Upload
bryan-gerald-hukom
View
45
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
ELISA
Citation preview
TEST ELISA
聽 Sejarah ELISA
Sebelum pengembangan ELISA, satu-satunya pilihan untuk melakukan suatu
immunoassay adalah radioimmunoassay, teknik menggunakan antigen berlabel radioaktif
atau antibodi. Dalam radioimmunoassay, radioaktivitas memberikan sinyal, yang
menunjukkan apakah suatu antigen tertentu atau antibodi hadir dalam sampel.
Radioimmunoassay pertama kali dijelaskan dalam kertas oleh Rosalyn Sussman Yalow
dan Salomo Berson diterbitkan pada tahun 1960. Sebuah mikrobiologi menggunakan
enzim suatu Linked tes Assay (ELISA) immunosorbent, dalam rangka untuk
mengembangkan metode untuk deteksi cepat antigen p24 HIV dalam sampel darah.
Karena radioaktivitas menimbulkan ancaman kesehatan potensial, alternatif yang
lebih aman itu dicari. Sebuah alternatif yang cocok untuk radioimmunoassay akan
mengganti sinyal non-radioaktif di tempat sinyal radioaktif. Ketika enzim (seperti
peroksidase) bereaksi dengan substrat yang sesuai (seperti ABTS atau 3,3 ', 5,5'-
tetramethylbenzidine), perubahan warna terjadi, yang digunakan sebagai sinyal. Namun,
sinyal tersebut harus dikaitkan dengan keberadaan antibodi atau antigen, yang mengapa
enzim harus dihubungkan dengan antibodi yang sesuai. Proses menghubungkan secara
independen dikembangkan oleh Stratis Avrameas dan GB Pierce. Karena itu perlu untuk
menghilangkan antibodi atau antigen terikat dengan mencuci, antibodi atau antigen harus
tetap ke permukaan wadah;. Yaitu, immunosorbent telah harus dipersiapkan. Sebuah
teknik untuk mencapai hal ini diterbitkan oleh Wide dan Jerker Porath pada tahun 1966.
聽
Pada tahun 1971, Petrus Perlmann dan Eva Engvall di Universitas Stockholm di
Swedia, dan Anton Schuurs dan Bauke van Weemen di Belanda mandiri makalah yang
disintesis pengetahuan ini ke dalam metode untuk melakukan EIA / ELISA.
聽
聽 Pengertian ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu
teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi
untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu
sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang
medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam
pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal
ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik
dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan
antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap
terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim
menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat
cahaya dengan panjang gelombang 聽 tertentu disinarkan pada suatu
sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga
jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya
fluoresensi.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan
spesifitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah
antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu
permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter
polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada
permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi
lain yang 聽 spesifik untuk antigen yang sama, disebut 鈥 ?
i>sandwich 鈥 ?/i> ELISA). Setelah antigen diimobilisasi,
antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan
antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan
enzim, atau dapat dideteksi 聽 secara langsung oleh antibodi
sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di
antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen
lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang
tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate
ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang
visibel, yang menunjukkan 聽 kuantitas antigen dalam sampel.
Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik,
meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat
fluorogenik yang jauh lebih sensitif.
Aplikasi ELISA
ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel,
karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi 聽
antibodi 聽 dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi kehadiran
antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam industri makanan untuk mendeteksi
allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA
聽 juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada
berbagai kelas obat.
ELISA adalah tes skrining dahulu banyak digunakan untuk HIV karena kepekaan
tinggi. Dalam ELISA, serum seseorang diencerkan 400 kali lipat dan diterapkan pada
pelat yang antigen HIV yang terpasang. Jika antibodi terhadap HIV hadir dalam serum,
mereka dapat mengikat antigen HIV. Pelat ini kemudian dicuci untuk menghapus semua
komponen lain dari serum. Sebuah "antibodi sekunder" khusus disiapkan - antibodi yang
mengikat antibodi lain - kemudian diterapkan ke piring, mencuci diikuti oleh yang lain.
Ini antibodi sekunder secara kimiawi terkait di muka untuk enzim.
"Anti IgG manusia" Antibodi Ganda Sandwich ELISA
Dengan demikian, piring akan berisi enzim sebanding dengan jumlah antibodi
sekunder terikat ke piring. Sebuah substrat untuk enzim diterapkan, dan katalisis oleh
enzim mengarah ke perubahan pada warna atau fluoresensi. Hasil ELISA dilaporkan
sebagai nomor; aspek paling kontroversial dari tes ini adalah menentukan "cut-off" titik
antara positif dan hasil negatif. Sebuah titik cut-off dapat ditentukan dengan
membandingkannya dengan standar yang dikenal. Jika tes ELISA digunakan untuk
skrining obat di tempat kerja, konsentrasi cut-off, 50 ng / mL, misalnya, didirikan, dan
sampel yang berisi konsentrasi analit standar akan disiapkan. Diketahui bahwa
menghasilkan sinyal yang lebih kuat daripada sampel dikenal adalah "positif." Mereka
yang menghasilkan sinyal lemah, yang "negatif." Dokter Dennis E Bidwell dan Alister
Voller menciptakan tes.
Kegunaan lain dari ELISA meliputi:
1. deteksi antibodi mikobakteri dalam TB.
2. deteksi rotavirus dalam tinja.
3. deteksi penanda hepatitis B dalam serum.
4. deteksi enterotoksin E. coli dalam tinja.
聽 Tipe-tipe ELISAAda beberapa tipe-tipe ELISA, diantaranya adalah sebagai berikut:1.聽聽聽聽聽 Indirect ELISA2.聽聽聽聽聽 Sandwich ELISA3.聽聽聽聽聽 Competitive ELISA聽
聽 1.聽聽聽聽 Indirect ELISA
聽
(Gambar Mekanisme Indirect ELISA)
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi
konsentrasi antibodi dalam serum adalah:
a) 聽 聽 聽 聽 聽 Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui
konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate
mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan
plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen
yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar 聽 yang
digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu
sampel yang akan diuji.
b) 聽 聽 聽 聽 聽 Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti
bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam
semua lubang plate mikrotiter. 聽 Tahap ini dikenal sebagai
blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik
dari protein lain ke plate.
c) 聽 聽 聽 聽 聽 Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian
dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui,
dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan
untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap
ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi
protein total harus sama dengan antigen standar.
d) 聽 聽 聽 聽 Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk
antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya
akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang,
bukan pada protein serum yang lain atau protein yang
terbloking.
e) 聽 聽 聽 聽 聽 Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang
antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi
sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat
spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi
berkonjugasi dengan enzim.
f)聽 聽 聽 聽 聽 聽 Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-
antibodi yang tidak terikat.
g)聽 聽 聽 聽 聽 Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk
mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
h) 聽 聽 聽 聽 聽 Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer,
spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya.
Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit
antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan
memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode
indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik,
sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang
plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel
harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada
permukaan lubang.
聽 2.聽聽聽聽 Sandwich ELISA
聽
Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:
a) 聽 聽 聽 聽 聽 Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi 鈥 榩 enangkap
鈥?/span>
b)聽聽聽聽聽 Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
c)聽聽聽聽聽 Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
d)聽聽聽聽 Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
e)聽聽聽聽聽 Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan 聽 antigen
f)聽聽聽聽聽聽 Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan
berikatan dengan antibodi primer
g) 聽 聽 聽 聽 聽 Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat
dibuang
h) 聽 聽 聽 聽 聽 Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal
berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia
i)聽聽聽聽聽聽聽 Diukur absorbansinya 聽 untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari
antigen
Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji
sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki.
Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk
protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan
kuantitas antigen yang terimobilisasi.
Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:
聽
聽 3.聽聽聽聽 Competitive ELISA
Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah
dibahas sebelumnya, yaitu:
a)聽聽聽聽聽 Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b)聽 聽 聽 聽 聽 Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang
telah dilapisi antigen
c)聽聽聽聽聽 Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen
dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang
menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi
d) 聽 聽 聽 聽 Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer.
Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim
e) 聽 聽 聽 聽 聽 Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal
kromogenik/ fluoresensi.
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin
lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:
聽
Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai
berikut:
聽
聽 4.聽聽聽聽 Beberapa dan Portable ELISA (M & P ELISA) (ELISA Reverse di makalah yang diterbitkan)
Sebuah teknik baru (EP 1 499 894 B1 di EPO Buletin 25.02.209 N. 2009/09;
USPTO 7510687 di USPTO Buletin 2009/03/31; ZL 03.810.029,0 di SIPO RRC Buletin
2009/08/04) menggunakan fase padat terdiri dari polistiren immunosorbent batang
dengan 8-12 ogives menonjol. Seluruh perangkat direndam dalam tabung reaksi berisi
sampel dikumpulkan dan langkah-langkah berikut (cuci, inkubasi dalam conjugate dan
inkubasi dalam chromogenous) dilakukan oleh mencelupkan ogives di microwells standar
microplates pra-diisi dengan reagen.
Keuntungan dari teknik ini adalah sebagai berikut:
Para ogives masing-masing dapat peka terhadap reagen yang berbeda, memungkinkan
deteksi simultan dari antibodi yang berbeda dan / atau antigen yang berbeda untuk multi-
target tes;
Volume sampel dapat ditingkatkan untuk meningkatkan sensitivitas tes di klinik (darah,
air liur, urin), makanan (susu curah, telur dikumpulkan) dan (air) lingkungan sampel;
Satu ogive yang tersisa unsensitized untuk mengukur reaksi non-spesifik sampel;
Penggunaan perlengkapan laboratorium untuk mengeluarkan alikuot sampel, mencuci solusi
dan reagen dalam microwells tidak diperlukan, memfasilitasi pengembangan siap
menggunakan laboratorium-kit dan di tempat kit.
5.聽聽聽聽 Material Dalam Metode ELISA
脴聽 Antigen
脴聽 Monoclonal Ab
脴聽 Microplate
脴聽 Blocking Buffer
脴聽 Serum sample
脴聽 Conjugate (secondary Ab + Enzyme)
脴聽 Subtrate
脴聽