albuminu.Standardni način rada (Standard mode) dozvoljava prikaz rezultata dobijenog iz neobradjenih podataka.PAŽLJIVO PROČITATI UPUTSTVO ZA UPOTREBU ZA CAPILLARYS.

III. ZAVRŠETAK POSTUPKA SEPARACIJENa kraju rada operater mora da pokrene "stand by" ili "shut down" proceduru na CAPILLARYS sistemu kako bi se kapilare sačuvale u optimalnomstanju.

IV. PUNJENJE bOCA S REAGENSIMACAPILLARYS sistem ima automatsku kontrolu reagensa.VAŽNO: Pogledati uputstva za zamenu boca s reagensima vodeći računa o boji koda za bočice i konektore.Na ekranu će se pojaviti poruka kada je neophodno izvesti jednu od sledećih radnji:• Staviti novu bočicu pufera i/ili ;• Napuniti bocu s radnim rastvorom za ispiranje i/ili ;• Napuniti bocu s filtriranom destilovanom ili dejonizovanom vodom za ispiranje kapilara ;• Isprazniti bocu za otpad.

UPOZORENJE : Nemojte koristiti dejonizovanu vodu koju možete kupiti na tržištu, kao što je na primer voda za peglanje (rizik od velikogoštećenja kapilare). Koristite vodu samo izuzetne čistoće, kao što je voda za injekcije.

VAŽNO: Pre punjenja bocu za ispiranje isprati s dosta destilovane ili dejonizovane vode.PAŽLJIVO PROČITATI UPUTSTVO ZA UPOTREBU ZA CAPILLARYS.


- 96 -

KONTROLA KVALITETAPreporučuje se korišćenje kontrolnog seruma za svaki postupak separacije.

REZULTATI

VrednostiDirektno odredjivanje u kapilarama na 200 nm daje relativne koncentracije (procenat) pojedinačnih proteinskih zona.Normalne vrednosti (srednja ± 2 SD) za pojedinačne glavne elektroforetske serumske proteinske zone u CAPILLARYS sistemu utvrdjene su kodzdrave populacije od 246 odraslih osoba s normalnim nivoom triglicerida (muškarci i žene):

Preporučuje se da svaka laboratorija odredi sopstvene normalne vrednosti.NAPOMENA: Normalne vrednosti ustanovljene su korišćenjem standardnih parametara CAPILLARYS programa ("smoothing 2" i "automatic drift").

Tumačenje rezultataC4 komplement migrira izmedju beta-1 i beta-2 zona ; CRP migrira u beta-2 poziciju, pogledati primere ELEKTROFORETSKE SLIKE REZULTATA.Relativni rast zone beta-2 u poređenju sa zonom beta-1, bez kliničkog sadržaja inflamatornog oboljenja, mora da bude signal upozorenja da se obavedodatne analize.Ako postoji sumnja u vezi sa tumačenjem šablona i / ili pozicioniranja najmanje moguće količine (posebno kada se analizira spoljna kontrola),neophodno je preklopiti dobijeni šablon sa šablonom normalnog kontrolnog seruma (SEBIA, PN 4785).Može se posumnjati na monoklonalnu komponentu u uzorku seruma kada se pojavi znak upozorenja na ekranu "Upozorenje: Centriranje pomeranjaje van opsega" ili kada postoji zastoj kod elektroforetske šeme ili kada je izmenjena. Da bi se potvrdilo prisustvo monoklonalne komponente u uzorkuseruma, potrebno je tretirati uzorak sa beta-merkaptoetanolom i ponoviti analizu na uzorku posle redukcionog tretmana. U tom slučaju (i) pripremite1 % beta-merkaptoetanola (BME, ili 2-merkaptoetanola, 2 ME) u Fluidil-u (SEBIA, PN 4587, 1 bočica 5 mL), (ii) CAPILLARYS sistem koji je spremanda se u njega postavi nosač, dodajte 100 µL ovog redukcionog rastvora u 300 µL čistog seruma, (iii) promešajte i sačekajte maksimalno 15 minuta, azatim sledite standardnu proceduru.VAŽNO : Posle tretmana smanjivanja sa beta-merkaptoetanolom, uzorak mora biti analiziran bez odlaganja ; nosač sa uzorcima koji je unet u sistemCAPILLARYS, ne sme da čeka na analizu.Identifikacija se preporučuje za utvrđivanje monoklonalnih ili oligoklonalnih komponenti :- imunotipizacija sa SEBIA CAPILLARYS IMMUNOTYPING,- imunofiksacija sa SEBIA HYDRAGEL.Za pomoć pri tumačenju elektroforegrama serumskih proteina, pogledati LITERATURU.Alfa-2 zona:• U nekim uzorcima i prema haptoglobinskom fenotipu, alfa-2 zona može se razdvojiti ; pogledati primere ELEKTROFORETSKE SLIKE REZULTATA.

Smetnje i ograničenjaVidi poglavlje UZORCI ZA ANALIZU.Kada su lipoproteini / trigleceridi ili bilijarni pigmenti (sa karakterističnom žutozelenom bojom seruma) sa visokim koncetracijama u uzorku mogu dastvore vizuelni utisak bisalbmunemije na elektroforetskom šablonu.Ako se posumnja na kontaminaciju (veoma retko) između dva uzorka seruma, zbog prisustva nekih monoklonalnih proteina (npr. sa visokomkoncetracijom), preporučuje se ponavljanje analiza na izloženim uzorcima (kontaminiranim ili potencijalno kontaminiranim) selektovanjem posebnogpranja probe uzorka između dva uzorka, obuhvaćenih programom analize "PROTEIN(E) 6" (opcija "Pranje probe seruma").Ova opcija omogućava specifično pranje za sve uzorke analizirane tehnikom CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 (Primedba : rezultat analize se deli sa 2).PAŽLJIVO PROČITAJTE UPUTSTVO ZA RUKOVANJE ZA CAPILLARYS-om.Zbog rezolucije i granica osetljivosti zona elektroforeze, može se dogoditi da neke monoklonske komponente ne budu otkrivene ovom metodom.Možda se neće otkriti monoklonalna komponenta (tj. u slučaju polimerizovanog imuglobulina koji je razmazan ili prikriven u poliklonalnoj osnovi). Sdruge strane, blago odstupanje elektroforetskog šablona može da ukaže na prisustvo monoklonalnog imunoglobulina. U svim slučajevima mora da seanalizira klinički sadržaj i ako se sumnja na gamopatiju, onda se preporučuje da se izvede analiza imunotipizacije na uzorku. Ako i dalje postoji sumnja,rezultat potvrdite tehnikom imunofiksacije na agaroza gelu.

Problemi u raduUkoliko se pojavi problem s testom, a priprema i čuvanje materijala kao i sam postupak testa izvedeni su prema propisu, nazvati SEBIA tehničkuslužbu dobavljača.Dokumentacija o sigurnosti pakovanja reagensa i informacije o rešavanju otpada dostupne su kod naše tehničke službe.

PODACI O IZVODJENJU

Rezultati dobijeni CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 postupkom ukazuju na vrlo dobru reproducibilnost za kvantitativnu analizu sa srednjom vrednošćuCV % od 2,0 % za svaku frakciju proteina. Rezultati prikazani u tabeli koja sledi dobijeni su korišćenjem standardnih parametara CAPILLARYS softvera ("smoothing 2" i "automatic drift").

CAPILLARYS PROTEIN(E) 6Albumin 55,8 - 66,1 %Alfa-1 globulini 2,9 - 4,9 %Alfa-2 globulini 7,1 - 11,8 %Beta globulini 8,4 - 13,1 %

Beta-1 globulini 4,7 - 7,2 %Beta-2 globulini 3,2 - 6,5 %

Gamma globulini 11,1 - 18,8 %


- 97 -

Reproducibilnost u serijiPet (5) različitih uzoraka seruma analizirano je na 8 kapilara postupkom CAPILLARYS PROTEIN(E) 6, korišćenjem dve različite serije pufera zaseparaciju. Srednja vrednost, SD i CV (n = 8), izračunata je za svaki uzorak, svaku zonu i svaku seriju pufera.U tabeli su prikazane vrednosti 5 testiranih uzoraka, za 4 glavne frakcije proteina i dve serije pufera.

NAPOMENA : Maksimalna vrednost za standardno odstupanje i koeficijent varijacije (SD MAX i CV (%) MAX) utvrđeni su dodatnim analizamareproduktibilnosti kontrolnih seruma koje su izvršene na seriji instrumenata. One su nezavisne od vrednosti označene u gornjoj tabeli sa rezultatima.

Reproducibilnost izmedju serijaOsam (8) različitih uzoraka seruma testirano je 10 puta na 8 kapilara postupkom CAPILLARYS PROTEIN(E) 6, korišćenjem tri različite serije puferaza separaciju. Srednja vrednost, SD i CV (n = 10), izračunata je za svaki uzorak, svaku zonu i svaku seriju pufera.U tabeli su prikazane granične vrednosti za 8 testiranih uzoraka i 3 različite serije pufera kao i srednja vrednost izračunata iz srednjih vrednosti svakefrakcije (n = 24).

Reproducibilnost izmedju različitih serija puferaOsam (8) različitih uzoraka seruma testirano je 10 puta na 8 kapilara postupkom CAPILLARYS PROTEIN(E) 6, korišćenjem tri različite serije puferaza separaciju. Srednja vrednost, SD i CV (n = 30), izračunata je za svaki uzorak, svaku zonu i svaku seriju pufera.U tabeli su prikazane granične vrednosti za 8 testiranih uzoraka i 3 različite serije pufera kao i srednja vrednost izračunata iz srednjih vrednosti svakefrakcije (n = 3).

TačnostPatološki i normalni serumski uzorci (n = 135) testirani su postupkom CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 i drugim komercijalno dostupnim gel agaroznimsistemima. Dobijeni koeficijenti korelacije izračunati za pojedine zone dobijene CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 postupkom u odnosu na komparativnegel sisteme (y = CAPILLARYS PROTEIN(E) 6) su sledeći:

FRAKCIJA ALbUMIN ALFA-1 ALFA-2 bETA-1 bETA-2 GAMMASerum A: serijski broj 1 / serijski broj 2SREDNJA VREDNOST % 60,8 / 60,6 3,8 / 3,7 8,8 / 8,5 6,1 / 6,3 4,7 / 4,8 15,8 / 16,1SD 0,3 / 0,4 0,1 / 0,1 0,2 / 0,2 0,1 / 0,1 0,1 / 0,2 0,1 / 0,2CV (%) 0,5 / 0,6 2,6 / 1,9 2,8 / 1,8 1,8 / 2,2 2,6 / 3,4 0,9 / 1,2Serum B: serijski broj 1 / serijski broj 2SREDNJA VREDNOST % 61,8 / 61,9 4,5 / 4,4 10,7 / 10,4 5,9 / 6,1 4,3 / 4,4 12,9 / 12,9SD 0,3 / 0,5 0,1 / 0,05 0,1 / 0,1 0,1 / 0,1 0,2 / 0,2 0,1 / 0,2CV (%) 0,4 / 0,8 2,5 / 1,1 1,0 / 1,3 1,4 / 2,3 3,7 / 4,0 1,2 / 1,6Serum C: serijski broj 1 / serijski broj 2SREDNJA VREDNOST % 60,6 / 60,9 4,4 / 4,4 10,6 / 10,3 5,9 / 6,0 4,4 / 4,4 14,2 / 14,0SD 0,5 / 0,3 0,1 / 0,1 0,1 / 0,1 0,1 / 0,1 0,2 / 0,1 0,1 / 0,2CV (%) 0,8 / 0,5 3,0 / 3,0 1,3 / 1,3 1,5 / 1,8 3,6 / 2,9 0,9 / 1,3Serum D: serijski broj 1 / serijski broj 2SREDNJA VREDNOST % 62,6 / 62,5 4,1 / 4,1 9,0 / 8,8 6,3 / 6,6 4,3 / 4,3 13,6 / 13,7SD 0,5 / 0,5 0,1 / 0,1 0,2 / 0,3 0,1 / 0,2 0,1 / 0,1 0,2 / 0,2CV (%) 0,8 / 0,9 2,1 / 3,5 2,1 / 2,9 1,6 / 2,7 2,8 / 2,4 1,6 / 1,4Serum E: serijski broj 1 / serijski broj 2SREDNJA VREDNOST % 47,6 / 47,0 5,2 / 5,2 7,5 / 7,3 5,5 / 5,7 5,4 / 5,5 28,8 / 29,3SD 0,5 / 0,6 0,2 / 0,2 0,2 / 0,2 0,1 / 0,1 0,2 / 0,2 0,5 / 0,3CV (%) 1,0 / 1,3 4,1 / 3,1 2,7 / 2,9 1,7 / 2,3 3,7 / 2,8 1,7 / 1,2

SD MAX 1,2 0,4 0,7 0,7 0,5 0,5CV (%) MAX 2,0 7,0 7,0 7,0 7,0 4,0

FRAKCIJA SREDNJA VREDNOST (%) SD CV (%) SREDNJA VREDNOST CV (%)Albumin 46,5 - 64,6 0,1 - 0,7 0,2 - 1,2 0,6Alfa-1 3,0 - 5,3 0,04 - 0,2 1,1 - 4,0 2,6Alfa-2 7,5 - 11,1 0,1 - 0,3 0,6 - 3,0 1,7Beta-1 4,6 - 7,0 0,1 - 0,3 1,0 - 5,0 2,2Beta-2 3,7 - 6,6 0,1 - 0,2 1,1 - 3,8 2,2Gamma 9,4 - 29,4 0,1 - 0,3 0,6 - 2,1 1,0

FRAKCIJA SREDNJA VREDNOST (%) SD CV (%) SREDNJA VREDNOST CV (%)Albumin 46,7 - 64,4 0,3 - 0,6 0,4 - 1,1 0,7Alfa-1 3,0 - 5,2 0,1 - 0,2 2,2 - 3,9 3,2Alfa-2 7,7 - 10,8 0,1 - 0,3 1,2 - 3,3 2,2Beta-1 4,6 - 6,7 0,1 - 0,4 1,8 - 5,5 2,9Beta-2 3,9 - 6,6 0,1 1,7 - 3,4 2,5Gamma 9,5 - 29,2 0,1 - 0,3 0,7 - 1,6 1,2


- 98 -

OsetljivostSerijska razblaženja jednog serumskog uzorka s monoklonalnim proteinom 0,429 g/dL odredjena su korišćenjem postupka CAPILLARYSPROTEIN(E) 6. Najveće razblaženje u kome je mogla da se uoči monoklonalna traka je 1:16 što odgovara koncentraciji od 27 mg/dL monoklonalnogproteina. NAPOMENA: Detekcioni limit može se razlikovati u zavisnosti od položaja monoklonalne komponente i poliklonalne pozadine u gamma zoni.

LinearnostRastvor albumina sa 5,2 g/dL i rastvor gamaglobulina sa 3,1 g/dL (koncentracija proteina određena je pomoću nefelometrije na 280 nm) pomešani suu različitim odnosima od 10 do 10 (100 % rastvor albumina + 0 % rastvor gamaglobulina, 90 % + 10 %, itd..., 0 % rastvor albumina + 100 % rastvorgamaglobulina) i mešavine su podvrtnute elektroforezi sa CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 procedurom.Rezultati su pokazali da je dobijeni procenat svake frakcije u savršenoj korelaciji sa teorijskim procentom svake frakcije u okviru mešavine i da bilokoja varijacija može da se otkrije sa linearnošću pomoću CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 procedure.Utvrđeno je da je CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 procedura linearna za frakcije albumina i gamaglobulina u okviru kompletnog ispitanog opsegakoncetracija (između 0,0 i 5,2 g/dL albumina i 3,1 g/dL gamaglobulina).

Frakcija Koeficijent korelacije Odsečak na y osi Nagib Raspon vrednosti koncentracijaCAPILLARYS PROTEIN(E) 6

Albumin 0,973 -4,539 0,972 32,2 - 74,3Alfa-1 0,975 1,199 1,519 2,9 - 13,9Alfa-2 0,947 0,073 1,028 7,1 - 20,1Beta-1 0,850 -0,903 0,932 4,0 - 18,8Beta-2 0,969 0,478 1,189 1,2 - 27,4Gamma 0,969 3,724 0,959 0,7 - 49,8


- 176 -


1. Clark R et al. Rapid capillary electrophoretic analysis of human serum proteins : qualitative comparison with high-throughput agarose gelelectrophoresis. J. Chromatogr. A, 744, 205-213 (1996).

2. Henskens Y et al. Detection and identification of monoclonal gammopathies by capillary electrophoresis. Clin. Chem., 44, 1184-1190 (1998).3. Jellum E et al. Diagnostic applications of chromatography and capillary electrophoresis. J. Chromatogr. B, 689, 155-164 (1997).4. Jenkins MA and Guerin MD. Quantification of serum proteins using capillary electrophoresis. Ann. Clin. Biochem., 32, 493-497 (1995).5. Jenkins MA et al. Evaluation of serum protein separation by capillary electrophoresis : prospective analysis of 1000 specimens. J. Chromatogr. B,

672, 241-251 (1995).6. Jenkins MA and Guerin MD. Capillary electrophoresis procedures for serum protein analysis : comparison with established techniques.

J. Chromatogr. B, 699, 257-268 (1997).7. Jenkins MA and Ratnaike S. Five unusual serum protein presentations found by capillary electrophoresis in the clinical laboratory. J. Biochem.

Biophys. Methods, 41, 31-47 (1999).8. Katzmann JA et al. Identification of monoclonal proteins in serum : A quantitative comparison of acetate, agarose gel, and capillary

electrophoresis. Electrophoresis, 18, 1775-1780 (1997).9. Landers JP. Clinical Capillary Electrophoresis. Clin. Chem., 41, 495-509 (1995).10. Oda RP et al. Capillary electrophoresis as a clinical tool for the analysis of protein in serum and other body fluids. Electrophoresis, 18, 1715-1723

(1997).11. Wijnen PA and van Dieijen-Visser M. Capillary Electrophoresis of serum proteins : Reproducibility, comparison with agarose gel electrophoresis

and a review of the literature. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 34, 535-545 (1996). 12. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité.

Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97.13. Le Carrer D, Bach-Ngohou K. L'électrophorèse capillaire automatisée en biologie clinique. Spectra Biologie, 146 : 47 - 52 (2005).14. L. Guis, A. Chaumier, V. Le Gall, S. Havrez (Février 2013) Intégration du Capillarys 2 Flex Piercing (Sebia) dans un laboratoire de biologie

médicale spécialisée. Revue Francophone des Laboratoires, 449, 47 – 56.15. Blancher A., Boulestin A., Abbal M. (2007) Diagnostic biologique des gammapathies monoclonales en 2007 et leur identification immunologique.

Feuillets de biologie, 48, N° 279, 29 – 36.16. Blessum C., Jeppsson J.O., Aguzzi F., Bernon H., Bienvenu J. (1999) L’électrophorèse capillaire : principe et applications au laboratoire de

biologie clinique. Annales de Biologie Clinique. Volume 57, Numéro 6, 643 - 57, Novembre - Décembre 1999.17. Chartier C. et al (2011) Evaluation of two automated capillary electrophoresis systems for human serum protein analysis. Clin. Biochem.,

DOI:10.1016/j.clinbiochem.2011.05.022.

bIbLIOGRAPHIE / bIbLIOGRAPHY

- 177 -


C3 Complement

Albumin

Alpha-1

Alpha-2

Beta-1

Beta-2

Gamma

2-2 Haptoglobin phenotypeAlpha-2 macroglobulin

TransferrinHemopexin

Alpha-1 acid glycoproteinAlpha-1 antitrypsin

PrealbuminGammaglobulins

C4 Complement

Albuminα-lipoproteinspreß-lipoproteinsß-lipoproteins

SCHÉMAS / FIGURES

1-1 Haptoglobin phenotype

Alpha-1

Albumin

Alpha-2

Beta-1

Beta-2

Gamma

Figure 1

Figure 2

PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES - ELECTROPHORETIC PATTERNS

- 178 -


Figure 3

PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES - ELECTROPHORETIC PATTERNS

SCHÉMAS / FIGURES

1-2 Haptoglobin phenotype

Alpha-1

Albumin

Alpha-2

Beta-1

Beta-2

Gamma

Documents

elektroforeza